KR101801403B1 - 다차원 바이오재료 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

분화된 MSC 조직 및 상기 분화된 MSC 조직 내에 분산되어 있는 탈미네랄화된 골 매트릭스를 함유하는, 다차원 구조를 갖는 바이오재료 및 그의 제조방법.

Description

다차원 바이오재료 및 그의 제조방법{MULTI-DIMENSIONAL BIOMATERIAL AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 중간엽 줄기세포 및 다차원 조직 또는 바이오재료 또는 매트릭스 제조를 위한 그의 분화에 관한 것이다. 본 발명의 생성물은 류마티스학, 조직 재건, 및/또는 외과수술, 특히 외상학, 정형외과수술, 성형수술 및 악안면 수술 분야에서 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 생성물은 뼈 및 연골의 복구 또는 대체에 유용할 수 있다.
조직 엔지니어링 분야는 신흥 분야로서 여러 가지 체내 이식용 신소재가 개발 중에 있다. 한 가지 중요한 분야는 외상 또는 질병 (예컨대 종양 절제)로 인하여 상실된 뼈 부분을 대체하기 위한 골이식 재료에 관한 것이다. 전통적으로, 이식 재료는 이식 재료를 제공받는 개체의 뼈로부터 얻을 수 있다. 그러나, 이를 위하여는 부가적인 외과수술과 그에 따른 부가적인 회복이 필요하다. 다른 사람 또는 심지어 시신으로부터도 뼈를 수득할 수는 있지만, 이것은 생체적합성 문제뿐만 아니라 질병 전이 위험성을 수반한다.
이 때문에 조직을 생성하기 위하여 줄기세포 분화 분야에서 많은 연구가 행해져왔다. 예를 들어, WO2007/103442에는 지방 유래 줄기세포인 성체 줄기세포와 실크 스캐폴드를 포함하여 이루어진 조성물이 개시되어 있다.
기술 문제
그러나, 골이식 또는 골강화 또는 골재건을 위한 다차원 조직의 생산은 실질적인 기술적 문제를 안고 있다. 이같은 이슈는 연골 재건 또는 연골 결손의 경감에 있어서도 마찬 가지의 문제가 되고 있다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는, 전적으로 생체적합하고 의도된 용도에 대해 적절한 기계적 특성을 제공해주는 조직 엔지니어링된 재료가 여전히 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 분화된 중간염 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cells) 조직과 탈미네랄화된 골 매트릭스(DBM: demineralised bone matrix)를 포함하는 (여기서 상기 탈미네랄화된 골 매트릭스는 분화된 MSC 조직 내에 분산되어 있음), 다차원 구조를 갖는, 인간의 천연 골유도성 바이오재료에 관한 것이다.
분화된 MSC 조직을 만들기 위해 사용되는 MSC는 인간 또는 동물로부터 유래한 것일 수 있다.
첫 번째 실시상태에 따라, MSC를 지방조직으로부터 분리하는데, 이를 이하에서는 지방조직 중간엽 줄기세포(AMSC: adipose tissue mesenchymal stem cells)라고 칭하기로 한다.
또 다른 실시상태에서는 MSC를 골수로부터 분리하며 이를 이하에서 골수 줄기세포(BMSC: bone-marrow stem cells)로 부르기로 한다. 좋기로는 본 발명에 속하는 MSC는 후기 계대(late passaged) 지방조직 유래형 줄기세포이다.
본 발명의 바이오재료는 인간이나 동물의 몸에 이식되도록 의도된 것이다. 이식된 바이오재료는 자가 유래인 것일 수 있고 또는 동종이형(allogeneic)의 것일 수도 있다. 본 발명의 바이오재료는 뼈 또는 연골 부분에 이식될 수 있다. 본 발명의 바이오재료는 사람이나 동물의 몸의 불규칙한 부분에 이식될 수 있다.
본 발명의 바이오재료는 생체적합성이다.
일반적으로, 본 발명의 바이오재료는 균질(homogeneous)한데, 이는 바이오재료의 구조 및/또는 구성이 조직 전체를 통해 유사함을 의미하는 것이다. 일반적으로, 본 발명의 바이오재료는 천연의 환부에 이식하는데 필요한 바람직한 조작 특성과 기계적 특성을 두루 갖추고 있다.
특정 실시상태에서, 본 발명의 바이오재료는 찢어짐 없이 외과수술 기구로 잡을 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시상태에서, 본 발명의 바이오재료는 어떠한 접착제나 결합제도 함유하지 않는다.
바람직한 실시상태에 따라, 본 발명의 바이오재료는 3차원인 것이 좋다. 이 실시상태에서, 본 발명의 바이오재료는 두께가 적어도 1 mm인 후막을 형성할 수 있다. 바이오재료의 크기는 용도에 알맞게 조절될 수 있다. 또 다른 실시상태에서, 바이오재료는 스캐폴드(scaffold)를 형성하며; 따라서, 본 발명의 바이오재료는 또 다른 추가적인 합성 스캐폴드를 사용할 필요가 없다.
또 다른 실시상태에서, 본 발명의 바이오재료는 두께가 1 mm 미만인 박막을 형성할 수 있다. 이 실시상태에서, 바이오재료는 상기 2차원이다.
첫 번째 실시상태에서, 본 발명의 바이오재료는 오스테오칼신 발현 및 미네랄화 특성 면에서 진짜 뼈와 동일한 특성을 갖는다. 즉, 본 발명의 바이오재료는 뼈세포와 상호연결 조직을 포함하여 이루어진다. 특정 실시상태에 따라, 본 발명의 바이오재료는 골세포(osseous cells: 골세포 유사세포라고도 부른다)와 콜라겐, 좋기로는 석회화 및 미네랄화된 콜라겐, 골 매트릭스 및 골세포 상의 조직화된 포스포칼식(phophocalcic) 결정인 미네랄 코팅을 포함하여 이루어진다. 일반적으로, 본 발명의 바이오재료는 천연 뼈와 유사한 다공성을 갖는다.
두 번째 실시상태에서, 본 발명의 바이오재료는 진짜 연골과 동일한 특성을 갖는다. 즉, 본 발명의 바이오재료는 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함하는 세포외 매트릭스, 연골세포를 포함한다.
본 발명의 바이오재료의 재집락화(recolonization) 특성은 그 바이오재료가 이식되는 환경에 따라 달라지며; 본 발명의 바이오재료는 골 환경(osseous environment)에 놓여있을 때 재집락화가능하고 비골 환경(non-osseous environment)에 놓여있을 때는 재집락화가 가능하지 않다.
본 발명의 바이오재료는 그 바이오재료의 세포의 분화가 종점에 도달하면, 이식시, 바이오재료의 표현형이 변화하지 않은 채로 유지되는 그러한 바이오재료이다. 본 발명의 임플란트는 다층일 수 있다. 즉, 본 발명의 임플란트는, 예컨대 외과수술용 글루 또는 기타 적절한 고정 수단과 같은 적절한 수단에 의해 상호 고정되거나 가능하게는 봉합된 적어도 2층의 바이오재료로 된 것일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 바이오재료는 평균 직경이 50-2500 ㎛인 입자 형태의 탈미네랄화된 골 매트릭스를 포함하며; 제1 실시상태에서, 입자의 평균 직경은 50-125 ㎛; 제2 실시상태에서 입자의 평균 직경은 125-200 ㎛; 제3 실시상태에서 입자의 평균 직경은 500-1000 ㎛이다. 일반적으로, 탈미네랄화된 골 매트릭스는 연령이 40세 미만인 공여자로부터 수득된다. 한가지 실시상태에서, 골 매트릭스의 탈미네랄화 비율은 90-99%, 좋기로는 95-98%, 더욱 좋기로는 약 97%이다. 이 탈미네랄화 비율은 유리하게는, 3 시간 동안 HCl 0.6N을 이용하는 공정으로부터 결과된 것이다. 특정 실시상태에서, 탈미네랄화된 골 매트릭스를 멸균처리하기도 한다.
