JPH08502417A

JPH08502417A - ヘモフィルス外膜タンパク質

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Publication number: JPH08502417A
Application number: JP6512608A
Authority: JP
Inventors: チョン、ペレ; トーマス、ウェイン; ヤン、ヤン−ピン; ルースモア、シーナ; シア、ドゥオー、ユアン、チャールズ; クライン、マイケル
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1992-11-23
Filing date: 1993-11-23
Publication date: 1996-03-19
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: DE69333802D1; US6264954B1; DE69333802T8; CA2149319C; JP2907552B2; US6013514A; EP0668916B1; EP0668916A1; WO1994012641A1; US6083743A; DE69333802T2; GB9224584D0; BR9307510A; RU2141528C1; AU683435B2; ATE294864T1; CA2149319A1; AU5556594A

Abstract

(57)【要約】へモフィルスのＤ１５外膜タンパクの少なくとも一部をコード化したインフルエンザ菌の特定株からの精製および単離した核酸を提供する。この核酸は、診断および医療目的に、へモフィルスに関連した汚染物を含まないペプチド、ボリペプチドおよびタンパクの製造に使用される。さらに、この核酸は、へモフィルス感染の診断にも使用される。Ｄ１５外膜タンパクまたはペプチドの免疫投与により得られる免疫血清も診断および医療の目的に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】ヘモフィルス外膜タンパク質発明の分野本発明は、分子遺伝学の分野に関し、詳しくはヘモフィルスの外膜タンパクＤ１５のクローニングに関する。発明の背景インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）ｂ型（Ｈｉｂ）は、５才以下の幼児の細菌性髄膜炎の主要な原因である。この疾病に対する防御抗体は、生物体の莢膜多糖類により誘発され、また精製したポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）を抗原として用いるワクチンが開発された。このワクチンは成人および２４カ月齢以上の幼児に対して９０％以上の防御を与えるが、２４カ月齢以下の幼児に対しては効果がない〔ザングウイルら（Zangwill et al）］（引用文献は、本明細書の末尾にある参考文献表に記載してある）。他の多糖類抗原と同様に、ＰＲＰはＴヘルパー細胞の増殖を誘発せず、再免疫投与してもブースター反応も記憶細胞の増加も起こさない。ＰＲＰ多糖類をタンパクキャリヤーと複合させると、ワクチンにＴ細胞依存特性を与え、ＰＲＰ抗原に対する免疫反応を著しく高める。最近では４種のＰＲＰキャリヤー複合ワクチンが入手できる。これらは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたは髄膜炎菌外膜タンパクと複合させたｂ型インフルエンザ菌莢膜多糖類を基とするワクチンである。〔ザングウイルら（Zangwill et al）１９９３が総説〕。しかし、最近のヘマトフィルス複合ワクチンは、ｂ型インフルエンザ菌により起きる髄膜炎に対してのみ防御性がある。これらは、その他の侵入性型別可能の株（ａ型およびｃ型）に対して、またさらに重要なことには、産後および新生児セプシス、肺炎および中耳炎の共通の原因となる型別不能性（ＮＴＨｉ）株に対して防御性がない。米国内だけでも、中耳炎の処置のために、抗生物質および外科処理、例えば扁桃摘出、アデノイド切除および鼓室管の挿入に一年間に１０〜２０億ドルが費やされている。２〜６月齢グループおよびある程度危険性の高いグループにおけるインフルエンザ菌に関連した疾病に対して共通した高い防御性を得るために、保存性があり交差反応性の非莢膜性インフルエンザ菌免疫原が望ましい。疾病に対する免疫を誘発する方法は常に改善されており、現在ではサブユニットおよび性質のよく分かっている物質を抗原として利用する傾向にある。このために、ある種の未変性免疫原により起きる可能性がある副作用を低下あるいは除去し、一方、疾病に対する防御性を与えるためにその免疫原性を保存する方法が試みられている。従って、交差反応性外膜タンパク、フラグメント、類似体および／またはこれらに関連するペプチドを防御性抗原として用いるヘモフィルスに対する共通ワクチンの開発に非常に関心が持たれている。この抗原は、通常のｂ型インフルエンザ菌複合ワクチンに追加免疫原として組み込んでも、インフルエンザ菌莢膜多糖類に対する自己由来キャリヤーとして用いてもよい。インフルエンザ菌の型別不能およびｂ型株中に存在する高分子量外膜タンパクＤ１５が、交差反応性抗原として同定されている〔トーマスら（Thomas et al.，199 0）〕。Ｄ１５は、自然の状態で細胞表面露出性と考えられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して約８０ｋＤａの分子量を有している。診断、免疫投与および診断用および免疫学的試薬のためには、このＤ１５外膜タンパクおよびその部分に相当するペプチドをコード化したＤＮＡ分子の配列を与えることが望ましい。ヘモフィルスにより起きる疾病は重く、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管支炎などの疾病の予防、検出および処置のための改善された方法が要求されている。発明の概略本発明は、ヘモフィルス属のＤ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有する精製および単離した核酸分子の提供を目的とする。ヘモフィルス属のＤ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有する核酸分子は、ヘモフィルス株の特異的検出およびヘモフィルス感染の診断に使用される。Ｄ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有するＤＮＡのような精製および単離した核酸分子は、精製および単離したＤ１５外膜タンパクを経済的な方法で提供する組換えＤＮＡ手段によるＤ１５遺伝子の発現にも使用される。Ｄ１５外膜タンパクまたはそのフラグメントまたはその類似体は、ヘモフィルスにより起きる疾病に対するワクチンの製造、ヘモフィルス感染の診断および免疫学的試薬の生成のための手段として用いられる。本発明の態様に従って製造されたＤ１５外膜タンパクに対して生成するモノーおよびポリクロナール免疫血清（抗体）は、ヘモフィルス感染の診断、ヘモフィルスの特異的検出（例えばインビトロおよびインビボ検査の場合）およびヘモフィルス感染により起きる疾病の処置に使用される。Ｄ１５外膜タンパクの部分に相当するペプチドまたはその類似体は、ヘモフィルスにより起きる疾病に対するワクチンの製進ヘモフィルス感染の診断および免疫各的試薬の生成のための手段として用いられる。本発明の態様により製造されたこれらのペプチドに対して生成したモノーおよびポリクロナール免疫血清は、ヘモフィルス感染の診断、ヘモフィルスの特異的検出（例えばインビトロおよびインビボ検査の場合）およびヘモフィルス感染により起きる疾病の処置として受動免疫投与に用いられる。従って、本発明の一つの態様では、その分子がＤ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有する精製および単離した核酸分子を提供する。この核酸分子は、下記のいずれかのＤＮＡ配列を有する。（ａ）ＤＮＡ配列が、図１Ａ〜１Ｅ（以下に説明）またはその相補ストランドのいずれかである。（ｂ）厳しい条件下でハイブリッド化して（ａ）に定義したＤＮＡ配列となるＤＮＡ配列。（ｂ）に定義したＤＮＡ配列は、（ａ）に定義したＤＮＡ配列を少なくとも９０％有することが好ましい。（ｂ）に定義したＤＮＡ配列は、図１Ｆに記載した共通配列から成っていてもよい（以下に説明）。本発明の他の態様では、精製および単離したＤ１５外膜タンパクまたはその一部を提供する。Ｄ１５外膜タンパクは、ヘモフィルスＤ１５外膜タンパク、なかでもインフルエンザ菌Ｄ１５外膜タンパクであってもよく、そのインフルエンザ菌株は、インフルエンザ菌ｂ型株、例えばインフルエンザ菌ｂ型Ｃａまたはイーガン（Eagan）またはＭｉｎｎＡ（MinnA）株または型別不能インフルエンザ菌株、例えばＰＡＫ１２０８５またはＳＢ３３である。別の態様では、本発明は、ホストの形質変換に適応する組換えプラスミドを含み、その組換えプラスミドはその中に本発明で提供する精製および単離したＤＮＡ分子から成るＤＮＡセグメントを挿入したプラスミドベクターから成る。このような組換えプラスミドは、上記のＤＮＡ分子から選択した少なくとも一種の１８ｂｐフラグメントから成るＤＮＡセグメントが挿入されているプラスミドベクターから成る。組換えプラスミドは、１９９３年１１月４日に寄託したＡＴＣＣ受入番号７５６０４のプラスミドＤＳ−７１２−２− １および１９９３年１１月４日に寄託したＡＴＣＣ受入番号７５００６のプラスミドＪＢ−１０４２−５−１でもよい。本発明の別の態様の場合には、組換えベクター中への組み込みにより、異種でも同種でもよいホストのホスト細胞中のコード化した１５外膜タンパクの発現に適応させてもよい。組換えベクターは、上記のようなＤＮＡ分子のいずれかの少なくとも一個の１８ｂｐフラグメントから成る少なくとも一個のＤＮＡセグメントおよびホスト細胞中にこれによりコード化した生成遺伝子の発現のためのＤＮＡセグメントに人為的に結合させる発現手段から成ってもよい。コード化したＤ１５外膜タンパクの発現のためのプラスミドは、大腸菌（E．coli．）内でＤ１５外膜タンパクにおいて発現するように適応させた１９９３年１１月４日に寄託したＡＴＣＣ受入番号７５６０５のプラスミドＤＳ−８８０−１−２でもよい。選定したＤＮＡセグメントは、残基少なくとも６個のポリペプチドをコード化してもよく、特には表２（下記）のポリペプチドをコード化するいずれかのセグメントであってもよい。さらに、ＤＮＡセグメントはホストから生成遺伝子を送りだすためのリーダー配列をコード化する核酸配列から成っていてもよい。発現のためのホストは、例えば大腸菌、バシラス（Bacillus）、ヘモフィルス、真菌、酵母菌のいずれかであってよく、あるいはバクロウイルス発現システムを利用してもよい。本発明の他の態様には、Ｄ１５外膜タンパク、このタンパクのフラグメントまたは機能的な類似体をコードする部分を少なくとも有するＤＮＡ分子によりコード化されるタンパク、予防接種または診断におけるタンパクまたは類似体の使用および免疫学的試薬の生成を含んでいる。また本発明は、Ｄ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有するＤＮＡ分子によりコード化されるＤ１５外膜タンパクに対して生成する免疫血清（抗体）およびＤ１５外膜タンパクの部分に相当する精製ペプチドも含んでおり、また受動的免疫投与およびヘモフィルスにより起きる疾病の処置も含む。本発明の別の態様によると、Ｄ１５外膜タンパクまたは免疫原性を保存している変異体または突然変異体の少なくとも一部分のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する生成および単離したペプチドを含む。ペプチドは、組換え法またはペプチド合成により製造しもよく、これにより精製したペプチドはＤ１５外膜タンパクに通常含まれる細菌による汚染を防止することができる。このような合成ペプチドは、表２に示したいずれかのアミノ酸配列を有することが好ましい。本発明の別の態様によると、Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメント、その機能的な類似体または上記のペプチドおよび生理学的に許容できるこれらのキャリヤーから成る免疫原性組成物が提供される。この免疫原性組成物は、特にヘモフィルスにより起きる疾病に対して防御するためにin vivo投与するためのワクチンとして配合される。この目的には、免疫原性組成物は、微粒子調剤、カプセル調剤またはリポソーム調剤として配合される。さらにこのような免疫原性組成物は、免疫系の特定の細胞にまたは粘膜表面に投与するための標的分子と一緒に供給してもよい。本発明のさらに別の態様では、ヘモフィルスにより起きる疾病に対する防御を誘発する方法が提供され、これはヘモフィルス感染に対する防御的免疫を得るための上記の免疫原性組成物または核酸分子の有効量の哺乳類例えばヒトを含む患者への投与の手段から成る。さらに本発明は、他のポリペプチドまたはタンパクまたは多糖類とリンクさせた本発明で提供するＤ１５タンパクまたはこれに相当するペプチドから成るキメラ分子も含む。リンクしたポリペプチドまたはタンパクは、インフルエンザ菌のＰ１、Ｐ２またはＰ６外膜タンパクであってもよい病原性細菌からの表面タンパクまたはこれに相当するペプチドから成っていてもよい。リンクした多糖類は、インフルエンザ菌からのＰＲＰ分子からなると好ましい。図の簡単な説明本発明は、下記の図を参照して説明するとさらに良く理解されるであろう。図１Ａは、インフルエンザ菌ｂ型Ｃａ株からのＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびこれに由来するアミノ酸配列（配列番号２）である。図１Ｂは、インフルエンザ菌ｂ型イーガン株からのＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびこれに由来するアミノ酸配列（配列番号４）である。図１Ｃは、インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株からのＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびこれに由来するアミノ酸配列（配列番号６）である。図１Ｄは、インフルエンザ菌型別不能ＳＢ３３からのＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）およびこれに由来するアミノ酸配列（配列番号８）である。図１Ｅは、インフルエンザ菌型別不能ＰＡＫ１２０８５からのＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）およびこれに由来するアミノ酸配列（配列番号１０）である。図１Ｆは、種々のインフルエンザ菌単離株（型別可能、Ｃａ，イーガンおよびＭｉｎｎＡ；型別不能、ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５）から得たＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、７および９）のアラインメントである。図２は、クローンｐＵＣ１９／Ｄ１５（Ｃａ）、ＤＳ−７１２−２−１（イーガン）、ＤＳ−６９１−１−５（ＭｉｎｎＡ）、ＪＢ−１０４２−５−１（ＳＢ３３）およびＪＢ１０４２−９−４（ＰＡＫ１２０８５）の制限酵素切断地図である。Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｒ＝ＥｃｏＲＩ；Ｓ＝Ｓａｕ３ＡＩ；およびＸｂ＝ＸｂａＩ。図３は、種々のインフルエンザ菌単離株（型別可能、Ｃａ，イーガンおよびＭｉｎｎＡ；型別不能、ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５）から得たＤ１５外膜タンパクのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８および１０）のアラインメントである。