본 발명의 특정 실시상태에서, 탈미네랄화된 골 매트릭스는 유니버시티 티슈 뱅크 (Cliniques universitares Saint-Luc, 벨기에 브뤼셀)가 제공하였다.
본 발명은 또한 15-25일간 골모 및/또는 연골형성 배지에서 15-25일 동안 MSC를 인큐베이션시킨 다음 상기 배지 중의 탈미네랄화된 골 매트릭스를 첨가하여 다시 15-30일, 좋기로는 15-25일, 더욱 좋기로는 20일간 인큐베이션을 유지한 다음; 이 부가적인 기간 동안, 좋기로는 탈미네랄화된 골 매트릭스를 제거하지 않은 채로 배지를 2일마다 한번씩 갈아주는 것을 포함하여 이루어지는, 다차원 바이오재료의 제조방법에 관한 것이기도 하다.
탈미네랄화된 골 매트릭스 첨가에 앞서서 MSC를 인큐베이션시키는 것이 본 발명의 방법의 핵심 단계이다. 이와 같은 단계는 MSC가 연골생성 세포 및/또는 골모세포로 분화되도록 하는데 필요하다. 또한, 이 단계는 3차원(3D) 골 유사 구조를 얻는데도 필요하다.
바람직한 실시상태에서, MSC는 후기 계대(late passaged) 지방조직 간엽 줄기세포이다.
한가지 실시상태에서, 배지 1 ml 당 1 내지 20 mg의 탈미네랄화된 골 매트릭스가 첨가된다. 바람직한 실시상태에서는, 배지 1 ml 당 1 내지 10 mg의 탈미네랄화된 골 매트릭스가 첨가된다.
가장 좋기로는 배지 1 ml 당 5 내지 10 mg의 탈미네랄화된 골 매트릭스가 첨가된다. 탈미네랄화된 골 매트릭스의 상기한 양은 바이오재료의 3D 골 유사 구조를 제공하는데 최적화된 농도이다.
한가지 실시상태에서, 모든 배지는 동물성 단백질이 없는 것이다.
두 번째 실시상태에서, 분화용 배지는 인간의 혈청을 함유한다. 좋기로는, 분화용 배지는 동물의 혈청을 함유하지 않는 것이 좋으며, 특히 사람 혈청 이외의 다른 혈청은 함유하지 않는 것이 좋다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 다차원 바이오재료에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 인간 또는 동물의 몸에 이식되도록 의도된 것이다. 이식된 바이오재료는 자가 기원일수도 있고 동종이형(allogeneic)의 것일 수도 있다. 본 발명의 바이오재료는 뼈나 연골 부분에 이식될 수 있다. 이 바이오재료는 사람 또는 동물의 몸 중 불규칙한 부분(irregular areas)에 이식될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 생체적합한 것이다.
이 바이오재료는 균질한데, 이는, 바이오재료의 구조 및/또는 구성이 전체 조직에 걸쳐 유사하다는 것을 의미한다. 좋기로는, 이 바이오재료는 천연의 환부에 이식하는데 필요한 바람직한 조작 특성과 기계적 특성을 구비하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 찢어짐 없이 외과수술 도구로 집을 수 있다.
본 발명의 한가지 실시상태에서, 바이오재료는 어떠한 접착제나 결합제도 함유하지 않는다.
또 다른 실시상태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 3차원의 것이다. 이 실시상태에서, 바이오재료는 적어도 1 mm의 두께를 갖는 후막 형태일 수 있다. 바이오재료의 크기는 사용목적에 따라 편하게 조절할 수 있다. 또 다른 실시상태에서, 바이오재료는 스캐폴드를 형성한다; 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 추가의 합성 스캐폴드를 사용할 필요가 없다.
또 다른 실시상태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 두께가 1 mm 미만인 박막을 형성할 수 있다. 이 실시상태에서, 바이오재료는 2차원이다.
본 발명의 첫 번째 실시상태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 오스테오칼신 발현 및 미네랄화 특성 면에서 진짜 뼈와 동일한 특성을 갖는다. 즉, 본 발명의 바이오재료는 뼈세포와 상호연결 조직을 포함하여 이루어진다. 한가지 실시상태에서, 이 바이오재료는 골세포(osseous cells: 골세포 유사세포라고도 부른다)와 콜라겐, 좋기로는 석회화 및 미네랄화된 콜라겐, 골 매트릭스 및 골세포 상의 조직화된 포스포칼식(phophocalcic) 결정인 미네랄 코팅을 포함하여 이루어진다. 일반적으로, 본 발명의 바이오재료는 천연 뼈와 유사한 다공성을 갖는다.
두 번째 실시상태에서, 본 발명의 방법으로 수득가능한 바이오재료는 진짜 연골과 동일한 특성을 갖는다. 즉, 이것은 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함하는 세포외 매트릭스, 연골세포를 포함한다.
본 발명의 방법으로 수득가능한 바이오재료는 그 바이오재료의 세포의 분화가 종점에 도달하면, 이식시, 바이오재료의 표현형이 변화하지 않은 채로 유지되는 그러한 바이오재료이다. 본 발명의 임플란트는 다층일 수 있다. 즉, 본 발명의 임플란트는, 예컨대 외과수술용 글루 또는 기타 적절한 고정 수단과 같은 적절한 수단에 의해 상호 고정되거나 가능하게는 봉합된 적어도 2층의 바이오재료로 된 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 바이오재료는 평균 직경이 50-2500 ㎛인 입자 형태의 탈미네랄화된 골 매트릭스를 포함하며; 제1 실시상태에서, 입자의 평균 직경은 50-125 ㎛; 제2 실시상태에서 입자의 평균 직경은 125-200 ㎛; 제3 실시상태에서 입자의 평균 직경은 500-1000 ㎛이다. 일반적으로, 탈미네랄화된 골 매트릭스는 연령이 40세 미만인 공여자로부터 수득된다. 한가지 실시상태에서, 골 매트릭스의 탈미네랄화 비율은 90-99%, 좋기로는 95-98%, 더욱 좋기로는 약 97%이다. 이 탈미네랄화 비율은 유리하게는, 3 시간 동안 HCl 0.6N을 이용하는 공정으로부터 결과된 것이다. 특정 실시상태에서, 탈미네랄화된 골 매트릭스를 멸균처리하기도 한다.
일반적으로, 탈미네랄화된 골 매트릭스는 유니버시티 티슈 뱅크 (Cliniques universitares Saint-Luc, 벨기에 브뤼셀)가 제공하였다.
본 발명은 본 발명의 바이오재료의 의료 장치로서의 용도 또는 의료 장치에 포함되는 것으로서의 용도 또는 의약 조성물에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이오재료 및 적절한 고정 수단, 예컨대 외과수술용 글루 또는 조직-글루, 또는 생체적합성이며 비독성인 외과수술용 접착제 조성물, 및 가능하게는 생체재흡수가능하고, 특히 생물학적 조직을 상호 결합시키거나 또는 이식된 바이오재료에 결합시키기 위한 수단을 포함하여 이루어지는 의료 장치를 포함하는 키트에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이오재료 및 적절한 고정 수단, 예컨대 외과수술용 글루, 또는 조직-글루 또는 생체적합하고 비독성인 외과수술용 접착제 조성물 및 가능하게는 생체재흡수가능하고, 특히 생물학적 조직을 상호 결합시키거나 또는 이식된 바이오재료에 결합시키기 위한 수단을 포함하여 이루어지는 키트에 관한 것이기도 하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 뼈 또는 연골 결손을 경감 또는 치료하기 위한 방법에 사용되기 위한 본 발명에 따른 바이오재료에 관한 것이다.
본 발명은 또한 포유동물에 있어서 뼈 또는 연골 결손을 경감시키기 위한 방법에 관한 것으로, 이 방법은 뼈 또는 연골이 결손된 상기 포유동물에게 본 발명에 설명된 바와 같은 바이오재료의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어진다.