アミノ酸は通常の１文字コードで表す。ＣａＤ１５配列を対照標準として使用し、ＣａのＤ１５外膜タンパクのアミノ酸と一致するアミノ酸残基を点で示す。図４は、強力な誘発Ｔ７プロモーターからの完全長ＳＢ３３Ｄ１５（ｒＤ１５）を発現するプラスミド（ＤＳ−８８０−１−２）の構造である。図５は、インフルエンザ菌株３０から親和精製した未変性Ｄ１５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図６は、プラスミドＤＳ−８８０−１−２を含む大腸菌内に発現した全長ｒＤ１５の精製の間に得た配列フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図７は、完全長ｒＤ１５に対するモルモットＩｇＧ抗体反応である。矢印は免疫投与スケジュールを示す。０、２、４、６および８週目に採血した。棒印は、標準偏差を示す。図８は、完全長ｒＤ１５に対するマウスＩｇＧ反応である。矢印は免疫投与スケジュールを示す。０、１、４、５および７週目に採血した。棒印は、標準偏差を示す。図９は、ＧＳＴ−（Ｄ１５フラグメント）融合タンパクから精製したＮ末端ｒＤ１５フラグメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。レーン：１．染色前低分子量マーカー（１４ｋＤａ、２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４５ｋＤａ、６８ｋＤａ、９７ｋＤａ）；２．ＧＳＴ標準；３．ＧＳＴ−（Ｄ１５フラグメント）融合タンパク；４．トロンビンで切断した融合タンパク；５．Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント；６．ＧＳＴ；７．低分子量マーカー図１０は、Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントに対するモルモットＩｇＧ抗体反応である。矢印は免疫投与スケジュールを示す。２、４、６および８週目に採血した。棒印は標準偏差を示す。図１１は、ホープ（Hope，1986）に従って７残基のウインドウ平均を用いて確立したＤ１５の親水性プロットである。発明の詳細な説明Ｄ１５遺伝子を有するあらゆるヘモフィルス株は、本発明の態様により代表されるＤ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有する精製および単離した核酸分子（これはＤＮＡ分子の形であってもよい）を得るために用いると都合がよい。これらの株は、病院、または細菌培養コレクション、例えばAmerican T ype Culture Collectionから入手できる。インフルエンザ菌株には、ａ型、ｂ型よびｃ型株、型別不能株およびＤ１５タンパクを生成する他の細菌、フラグメントまたはその類似体を含んでいる。適合するヘモフィルス株は、下記である。インフルエンザ菌ｂ型Ｃａ株インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株インフルエンザ菌ｂ型イーガン株インフルエンザ菌型別不能ｂ株ＳＢ３３；またはインフルエンザ菌型別不能ｂ株ＰＡＫ１２０８５この用途では、例えばヘモフィルスの各種の株中に存在するようなアミノ酸配列中に自然的に起きる変異を有するタンパクを含むＤ１５タンパクの一群を定義するために、Ｄ１５外膜タンパクの用語を用いる。本発明のＤ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有する精製および単離したＤＮＡ分子は、例えばヘモフィルスの各種の株中に存在するような核酸配列中に自然的に起きる変異を有するＤＮＡ分子も、またＤ１５外膜タンパクの機能的類似体をコード化するＤＮＡ分子も含む。この用途では、第一のタンパクが第二のタンパクと免疫学的に関連および／または同じ機能を有する場合には、第一のタンパクは第二のタンパクの機能的類似体とする。機能的類似体は、例えばタンパクのフラグメントまたはその置換、付加または欠失突然変異体であってもよい。本発明の態様では、Ｄ１５遺伝子は、インフルエンザ菌ｂ型株Ｃａ、図１Ａ：インフルエンザ菌ｂ型株イーガン、図１Ｂ；インフルエンザ菌ｂ型株ＭｉｎｎＡ、図１Ｃ；型別不能インフルエンザ菌ＳＢ３３、図１Ｄ；型別不能インフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５、図１Ｅである。これらのインフルエンザ菌株からのＤ１５遺伝子の核酸配列の比較およびＤ１５外膜タンパクの誘導アミノ酸配列の比較から、遺伝子およびタンパクは高度に保存されていることが認められる（図１Ｆおよび３）。Ｄ１５遺伝子の共通配列（配列番号５５）を図１Ｆに示す。本明細書に記載した態様により代表されるヘモフィルスの種のＤ１５外膜タンパクをコードする部分を少なくとも有する精製および単離したＤＮＡ分子は、下記に有利である。 −インビトロおよびインビボにおけるヘモフィルス株の特異的識別のための核酸プローブ。 −ＤＮＡ分子にコード化された精製物は、診断用試薬、ヘモフィルス特異的免疫血清の製造のため、ヘモフィルスの種により起きる疾病に対する予防接種のためおよびヘモフィルス感染の検出のための抗原として用いられる。 −本明細書に記載した態様で代表されるＤ１５外膜タンパクの部分に相当するペプチドは、診断用試薬、ヘモフィルス特異的免疫血清の製造のため、ヘモフィルスの種により起きる疾病に対する予防接種のためおよびヘモフィルス感染の検出のための抗原として有利である。本発明の現在の好ましい態様は、下記の実施例と一緒にして詳細に参照すると、本発明の原理が説明されるであろう。開示を明確にするために、本発明の説明を以下の部分に分割するが、これは本発明を制限するものではない。（ｉ）インフルエンザ菌ｂ型Ｃａ株からの外膜タンパクＤ１５をコードするＤＮＡ配列バーンズとトーマス（Burns and Thomas 1965）およびトーマスとロッシ（Tho mas and Rossi，1986）がすでに記載している方法により、Ｄ１５と表記するインフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）の外膜タンパクを生成するクローンを、インフルエンザ菌ｂ型ＯＭＰ特異性ポリクロナール抗体を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングして単離した。Ｄ１５タンパクをコード化するＤＮＡフラグメントを単離し、ｐＵＣ１９中にサブクローン化してｐＵＣ１９／Ｄ１５を得て（図２）、実施例１に記載の方法により大腸菌ＨＢ１０１を形質変換した。ｐＵＣ１９／Ｄ１５プラスミドを含む大腸菌ＨＢ１０１の個別のコロニー２個からプラスミドＤＮＡを製造した。色素ターミネーター化学およびＡＢＩＤＮＡシンヤサイザーモデル３８０Ｂを用いて合成しクロマトグラフィーで精製したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＡＢＩＤＮＡシンセサイザーモデル３７０Ａを用いて配列決定した。Ｄ１５遺伝子のヌクレオチド配列解析から、これが推定プロモーターおよび７８９個のアミノ酸をコード化するオープン読み枠を含むことが認められた（図１Ａ）。翻訳したオープン読み枠の最初の１９個のアミノ酸残基は、他のインフルエンザ菌ｂ型外膜タンパク、例えばＰ１およびＰ２に存在するような典型的なリーダー配列を形成する。免疫親和性の精製未変性Ｄ１５抗原のＮ末端配列は、ＡＢＩ４７７Ａタンパクシーケンサーを用いる自動式エドマン（Edman）分解法により測定し、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであることが分かったが、これは図１Ａに示したＤ１５遺伝子の配列の解析から予想されるようにＮ末端アミノ酸配列Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−（配列番号１１）と同一である。（ｉｉ）他のインフルエンザ菌株からのＤ１５遺伝子の配列インフルエンザ菌ｂ型株イーガン、ＭｉｎｎＡおよび型別不能インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）株ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５のクロモソームライブラリーをスクリーニングして他のインフルエンザ菌株からのＤ１５遺伝子を単離したが、これは実施例２、３および４に記載してある。ハイブリッド形成陽性クローンを塗布して、二回目のスクリーニングを行った。得られたクローンの制限酵素切断地図は図２である。Ｓ１５遺伝子のヌクレオチド配列をこれらのクローンすべてについて決定し（図１Ｂ〜１Ｅ）、これらから得たアミノ酸配列を比較した（図３）。３種のインフルエンザ菌ｂ型株のＤ１５アミノ酸配列は同一であり、型別不能株のＤ１５タンパクのアミノ酸配列とは数個のアミノ酸が相違するだけであった（図３）。（ｉｉｉ）大腸菌内におけるＤ１５およびそのフラグメントの発現Ｄ１５はインフルエンザ菌株では発現量が少ないので、この抗原は、異種系、例えば大腸菌内で組換えタンパクとして発現させるか、またはインフルエンザ菌生物体を変性して未変性Ｄ１５発現を増加させると有利である。Ｄ１５タンパク完全長をコード化するインフルエンザ菌ｂ型Ｃａ株ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントは、ｐＵＣ１９中では発現したが、ｐＵＣ１８中では発現せず、未変性１５遺伝子プロモーターが存在するにもかかわらず、ｌａｃプロモーターが大腸菌内のＤ１５遺伝子発現を助けることを示唆している。Ｔ７発現系は、厳密に制御され誘導可能な系であり、これは大腸菌内の異種タンパクの発現に非常に役立つ。Ｔ７発現系は、米国特許（ＵＳＰ）第４，９５２，４９６号に記載されている。従って、Ｔ７系を用いて、アミノ末端にに追加のメチオニン残基を有する成熟Ｄ１５タンパクを発現させるようにクローンを構成した。この構成プロセスの間にＤ１５シグナル配列は除かれた。完全長組換えＤ１５（ｒＤ１５と表示）は、１５タンパクを容易に精製させるような封入体中で発現させた。インフルエンザ菌ｂ型Ｃａおよびインフルエンザ菌型別不能ＳＢ３３株からのＤ１５遺伝子は、Ｔ７系を用いて大腸菌内に大量に発現し、ｒＤ１５タンパクの大量生産が可能となった。ＳＢ３３Ｄ１５遺伝子を発現するクローンＤＳ−８８０−１−２の構成を記載する（図４および実施例５参照）。ｒＤ１５タンパクは、型別可能および型別不能株インフルエンザ菌から単離した未変性の対応物と免疫学的に類似している（下記参照）。従って、ｒＤ１５は、Ｄ１５外膜タンパクまたはその類似体を精製するインフルエンザ菌および他の細菌の全部ではなくても多数を検出するための診断キットに用いる交差反応性抗原として使用できる。あるいは、ｒＤ１５は、試料中のインフルエンザ菌の存在を特異的に検出する抗原としても使用できる。トランケートＤ１５フラグメントは、実施例６に記載するようにグルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）に用いて融合タンパクとして大腸菌内に発現した。その構造はＤ１５タンパクのＮ末端フラグメントを発現するように設計した。融合タンパクは、ｐＧＥＸ−２Ｔ構造から高レベルで発現し、Ｎ末端フラグメントはトロンビンで処理してＧＳＴキャリヤータンパクから切断した。この方法によりＤ１５タンパクのアミノ酸６３〜２２３に相当するＮ末端ｒＤ１５フラグメントと呼ばれる分子が生成する。このＮ末端ｒＤ１５フラグメントは、免疫原性が高く、生きているインフルエンザ菌の攻撃を防御する抗体を誘導した。（ｉｖ）インフルエンザ菌細胞ペーストからの未変性Ｄ１５の精製本発明は、またインフルエンザ菌からの精製未変性Ｄ１５タンパクの製造法も提供する。界面活性剤水溶液中にタンパクを溶解させることを含む方法により、型別可能または型別不能インフルエンザ菌単離物の細胞ペーストから抽出してこのタンパクを親和精製する（実施例１３参照）。型別不能インフルエンザ菌株３０からの未変性Ｄ１５タンパクを５０ｍＭトリスＨＣ１／０．５％トリトン（Tr iton）Ｘ−１００／１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．０を用いて可溶化させ、Ｄ１５特異性モノクロナール抗体親和性カラムを用いてさらに精製した（図５Ａ）。５０ｍＭジエチルアミン、ｐＨ１２．０を用いて８０ｋＤａタンパクがカラムから溶出し、免疫ブロット分析でＤ１５特異性モノクロナール抗体と反応することを確認した（図５Ｂ）。未変性Ｄ１５は、実験用動物に対しても高度に免疫原性があった。ウサギ抗Ｄ１５免疫血清は、免疫ブロット分析によるとすべてのインフルエンザ菌単離物と反応した。（ｖ）大腸菌内に発現した完全長組換えＤ１５タンパクの精製完全長組換えＤ１５（ｒＤ１５）タンパクは大腸菌内の封入体中に発現した。図６に示すように、ｒＤ１５封入体は、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、次いで０．５％トリトンＸ−１００および１０ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて、大腸菌溶解菌を逐次抽出して精製した。遠心分離の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると得られたペレット中のタンパクの９５％以上が８０ｋＤａタンパクであり、イムノブロット法によるとこれらはＤ１５特異性モノクロナール抗体と反応した。ｒＤ１５のＮ末端配列は、Ｍｅｔ−Ａｌａ −Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−（配列番号５４）であることが分かり、これは予想したアミノ酸配列と同一である。ＰＢＳ、０．５％トリトンＸ−１００、１０ｍＭＥＤＴＡおよび８Ｍ尿素の混合物を用いて、ｒＤ１５封入体を可溶化した（実施例８参照）。ＰＢＳに対して透析して尿素を除去すると、８０％以上のＤ１５タンパクが可溶性で残った。この可溶性ｒＤ１５抗原は、下記の免疫原性試験に使用した。フラスコ振とう試験から推定すると、大腸菌培地１リットルから、可溶性ｒＤ１５タンパク約１０ｍｇが得られた。最適化した発酵条件下における組換え大腸菌株の増加は、ｒＤ１５生成のレベルを著しく高めることは明らかである。（ｖｉ）完全長組換えＤ１５タンパク（ｒＤ１５）の免疫原性モルモットおよびマウスを用いて完全長Ｄ１５タンパクの免疫原性を試験した。図７に記載した免疫投与プロトコールにより、フロイント（Freund）アジュバントまたはＡｌＰＯ₄の存在下で、１５μｇのｒＤ１５を投与すると、モルモット内に高いＩｇＧタイターが誘発された。マウスの投与反応試験では、このタンパクは５μｇの低い投与量でもフロイントアジュバント中（図８Ａ）でもはＡｌＰＯ₄中（図８Ｂ）でも免疫原性であった。ｂ型インフルエンザ菌感染に対するｒＤ１５の防御能力は、実質的にローブ（ Loeb，1987）の記載に従って、菌血症の未成熟ラットモデルを用いて試験した。これによると、モルモット抗ｒＤ１５免疫血清を用いて免疫投与した未成熟ラットは、プレブリード血清を注射した対照マウスよりも、菌血性が著しく低く、これはトーマスら（Thomas et al.，1990）の以前の報告と一致した。（ｖｉｉ）Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントの精製と特性検討実施例６に記載したＤ１５タンパクのＮ末端（残基２２〜２２３）に相当するトランケートｒＤ１５フラグメントは、ＧＳＴに融合させた可溶性タンパクとして大腸菌内に発現した。この融合タンパク（４６ｋＤａ）は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて容易に抽出された。ＧＳＴ −Ｄ１５フラグメント融合タンパクの精製は、グルタチオン−セファロース４Ｂカラム（図９、第３レーン）上の一段親和精製プロセスにより行った。トロンビンを用いて４６ｋＤａ融合タンパクを切断すると、２個のフラグメントとなり（図９、第４レーン）、２６ｋＤａタンパクは精製ＧＳＴ標準（図９、第２レーン）に相当し、２０ｋＤａポリペプチドはＮ末端ｒＤ１５フラグメント（アミノ酸残基６３〜２２３）に考えられる大きさである。これら２個のタンパクの分離は、再度のグルタチオン−セファロース４Ｂクロマトグラフィーにより行った。フラスコ振とう実験から、大腸菌培養基１リットルから精製Ｎ末端Ｒｄ１５フラグメント約１ｍｇが回収されたと推定した。最適化した発酵条件下における大腸菌株の増加は、Ｎ末端Ｒｄ１５フラグメントの生成レベルを著しく高めることは明らかである。２０ｋＤａポリペプチドおよび２６ｋＤａタンパクの同定は、免疫ブロッティングおよびタンパク配列決定により確認された。２０ｋＤａポリペプチドのＮ末端配列は、ＮＨ₂−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ −Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ −Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ −Ｓｅｒ（配列番号１２）であり。これはＤ１５の一次配列の残基６３〜８５に相当することが分かった。この結果は、Ｄ１５配列内に疑似トロンビン切断サイトが存在し、ｒＤ１５フラグメントの始めの４２個のアミノ酸がトロンビン消化の間に切断されたことを示している。従って、最後のＮ末端ｒＤ１５フラグメントは、Ｄ１５の一次配列の残基６３〜２２３に相当する１６１のアミノ酸の長さであった。２６ｋＤａタンパクから得られたＮ末端配列（ＮＨ₂−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−配列番号１３）から、これがＧＳＴであることを確認される。（ｖｉｉｉ）Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントの免疫原性Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントの免疫原性は、各種のアジュバントを用いてモルモットで試験した。図１０に記載した免疫投与プロトコールにより、Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントを１０μｇ投与すると、試験したほぼすべてのアジュバントに対して、モルモット中に良好なブースター反応を誘発した。最高の抗−Ｄ１５タイターは、フロイトアジュバント中のＮ末端ｒＤ１５フラグメントを用いて免疫投与したモルモットの群で認められた。次に良かったアジュバントは、タイターマックス（Titermax，CytR x Inc．）であった。その他の二種のアジュバント、ＴＰＡＤ４（トリパルミチル−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ₄）およびＡｌＰＯ₄の効力は同等であった。（ｉｘ）ｂ型インフルエンザの菌攻撃誘発に対するＮ末端ｒＤ１５フラグメントの防御能力ヘモフィルスにより起きる疾病に対する抗原の防御能力を評価するためのin v ivo攻撃誘発モデルとして、ローブ（Loeb，1987）が記載した菌血症のラット新生仔モデルを用いた。ｂ型インフルエンザ菌の攻撃誘発に対するＮ末端ｒＤ１５フラグメントの防御能力をこのラットモデルで試験した。表１の記載のように、ウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント免疫血清を用いて受動免疫投与したラット新生仔は、プレブリード血清を注射したラットと比較して、菌血性の程度が著しく低かった。Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントに対する受動転移免疫血清は、菌血症のラット新生仔モデルにおいて防御性があることが分かったので、このＮ末端ｒＤ１５フラグメントの防御性エピトープの同定を試みた。インフルエンザ菌ｂ型ＣａからのＤ１５遺伝子の配列（図１）から得たアミノ酸配列を基にして、表２に記載したＤ１５タンパクの最初の９個のオーバーラップペプチドを化学的に合成した。ＥＬＩＳＡによる精製Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントに対して生成したウサギまたはモルモット免疫血清を用いて、これらの合成ペプチドの反応性を試験した。図３に示すように、モルモットとウサギのいずれの血清も、Ｄ１５一次配列の９３〜２０９残基に相当するＤ１５−Ｐ４からＤ１４−Ｐ８までのペプチドを含むＤ１５ペプチドのクラスターと反応した。さらに、新生仔ラットにウサギ抗Ｄ１５免疫血清を用いて観察されたｂ型インフルエンザ菌に対する防御性がＤ１５ペプチドにより中和されるか否かを決めるための実験を行った。一回目の実験では、９種のペプチド（Ｄ１５−Ｐ２〜Ｄ１５−Ｐ１０）の混合物が存在または存在しない新生仔ラット７匹の群にウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント免疫血清を注射した。陽性対照群の動物には、精製Ｄ１５フラグメントを混合したウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント免疫血清を注射し、陰性対照群には、９種のペプチドのみを注射した。表４に記載のように、ウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント免疫血清を用いて受動免疫投与した新生仔ラット（群１）は、陰性対照群の値（群４、１００％）と比較すると、有意に低い菌血性レベル（３％、ｐ＝１．２ｘ１０^-7）を示し、以前に得られた結果と一致する。ウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント免疫血清による防御作用は、精製Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントを添加すると大幅に中和され（群３、６４％）、これは群３と群４との間の菌血性レベルに有意差がないこと（ｐ＝０．０９）から明らかである。９種のＤ１５ペプチドの添加により、群１（３％）と比較して免疫血清により得た防御は僅かに中和されただけであったが（群２、１３％）、この２群間の菌数の差異は、統計学的に有意であった。（ｐ＝０．００３７）。Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントの防御エピトープをより明瞭に決定するために、ウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント免疫血清との強い反応性から選択した５種のペプチド（ペプチドＤ１５−Ｐ４〜Ｄ１５−Ｐ８）を用いて上記の実験を反復した。この二回目の実験から得た結果から、ウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントを用いて得られた防御（表５、群１）は、５種のペプチドを加えると完全にブロックされることが分かった（表５、群２、１０６％、ｐ＝０．５３ｘ１０^-8）。これらの結果から、Ｄ１５合成ペプチドの反応溶液はインフルエンザ菌に対する防御抗体を誘発する免疫原として使用できることが明らかになった。（ｘ）エピトープの推定およびペプチドの合成免疫優性のＤ１５のＴ細胞またはＢ細胞エピトープの位置を決めるために、実施例１５に記載するように、ｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成を用いて、Ｄ１５タンパクの全配列をカバーするオーバーラッピング合成ペプチド（表２、配列番号１４〜４９）を合成した。このペプチドは、二次構造予想解析により想定した親水性 βターンの指数が高いことから選択した（図１１）。このペプチドは、表面暴露性で抗原性と考えられる。変性エピトープとの類似性が高いことから、長さが２５残基以上のペプチドを選択した。（ｘｉ）合成ペプチドを用いたＤ１５の免疫優性エピトープの識別および特性検討Ｄ１５の線型Ｂ細胞エピトープの位置を決めるために、Ｄ１５の全配列と同じオーバーラッピング合成ペプチドをＥＬＩＳＡプレート上に個別に被覆し、実施例１９の記載のように数種の抗ｒＤ１５免疫血清を用いて試験した。その結果を表６に総括した。ｒＤ１５に対して生成したマウス免疫血清は、すべてのＤ１５ペプチドと反応したが、主要なエピトープはそれぞれペプチドＤ１５−Ｐ８（残基１８０〜２０９、配列番号２１）、Ｄ１５−Ｐ１０（残基２１９〜２４９、配列番号２３）、Ｄ１５−Ｐ１１（残基２４１〜２７０、配列番号２４）およびＤ１５−Ｐ２６（残基５５４〜５８２、配列番号３９）内に位置していた。ウサギ抗Ｄ１５免疫血清は、ペプチドＤ１５−Ｐ４（残基９３〜１２２、配列番号１７）、Ｄ１５−Ｐ１４（残基３０４〜３３３、配列番号２７）およびＤ１５−Ｐ３６（残基７６９〜７９８、配列番号４９）のみを認識した。ｒＤ１５に対して生成したモルモット免疫血清は、ペプチドＤ１５−Ｐ２（残基４５〜７２、配列番号２５）、Ｄ１５−Ｐ４（残基９３〜１２２、配列番号１７）、Ｄ１５−Ｐ６（残基１３５〜１６４、配列番号１９）、Ｄ１５−Ｐ８（残基１８０〜２０９、配列番号２１）、Ｄ１５−Ｐ１４（残基３０４〜３３３、配列番号２７）、Ｄ１５− Ｐ２７（残基５７７〜６０２、配列番号４０）と反応した。これから、３種の動物すべてのｒＤ１５免疫血清により認識されたのは、２種のペプチドのみであったので、Ｄ１５の免疫優性直線型Ｂ細胞エピトープは、ペプチドＤ１５−Ｐ４（残基９３〜１２２、配列番号１７）およびＤ１５−Ｐ１４（残基３０４〜３３３、配列番号２７）内に位置することが分かった。この結果から、上記の直線型Ｂ細胞エピトープ配列を有するペプチドは、例えば、試料中の抗Ｄ１５および抗インフルエンザ菌抗体の存在を検出する診断キット中の標的抗原として使用できることが明らかとなった。（ｘｉｉ）合成ペプチドを用いたＤ１５の免疫優性Ｔ細胞エピトープの識別と特性検討免疫および感染における免疫性および感染性反応におけるシトカインネットワークおよび病理学におけるその交代の重要性は、新しいシトカイン族が識別され特性検討されたために、いよいよ明らかになっている。最近、ミルら（Mill et al.，1993）は、細菌、呼吸器感染の後６週間の危険性について、または全細胞百日咳ワクチンの２回の免疫投与の後のマウスの肺からの百日咳菌（B．Perutus sis）の迅速なクリアランスについて報告している。百日咳抗原（百日咳トキソイド、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）およびペルタクチン（pertactin））が存在すると、これらの免疫投与マウスからの牌臓細胞は、高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γおよび低レベルのＩＬ−５を分泌することが分かった。この結果は、Ｔｈ１細胞（高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを生成するＴ細胞）増殖は、呼吸器感染からの回復に非常に重要であることを示唆する。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞サブセットの生成は、種々のシトキン類の群、主としてＩＬ−１２およびＩＬ −４の間のバランスにより調節される〔トリンキエリ（Trinchieri）1993〕。ＩＬ−２およびＩＬ−４は、それぞれＴｈ１およびＴｈ２細胞の分化に影響を与える。免疫系内におけるＴｈ２の役割の一つは、免疫投与の後に高レベルの抗原特異性抗体を誘出するためのヘルパー作用を与えることである。Ｔｈ１エピトープを含む抗原は、エピトープ刺激抗原特異性Ｔ細胞を刺激して高レベルのＩＬ− ２およびＩＬ−４を生成させ、一方、Ｔｈ２エピトープは、高レベルのＩＬ−４発現を誘発する。Ｔｈ０エピトープは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の合成を促進する。インフルエンザ菌の外膜タンパクに対する細胞免疫反応およびインフルエンザ菌感染および疾病に対する防御におけるその役割に関してほとんど知られていない。この目的で、本発明者は、ｒＤ１５免疫投与の後のマウス内で起きる細胞反応の試験を実施した。ｒＤ１５を用いて免疫投与したＢＡＬＢ／ｃマウス５匹から得たＤ１５ペプチドおよびＴ細胞系統を用いて、Ｄ１５特異性Ｔ細胞エピトープを決定した。（実施例２３参照）。オーバーラップするＤ１５ペプチドに対するＤ１５特異性Ｔ細胞系統のリンパ球増殖反応は、実施例２４に記載のように通常のシトキン中で測定した。表７に記載した結果から、ある種の合成ペプチドを用いる刺激のみが増殖性反応および特定のシトキンの放出を誘出することが明らかになった。残基１１４〜１４３（Ｄ１５−Ｐ５、配列番号１８）、２８２〜３１２（Ｄ１５−Ｐ１３、配列番号２６）および５７７〜６０２（Ｄ１５−Ｐ２７、配列番号４０）、および２１９〜２４９（Ｄ１５−Ｐ１０、配列番号２３）、２６２〜２９１（Ｄ１５−Ｐ１２、配列番号２５）、３９０〜４１６（Ｄ１５− Ｐ１８、配列番号３１）、４１０〜４３５（Ｄ１５−Ｐ１９、配列番号３２）、５５４〜５８２（Ｄ１５−Ｐ２６、配列番号３９）、５９６〜６２５（Ｄ１５−Ｐ２８、配列番号４１）、７２５〜７５０（Ｄ１５−Ｐ３４、配列番号４７）および７４５〜７７１（Ｄ１５−Ｐ３５、配列番号４８）に相当する合成ペプチドは、それぞれＤ１５特異性ＢＡＬＢ／ＣＴｈ０細胞およびＴｈ１細胞に対して高い刺激性があることが分かった。従って、これらの免疫優性Ｔ細胞エピトープは、それらの免疫原性を高めるために、ＰＲＰおよび／またはＯＭＰＢ細胞の自己由来キャリヤーとして使用できる。上記で識別されたＴｈ１細胞エピトープは、インフルエンザ菌特異性細胞免疫反応を誘発するためのインフルエンザ菌ワクチン配合に用いることができる。（ｘｉｉｉ）Ｄ１５ペプチドの免疫原性合成Ｄ１５ペプチドが免疫原性か否かを決定するために、遊離ペプチドの免疫原性を個別に試験した。ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロッティングによる免疫投与ペプチドならびに未変性Ｄ１５およびｒＤ１５に対する反応性について、ウサギおよびモルモット抗ペプチド免疫血清を試験した。図８に示すように、Ｄ１５−Ｐ２６（配列番号３９）、Ｄ１５−Ｐ２９（配列番号４２）、Ｄ１５−Ｐ３０（配列番号４３）およびＤ１５−Ｐ３１（配列番号４４）に対して生成したものを除くすべてのモルモット抗Ｄ１５ペプチド免疫血清は、ＥＬＩＳＡにより免疫原性であることが分かった。遊離ペプチドによるペプチド特異性ＩｇＧ抗体の高タイターの誘発は、大部分のペプチドが機能性Ｔヘルパー決定因子およびＢ細胞エピトープのいずれも含んでいることを明らかに示している。さらに、これらの抗ペプチド免疫血清は、免疫ブロット試験でＤ１５を認識した。大部分のペプチドは、強力な機能性Ｔヘルパー決定因子を含み、強いＩｇＧ抗体反応を哺乳類内で誘発するので、これらは、インフルエンザ菌ワクチン調製の際の成分の候補となる。Ｄ１５ペプチド特異性免疫血清は、免疫ブロッティングの判断によるとインフルエンザ菌の型別不能株からのＤ１５と交差反応を示した。この所見は、免疫原性Ｄ１５ペプチドは、インフルエンザ菌の型別可能および型別不能中で強く保存されるエピトープを含むことを示している。その上、これらのエピトープに対するポリクロナール抗体は、生物学的試料中でインフルエンザ菌の検出に使用できる。