바이오재료는 포유동물에서 뼈 또는 연골 결손을 경감 또는 치료하기 위한 치료적 유효량으로서 사용된다.
뼈 또는 연골 결손의 비제한적인 예로는 골절, 골쇠약증, 골 미네랄 밀도 손실, 관절염, 골다공증, 골연화증, 골감소증, 골암, 파젯씨병 (Paget's disease), 경화성 병변(sclerotic lesions), 침윤성 골질환, 대사성 골손실을 들 수 있다.
본 발명은 또한 정형외과학, 특히 악안면 수술 또는 성형수술에 있어서 본 발명의 바이오재료의 용도에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 바이오재료는 류마티스학에 이용될 수도 있다.
본 발명은 또한 관절, 두개-안면-상악골의 선천성 또는 후천성 이상을 교정하거나 지지하기 위한 방법, 치아교정술, 외과수술 후 뼈 또는 관절뼈 대체술, 외상 또는 기타의 선천성 또는 후천성 이상증을 치료하는데 있어서 본 발명의 바이오재료를 사용하는 방법 및 기타 근육골격 임플란트, 특히 인공 및 합성 임플란트를 지지하는데 있어서의 본 발명의 바이오재료의 사용 방법에 관한 것이기도 하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 또는 동물의 몸의 골강(bone cavity)을 채우는데 있어서의 본 발명의 바이오재료의 용도에 관한 것이기도 하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 재건 수술 또는 미용 수술에 사용되기 위한 본 발명의 바이오재료에 관한 것이다. 본 발명의 바이오재료는 자가유래 또는 동종이형계의 것일 수 있다. 이것은 조직 이식에 이용될 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이오재료를 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 인간 또는 동물의 몸의 체강을 충전하는 방법에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 바이오재료는 동종이형계 임플란트 또는 자가 유래 임플란트에 사용될 수 있다.
바이오재료는 또한 비면역원성이며 면역조절 효과를 갖는 다는 점에서도 유리하다; 놀랍게도, 본 발명의 바이오재료에서, 미분화된 MSC의 면역조절 특성이 유지됨으로 해서, 본 발명의 바이오재료를 인간 또는 동물 체내에 이식하여도 염증 반응이 야기되지 않는다; 오히려, 바이오재료가 존재하면 이식 부위에서 염증이 경감된다.
본 발명의 바이오재료는 따라서 관절염 특히 염증성 관절염을 치료하는데 있어서, 항염 약물의 대체물로서 또는 상기 염증의 결과로 고통받는 환자에게 필요시되는 항염 약물의 양을 감소시키기 위한 수단으로서 적합하다.
본 발명의 바이오재료는 혈관신생을 자극하는데 있어서도 유리하다. 실제로, 본 발명의 바이오재료의 MSC는 새로운 혈관의 성장을 촉진하는 혈관의 내피성장인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)를 방출한다. 이러한 본 발명의 구체예는 뼈 또는 연골 형성에 최적의 환경을 제공하는 것이기 때문에 특히 유망하다.
정의
본 발명에서, "조직( tissue )"이라는 용어는 자연적인 인체 조직 내에서 유사한 기능을 수행하는, 상호연결된 세포들의 집합체를 가리킨다.
본 발명에서 "중간엽 줄기세포( mesenchymal stem cells )" 또는 MSC라는 용어는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)이다.
"지방( adipose )"이라는 용어는 지방 조직을 가리킨다. 지방 조직은 갈색, 황색 또는 백색 지방조직일 수 있다. 좋기로는, 지방 조직은 피하의 백색 지방 조직인 것이 바람직하다. 지방 조직에는 지방세포와 간질(stroma)이 있다. 지방조직은 동물 체내 전체에 걸쳐서 발견할 수 있다. 예를 들어, 포유동물에서, 지방조직은 그물막(omentum), 골수, 피하 공간, 지방 패드(예컨대 견갑 또는 슬개하 지방 패드), 및 대부분의 주변 장기(surroding most organs)에 존재한다. 지방조직으로부터 수득한 세포들은 1차 세포배양체 (primary cell culture) 또는 기원세포주(progenitor cell line)일 수 있다. 지방조직은 지방 조직을 갖는 여하한 장기로부터 유래된 것일 수 있다.
"지방조직-유래 세포"라는 용어는 지방조직에서 기원하는 세포를 가리킨다. 지방조직으로부터 분리된 초기 세포 집단은 비제한적인 예로 간질 혈관 분획(SVF: stromal vascular fraction) 세포를 비롯한 여러 종을 포함하는 이종의 세포 집단이다.
본 발명에서 "지방조직 중간엽 줄기세포" ( AMSC : adipose tissue mesenchymal stem cells )"라 함은 비제한적인 예로 지방세포, 골세포, 연골세포를 비롯하여 여러가지 다양한 세포 유형의 전구체로서 작용할 수 있는 지방조직으로부터 기원한 간질 세포를 가리킨다.
본 발명에서 "후기 계대 지방조직 중간엽 줄기세포( late passaged adipose tissue mesenchymal stem cells )"라 함은 초기 계대 세포(earlier passaged cells)에 비해 면역원성 특성을 덜 나타내는 세포를 가리킨다. 지방조직으로부터 유래한 간질 세포의 면역원성은 계대 수에 대응한다. 좋기로는 세포는 적어도 4차 계대까지, 더욱 좋기로는 적어도 6차 계대까지, 가장 좋기로는 적어도 8차 계대까지 계대시킨 세포들이 바람직하다.
본 발명에서 "생체적합성( biocompatible )"이라는 용어는 포유동물에 이식될 경우 그 포유동물에서 해로운 반응을 일으키지 않는 물질을 말한다. 생체적합성 물질은 개체로 도입될 경우, 그 개체에 대해 비독성이거나 무해한 것이며, 그 포유동물에서 아무런 면역 거부반응도 일으키지 않는 물질이다.
본 발명에서 "자가( autologous )"라는 용어는 어떤 생물학적 물질을 나중에 그 물질이 유래된 동일한 개체에 재도입하는 경우를 가리킬 때 사용된다.
본 발명에서 "동종이형(allogeneic)"이라는 용어는 생물학적 물질과 관련하여, 그 물질이 도입되는 개체와 동일한 종이지만 유전적으로는 다른 개체로부터 유래하는 경우에 사용된다.
본 발명에서 "이식편(graft)"이라는 용어는 일반적으로 결손을 대체, 보정 또는 달리 극복하고자 할 때, 개체에게 이식되는 세포, 조직 또는 기관을 의미한다. 이러한 조직 또는 기관은 동일한 개체로부터 기원하는 세포들로 구성될 수 있다; 이러한 그래프트는 본 발명에서 다음의 용어들과 호환 사용된다: "자가이식편(autograft)", "자가 트랜스플란트(autologous transplant)", "자가 임플란트(autologous implant)", 및 "자가이식편(autologous graft)". 동일한 종의 유전적으로 다른 개체로부터 유래된 세포들을 포함하는 이식편은 본 발명에서 다음의 용어들과 호환 사용된다: "동종이식편(allograft)", 동종이형 트랜스플란트(allogeneic transplant)", "동종이형 임플란트(allogeneic implant)", 및 "동종이형 이식편(allogeneic graft)". 어떤 개체의 그와 동일한 쌍둥이 개체로부터 유래된 이식편은 본 발명에서 "동인자간이식편(isograft)", "동계 트란스플란트(syngeneic transplant)", "동계 임플란트(syngeneic implant)" 또는 "동계 이식편(syngeneic graft)"라고 칭하기도 한다. "이종이식편(xenograft)", "이종 트랜스플란트(xenogeneic transplant)" 또는 "이종 임플란트(xenogeneic implant)"는 한 개체로부터 그와 다른 종의 개체로 이식되는 이식편을 가리킨다.
본 발명에서, "조직 이식( tissue grafting )" 및 "조직 재건( tissue reconstructing)"이라는 용어는 두 가지 모두, 예컨대 골 결손 또는 연골 결손과 같은 조직 결손을 치료 또는 경감시키기 위하여 개체에게 이식편을 이식하는 것을 가리킨다.