従って、これらの保存されたＤ１５エピトープは、個別にまたは組み合わせて、インフルエンザ菌の型別可能および型別不能およびＤ１５を生成する他の細菌、フラグメントまたはその類似体に対する交差反応性合成免疫原の製造に使用できる。上記のペプチドは、さらに異なるワクチンを製造するために、重合、リポペプチドとしての脂質を用いて変性、または合成糖ペプチドまたはリポ糖ペプチドとしてのＰＲＰを含む多糖類とリンクさせることができる。これらのワクチンは、例えば筋肉内または非経目経路による哺乳類への投与、または微粒子、カプセル、リポソームおよび標的分子、例えばトキシンまたはそのフラグメント、および抗体を用いて、免疫系の細胞または粘膜表面に投与することにより、インフルエンザ菌により起きる疾病に対する免疫投与に使用できる。（ｘｉｖ）配糖体の製造のためのキャリヤータンパクとしてのＤ１５の利用Ｄ１５が防御抗原およびキャリヤーの両方の役割を持っているか否かを決定するために、実施例１４に記載したＤ１５−ＰＲＰ抱合化実験を実施しＬＤ１５− ＰＲＰ抱合体は、Ｄ１５特異性ＥＬＳＡおよびＰＲＰ−ＢＳＡ免疫アッセイによる判断では、ウサギにおいて免疫原性が高く、抗Ｄ１５および抗ＰＲＰＩｇＧ抗体反応を誘発することができることが分かった（図９）。これらの結果は、配糖体形成技術のキャリヤータンパクとしてＤ１５が利用できることを明らかに証明している。本発明の好ましい態様では、Ｄ１５のキャリヤー機能は、被包性細菌を含む病原菌に対するキメラ分子および複合ワクチン製造に一般的に使用できる。従って、本発明の配糖体は、多糖類抗原を有するあらゆる細菌、例えばインフルエンザ菌、肺炎双球菌、大腸菌、髄膜炎菌、チフス菌、ストレプトコッカス・ムタンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クレブシエラ属細菌、黄色ブドウ球菌、および緑膿菌を含む細菌による感染に対する防御のための接種に使用できる。他の態様では、ガン細胞の異常多糖類に対する免疫を誘発するため、または化学療法または生物活性薬剤と複合できる抗ガン性抗体の製造に、Ｄ１５のキャリヤー機能が利用できる。従って、本発明は、ヘモフィルスにより起きる疾病の予防および診断に使用できるインフルエンザ菌の抗原（Ｄ１５）の一次配列および調製物を提供する。なかでも、本発明者らは、組換えＤ１５またはそのフラグメントが、生きているｂ型インフルエンザ菌の攻撃誘発に対する防御抗体反応を誘発することを発見した。このように、本発明はワクチンとしての用途がある。また、本発明はインフルエンザ菌のｂ型株および型別不能単離体の双方から単離されたＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列も開示する。Ｄ１５をコード化したＤＮＡセグメントを開示し、これらのヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列中に僅かな多型性を示す（図１Ｆおよび３）。これらのＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ技術を適用して、他のインフルエンザ菌抗原（例えばＰＲＰおよびリポオリゴ糖類（ＬＯＳ））を実質的に含まない免疫原の提供に利用できる。本開示は、さらに実質的に純粋なＤ１５またはそのフラグメントならびに機能的類似体の製造に使用できる技術を提供する。組換えＤ１５タンパク、そのフラグメントまたは類似体は、適当な発現系、例えば大腸菌、ヘモフィルス属細菌、ボルデテラ属細菌、バシラス属細菌、真菌、酵母、バクロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたは哺乳類発現系中で製造できる。ある態様では、本発明は、未変性Ｄ１５と免疫学的に交差反応性がある精製組換えＤ１５（ｒＤ１５）またはｒＤ１５フラグメントを含むワクチン組成物の製造プロセスに関する。なかでも、全Ｄ１５タンパクをコードする遺伝子およびグルタチオン−Ｓ−転移酵素遺伝子に融合したＮ末端ｒＤ１５フラグメントをコード化しているＤＮＡセグメントを構築し、大腸菌内で発現させた。発現したｒＤ１５タンパクおよびそのフラグメントは、型別可能および型別不能インフルエンザ菌単離体の双方から単離された未変性Ｄ１５抗原と交差反応し、従って、インフルエンザ菌により起きる疾病に対するワクチン中に封入するための交差反応免疫原である。さらに、ヘモフィルスの回復期の血清は、本明細書に記載するようにインフルエンザ菌から精製したＤ１５、ｒＤ１５およびＮ末端ｒＤ１５フラグメントを識別する。他の態様では、本発明は、他のポリペプチドまたはタンパクまたは多糖類、例えばインフルエンザ菌外膜タンパク、例えばＰ１、Ｐ２またはＰ６またはＰＲＰに融合するＤ１５フラグメントを含むハイブリッドまたはキメラタンパクを遺伝子組換えにより製造するために、本明細書に記載する特異性ヌクレオチド配列を有するインフルエンザ菌からの外膜タンパクＤ１５をコードする遺伝子、またはこれと実質的に同族の遺伝子（すなわち、この配列に厳しい条件下でハイブリッド化させる）を提供する。その結果、そのハイブリッド、キメラタンパクまたは配糖体は、Ｄ１５、またはＰ１、またはＰ２、またはＰ６、またはＰＲＰ単独よりもインフルエンザ菌に対して高い防御性を有する。このように、Ｄ１５外膜タンパクは、防御性抗原および自己由来Ｔ細胞開始を与えるための複合ワクチン中でキャリヤーとして機能し、その際、抱合体のハプテン部は、インフルエンザ菌の莢膜多糖類部分（ＰＲＰ）である。このＤ１５炭水化物抱合体は、ＰＲＰおよびＤ１５の双方に対する抗体を誘発することができ、従って、インフルエンザ菌に関連した疾病、特に幼児に対する防御のレベルを高める。他の態様では、本発明には、少なくとも一種のＤ１５の抗原決定因子に相当するアミノ酸配列を含む少なくとも一種のタンパクまたはペプチドの実質的に純粋な形も含まれ、そのぺプチドは哺乳類内でインフルエンザ菌に対するポリクロナール抗体を誘発することができる。これらのＤ１５特異性抗体は、生物学的試料中に存在するインフルエンザ菌を検出するための試験キットに用いられる。このペプチドは、例えば下記の表２に記載したインフルエンザ菌ｂ型Ｃａ株のＤ１５タンパクの残基２０〜４９、４５〜７４、６８〜９９、９３〜１２２、１１４〜１４３、１３５〜１６４、１５７〜１８７、１８０〜２０９、１９９〜２２８、２１９〜２４９、２４１〜２７０、２６２〜２９１、２８２〜３１２、３０４〜３３３、３２５〜３５４、３４６〜３７５、３６７〜３９６、３９０〜４１６、４１０〜４３５、４３０〜４５５、４５０〜４７７、４７１〜４９７、４９１〜５１６、５１１〜５３８、５３２〜５５９、５５４〜５８２、５７７〜６０２、５９６〜６２５、６１９〜６４６、６４１〜６６６、６６２〜６８８、６８１〜７０９、７０５〜７３１、７２５〜７５０、７４５〜７７１、７６９〜７９８（配列番号１４〜４９）、または免疫原性を有するあらゆる部分、変異体またはその突然変異体のアミノ酸配列を有してもよい。さらに別の態様では、本発明は型別可能または型別不能インフルエンザ菌単離物の培養基から抽出し、クロマトグラフィーにより精製した純粋の未変性Ｄ１５タンパクを提供する。この新規の方法は、他の外膜タンパクについての公知の技術により、界面活性剤水溶液を用いる細胞ペーストからのＤ１５タンパクの抽出、引き続く遠心分離またはクロマトグラフィーによる精製を含む。精製未変性Ｄ１５抗原は、例えば、筋肉内または非経口経路により、または微粒子、カプセル、リボソームおよび標的分子、例えばトキシンまたはそのフラグメントおよび抗体を用いて投与することにより、インフルエンザ菌により起る疾病に対して哺乳類を免疫投与するために用いることができる。本発明の他の態様では、Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体またはＤ１５の部分に相当するペプチドは、中耳炎に対する多価ワクチンの成分とすることができる。この多価ワクチンは、本明細書に記載したＤ１５の免疫原性決定因子少なくとも一種と、肺炎双球菌、ブランヘメラ（モロクセラ）カタルハリス、スタフィロコッカス・アウレウスまたはアジュベントを含む呼吸器合胞性ウイルスから単離した少なくとも一種の防御性抗原との混合物またはこれらの混合物から成る。Ｄ１５タンパク（表２）またはそのいかなる部分、変異体、突然変異体は、手作業または市販されているペプチド合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ・モデル４３０Ａ合成装置（Applied Biosystems Model 430A Synsesizer）を用いて容易に合成できる。当該分野の専門家にとっては、本発明の種々の態様は、予防接種、診眺、およびヘモフィルス感染により起る疾病の処置、および免疫学的試薬調製の分野に多くの用途があることは明らかである。これらの用途に関する考察を以下に記載するが、これらに限るものではない。１．ワクチンの調製および使用ワクチンへの使用に適する免疫原性組成物は、本明細書に開示するように、免疫原性Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体および／またはＤ１５の部分に相当するペプチドから製造することができる。ワクチンは抗Ｄ１５外膜タンパク抗体およびオプソニン作用性または殺菌性のＤ１５に対する抗体を含む抗体を生成する広範な反応を誘発する。接種した対象がヘモフィルスの危険に曝された場合には、抗体はＤ１５外膜タンパクに結合し、これにより細菌を不活性化する。オプソニン作用性または殺細菌性抗体は、疾病に対する防御の例である。ペプチドを含むワクチンは、本分野では例えば米国特許第４，６０１，９０３、第４，５９９，２３１号、第４，５９９，２３０号および第４，５９６，７９２号から一般に公知であり、これらのすべての引用文献は、参考文献として添付してある。本明細書中のその他の引用特許および引用文献は、その効果をあらためて述べなくても参考文献に含まれている。ワクチンは、注射用として、溶液または乳液として調製してもよい。Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体および／またはＤ１５の部分に相当するペプチドは、Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体またはペプチドと相容性がある生理学的に許容できる付形剤と混合することもできる。付形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール、およびこれらの組合せが含まれる。ワクチンはさらに少量の助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはワクチンの効果を高めるアジュバントを含んでいてもよい。ワクチンに対するアジュバントの効果を得るための方法には、アルミニウムの水酸化物またはリン酸塩（ミョウバン）のような薬剤を通常リン酸緩衝生理食塩中に０．０５〜０．１％になるように添加して使用する方法が含まれる。ワクチンは、皮下または筋肉注射により非経口投与することができる。あるいは、座薬または経口配合等の投与方法も可能である。座薬には、バインダーおよびキャリヤー、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。経口配合剤には、通常用いられる付形剤、例えば医薬級のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性配合剤または粉剤の形を取り、Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体および／またはペプチドを１０〜９５％含む。ワクチンは、投与配合に適した方法で、また治療的に有効で、防御性および免疫原性がある量を投与する。投与する量は、処置する対象、例えば個体の免疫系の抗体合成能力、必要ならば細胞仲介免疫反応誘発能力に関係する。投与すべき有効成分の正確な量は、現場の医者の判断による。しかし、適切な投与レベルは、この分野の専門家には容易に決定でき、Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体および／またはペプチドとしてμｇの範囲内にある。最初の免疫投与および追加免疫投与の適当な治療法も種々あるが、最初の免疫投与を行った後に引き続き投与してもよい。ワクチンの投与は、投与経路にも依存し、ホストの大きさによっても異なる。本発明のＤ１５外膜タンパクをコード化する核酸分子は、ＤＮＡの直接投与、例えば遺伝子的免疫投与のための注射、または活ベクター、例えばサルモネラ菌、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルスまたはワクシニア等を構成することによる直接免疫投与に使用してもよい。免疫系に異種抗原を保持させるために使用されているある種の活ベクターについては、例えばオヘーゲン（O'Hagen，1992）が総説している。遺伝子的免疫投与のための試験対象へのＤＮＡの直接注射のプロセスは、例えばウルマンら（Ulamn et al.，19 93）によって記載されている。ペプチドのin vivo使用には、ペプチド自身の血清および／または組織の半減期が十分長くないために、先ずその化学的修飾が必要となる。このような化学修飾ペプチドは、ペプチド類似体として本特許に記載する。ペプチド類似体の用語は、本発明の実施に関してin vivoまたはin vitroにおける高い安定度および／または効率が特徴であるペプチドと等価であるすべての機能性化学薬品にも拡大して用いる。またペプチド類似体の用語は、本明細書に記載したペプチドのすべてのアミノ酸誘導体にも拡大して用いる。ここで考えているペプチド類似体は、側鎖の修飾、ペプチド合成過程における修飾アミノ酸および／またはそれらの誘導体の組み込み、架橋剤の使用およびペプチドまたはこれらの類似体に形状的制約となるクロスリンク剤および他の方法を含む方法により製造さるれが、これに限定されるものではない。本発明で対象とする側鎖修飾の例は、例えばアルデヒドと反応させた後ＮａＢＨ₄で還元する還元性アルキル化によるアミノ基の修飾、メチルアセトイミダートを用いるアミド化、無水酢酸を用いるアセチル化、シアン酸塩を用いるアミノ基のカルバミル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いるアミノ酸のアルキル化、およびピリドキサ−５’−ホスファートを用い、その後ＮａＢＨ₄で還元するリジンのピリドキシル化である。アルギニン残基のグアニジノ基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサール等の試薬を用いる複素環式縮合物の形成により修飾することができる。カルボキシル基は、ｏ−アシリソ尿素形成を経由し、引き続き、例えば相当するアミドへの誘導体化によるカルボジイミド活性化により修飾することができる。スルフヒドリル基は、例えばヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いるカルボキシメチル化、システイン酸への過ギ酸酸化、その他のチオール化合物を用いる混合二硫化物の形成、マレイミド、無水マレイン酸またはその他の置換マレイミドとの反応、４−クロロメルクリ安息香酸、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールおよびその他の水銀化合物の形成、アルカリ性ｐＨにおいてシアン酸塩を用いるカルバミル化の方法により修飾することができる。トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモスクシンイミドを用いる酸化または臭化２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルまたはハロゲン化スルホニルを用いるインドール環のアルキル化により修飾することができる。チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いるニトロ化により３−ニトロチロシン誘導体を形成して修飾することができる。ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ヨード酢酸誘導体を用いるアリキル化またはジエチルピロカーボネートを用いるＮ−カルボエトキシル化により修飾することができる。天然に存在しないアミノ酸の組み込みおびペプチド合成過程での誘導体の例は、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体があるが、これに限られるものではない。２．免疫アッセイ本発明のＤ１５外膜タンパク、類似体、フラグメントおよび／またはペプチドは、免疫アッセイに用いられるが、これには酵素リンク免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよびその他の非酵素リンク抗体結合アッセイ、または抗菌性、ヘモフィルス、Ｄ１５および／またはペプチド抗体の検出のために従来から公知の方法が含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイでは、Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体および／またはＤ１５外膜タンパクの部分に相当するペプチドを、所定の表面、例えばタンパク親和性を有する表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートのウエル上に固定化する。吸着が不完全なＤ１５外膜タンパク、類似体、フラグメントおよび／またはペプチドを洗浄除去した後に、試験試料に対して抗原的に中性であるこが分かっている非特異性タンパク、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインを所定の表面に結合させてもよい。これは固定化表面上の非特異性吸着部位をブロックし、免疫血清の表面への非特異的結合によるバックグラウンドを低下させる。通常、これに用いるペプチドは、１２残基から好ましくは１４〜３０残基の範囲までである。次いで、免疫錯体（抗原／抗体）を形成させるために、試験しようとする臨床または生物学的物質などの試料を固定化表面と接触させる。このためには、試料を希釈剤、例えばＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）／ツイン（Tween）を用いて希釈する。次いで温度２５〜３７℃の程度で２〜４時間試料をインキュベーシヨンする。インキュベーションの後、試料と接触した表面を洗浄して免疫錯体を形成しなかった物質を除去する。洗浄手順には、ＰＢＳ／ツインまたはホウ酸塩緩衝液などの溶液を用いる洗浄も含まれる。試験試料とＤ１５外膜タンパク、類似体、フラグメントおよび／またはペプチドとの特異性免疫錯体の形成および引き続く洗浄に続き、最初の抗体に特異性を有する第二の抗体を免疫錯体に作用させて、免疫錯体生成の発生およびその量を測定しもよい。ヒト由来の試験試料の場合には、第二の抗体は、ヒト免疫グロブリンおよび一般にはＩｇＧに対して特異性を有する抗体を用いる。検出手段とするために、第二の抗体は、例えば色素を生成する適当な基質を用いてインキュべーションすることにより発色する酵素活性のような副次活性を有していてもよい。これにより、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて発色の程度を測定することにより定量することができる。３．ハイブリッド化プローブとしての配列の使用Ｄ１５外膜タンパクの配列から成る本発明のヌクレオチド配列は、Ｄ１５外膜タンパクをコード化するいかなるヘモフィルスまたは他種の細菌からでも、そのＤ１５外膜タンパク遺伝子の識別およびクローニングを可能とする。本発明のＤ１５外膜タンパクをコード化する配列から成るヌクレオチド配列は、他のＤ１５遺伝子の相補部分をと共に二重鎖分子を選択的に形成する能力に利用される。用途によっては、他のＤ１５遺伝子に対するプローブに種々の程度の選択性を与えるために、種々のハイブリッド化条件を用いることができる。高度の選択性に対しては、二重鎖形成のために厳しい条件、例えば０．０２〜０．１５ＭＮａＣｌ、温度５０〜７０℃のような低い塩濃度および／または高温条件を用いる。ある種の用途には、例えば０．１５〜０．９ＭＮａＣｌ、温度範囲２０〜５０℃のような温和な条件が必要となる。また、ハイブリッド二重鎖の安定度を低下させるために、ホルムアルデヒドを大量に加えて、ハイブリッド化条件をさらに厳しくすることもできる。このように、特定のハイブリッド化条件を容易に設定することができ、一般に目的に従って方法を選択することができる。臨床診断の態様では、本発明のＤ１５外膜タンパクの核酸配列は、ハイブリッド化を測定するための標識付与等の適当な手段と組み合わせて使用することもできる。放射能、酵素またはその他のリガンド、例えばアビジンやビオチンなど、検出可能な信号を発生する多数の適当な指示薬が以前から知られている。ある診断の態様では、酵素標識、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼが放射能標識の代わりに使用できる。酵素標識の場合に、Ｄ１５遺伝子配列を含む試料を用いた特定のハイブリッド化を識別するために、比色指示基質が、肉眼的または分光光度計で測定できる手段として使用できることは公知である。本発明のＤ１５遺伝子の核酸配列は、溶液ハイブリッド化および固相法を用いる態様におけるハイブリッド化プローブとして使用できる。固相法を用いる態様では、滲出液、体液（例えば血清、羊水、中耳滲出液、痰、気管支肺胞洗浄液）または組織などの臨床試料からの試験用ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を所定のマトリックスまたは表面に吸着または固定させる。次いで、所望の条件下で本発明のＤ１５遺伝子またはそのフラグメントの核酸配列から成る所定のプローブを用いて、固定した単一ストランド核酸を特異的にハイブリッド化させる。所定の条件は、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸のタイプ、核酸の出所、ハイブリッド化プローブの大きさなどに関連して要求される特定の判断基準に基づく特定の環境に依存する。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリッド化表面を洗浄した後に、標識を利用して特定のハイブリッド化を検出または定量する。所定のプローブは、少なくとも１８ｂｐであるが、３０ｂｐ〜９０ｂｐの範囲の長さであってもよい。４．Ｄ１５外膜タンパク遺伝子の発現ホスト細胞と相容性がある種から得られたレプリコンおよびコントロール配列を含むプラスミドベクターは、発現系内にＤ１５外膜タンパク遣伝子を発現させるために使用することができる。このベクターは複製部位の他にも、形質転換細胞中に表現型選択を与えることができるマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むｐＢＲ３２２を用いて形質転換してもよく、これは形質転換細胞を容易に識別できる手段を与える。ｐＢＲ３２２プラスミドまたはその他の微生物プラスミドまたはファージは、微生物体によりそれ自身のタンパクを発現させるために使用できるプロモーターを含むか、または含むように修飾しなければならない。その上、ホスト微生物体と相容性のあるレプリコンおよびコントロール配列を含むファージベクターは、これらのホストにおける形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ラムダＧＥＭ^TM−１１は、大腸菌ＬＥ３９２のようなホスト細胞を形質転換させるための組換えファージベクターを作るために利用できる。組換えＤＮＡ構造中に通常用られるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトーゼプロモーターシステムおよび他の微生物プロモーター、例えばＴ７プロモーターシステムも含まれる。プロモーターのヌクレオチド配列に関する詳細は公知であり、当該分野の専門家は、これらとプラスミドベクターを機能的に容易に結合させることができる。一般的に使用される特定のプロモーターは、目的に応じて選択することができる。大腸菌、バチルス、ヘモフィルス、ボルデテラ、真菌、酵母またはバクロウイルスおよびボックスウイルス発現系を含むトランスフェリンレセプター遺伝子、そのフラグメント、類似体または変異体の発現に適したホストを使用することができる。本発明の態様によると、組換え法によりＤ１５外膜タンパク、これのフラグメントまたは類似体を製造すると有利であるが、これは特にヘモフィルスの種の培養培地から精製した天然に存在するＤ１５タンパクは、痕跡量の毒性物質などの望ましくない汚染物を含んでいる場合があるからである。この問題は、精製物質中の毒素を最小にするようにホストから単離できる非相同システム中における組換え法により製造されたＤ１５外膜タンパクを用いることにより避けることができる。この観点から表現に特に望ましいホストは、リポ多糖（ＬＰＳ）を有さず、従ってエンドトキシンを含まないグラム陽性菌である。このようなホストにはバチルス種があり、非発熱原性Ｄ１５外膜タンパク、そのフラグメントまたは類似体の製造に特に有用である。生物学的寄託本明細書に記載および言及した少なくともインフルエンザ菌株からのＤ１５外膜タンパクをコード化した部分を有するいくつかのプラスミドは、ブタペスト条約に準拠し、また本発明の出願の前に、米国メリーランド州ロックビル（Rockvi lle，Maryland，USA）にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（American Type Culture Collection）に寄託した。寄託したプラスミドの試料は、米国特許出願に基づく特許付与の後、一般に公開される。寄託した態様は本発明の説明を目的とするのみであるので、本明細書に記載し特許請求する発明は、寄託したプラスミドの範囲により制限するものではない。本出願の記載と類似または等価の抗原をコード化した等価または類似のプラスミドは、本発明の範囲内に含まれる。上記の開示は本発明内の一般的な説明である。下記のそれぞれの実施例を参照すると、より完全に理解できる。これらの実施例は、説明のためであり、本発明の範囲を制限するものではない。この中で特定の用語を用いるが、この用語は説明を意図するものであって、制限するためのものではない。本公開中には免疫学的および組換えＤＮＡの方法をあらためて記載しなかったが、この分野の専門家には公知のものである。実施例利用したが本公開中にはあらためて記載していない分子遺伝学、タンパク生化学および免疫学の方法およびこれらの実施例は、科学的文献中に広く報告されており、この分野の専門家には公知のものである。実施例１本実施例はＤ１５遺伝子のクローニングおよび配列決定を説明する。バーンズとトーマス（Burns and Thomas，1965）に従って、プロナーゼおよびドデシル硫酸ナトリウムを用いて細菌を溶解させ、次いでフェノール抽出およびイソプロパノール沈殿を行ってインフルエンザ菌ｂ型株ＣａからゲノムＤＮＡを精製した。次いでＥｃｏRIを用いてＤＮＡを部分的に消化させ、低融点アガローズ中の電気泳動により６〜１０フラグメントを含むＤＮＡフラクションを単離した。これらのフラグメントをラムダｇｔｌｌＡｍｐｌベクター〔トーマスとロッシ（Thomas and Rossi），1986〕に結合させ、溶原として大腸菌BTA282株中にクローン化した。ベクターにより与えられるアピシリン耐性により、組換えクローンを選別した。インフルエンザ菌ｂ型抗原を生成するクローンを識別するために、ニトロセルロース上にクローンをレプリカ塗布し、２反復のコロニーを４２℃ 、２時間の温度スイッチにより表現させた。１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いてフィルターを濡らして、コロニーを溶解した。次いでクロロホルム飽和雰囲気中にフィルターを１５分間置いた。次いで、大腸菌溶解物に吸着させた高度免疫性ウサギ抗インフルエンザ菌ｂ型免疫血清を用いてコロニーのラジオ免疫アッセイにより、フィルターを分析抗原表現を検査した。オートラジオグラフィーによりインフルエンザ菌ｂ型抗原を生成していると認められたクローンをさらに精製し、その複製物の高度免疫性抗インフルエンザ菌ｂ型免疫血清との反応性を再度試験した。１０¹⁰個の無傷のインフルエンザ菌ｂ型（Ｃａ株）に吸着させた免疫血清を陰性対照として使用した。非吸着免疫血清とは反応し、吸着免疫血清とは反応しない多数のクローンを識別し、さらに分析を続けた。Ｄ１５のクローンの一種を精製、増殖させると、Ｍ_r 約８０ｋＤａのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中を移動するインフルエンザ菌ｂ型抗原が生成したことが認められＬＤ１５クローンからの溶解物をセファロース（Sephar ose^TM）４Ｂゲルと結合させ、抗Ｄ１５抗体のアフィニティー精製に使用した。この方法はトーマス（Thomas，1990）が記載しているが、最初のＭ_rが約１０３ｋＤａであった点が異なっている。アフィニティ−精製したＤ１５に対する抗体は、次いでインフルエンザ菌ｂ型の外膜タンパク調製物中のＭ_r８０ｋＤａタンパク〔サルコシル不溶性フラクション、カーロンら（Carlone et al.，1986〕と反応することが認められた。インフルエンザ菌ｂ型および型別不能からの膜調製物のラジオイミノドットブロットおよびウエスタンブロット法から、アフィニティー精製抗Ｄ１５抗体はすべての単離体と反応することが認められた。これらの抗体は、生インフルエンザ菌ｂ型を腹腔内注射しても、菌血症から新生仔ラットを防御する能力があることが認められた。防御の特異性は、セファロースに結合させたＤ１５を発現する大腸菌溶解物を用いて、抗Ｄ１５抗体の防御活性を吸収除去して確認した。この防御試験は、トーマスら（Thomas etal.，1990）が詳しく報告している。ラムダｇｔｌｌＡｍｐｌＤ１５ファージからのＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ消化により５．７ｋｂｐフラグメントを放出させた。このフラグメントをｐＵＣ１９中にサブクローン化し、得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させた。組換え細菌をウエスターンブロッティングで試験すると、期待していたＭ_r８０ｋＤａインフルエンザ菌ｂ型抗原が生成していることが認められた。次いで、制限エンドヌクレアーゼマッピングにより挿入ＤＮＡの特性を検討した。２．８ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＵＣ１９中にサブクローン化して、プラスミドｐＵＣ１９／Ｄ１５を生成させ、これを大腸菌ＨＢ１０１に形質転換させた。この組換え細菌は溶解大腸菌のウエスターンブロット分析でＤ１５特異性抗体により認識されるＭ_r８０ｋＤａタンパクを表現した。プラスミドＤＮＡは、標準的な方法を用いてｐＵＣ１９／Ｄ１５プラスミドを含む組換え大腸菌ＨＢ１０１の２個の個別コロニーから製造した。長さ１７〜２５塩基のオリゴヌクレチオド配列決定プライマーは、ＡＢＩモデル３８０Ａシンセサイザーを用いて合成し、アプライドバイオシステムズ社（Appalied Biosyst ems Inc．）から入手したＯＰＣカートリッジを用い、メーカーの推奨する方法に従って使用して、クロマトグラフィーを行って精製した。ＡＢＩモデル３７０ＡＤＮＡシーケンサーを用い、メ−一カーのプロトコールに従って色素ターミネーター化学によって試料の配列を決定した。