본 발명에서 어떤 질환, 결손, 장애 또는 질병을 "경감하다( alleviate )"라는 용어는 그 질환, 결손, 장애 또는 질병의 한가지 이상의 증상의 위중도를 감소시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, "치료하다( treat )"라는 용어는 해당 환자가, 그 질환, 결손, 장애 또는 해로운 상태 등의 증상이 나타나는 빈도의 감소를 경험하는 것을 의미한다.
본 발명에서, "치료적 유효량"이라는 용어는 해당 조성물이 투여되는 개체에게 유익한 효과를 제공하는데 충분한 조성물의 양을 가리킨다.
본 발명에서, "골 결손( bone defect )"이라는 용어는 뼈가 부러지거나, 골절되거나, 뼈 조각이 없어지거나 또는 다른 방식으로 손상된 경우를 가리킨다. 이러한 손상은 선천적 이상, 질병, 질병 치료, 외상 또는 골 감염에 기인하는 것일 수 있고, 급성 또는 만성적인 것일 수 있다. 예를 들어, 골 손실(bone loss)은 종양 절제에 기인할 수 있으므로, 골 결손을 야기한다. 골 결손의 비제한적인 예로는: 골절, 골/척추 기형, 골육종, 골수종, 골형성이상, 척추측만증, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유 골염, 섬유형성이상, 신장골 퇴행위축 및 뼈의 파젯씨병을 들 수 있다.
본 발명에서 "연골 결손( cartilage defect )"이라는 용어는 연골이 없어지거나, 그 양이 줄어들거나 또는 달리 손상된 것을 가리킨다. 연골 조직 결손은 선천적 이상, 질병, 질병의 치료 또는 외상에 기인한 것일 수 있으며 급성 또는 만성 (골관절염)일 수 있다.
본 발명에서, "골모세포 및/또는 연골생성 배지( osteoblastic and / or chondrogenic media )"라 함은 골모세포 및/또는 연골생성 세포의 성장과 분화를 촉진하는 배양 배지를 가리킨다.
좋기로는, 골형성은 표준 배지에 인간 또는 동물 혈청(좋기로는 소태아 또는 소 혈청(FCS, FBS)), 덱사메타손, 소듐 아스코르베이트, 소듐 디히드로포스페이트, 페니실린 및 스트렙토마이신을 공급함으로써 유도하는 것이 유리하다. 배지를 2일마다 갈아주면서 골형성 배지 중에 세포를 유지시킨다.
바람직한 실시상태에서, 골모세포용 배지는 표준배지, 좋기로는 10% v/v의 인간 혈청, 1μM의 덱사메타손, 50㎍/ml의 소듐 아스코르베이트, 36mg/ml의 소듐 디히드로포스페이트, 100U/ml의 페니실린, 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 보강된 DMEM인 것이 좋다.
연골생성은 좋기로는 표준 배지에 인간 또는 동물 혈청(좋기로는 소태아 또는 소 혈청(FCS, FBS)), 덱사메타손, TGF-B3, L-프롤린, 소듐 아스코르베이트, 소듐 디히드로포스페이트, 소듐 피루베이트, ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄, 예컨대 Sigma사로부터 구득가능한, 인슐린-트랜스페린-소듐 셀레나이트 배지 보강된 동결건조 분말), 페니실린 및 스트렙토마이신을 공급함으로써 유도하는 것이 좋다.
바람직한 연골생성용 배지는 10% v/v의 인간 혈청, 1μM의 덱사메타손, 10ng의 TGF-B3, 40㎍/ml의 L-프롤린, 50㎍/ml의 소듐 아스코르베이트, 36 mg/ml의 소듐 디히드로포스페이트, 100㎍/ml의 소듐 피루베이트, 100㎕/ml의 ITS (인슐린-트랜스페린 셀레늄, 예컨대 Sigma사로부터 구득가능한, 인슐린-트랜스페린-소듐 셀레나이트 배지 보강된 동결건조 분말), 100U/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 보강된 DMEM인 것이 좋다.
골형성 배지와 연골생성용 배지 두가지 모두로 적절한 표준 배지의 비제한적인 예로는 DMEM, EMEM, RPMI, 및 GMEM을 들 수 있으며, DMEM이 특히 바람직한 표준 배지이다.
본 발명에서, "스캐폴드(scaffold )"라 함은 비제한적인 예로서 막(film) (예컨대 3차원보다 실질적으로 큰 2차원 형태), 리본, 코드, 시트, 납작한 원반(flat diSC), 실린더, 구, 3차원 무정형 등의 형태를 갖는 구조를 가리킨다.
도 1. 도 1은 인간 혈청과 DBM이 보강된 골생성 배지에 있어서의 인간 AMSC의 분화를 도시한 도면이다. 조직 후퇴(tissue retraction)이 있는 다층 구조(A)와 상호연결조직(B)가 트리크롬 매슨 (Trichrom Masson) 염색(C)에 의해 발견되었다.
도 2. 도 2는 DBM이 부재 (A, B) 및 존재 (C, D, E)하는 연골생성 배지에 있어서 AMSC의 분화를 도시한 도면이다. 세포가 컨플루언트하게 자란(confluent cell) 단층 구조(A)가 DBM이 부재하는 연골생성 배지(B)에서 발달하였다. 이와 대조적으로, 세포조직 후퇴(D)에 의해 수득된 다층 구조(C)는 알시안 블루(Alcian blue) (E 및 장방형 김사(Giemsa) 염색)에 의해 염색된 연골생성-유사 매트릭스에 의해 구성된다.
도 3. 도 3은 DBM이 부재 (A, B, C) 및 존재 (D, E, F)하는 골형성용 배지에서 인간의 AMSC의 분화를 도시한 도면이다. 개개의 골 결절(알리자린 레드(Alizarin Red) 염색, B) 및 내결절(intra-nodule) 콜라겐 조직 (C)으로 만들어진 단층 구조(A)가 DBM이 없는 골형성 배지에서 발달하였다. 이와 대조적으로, 미네랄화된 콜라겐으로 만들어진 상호연결 조직 (E)를 갖는 세포 조직 후퇴 (D)는 미네랄화된 콜라겐(F, 검은색 Von Kossa 염색: 왼쪽 사각형) 과 오스테오칼신-발현 세포 (F, 오른쪽 사각형)으로 만들어졌다.
도 4. 도 4는 누드 래트의 척추 주변(para-vertebral) 근육에 이식된 지 60일 후, BM-MSC 및 AMSC 생존능의 변화를 보여준다. 중간엽 줄기세포들은 GFP 및 오스테오칼신 항체에 대한 면역조직학에 의해 검출되었다. 뼈 만을 단독으로 이식한 경우, GFP 발현 및 오스테오칼신 염색 세포가 발견되지 않았다. "MSC-인간 골 이식편"으로 만들어진 복합 이식편의 경우에는 GFP 및 오스테오칼신 세포가 검출되었다.
도 5. 도 5는 DBM이 보강된 골형성 배지 (A-C)와 연골생성 배지 (E-F)에서 인큐베이션된 AMSC에 대한 다차원 구조의 발달을 도시한 도면이다. 조직 후퇴 (A, D), DBM 상호-연결(B, E) 및 오스테오칼신 (C) 및 프로테오글리칸 (F) 단백질.
도 6. 도 6은 AMSC 대 BM-MSC의 혈관형성 잠재능을 도시한 도면이다. .시험관내 잠재능은 두 가지 세포 모두를 서로 다른 산소 농도(0.1, 3, 5 및 21% O2)에서 인큐베이션함으로써 발견하였다. AMSC는 각각의 O2 농도에서 입증되었고, BM-MSC에 비해 VEGF가 훨씬 더 많이 방출되었다.