この配列決定から、Ｄ１５遺伝子は推定シグナル配列を含む７８９アミノ酸をコード化したオープンリーディングフレームを含むことが認められた（図１）。誘導されたアミノ酸配列は、未修飾Ｄ１５のトロンビン消化により得られた内部ペプチドの配列を含むことが化学的に認認された。アミノ酸分析によると、Ｄ１５遺伝子配列から誘導したＤ１５のアミノ酸組成は、未修飾タンパクの配列と同様（実験誤差の範囲内）であった。実施例２本実施例は、インフルエンザ菌のイーガン、ＭｉｎｎＡ、ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５株からの染色体ＤＮＡの製造を説明する。インフルエンザ菌は、ミュラー−ヒントン（Mueller-Hinton）寒天上またはハークネスら（harkness et al.，1992）が記載している脳−心臓浸出物ブイヨン中で培養した。イーガン染色体ＤＮＡ４℃、５，０００ｒｐｍで、２０分間遠心分離を行い、培養液５０ｍＬから細菌をペレット化した。２５ｍＬのＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中にペレットを懸濁させ、５ｍＬを２点採って染色体ＤＮＡを調製した。各試料に１０％サルコシル０．６ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬプロテナーゼＫ０．１５ｍＬを加え、３７℃で１時間インキュベーシヨンした。トリス飽和フェノール（ｐＨ８．０）を用いて一回、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて３回、溶解物を抽出した。水相をプールして、最終体積７ｍＬとした。次いで、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．７ｍＬおよびイソプロパノール４．３ｍＬを加えてＤＮＡを沈殿させ、これをスプールし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、水１ｍＬ中に再懸濁した。ＭｉｎｎＡ、ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５染色体ＤＮＡソルボール（Sorvall）ＲＣ−３Ｂ遠心分離機を用いて、４℃、５，０００ｒｐｍで、１５〜２０分間遠心分離し、培養法５０ｍＬから細菌をペレット化した。２５ｍＬのＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中にペレットを再懸濁させ、プロナーゼを５００μｇ／ｍＬ、ＳＤＳを１％となるように加えた。透明な溶解物が得られるまで、３７℃で約４時間インキュベーションした。トリス飽和フェノールを用いて一回、トリス飽和フェノール／クロロホルム（１：１）を用いて１回、クロロホルムを用いて１回溶解物を抽出した。最終の水相を、４℃で１ＭＮａＣｌの２ｘ５００ｍＬに対して２４時間透析し、緩衝液を一回交換し、２ｘ５００ｍＬのＴＥに対して２４時間透析し、緩衝液を一回交換した。以後の試験のために最終の透析物を採取した。実施例３本実施例は、インフルエンザ菌染色体ライブラリーの調製を説明する。インフルエンザ菌イーガンおよびＰＡＫ１２０８５染色体ＤＮＡを３７℃で１５分間Ｓａｕ３ＡＩ（０．５単位／１０μｇＤＮＡ）を用いて消化し、アガロースゲル電気泳動により大きさを分画した。１５〜２３ｋｂのＤＮＡフラグメントに相当するゲルスライスを切除し、ＴＡＥ（４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３ｍＬを含む透析管中で１４Ｖにおいて一晩電気溶出した。ＤＮＡを２回沈殿させ、水に再懸濁させ、次いでＥＭＢＬ３Ｉアーム（Pr omega）を用いて一晩結紮させた。ラムダin vitroパッキングキット（Amersham ）を用いて、メーカーの指示に従って結紮混合物をパッケージし、大腸菌ＮＭ５３９細胞上に塗布した。ライブラリーを滴定し、次いで増殖させ、０．３％クロロホルム中、４℃で保管した。ＭｉｎｎＡ染色体ＤＮＡ（１０μｇ）はＳａｕ３ＡＩ（４０単位）を用いて、２、４および６分間消化し、次いでＴＮＥ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＮａＣｌ、１ｍＬＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で１０〜３０％スクロースでグラジエントを行って分画した。５ｋｂ以上のＤＮＡフラグメントを含むフラクションをプールし、沈殿させた。第二の実験では、染色体ＤＮＡ（２．６μｇ）をＳａｕ３ＡＩ（４単位）で、１、２および３分間消化し、分取アガロースゲル電気透析により大きさを分画した。１０〜２０ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むゲルスライスを切除し、ＤＮＡを標準的なの冷凍／解凍法により抽出した。２回の実験で得られた大きさを分画したＤＮＡをプールして、ＥＭＢＬ３Ｉ（Promega）のＢａｍＨＩアームを用いて結紮した。結紮混合物をギガパックＩＩパッケージングキット（Gigapack II packaging kit (Amersha m)）を用いてパッケージし、大腸菌ＬＥ３９２細胞上に塗布した。ライブラリーを滴定し、次いで増殖させ、０．３％クロロホルム中、４℃で貯蔵した。ＳＢ３３染色体ＤＮＡ（２０μｇ）はＳａｕ３ＡＩ（４０単位）で、２、４および６分間消化し、次いでＴＮＥ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で１０〜３０％スクロースでグラジエントを行い分画した。５ｋｂ以上のＤＮＡフラグメントを含むフラクションをプールした。第二の実験では、ＳＢ３３染色体ＤＮＡ（２μｇ）をＳａｕ３ＡＩ（４単位）で、２、４および６分間消化し、分取アガロースゲルにより大きさを分画した。１０〜２０ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むゲルスライスを切除し、ＤＮＡを標準的な冷凍／解凍法により抽出した。２回の実験で得られた大きさを分画したＤＮＡをプールして、ＥＭＢＬ３Ｉアーム（Promega）のＢａｍＨＩアームを用いて結紮した。結紮混合物をギガパックＩＩパッケージングキットを用いてパッケージし、大腸菌ＬＥ３９２細胞上に塗布した。ライブラリーを滴定し、次いで増殖させ、０．３％クロロホルム中、４℃で貯蔵した。実施例４本実施例は、ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを説明する。イーガン、ＭｉｎｎＡ、ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５ＤＮＡライブラリーを、ＮＺＣＹＭプレート上のＬＥ３９２細胞に塗布し、ＮＺＣＹＭ中の０．７％トップアガロースを重ねた。標準的方法に従って、ニトロヤルロースフィルター上ヘプラークリフトを行い、メーカー（Bohringer Mannheim）の仕様に従って調製したジゴキシゲニン標識Ｄ１５プローブを用いてフィルターを処理し、ハイブリッド化した。このプローブは、ＣａＤ１５遺伝子をすべて含むｐＵＣ１９／Ｄ１５からのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであった（図２）。推定プラークを塗布し、同じ手順による２回目のスクリーニングを実施した。ファージＤＮＡは、標準的技術を用いて培養液５００ｍＬから調製し、挿入ＤＮＡはＳａｌＩ消化により切除し、ｐＵＣにクローン化して、クローンＤＳ７１２ − ２−１（イーガン）、ＤＳ−６９１−１−５（ＭｉｎｎＡ）、ＪＢ−１０４２− ５−１（ＳＢ３３）、およびＪＢ−１０４２−９−４（ＰＡＫ１２０８５）を生成させた。これを図２に記載する。インフルエンザ菌ｂ型株イーガンおよびＭｉｎｎＡ、型別不能インフルエンザ菌株ＳＢ３３およびＰＡＫ１２０８５からのＤ１５遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、Ｃａ株のものと比較して、図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅに示す。目的とするアミノ酸配列は、図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄおよび１Ｅに示し、またインフルエンザ菌ｂ型ＣａからのＤ１５タンパクのアミノ酸配列と比較した（図３）。実施例５本実施例は、大腸菌中のｒＤ１５タンパクの表現について説明する。２．８ｋｂフラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲ１をｐＵＣ１９にサブクローンし、このｐＵＣ１９／Ｄ１５プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。誘導後、陽性クローンは８０ｋＤａタンパクを表現し、これはウエスタンブロット分析でＤ１５特異性免疫血清により識別された。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントもｐＵＣ１９にサブクローン化すると、６７ｋＤａタンパクを表現した。制限酵素切断地図によると、この６７ｋＤａタンパクはＣ末端切除Ｄ１５タンパクに相当した。ウエスタンブロット分析では、この切除Ｄ１５タンパクもまだＤ１５特異性免疫血清により識別された。型別不能株ＳＢ３３のＤ１５遺伝子を大腸菌中に表現するプラスミドを構築した。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＳＢ３３Ｄ１５遺伝子を含むプラスミド１０４２−５−１およびの隣接領域を消化し、Ｄ１５インサートを３ｋｂｐＵＣにサブクローンし、プラスミドｐＲＹ−６０−１を得た（図４）。表現プラスミドｐＴ７−７のＡＴＧコドンとＤ１５遺伝子中のＢｓｒＦＩサイトの間の未修飾Ｄ１５配列を回復させるために、適当なオリゴヌクレチオドを合成した。このオリゴヌクレチオドは下記の配列を有していた。Ｎｄｅ５’− ＴＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧ− 配列番号５０ＴＧＧＴＴＧＴＴＴＡＧＧＣＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＣ−５’一配列番号５１ＢｓｒＦＩＥｃｏＲＩおよびＢｓｒＦＩを用いてプラスミドｐＲＹ６０−１を消化し、大部分のＤ１５遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを精製した。ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩを用いてｐＵＣを消化し、ベクターフラグメントを精製した。ｐＵＣおよびＤ１５フラグメントおよびオリゴヌクレオチドの間の多成分結紮により、プロモーターを含まないＳ１５配列を含むプラスミドＤＳ−８６０−１−１を生成した。ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＴ７−７を消化し、ベクターフラグメントを精製した。ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いてＤＳ−８６０−１−１を消化し、Ｄ１５インサートを精製し、Ｔ７−７と結紮するとプラスミドＤＳ−８８０−１−２が生成した（図４）。プラスミドの構築は、ホストとして大腸菌ＪＭ１０９を用いて行った。表現させるために、プラスミドＤＳ−８８０−１−２を大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３、ＢＬ２１／ＤＥ３／ｐＬｙｓＳまたはＪＭ１０９／ＤＥ３細胞に形質転換させた。細胞の形質変換は、塩化カルシウムで処理したコンピテント細胞またはＢｉｏＲａｄエレクトロポレーターを用いるエレクトロポレーションを用いて行った。形質転換細胞をＹＴ、Ｍ９またはＮＺＣＹＭ媒体中で増殖させ、ＩＰＴＧまたはその他の誘発剤を用いて誘発させた。実施例６本実施例は、大腸菌中のＧＳＴ−Ｄ１５フラグメントハイブリッド遺伝子の構成および発現を説明する。前進プライマー（プライマー１）５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＧＴ（配列番号５２）および後退プライマーＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣ−５’（プライマー７、配列番号５３）を用いて、ポリマーゼ連鎖反応により、Ｄ１５タンパクの一次配列のＮ末端アミノ酸残基２２〜２２３をコード化したＤ１５遺伝子の２．８ｋｂフラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩを増殖させた。６０９ｂｐ増殖フラグメントのヌクレチオド配列は、ＤＮＡ配列決定により確認した。増殖遺伝子フラグメントをＧＳＴ遺伝子の下流のｐＧＥＸ−２Ｔベクターに結紮し、大腸菌ＴＧ−１を形質転換させた。ウサギ抗インフルエンザ菌ｂ型免疫血清を用いたコロニーラジオ免疫アッセイにより、インフルエンザ菌ｂ型抗原を表現するコロニーをスクリーニングし、単離した。形質転換大腸菌から製造したグルアチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｄ１５フラグメント融合タンパクを、グルタチオンアガロース上のアフィニティー精製により単離した実施例７本実施例は、別のｒＤ１５のための別の表現システムを説明する。Ｄ１５遺伝子およびそのフラグメントは、他の制御されたプロモーターの制御の下で大腸菌中に表現される。Ｄ１５遺伝子およびそのフラグメントは、リーダーペプチドが存在しないように、またはＤ１５表現によるホストに対する毒性が問題とならない別のクローン化系に表現させる。遺伝子およびそのフラグメントは、de novoあるいは適当なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により合成する。これらの遺伝子を大腸菌内の適当なクローニングベクター、またはバクテリオファージベクターまたは毒性が避けられる場合には他のホストに直接クローン化する。表現系は、グラム陽性細菌（例えばバチルス種）、ポックスウイルス、アデノウイルス、バクロウイルス、酵母、真菌、ＢＣＧまたは哺乳類表現系である。実施例８本実施例は、大腸菌表現系からのｒＤ１５の抽出および精製のプロトコールを説明する。２５０ｍＬ培養液から、実施例５に記載した方法で調製した細胞ペレットを、５０ｍＬトリス、ｐＨ８．０、４０ｍｌ中に再懸濁し、音波処理（３ｘ１０分、７０％デューティサークル）により破壊した。抽出液を２０，０００ｘｇで遠心分離し、得られたペレットを保存した。５０ｍＭトリス、０．５％トライトンＸ −１００、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、４０ｍｌを用いて、最初のペレットを再抽出した。次いで懸濁液を１０分間７０％デューティサークルで音波処理した。抽出液を３００ｘｇで５分間遠心分離した。得られた上清を再び２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、得られたペレットを保存した。５０ｍＭトリス、０．５％トライトンＸ−１０００．５、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に得られたペレットを再懸濁した。次いで懸濁液をＰＢＳ／８Ｍ尿素を混合して最終尿素濃度６Ｍとした。溶液をＰＢＳに対して透析して尿素を除いた。透析の後、溶液を３００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を分取し、４℃で保管した。