실시예
실시예 1
본 발명에 따른 다차원 바이오재료의 제조
전임상 ( pre - clinical ) 모델에 있어서 AMSC 의 동물 소스
녹색 형광 트랜스제닉 돼지를 골수 및 지방세포 줄기세포의 도너(donor)로서 이용하였다(Brunetti D, Cloning Stem Ceils, eupb 2008). 동물들을 벨기에 농업 및 동물 보호청(Belgian Ministry of Agriculture and Animal Care)의 지침에 따라 가둬 키웠다. 모든 공정은 위니베르시트 카솔리끄 드 루뱅의 동물보호 지역 윤리위원회의 승인을 받아 실시하였다.
동물 기원의 AMSC 의 소스
콜라게나제(0.075g)를 행크 밸런스드 염용액(Hank's Balanced Salt Solution: 칼슘 이온 함유)에 재조성시켜 2-8℃에서 보관한 다음 분해한다. 지방 조직 (평균 15g)을 NaCl 0.009%로 3회 세척한 다음 페트리-디쉬에서 절단하여 혈관과 섬유 연결 조직을 제거한다. 분해하기 전에 지방을 칭량하고 효소가 함유된 50-ml 팔콘 시험관에 옮긴다. 37℃의 진탕 수조에 조직을 넣고 60분간 계속 교반한다. 분해 후, 콜라게나제를 50ml의 인간 혈청, L-글루타민(5ml) 및 5ml 항생제 (페니실린/스트렙토마이신)이 보강된 DMEM (500 ml)에서 불활성화시킨다. 수집된 조직을 1500 rpm에서 실온 (20-25℃)에서 10분간 원심분리한다. 성숙한 지방세포들이 함유된 상등액을 흡입한다. 10%의 인간 혈청과 항생제 (100 U/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신)가 보강된 DMEM으로 만들어진 증식용 배지(MP) 20 ml에 펠렛을 재현탁시키고
500㎛ 메쉬-스크린을 통해 여과한다. 수집된 조직(여과 후)을 실온(20-25℃)에서 10분간 1500 rpm으로 원심분리하고 펠렛을 MP에 재현탁시키자 간질 혈관 분획 (Stromal Vascular Fraction: SVF) 세포로서 동정되었다. 이 일차 세포(priary cells)의 초기 계대분을 0차 계대 (P0)이라 칭한다. 5% C02, 37℃에서 24-48 시간 인큐베이션한 후, 배양체를 PBS로 세척하고 MP에서 P4 (4차 계대)까지 유지시킨 다음 특정 배지 (하기 내용 참조)에서 분화시킨다.
인간 기원의 AMSC 의 소스
인간 지방 조직 (피하 지방 조직 소편, 1-2g, n=4)을 일반적인 외과 수술 (복부 수술 및 정형외과 수술) 도중 절제한 다음, 차가운 4℃ 생리용액에서 실험을 위해 보관하였다. 돼지의 지방 조직 프로세싱과 관련하여 전술한 바와 같이 이 인간의 지방을 분해하였다. 분해 후, 인간 AMSC를 MP에서 배양하고 (i) 소 태아 혈청(10% v/v) 또는 (ii) 인간 혈청 (10% v/v)이 보강된 특정 배지 (추출 조성물에 대해서는 하기 내용 참조)에서 분화시켰다. FBS를 함유하는 분화용 배지와 인간 혈청을 함유하는 분화용 배지의 두가지 모두에서 AMSC가 분화한 것으로 관찰되었다.
탈미네랄화된 골 매트릭스의 소스
인간의 탈미네랄화된 골 매트릭스는 유니버시티 티슈 뱅크 (Cliniques universitares Saint-Luc, 벨기에 브뤼셀)에 의해 제공되었으며, 다기관 인간 도너로부터 생산되었다. 탈미네랄화 처리 (하기 설명 참조)를 위해 대퇴골과 정강이뼈의 골간을 절단 및 분쇄하여 l000 ㎛ 미만의 입자로 만들었다.
인간 도너들로부터 선택된 피질골을 분쇄함으로써 인간의 DBM을 수행한다. 먼저, 인간의 골 조직을 밤새 아세톤(99%) 배쓰에서 처리하여 탈지시킨 다음 탈미네랄화된 물로 2 시간 세척한다. 실온에서 교반하면서 HCL 0.6 N에 3시간 침지시킴으로써 (뼈 1 그램 당 20 ml 용액) 칼슘을 제거한다. 이어서, 탈미네랄화된 뼈 분말을 2 시간 동안 탈미네랄수로 헹구고 pH를 조절한다. pH가 너무 산성이면, 교반 하에 DBM을 0.1M 포스페이트 용액으로 완충시킨다. 마지막으로, DBM을 건조 및 칭량한다. DBM을 냉동 온도에서 감마선을 25 kGray 조사하여 멸균처리한다.
줄기세포 분화 및 특징화
지방세포 생성( adipogenesis )
MP를, 20% 인간 혈청, L-글루타민 (5 ml), 소의 인슐린(5㎍/m1), 인도메타신 (50㎛), 3-이소부틸-1-메틸-잔틴(IBMX, 0.5 mM), 덱사메타손 (1 ㎛) 및 페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신 100㎍/ml가 보강된 Iscove 변형 둘베코 배지(Dulbecco's Medium)로 이루어진 지방세포 유도 배지로 대체함으로써, AMSC의 컨플루언트 배양을 유도하였다 (Mauney JR, Biomaterials 2005, vol 26: 6167). 배지를 2일마다 갈아주면서 세포들을 지방세포 생성 배지에서 유지시켰다. 배양체를 PBS로 헹구고 포르말린 용액에 고정시킨 다음, 천연 지질을 오일 레드로 염색함으로써, 지방세포 분화 정도를 조사한다.
골형성
인간 혈청(10% v/v), 덱사메타손 (l㎛), 소듐 아스코르베이트(50㎍/ml), 소듐 디히드로포스페이트(36mg/ml), 페니실린 (100U/ml), 및 스트렙토마이신(100㎍/ml)으로 DMEM을 보강함으로써 얻은 골형성용 배지를 이용하여 AMSC의 컨플루언트 배양을 유도하였다 (도3A, 도3B, 도3C 참조). 배지를 2일마다 갈아주면서 세포들을 골형성 배지에 유지시켰다. 세포를 PBS로 헹구고 70% 에탄올에 고정시킨 다음 알리자린 레드를 이용한 칼슘 포스페이트 염색에 의해 골형성 분화에 대해 조사하였다. 또한, 오스테오칼신에 대한 면역조직화학 및 von Kossa 염색을 실시하여 "뼈"의 표현형을 확인하였다 (도 4 참조).
연골형성
인간 혈청(10% v/v), 덱사메타손 (l㎛), TGF-B3 (l0ng), L-프롤린 (40㎍/ml), 소듐 아스코르베이트 (50㎍/ml), 소듐 디히드로포스페이트 (36 mg/ml), 소듐 피루베이트 (100㎍/ml), ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄, 예컨대, Sigma사로부터 구득가능한, 인슐린-트랜스페린-소듐 셀레나이트 배지 보강된 동결건조 분말) (100㎍/ml), 페니실린 (100U/ml), 및 스트렙토마이신 (100㎍/ml)으로 DMEM을 보강하여 얻은 연골형성 배지를 이용하여 AMSC의 컨플루언트 배양을 유도하여 연골 생성을 수행하였다(Taipaleenmaki H, Experimental Cell Research 2008 vol 314: 2400). 2일마다 배지를 갈아주면서 세포들을 연골생성용 배지에서 유지시켰다.
AMSC 성장에 미치는 분화 배지의 영향 (골형성 및 연골형성)
성장
세포 및 배양 조건.
AMSC를, 약 85-90% 컨플루언스가 될 때까지, 증식용 배지 (MP)에서 성장시켜 37℃ (95% 공기 및 5% C02)에서 유지시켰다. 배지를 2일마다 갈아주었다. 세포독성 분석을 위해 세포를 현탁시키기 위해, 세포들을 0.25% 트립신-EDTA 혼합물과 함께 배양 플라스크로부터 37℃에서 10분간 세포들을 탈착시키고 배양 배지에 재현탁시켰다. MTS를 위해 세포들을 96-웰 마이크로플레이트에 (3-[4,5 디메틸티아졸-2-일]-5-[3-카르복시메톡시페닐]-2-[4-설포페닐]-2H-테트라졸륨 브로마이드)로 1 x 104 세포/웰로 접종하였다. 이들을 5일 동안 여러가지 시험 배지: (i) MP, (ii) 골형성 배지 및 (iii) 연골형성 배지에 노출시키기에 앞서서 37℃에서 96 시간 동안 컨플루언시 가깝게 성장시켰다.
MTS 분석. 추출물-세포 접촉 24시간 후, 20 ㎕의 "Cell titer 96
Figure 112012000973646-pct00001
AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay" (Promega, Madison, WI)를, 100 ㎕의 추출 배지를 함유하는 각각의 웰에 직접 첨가하였다. 세포들을 37℃에서 3 시간동안 인큐베이션시켰다. 마이크로타이터 플레이트 분광광도계를 이용하여 492 nm에서 흡수도를 측정하였다 (Multiskan Ex, Labsystems, Brussels, Belgium). 참고 파장은 690 nm이었다. 광학 밀도차 OD= OD492nm-OD690nm를 평가하였다.
특이적인 분화용 배지를 사용한 경우에만 분화가 일어난 것으로 관찰되었다.
다차원 구조의 발달
특정 배지(골형성 또는 연골 형성 배지)에서 AMSC를 인큐베이션시킨 후 (4차 서브컬쳐 계대), 탈미네랄화시킨 골 매트릭스(demineralized bone matrix: DBM)을 골형성 및 연골형성 배지에 보강하여 다시 20일 경과시킴으로써 다차원 구조(DBM 1 mg/분화된 배지 1 ml)를 얻었다. DBM을 제거하지 않고 이 배지를 2일마다 갈아주었다.
분화 말기에, 배양체들을 PBS로 헹구고, 오스테오칼신, 알시안 블루(Alcian Blue) 및 김사 염색을 위한 조직학 연구에 의한 골 및 연골형성 특징화를 위한 포르말린 용액에 고정시켰다. 특징 (도 2-C,D,E, 도 3-D,E,F).
세포 펠릿을 4% 파라포름알데히드에 밤새 고정시켰다. 시리즈 섹션들(5 ㎛ 두께)을 탈미네랄수와 함께 유리 슬라이드에 올린 다음, 37℃에서 12 시간 건조시키고 면역분류 검사 또는 조직화학 검사를 실시하였다. 섹션들을 과산화수소(0.3% H202)에 30분간 넣어둠으로써 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. Tris-Triton 완충염(TBS-0.05M, 0.05%, pH=7.4)으로 세척한 후, 슬라이드들을 실온에서 정상적인 염소 혈청(1:10; BIOSYS, Boussens, France)과 함께 30분간 인큐베이션시킨 다음, 오스테오칼신을 염색하기 위한 1차 항체 (항오스테오칼신 모노클로날 마우스 항체; ABCAM, Cambridge, UK)으로 1:100으로 희석시켜 밤새 인큐베이션시켰다. Tris-TBS로 세척한 후, 슬라이드를 2차 항마우스 IgG와 함께 1 시간 동안 인큐베이션시켜 면역퍼옥시다제 검사를 실시하였다.
모든 유형의 미분화/분화 세포에 대해 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrom)을 각 샘플에 대해 실시함으로써 콜라겐 구조를 조사하였다. 증식 및 분화(골형성, 연골형성 및 지방형성) 배지에서 인큐베이션시킨 섬유아세포들을 음성 대조군으로서 사용하였다.
프로테오글리칸-분비 연골세포들을 알시안 블루와 김사 색소로 염색하였다.
AMSC를 피코에리스린(PE)와 컨쥬게이션된 포화량의 모노클로날 CD90 항체로 염색하였다. 셀리퀘스트(Celiquest) 소프트웨어를 이용, 세포유동분석기(FACScan, BD Biosciences)에 의해 적어도 15,000회 이상 분석하였다.
골형성 분화 배지와 연골형성 분화 배지의 두가지 모두에 있어서, 보강된 DMB은 세포 구조, 콜라겐 합성 및 탈미네랄화된 골 매트릭스 입자의 재그룹화에 의해 3차원 구조의 발달을 유도시켰다(도 5. A-E). 현미경 관찰에 의하면, 오스테오칼신 발현과 프로테오글리칸 분비가 골형성 조건(도 5C) 및 연골형성 조건 (도 5F)에서 각각 나타났다.
생체내 이식 및 조직 분석
골모세포 분화된 GFP-돼지 AMSC를 유니버시티 티슈 뱅크(University clinical hospital Saint-Luc, Brussels, Belgium)가 제공한 인간의 처리된/탈세포화 골 매트릭스(Dufrane D, Eur Cell Mater, vol 1: 52, 2001)에 접종하였다. 이 복합 이식편을 누드 래트 (이식편 2개/수혜자 및 n=lO) (수컷, 6-8주령)의 척추 주변부에 피하 이식하였다. 60일 후, 동물들을 희생시키고 임플란트를 적출하여 면역조직화학 검사를 실시하였다. 이어서 임플란트를 HCl에서 탈회처리(decalcified), 가공하여 파라핀에 고정시키고 절단하였다(5 ㎛). 이어서 오스테오칼신과 "Green Fluorescent Protein" (모노클로날 항체)의 Masson's Trichrom 및 면역조직화학검사를 실시하였다.
실시예 2:
지방 중간엽 줄기세포로부터 기원한 다차원 골유사 이식편의 잠재능
재료 및 방법
돼지와 인간의 AMSC 분리
이 실험을 위해서, 돼지와 인간의 AMSC를 실시예 1에 설명한 바와 같이 분리하였다.
AMSC 의 혈관형성 잠재능
시험관 내 ( In vitro )
정상적인 산소 조건과 저산소 조건 하에서 줄기 세포의 예비 혈관형성 능력(proangiogenic capacities)을 시험관내 평가하기 위해, 돼지의 골수-MSC 및 지방-MSC를 0.1, 3, 5 및 21% O2 농도의 저산소 챔버에서 24, 48 및 72시간 동안 넣어두고 ELISA 검사에 의해 VEGF의 배출량을 정량하였다.
탈미네랄화된 골 매트릭스 를 이용한 다차원 구조의 최적화
MP에 소의 태아 혈청(FBS, 10% v/v), 덱사메타손(1㎛), 소듐 아스코르베이트(50㎍/ml), 소듐 디히드로포스페이트 및 페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신 100㎍/ml을 보강함으로써 AMSC로 골 형성을 유도하였다. 세포들을 골형성 배지에서 유지하면서 2일 마다 배지를 갈아주었다(Post et Al. Bone 2008, 43,1; 32-39, Qu et Al In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2007; 43; 95-100). 배양체를 PBS로 헹구고 70% 에탄올에 고정시킨 다음 칼슘 포스페이트와 알리자린 레드 염색을 이용하여 골형성 분화를 조사하였다. 또한, 오스테오칼신 및 폰 코사(von Kossa) 염색을 위한 면역조직화학분석을 실시하여 "뼈"의 표현형을 확인하였다.
유니버시티 티슈 뱅크(University clinical hospital St-Luc, Brussels, Belgium)가 제공한 "탈미네랄화된 골 매트릭스 (DBM)"의 존재 하에 AMSC와 함께 인큐베이션시킴으로써 다차원 구조를 실시하였다. 탈미네랄화된 골 매트랙스의 제조는 실싱메 1의 탈미네랄화된 골 매트릭스의 소스에 개시되어 있다.
매트릭스
DBM의 효능은 다음, 즉: (i) 탈미네랄화 공정 후 잔류 칼슘 농도를 측정하고 (>97%의 [칼슘] 감소) (ii) 이식한지 1개월 후 생체내(누드 래트에 있어서 골형성 능력을 측정함으로써 평가한다.
평균 15-18일 동안 골모세포용 배지에서 AMSC(4차 서브컬쳐 계대)를 인큐베이션한 후, 여러 가지 농도(0/1/5/10 및 20 mg/ml)의 DBM을 특이적인 분화용 배지에 첨가한다. 배지들을 2일마다 갈아주되 DBM은 제거하지 않는다. 3-D 구조의 정도, 세포 구조, 오스테오칼신 발현 및 폰 코사(Von Kossa) 염색 (칼슘 침착에 대한 염색)을 평가하여 3-D 골 유사구조에 적합한 DBM 농도를 선정한다.
이식 공정 및 탈미네랄화된 골 매트릭스와 AMSC 를 이용한 후속적인 다차원 구조화
(다차원 구조에 최적인) 최적의 DBM 농도를 갖는, 골형성 배양체(4차 계대)로부터 얻은 AMSC를 이식을 위해 수집하였다.
- 누드 래트 (Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, Massachusetts, USA)를 수혜자로서 이용하였다. 세포를 척추 주변 근육에 이식하였다. 척추를 중심으로 길이 방향으로 절개하여 피하 조직을 절개하여 근막을 노출시켰다. 다차원 구조를 직접 (유니버시티 티슈 뱅크, Universite Catholique de Louvain, Brussels, Belgium) 척추 주변의 근육 조직에 이식하였다. 동일한 래트의 컨트로 측면 척추부위 근육에 동결건조된 암성 뼈(cancellous bone)만을 이식함으로써 대조군을 만들었다. 재흡착성이 아닌 봉합사를 이용하여 근막을 봉입하여 이식 부위가 쉽게 아물도록 하였다. 동물들을 희생시키고 이식 30일 후에 전신 마취 하에 T61 심장내주사(Intervet Int. GmbH-D, Germany) 수단에 의해 절제하였다. 이어서 임플란트들을 수확하고 조직학 및 마이크로 컴퓨터화 단층촬영을 실시하였다.
- 돼지 수혜자 2종의 서로 다른 외과수술 모델에서 이식편을 시험한다. 본 발명자들은: (i) 대퇴 피질 골 결손에 있어서의 이들 식편들의 브릿징 능력과 (ii) 전방경유 요추부 추체간 유합술(anterior lumbar interbody fusion: ALIF)에 있어서의 이들의 융합능을 분석하였다..
- (i) 피질골 결손 모델은 실험 정형외과 수술에서 널리 알려진 모델로서 본 발명자들의 실험실에서 주로 씨. 델로이(C. Delloye) 교수의 작업을 통해 연구되었다. 장골 상에 부분 골간 골 결손이 발생된 유사한 모델로 돼지들을 이용한 다음 이식편 재료로 충전시키거나 또는 텅 빈 상태로 방치한다. 본 발명자들의 실험에서는 돼지들의 양쪽 대퇴골 모두에 대해 시술한다. 1.5 - cm의 피질 골 결손을 만들고 표준 4.5-mm의 티타늄 잠금 압착판으로 안정화시킨다. 한쪽 대퇴 결손부는 텅 빈 상태로 방치하고 다른쪽 다리에는 AMSC 이식편을 이식한다.
- (ii) ALIF 모델은 돼지의 실험적 외과술에서 잘 확립된 모델이다. 본 발명의 기술은 후외측부 접근에 의한 4-레벨 ALIF 공정으로 이루어진다. 추체간 폴리에틸에틸케톤(PEEK) 수단에 의해 유합을 수행한다. 추간판을 열고 속질핵을 제거한 다음 연골을 재확장시켜(reamed) 연골하 골을 노출시키고 PEEK 케이지를 삽입한다. 이들 케이지들은 속이 빈 것이지만 여러가지 실험 물질로 충전될 수 있다. 이 경우, 각각의 레벨은 서로 다른 이식편 조직을 이식받아, 4가지 서로 다른 그룹을 형성한다; 하나의 케이지는 음성 대조군으로서 텅 빈 채로 방치되고, 또 다른 케이지는 동결건조 조사된 암성 골(임상 분야에서 흔히 이용된다)로 충전되며, 또 다른 케이지는 자가 암성 골 이식편(유합 공정에서 절대표준으로 여겨지며 따라서 본 발명에서 양성 대조군이다)을 함유하고, 마지막 케이지는 AMSC 이식편을 함유한다. 동물들을 희생시키고 이식 7주일 후에 전신 마취 하에 T61 심장내주사(Intervet Int. GmbH-D, Germany) 수단에 의해 외식하였다. 이어서 임플란트들을 수확하고 조직학 및 마이크로 컴퓨터화 단층촬영을 실시하였다.
후속 처리 ( Follow - up )
누드 래트: 외식된(explanted) 임플란트들을 HCl에서 탈회 처리하고, 가공하여 파라핀에 내장한 다음 절제하였다(5 ㎛). 조직학 염색을 위해, 헤말룬 에오신(Hemalun Eosin), Masson's Green Trichrom, 오스테오칼신 및 폰 코사(Von Kossa) 염색에 의한 표준 착색화를 실시하였다. Envision Rsystem 모노클로날 항체(Dako, Denmark)에 의해 나타난 모노클로날 항체(OC4-30, Abcam, Cambrige)를 이용하여 오스테오칼신을 염색하였다. 수집된 임플란트들의 미세구조를 pQCT (말초 정량 컴퓨터화 단층촬영 기기, 모델 XCT Research SA, Stratec, Pforzheim, Germany)를 이용하여 분석하였다. 각각의 임플란트의 여러가지 슬라이드에 대해 피질 및 총 골밀도를 측정하였다. 폰 빌레브란트(von Willebrandt staining) 염색 후에 새로 형성된 혈관을 정량함으로써 생체내 혈관신생의 정량화를 수행하였다 (상기 내용 참조).
돼지:
돼지들을 개별적으로 가두어 두고 물과 음식은 맘껏 이용할 수 있게 하였다. 실험 동물을 위한 표준 프로토콜에 따라 수술후 케어 및 진통 케어를 실시한다. 자가이식편(autograft) 모델의 경우, 생물학적 후속 처리(follow-up)는 혈액 샘플에 의한 염증 평가로 이루어진다. 방사능을 이용한 후속 처리를 수행하면 생체내 골형성을 이식 후 제1주, 5주 및 7주일 경과 시점에서 컴퓨터와 단층촬영(CT) 스캐닝에 의해 비교할 수 있다. 임상 CT 스캔의 해상도가 높고 다중평면 재구조화가 무척 정밀하기 때문에 본 발명자들은 생체내의 PEEK 케이지의 함량을 분석할 수 있었으며, 이에 따라, 유합 공정도 평가할 수 있게 되었다.
1회 스캔 스윕을 통해 수집된 모든 정보를 이용하여, 동일한 공정을 대퇴부에 대해 시행한다. 마이크로-CT를 통해 외식된 이식편을 가공함으로써 안락사시킨 후 보다 좋은 해상도가 얻어진다. 외식된 이식편에 대한 조직학 및 면역화학적 조사를 진행하여 새로운 골 형성과 이식편 재혈관화(혈관 내피성장인자, CD51, 폰 윌레브란트 인자), 경화요법(오스테오칼신) 및 미네랄화 (von Kossa)를 천연 피질 브릿징 및 유합 능력과 비교하였다.
탈회 공정(decalcification process)에 의해 이식된 재료의 조직학적 및 면역조직화학 연구를 수행할 수 있다. 조직학, 조직형태학 및 마이크로라디오그래피는 조직을 석회화 상태로 유지시킬 것을 필요로 한다; 따라서, 비-탈회 공정 역시도 필수적이다.
통계
그룹들 간의 차이의 통계적 유의성을 본페로니 사후연구)(Bonferroni's post hoc test)를 이용하여 일원 분산 분석법에 의해 검사하였다. 통계 조사는 Systat 버젼 8.0을 이용하여 수행하였다. p　<　0.05이면 그 차이가 유의적인 것으로 해석하였다.
결과
DBM 농도가 최적인 다차원 구조에 대한 개념 증거: 시험관내 골 유사 구조
AMSC 세포 이식을 위한 생물학적 지지체를 회피하기 위해, DBM과 조합하여 다차원 구조물을 개발하였다. AMSC와의 공-인큐베이션에 있어서 시험관내 세포 리모델링을 달성하기 위해서는, 누드 래트에 있어서 골형성 분화를 촉진하는 생체내 능력을 갖는 탈미네랄화된 골 매트릭스(평균 입경 700㎛) (AMSC와의 접촉시 사용 전에 요구되는 품질검사)가 필요하다.
두가지 골형성 분화 배지 모두에 있어서, 보강된-DBM은, DBM이 없이 AMSC 단독인 경우에 비해, 세포 수축, 콜라겐 합성 및 DBM 입자의 재그룹화에 의해 3차원 구조의 발달을 유도하였다. 다차원 구조의 발달을 최적화시키기 위해, 점진적인 DBM 투여량을 조사하였다. 극히 높은 농도 (20 mg/ml 초과)는 채택가능하지 않은 것으로 나타났다. 1 mg/ml으로는 외과수술용 이식편 핸들링을 위한 최적의 3-D 구조를 만들 수 없었다. 이와 대조적으로, 5 및 10 mg/ml은 외과수술 용도 및 이식편 제거를 위한 최적의 조직 수축능(retraction)을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 현미경 관찰에 의하면, 이들 후자의 DBM 농도의 경우, 오스테오칼신 발현 및 미네랄화 공정(Von Kossa 염색)이 나타났다. 골형성 조건으로 AMSC를 갖는 3차원 구조를 얻으려면 평균 20 ± 3일간의 DBM과의 공-인큐베이션이 필요하다.
DBM 농도가 최적인 다차원 구조에 대한 개념 증거: 생체내 골형성
누드 래트
누드 래트에서 30일간 이식 후, DBM 없이 AMSC만으로는 골 형성 구조물의 형성이 유도되지 않았다. 오로지 폰 코사(Von Kossa)에 의해 염색된 바와 같은 소형 골 결절(오스테오칼신 +)만이 누드 래트의 근육 골격 내에서 드문 드문 분포하였다. 이와 대조적으로, 다차원 구조물의 이식은 이식 부위에 우수하게 국소화되었다. 이식한 지 30일 후, DBM 입자 내에 현미경적으로 조밀한 연결 조직을 갖는 근육 내에서 컴팩트하고/강한 골 유사 구조물이 발견되었다. 골 유사 구조물은 오스테오칼신 염색 연결 조직 및 미네랄화 공정과 함께 발견되었다.
돼지 수혜자( pig recipients )
이식한 지 5 주일 후, CT-스캔 검사에 의하면, 돼지에서, 대퇴골 결손(무처리군)에서 아무런 자발적 강화(consolidation)가 발견되지 않았다. 스캐폴드 없이도 골 결손부 내로 다차원 구조물을 병합시키는 것은 용이하였다. 이 후자의 이식편은 이식 후 (이식 후 5주일)의 초기 기간 동안 골 강화를 유의적으로 향상시키며 골 유사 구조는 천연 피질골 결손부를 연결시켜 주었다.
DBM 농도가 최적인 다차원 구조에 대한 개념 증거: 생체내 혈관형성
정상적인 산소 조건 및 저산소 조건 하에서 줄기 세포의 시험관내 예비혈관형성 능력을 평가하기 위해, 전임상적인 돼지 골수-MSC 및 지방 MSC를 24, 48 및 72 시간 동안 0.1, 3, 5 및 21% O2의 저산소 챔버에 넣고 ELISA에 의해 VEGF의 방출을 정량하였다. 정상산소 조건에서보다 저산소 조건에서 BM-MSC는 VEGF를 더 많이 배출하였으며 이러한 배출은 24 시간에서보다 48 시간 및 72 시간에서 VEGF를 보다 높은 수준으로 유지되었다(p<0.05). 이와 대조적으로, AMSC로부터의 VEGF 방출은 다른 배양 조건들에서는 유사하였으나 BM-MSC 보다 AMSC에 의해 훨씬 더 높은 수준의 VEGF가 방출되었다(각각, 11274±679 대 2364±94 pg/ml; p<0.05) (도 6).
이러한 결과는 BM-MSC 및 AMSC 이식 후 생체내에서 확인되었다. BM-MSC에 비해 골형성 AMSC의 경우 훨씬 더 높은 혈관신생이 관찰되었다 (p<0.05).

Claims (18)

  1. 콜라겐 함유 연결조직을 포함하는 분화된 중간엽 줄기세포 (MSC: mesenchymal stem cells) 조직 및 상기 분화된 MSC 조직 내에 분산된 탈미네랄화된 골 매트릭스를 포함하고,
    상기 MSC는 지방조직 유래형 줄기세포인 것인, 다차원 구조를 갖는 바이오재료.
  2. 제1항에 있어서, 분화된 MSC 조직을 만들기 위해 사용된 MSC는 인간 또는 동물로부터 유래한 것인 바이오재료.
  3. 제1항에 있어서, MSC는 후기 계대(late passaged) 지방조직 유래형 줄기세포인 것인 바이오재료.
  4. 제1항에 있어서, 3차원인 것인 바이오재료.
  5. 제1항에 있어서,
    미네랄 코팅된 골세포를 포함하는 것이 특징인 바이오재료.
  6. 제1항에 있어서, 콜라겐과 프로테오글리칸을 포함하는 세포외 매트릭스 및 연골세포를 포함하는 것이 특징인 바이오재료.
  7. 제1항에 있어서, 탈미네랄화된 골 매트릭스는 평균 입경이 50 - 2500 ㎛인 입자 형태로 존재하는 것인 바이오재료.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 바이오재료를 포함하는 임플란트.
  9. 콜라겐 함유 연결조직을 포함하는 분화된 중간엽 줄기세포 (MSC: mesenchymal stem cells) 조직 및 상기 분화된 MSC 조직 내에 분산된 탈미네랄화된 골 매트릭스를 포함하고,
    상기 MSC는 지방조직 유래형 줄기세포인 것인 다차원 구조를 갖는 바이오재료의 제조방법으로서,
    골모세포 및/또는 연골생성세포의 성장 및 분화를 촉진하는 배양 배지에서 15-25일 동안 MSC를 인큐베이션한 다음 상기 배지에 탈미네랄화된 골 매트릭스를 첨가하여 다시 15-30일 동안 추가로 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 골모세포의 성장 및 분화를 촉진하는 배양 배지는 인간의 혈청, 덱사메타손, 소듐 아스코르베이트, 소듐 디히드로포스페이트, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보강된 표준 배지인 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 연골생성세포의 성장 및 분화를 촉진하는 배양 배지는 인간 혈청, 덱사메타손, TGF-B3, L-프롤린, 소듐 아스코르베이트, 소듐 디히드로포스페이트, 소듐 피루베이트, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보강된 표준 배지인 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 탈미네랄화된 골 매트릭스는 5 내지 10 mg/ml의 양으로 배지에 첨가되는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 수득되는 것인다차원 바이오재료.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 바이오재료를 포함하는 의료 기구.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 바이오재료 및 고정 수단을 포함하여 이루어지는 키트.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 골 손상 또는 연골 손상을 경감 또는 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 것인 바이오재료.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 관절, 두개-안면-상악골의 선천성 또는 후천성 이상을 교정하거나 지지하기 위한 방법, 치아교정술, 외과수술 후 뼈 또는 관절뼈 대체술, 외상 또는 선천성 또는 후천성 이상증의 치료에 사용하기 위한, 또는 근육골격 임플란트를 지지하는데 사용하기 위한 것인 바이오재료.
  18. 제17항에 있어서, 상기 근육골격 임플란트는 인공 및 합성 임플란트인 것인 바이오재료.
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