実施例９本実施例は、グルタチオン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーを用いるＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）融合タンパクの精製を説明する。実施例６に記載した方法により製造したＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）融合タンパク５ｍｇを、１％トライトンＸ−１００を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬに溶解した。次いで、１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳと平衡化させたグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（２ｍＬ）にこの溶液を注入した。カラムの通過物は廃棄した。ＰＢＳ２０ｍＬを用いてカラムを洗浄すると、５ｍＭグルタチオンを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０によりＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）融合タンパクが溶出した。溶出は２８０ｎｍの吸収でモニターした。タンパク含有フラクション（２ｍＬ／フラクション）を集めてプールした。タンパクの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験した（図９、レーン３）。精製融合タンパクの最終体積は６ｍＬであった。実施例１０本実施例は、末端切断Ｄ１５分子を放出するタンパクのチオンビン消化に使用したプロトコールを説明する。実施例９からのＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）融合タンパク試料（０．１〜０．５ｍｇタンパク／ｍＬ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）１Ｌに対して３回、少なくとも２間間隔で４℃において透析してプロテアーゼ阻害物質を除いた。透析後、トロンビン２５単位に対して溶液１ｍＬの割合でヒトトロンビン（Sigma）を用いて処理した。切断反応は３７℃で２時間行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図９、レーン４）。溶液を氷内に入れて反応を停止させた実施例１１本実施例は、グルタチオン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーを用いるＧＳＴからのＮ末端ｒＤ１５フラグメントのフラグメント精製手順を説明する。実施例１０の記載のようにして製造したトロンビン消化ＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）試料を、１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳと平衡しているグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（２ｍＬ）にこの溶液を注入した。Ｎ末端ｒＤ１５フラグメントを含むカラムの通過物を保存した。ＰＢＳ２０ｍＬを用いてカラムを洗浄した後、グルタチオン５ｍＬを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０を用いてＧＳＴを除去してアフィニティーカラムを再生した。ｒＤ１５フラグメントの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図９、レーン５）。このＮ末端ｒＤ１５フラグメントは、図１Ａに示す広いトロンビンサイトの切断の結果、Ｄ１５タンパクのアミノ酸６３〜２２３を含む。実施例１２本実施例は、ＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）融合タンパクを用いるアフィニティークロマトグラフィーによるＤ１５特異性ポリクロナール抗体の精製に使用したプロトコールを説明する。実施例９に記載の方法で製造した組換えＧＳＴ（Ｄ１５フラグメント）融合タンパクを、臭化シアン活性化ファロースに共役させた。次いで、ウサギ高度免疫性抗インフルエンザ菌ｂ型免疫血清から抗体を精製した。免疫ブロッティングにより、このアフィニティー精製抗体は、ｐＵＣ／Ｄ１５を用いて形質転換した大腸菌の溶解物中および数種の型別可能および未型別可能インフルエンザ菌単離物の溶解物中に存在する８０ｋＤａ成分と反応することが認められた。この結果から、融合タンパクのＤ１５フラグメントをコード化するＤＮＡフラグメントが、Ｄ１５遺伝子のオープンリーディングフレームの一部であることが確認された。同様に、組換え融合タンパク（実施例９）または精製Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント（実施例１１）に対して生成した免疫血清は、インフルエンザ菌株により生成したＤ１５タンパクと反応する（実施例１３）。実施例１３本実施例は、インフルエンザ菌の未修飾Ｄ１５の精製に使用したプロトコールを説明する。パネツッティら（Panezutti et al.，1993）が報告したＮＡＤ（２μｇ／ｍＬ）およびＨＥＭＩＮ（２μｇ／ｍＬ）を補充した脳−心臓浸出物培地中で増殖した培養液から調製した型別不能インフルエンザ菌ＳＢ３３株の細胞ペーストを、０．５％トリトンＸ−１００および１０ｍＭＥＤＴＡ（細胞ペースト１ｇ当たりに２０ｍＬ）を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中に再懸濁させた。この混合物を室温で２時間撹拌し、次いで２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。Ｄ１５は上清中に存在し、さらに精製した。Ｄ１５特異性モノクロナール抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより未修飾Ｄ１５を精製した（実施例２４参照）。Ｄ１５抽出液（２５ｍＬ）を室温で２時間アフィニティーマトリックス（１ｍＬ）と混合させた。この混合物をカラム内に装入し、通過フラクションは廃棄した。カラムを下記の緩衝液で順次洗浄した。０．５％トリトンＸ−１００および１０ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ＭＨＥＰＳ緩衝液、ｐＨ６．８；０．５％トライトンＸ−１００および１０ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；および１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０。次いで、５０ｍＭジエチルアミン、ｐＨ１２．０の３ｍＬを用いてカラムからＤ１５を溶出させ、ＩＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８（１／１０体積）によりタンパク溶液を中和した。アフィニティ一精製未修飾Ｄ１５をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、−２０℃で保管した。実施例１４本実施例はＤ１５−ＰＲＰ抱合体の製造に使用した手順を説明する。制御した酸加水分解により製造したインフルエンザ菌ｂ型オリゴ糖（ＰＲＰ）を、米国特許４，３５６，１７０号に記載の過ヨード酸塩酸化法を用いて、精製未修飾（実施例１３）または組換えＤ１５（実施例８）ならびにそのフラグメント（実施例１１）と共役させたが、その詳細は実施例１７に述べる。複合に用いたＰＲＰ分子の平均した分子の大きさは、約２０，０００ドルトンと測定された。リンカー分子を用いないで共役を行ったが、リンカー分子を用いても実施できる。過剰のＰＲＰハプテンを得るために、モル比率約７のＰＲＰ／Ｄ１５を用いた。ＰＲＰ／ｒＤ１５共役体は。、ウサギの免疫原性にする実施例１８のプロトコールに従って試験し、一次および二次抗ＰＲＰＩｇＧおよび抗Ｄ１５抗体反応を誘出した（表９）。免疫ブロット法によると、ウサギ抗ｒＤ１５ＰＲＰ免疫血清は、未修飾Ｄ１５およびｒＤ１５のいずれとも強く反応した。これらのデータは、ｒＤ１５が共役ワクチン中のキャリヤータンパクとして使用できることを示している。さらに、ｒＤ１５−ＰＲＰ共役ワクチンは、Ｄ１５タンパクに対する抗体により与えられる追加の単型予防の結果として、インフルエンザ菌ｂ型疾病、特に幼児に対して一様に防御を確保するであろう。実施例１５本実施例は、Ｄ１５ペプチドの製造を説明する。Ｄ１５ペプチド（表２）は、ＡＢＩ４３０Ａペプチドシンセサイザーを用いて合成し、メ一カーの記載のようにしてｔ−Ｂｏｃ化学を最適化し、次いでフッ化水素酸（ＨＦ）によ樹脂から切断した。このペプチドは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で１５〜５５％アセトニトリルグラジエントを行い、４０分間、流量２ｍＬ／分でバイダック（Vydac）Ｃ４半分取カラム（１ｘ３０ｃｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製した。生化学および免疫学的試験に用いたすべての合成ペプチド（表２）は、分析用ＨＰＬＣで判断して純度９５％以上であった。ウオーターズ・パイコータグ・システム（Waters Pico-Tag Syst em）を用いて行ったこれらのペプチドのアミノ酸組成分析は、その理論組成と良く一致した実施例１６本実施例は、Ｄ１５ペプチド特異性免疫血清製造に用いたプロトコールを説明する。フロイントの完全アジュバントで乳化した個別のペプチド（５０〜２００μｇ）を筋肉内注射して、モルモットおよびウサギを免疫投与した。１４日および２８日後に不完全フロイントアジュバント中の等量のペプチドを２回追加免疫投与した後、抗ペプチド免疫血清を４２日目に採取し、ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロッティングにより試験した。ペプチド特異性ＥＬＩＳＡによると、ウサギおよびモルモットのいずれの免疫血清も、それぞれの免疫ペプチドに対して単一特異性であることが認められた（表６）。その上、免疫ブロット分析では、Ｄ１５ペプチドに対して生成したモルモットおよびウサギのいずれの免疫血清も、インフルエンザ菌ｂ型および型別不能Ｄ１５と反応した。少なくとも一種の動物内で、大部分のＤ１５ペプチドは強いペプチド抗体反応を誘発したので、これらはワクチン調剤を含む免疫原性組成物中に含むべき適当な免疫原である。実施例１７本実施例は、ＰＲＰ−ＢＳＡ共役体調製に用いた手順を説明する。過ヨード酸水溶液〔カーローンら（Carlone et al）1986〕を用いて処理した未修飾ＰＲＰから調製した過ヨード酸塩酸化ＰＲＰ（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、１ｍＬ中に２５ｍｇ）０．５ｍＬに、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、０．５ｍＬ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１．３２ｍｇ；０．０２μモル）を加え、次いでシアノホウ水素化ナトリウム（１４μｇ，０．２２μモル、ＢＳＡの１０当量）を加えた。３７℃で５日間インキュベーションした後、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５、に対して透析した。得られた溶液を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、と平衡化した分析用スペロース（Superose）１２カラム〔１５ｘ３００ｍｍ、ファルマシア（Phar macia）〕に注入し、同じ緩衝液を用いて溶出した。フラクシヨンは、２３０ｎｍの吸収によりモニターした。最初の大きいタンパクピークをプールし、セントリプレップ（Centriprep）３０中で２．２ｍＬまで濃縮した。タンパクの量は、バイオラド（Bio Rad）タンパクアッセイを用いて測定し、３００μｇ／ｍＬであった。タンパク抱合フラクション中のＰＲＰの存在は、オルシノール試験により確認した。実施例１８本実施例は、ｒＤ１５−ＰＲＰを用いる動物中の抗ＰＲＰ免疫血清の製造に用いたプロトコールを説明する。ｍＬ当たり３ｍｇのＡｌＰＯ₄を混合したｒＤ１５−ＰＲＰ共役体（実施例１４）（５〜５０ｇＰＲＰ当量）を用いて、ウサギに筋肉内免疫投与し、次いで２週間間隔で２回追加免疫（同じ免疫原の半分量）投与した。最初の注射の後、２週間毎に免疫血清を採取し、５６℃、３０分間で熱不活性化し、−２０℃で保管した。実施例１９本実施例は、Ｄ１５特異性およびペプチド特異性ＥＬＩＳＡを用いるＤ１５ペプチドおよび抗ペプチドおよびＤ１５特異性免疫血清の間の反応性を説明する。コーティング緩衝液（１５ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、３５ｍＭＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）５０μＬ中の精製ｒＤ１５２００ｎｇまたはそれぞれのペプチド５００ｎｇを用いて、マイクロタイターウエル（Microtiter well，Nunc-Immunoplat e，Nunc，Denmark）を１６時間室温で被覆した。次いでリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ中の０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用い、３０分間、室温でプレートをブロックした。逐次希釈した免疫血清をウエルに加え、１時間、室温でインキュベーションした。免疫血清を取り出した後に、０．１％（ｗ／ｖツイン２０および０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを用いてプレートを５回洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼ（Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，PA）に共役させたヤギ抗ウサギ、モルモット、マウスたはヒトＩｇＧ抗体からのフラグメントを洗浄用緩衝液で希釈し（１／８０００）、マイクロタイタープレート上に加えた。室温で１時間インキュベーションした後に、洗浄用緩衝液を用いてプレートを５回洗浄した。次いでＨ₂Ｏ₂中の中の基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（AD I，Toronto）を用いてプレートを展開した。反応を１ＮＨ₂ＳＯ₄を用いて停止し、タイターテックマルティスカンII（Titretek Multiskan II，Flow Labs，Vi rginia）を用い４５０ｎｍで吸光度を測定した。２種の無関係のタンパクをペプチド特異性ＥＬＩＳＡ中の陰性対照とした。試験は３回行い、各免疫血清の反応性力価は、陰性対照から得た値に対して吸光度が常に２倍となる希釈度と定義した。得られた結果を表３、６および８および上記の発明の詳細な説明の項に記載した。実施例２０ＰＲＰ特異性ＥＬＩＳＡを用いるウサギ抗ＰＲＰ−Ｄ１５共役免疫血清中の抗ＰＲＰＩｇＧタイターの測定を説明する。コーティング緩衝液（１５ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、３５ｍＭＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）中の精製ＰＲＰーＢＳＡ（実施例１７参照）２００ｎｇを用いて、マイクロタイターウエル（Nunc-Immunoplate，Nunc，Denmark）を被覆して１６時間室温に置いた。次いでリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて、３０分間室温でプレートをブロックした。ＰＲＰ−Ｄ１５に対して生成し逐次希釈したウサギ免疫血清をウエルに加え、１時間、室温でインキュベーションした。免疫血清を除いた後に、０．１％（ｗ／ｖ）ツイン−２０および０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳを用いてプレートを５回洗浄した。ホースラデイシュペルオキシダーゼ（Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，PA）に共役させたヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体からのＦ（ａｂ’）₂フラグメントを洗浄用緩衝液で希釈し（１／８０００）、マイクロタイタープレート上に加えた。室温で１時間インキュベーションした後に、洗浄用緩衝液を用いてプレートを５回洗浄した。次いでＨ₂Ｏ₂中の基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ADI，Toronto）を用いてプレートを展開した。反応を１ＮＨ₂ＳＯ₄中で停止し、タイターテックマルティスカンII（Flow Labs，Virginia）を用い４５０ｎｍで吸光度を測定した。力価既知の標準抗ＰＲＰ免疫血清を陽性対照として含めた。試験は３回行い、各免疫血清の反応性力価は、前免疫血清から得たＯ．Ｄ．値に対して定常的に２倍となる希釈度の逆数として定義した（表９）。実施例２１本実施例は、精製Ｄ１５、ｒＤ１５またはＮ末端ｒＤ１５フラグメントを用いるＤ１５特異性免疫血清の製造に用いたプロトコールを説明する。フロイントの完全アジュバント（Difco）中で乳化したアフィニティー精製未修飾Ｄ１５（実施例１３）、組換えＤ１５（実施例８）またはＮ末端ｒＤ１５フラグメント（実施例１１）のいずれかを１０μｇの用量で、ニュージーランド白色種ウサギ（Maple Lane）およびモルモット（Charles River）の筋肉内に免疫投与（ＩＭ）した。２８日目にフロイントの不完全アジュバント中で乳化したアフィニティー精製Ｄ１５またはｒＤ１５またはｒＤ１５フラグメントを１０μｇの用量で追加免疫投与し、４２日目に耳の末梢血管から採血した。Ｄ１５特異性ポリクロナール抗体は、実施例１２に記載のようにしてこの物質から精製した。実施例２２本実施例は、菌血症の新生仔ラットモデルを用いるインフルエンザ菌ｂ型の攻撃誘発に対するＤ１５特異性免疫血清の防御活性を説明する。２種の異なるウサギ抗Ｎ末端ｒＤ１５フラグメント０．１５ｍＬを用いて、５日齢のラット新生仔の背面に皮下（ＳＣ）接種した。前免疫血清を陰性対照として使用した。免疫投与後１日目に、補因子を補充した脳−心臓浸出物（ＢＨＩ）培地中で新しく増殖し、０．５ｍＭＭｇＣｌ₂および０．１５ｍＭＣａＣｌ₂ を含むＰＢＳで希釈したインフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ（０．１ｍｌ）２００コロニー形成単位を腹腔内に注射した。１日後、メトキシフルラン麻酔し、心臓穿刺により採血し、チョコレート寒天プレート上に塗布した。血液ｍＬ当たりの細菌数を２４時間後に定量した。対照と比較した菌血症のレベルの統計学的有意差をスチューデントのｔ検定により解析した。結果を表１に総括した。実施例２３本実施例は、Ｄ１５特異性Ｔ細胞系の生成に使用するプロトコールを説明する。リン酸アルミニウム（ミョウバン）１．５ｍｇに吸着させた２０μｇのｒＤ１５を用い１、チャールズ・リバー・アニマル・ファーム（Charles River Anim al Farm．Montreal，Canada）から購入したＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）系マウスの皮下に免疫投与した。３週間間隔で、同量の免疫原を２回迫加免疫投与した。最後の追加免疫投与１０日後に、免疫投与したマウスの牌臓を取り出した。１０％熱不活性化子牛胎児血清（Gibco）、２ｍＭＬ−フルタミン（Flow Lab．）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Flow Lab．）および５ｘ１０^-5Ｍ２−メルカプトエタノール（Sigma）を補充して最終体積２００μＬとしたＰＲＭＩ１６４０培地（F low Lab．）を含む９６ウエルプレート（nunc，Denmark）中に各Ｄ１５ペプチド（表２）を種々の濃度（１、１０および１００μｇ／ｍＬ）で添加し、ウエル当たり５．７５ｘ１０⁵個の牌臓細胞を加えて培養した。５％ＣＯ₂／空気の存在下の加湿インキュベーター中で培養した。各ペプチドの各濃度毎に３個ウエルを用いた。５日後に、培地で希釈した１０％ラットコンカナバリンＡ培地上清１５０ μＬを、マイクロタイタープレートウエルに加え、ペプチド特異性Ｔ細胞を増殖させるためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）の原料とした。６日後、各マイクロカルチャーから上清１５０μＬを取り除き、ペプチド特異性Ｔ細胞の高い生存率を維持するために、培地上清を含む新しいＩＬ−２の１５０μ Ｌを加えた。さらに６日インキュベーションした後、それぞれ培地２００μＬを用いて、細胞を３回洗浄した。最終体積２００μＬ中２ｘ１０⁵個の照射（１，５００ｒａｄ）ＢＡＬＢ／ｃ牌臓細胞の存在下で、相当濃度（ｍＬ当たり１、１０およびμｇ）のペプチドで、各培養細胞を刺激した。次いで、上清６０μＬを各マイクロカルチャーから取り除いた。次いで、各３反復の培地上清をプールした。すべての上清について、ＩＬ−２、インターロイキン−４およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を試験した。ＩＬ−２およびＩＬ−４の検出は、それぞれエンドゲン社（Endogen In c.，MA，USA）から購入したマウスＩＬ−２およびＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。ＩＦＮ−γの試験は、ジェンチーム社（Genzyme Corporation，ＭＡ，USA）が供給するマウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットを用いて行った。試験培地上清は、メーカーの指示に従って１対５に希釈して試験した。得られた結果は、表７に記載する。実施例２５本実施例は、マウスＤ１５特異性モノクロナール抗体の製造に使用した一般的手順を説明する。フロイントの完全アジュバント中で乳化させたＮ末端ｒＤ１５フラグメント（実施例１１）２０〜５０μｇを、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内に免疫投与した。２週間後に、さらに不完全フロイントアジュベント中（ＩＦＡ）の同量の免疫原を注射した。融合３日前に、ＩＦＡ中の同量の免疫原を迫加免疫投与した。すでにハンメルら（Hammel et al.，1987）により記載されている方法に従って、非分泌性Ｓｐ２／０骨髄腫細胞を免疫投与マウスからの牌臓リンパ球に融合させて雑種細胞を製造した。Ｄ１５特異性雑種細胞を逐次限界希釈によりクローンし、抗Ｄ１５モノクロナール抗体製造のためにスクリーニングした。８種のＤ１５特異性雑種細胞細胞系を識別し、増殖し、液体窒素中に冷凍保存した。雑種細胞の１種の６Ｃ８−Ｆ６−Ｃ６は、部分的に特性が検討されている。モノクロナール抗体（６Ｃ８−Ｆ６−Ｃ６）は、ペプチドＤ１５−Ｐ８と反応する。このＭＡｂ６Ｃ８−Ｆ６−Ｃ６は、Ｄ１５特異性ＭＡｂアフィニティー性カラムの製造およびインフルエンザ菌細胞ペーストからの未修飾Ｄ１５の生成に使用される（実施例１３）。開示の要約本開示を要約すると、本発明は、Ｄ１５外膜タンパクをコード化した遺伝子を含む精製および単離した核酸分子、これらの遺伝子の配列およびこれから誘導されるアミノ酸配列を提供する。本発明は、またＤ３５外膜タンパクの部分に相当するペプチドも提供する。さらに、本発明は、Ｄ１５外膜タンパク、フラグメントおよびペプチドに対して生成する抗体も提供する。この遺伝子、ＤＮＡ配列、抗体およびペプチドは、診断、免疫投与および診断および免疫学的試薬の生成に使用される。表現した組換えＤ３５、その部分または提供した配列から誘導されるペプチドは、インフルエンザ菌疾病の防御に使用できる。本発明の範囲内で、改良も可能である。参考文献１５日齢のラット新生仔に０．１５ｍｌのウサギ抗Ｎ−末端ｒＤ１５フラグメントを皮下注射して、受動的免疫投与を行った。１日後に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型ＭｉｎｎＡ株２００ｃｆｕ（０．１ｍｌ腹腔内注射）で攻撃誘発を行った。攻撃誘発２４時問後に各ラットから血液を採取し、細菌数を測定した。２括弧内の数値は、分母が攻撃誘発を行ったラット数、分子が菌血症を発症したラット数ウサギ抗Ｎ−末端ｒＤ１５フラグメント抗血清（抗ｒＤ１５フラグメントＡｂ）１．５ｍｌを９種類のＤ１５ペプチドのいずれか（ペプチドＤ１５−Ｐ２〜Ｄ１５−Ｐ１０，１００μｇ、表２参照）または６００μｇのＮ−末端ｒＤ１５フラグメントを室温で１時間混合した。ＰＢＳで混合した抗血清とペプチドを対照とした。７日齢のラット新生仔に各調製物０．２ｍｌを皮下注射した。２４時問後に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型ＭｉｎｎＡ株２００ｃｆｕを腹腔内注射して攻撃誘発を行った。攻撃誘発２４時間後に血液を採取した。括弧内の数値は、分母が攻撃誘発を行った動物数、分子が菌血症を発症した動物数を表す。菌血症のレベルは、供試した６匹の新生仔の平均±１ＳＤで示す。ウサギ抗−ｒＤ１５フラグメント抗血清（ｒＤ１５Ａｂ）１．５ｍｌを５種類のＤ１５ペプチドのいずれか（ペブチドＰ４〜Ｐ８，２５０μｇ）を室温で１時間混合した。ＰＢＳで希釈した抗血清とペプチドを対照とした。７日齢のラット新生仔に各調製物０．２ｍｌを皮下注射した。２４時問後に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｈｚａｅｂ型ＭｉｎｎＡ株２００ｃｆｕを腹腔内注射して攻撃誘発を行った。攻撃誘発２４時問後に血液を採取した。括弧内の数値は、分母が攻撃誘発を行った動物数、分子が菌血症を発症した動物数を表す。菌血症のレベルは、供試した６匹の新生仔の平均±１ＳＤで示す。１反応性力価は、ペプチド特異性ＥＬＩＳＡの測定値。＋、＋＋、＋＋＋および＋＋＋＋は、それぞれ1/300、1/1000、1/2000および1/5000希釈で測定した動物の反応性抗血清の力価を示す。−は反応性のないことを意味する。２２匹のウサギにおけるｒＤ１５に対する抗血清力価の平均値３２匹のモルモットにおけるｒＤ１５に対する抗血清力価の平均値４５匹のマウスにおけるｒＤ１５に対する抗血清力価の平均値１結果は３回培養の平均で表示。標準偏差は、いずれも１５％以下であった。免疫優勢Ｔｈ１−細胞エピトープは太字で表示し、Ｔｈ０細胞エピトープはイタリック体で表示する。１反応性力価はペプチド特異性ＥＬＩＳＡで測定。力価が５００以下の場合、ペプチドは免疫原性を有さない。２２匹のウサギにおけるＤ１５ペプチド抗血清の平均値３２匹のモルモットにおけるＤ１５ペプチド抗血清の平均値４ＮＴ：試験せず１３ｍｇ／ｍｌのＡＬＰＯ⁴と混合したｒＤ１５−ＰＲＰ抱合体（ＰＲＰとして５〜５０μｇ相当量）を筋肉内に免疫投与し、２週間間隔で２回追加免疫投与した（同じ免疫原を半量。）２反応性力価はＰＲＰ特異性およびＤ−１５特異性ＥＬＩＳＡで測定。

【手続補正書】【提出日】１９９５年８月２日【補正内容】請求の範囲１少なくともヘモフィルス属のＤ１５外膜タンパクをコードした部分，および（ａ）図１Ａないし１Ｅのいずれかに記載のＤＮＡ配列（配列番号１、３、５、７または９）、（ｂ）図１Ａないし１Ｅのいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号２、４、６、８または１０）、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義した配列の９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列からなる群から選ばれる一のＤＮＡ配列を有することを特徴とする精製し単離した核酸分子。２（ｃ）で定義したＤＮＡ配列が、図１Ｆに記載の共通配列（配列番号５５）であることを特徴とする請求の範囲１に記載の分子。３請求の範囲１または２のいずれかに記載の核酸分子が挿入されていることを特徴とする、ホストの形質転換に適応した組替えプラスミド。４請求の範囲１または２のいずれかに記載の核酸分子の少なくとも１８ｂｐフラグメントが挿入されていることを特徴とする、請求の範囲３に記載の組替えプラスミド。５請求の範囲１または２のいずれかに記載の核酸分子の少なくとも１８ｂｐフラグメントが挿入されていて、表現のための手段がヘモフィルス属のＤ１５外膜タンパクまたはそれのポリペプチドフラグメントよリなる遺伝子生成物の表現のためにその少なくとも１８ｂｐフラグメントに人為的に結合されている、ホストの形質転換に適応した組替えベクター。６１９９３年１１月４日にＡＴＣＣ受託番号７５６０５として寄託されたプラスミドＤＳ−８８０−１２であり、インフルエンザ菌ＳＢ３３のＤ１５遺伝子をコード化することを特徴とする請求の範囲５に記載の組替えベクター。７ＤＮＡのセグメントが少なくとも残基６個のポリペプチドをコード化することを特徴とする請求の範囲５に記載の組替えベクター。８ポリペプチドが、表２に記載のものから選択されたことを特徴とする請求の範囲７に記載の組替えベクター。９核酸分子の少なくとも１８ｂｐフラグメントがヘモフィルス属のＤ１５遺伝子をコード化する配列以外のものであることを特徴とする請求の範囲項５ないし８のいずれかに記載の組替えベクター。１０ＤＮＡフラグメントが、更に上記のホストから上記の遺伝子生成物の送り出しの為のリーダー配列をコード化している核酸の配列であることを特徴とする請求の範囲９に記載の組替えベクター。１１請求の範囲９または１０のいずれかに記載の組み替えベクターに含まれているＤＮＡフラグメントでコード化されたことを特徴とする精製され及び単離されたタンパク。１２精製され及び単離されたＤ１５外膜タンパクまたはそれの一部分。１３Ｄ１５外膜タンパクがヘモフィルス属のＤｌ５外膜タンパクであることを特徴とする請求の範囲１２に記載のタンパク。１４Ｄ１５外膜タンパクがインフルエンザ菌のＤ１５外膜タンパクであることを特徴とする請求の範囲１３に記載のタンパク。１５インフルエンザ菌がｂ型インフルエンザ菌または型別不能インフルエンザ菌株であることを特徴とする請求の範囲１４に記載のタンパク。１６ｂ型インフルエンザ菌がＣａＭｉｎｎＡおよびイーガン株から，型別不能インフルエンザ菌株がＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３株から選ばれたことを特徴とする請求の範囲１５に記載のタンパク。１７請求の範囲１１から１６の一で請求されたタンパクのアミノ酸配列のみの部分に対応するアミノ酸配列を持つ合成ペプチド，またはそれらの変株または突然変異体。１８表２に含まれるアミノ酸配列を持つ請求の範囲１７に記載のペプチド。１９他のポリペプチドまたはタンパクまたは多糖類にリンクしている，請求の範囲１１から１６の一で請求されたタンパクまたは請求の範囲１７または１８の一で請求されたペプチドであることを特徴とするキメラ分子。２０他のポリペプチドまたはタンパクが病原性微生物の表面タンパク叉はこれに相当するペプチドであることを特徴とする請求の範囲１９に記載のキメラ分子。２１他のポリペプチドまたはタンパクがインフルエンザ菌のＰ１，Ｐ２またはＰ６外膜タンパクであり，他の多糖類がインフルエンザ菌のＰＲＰ分子よりなることを特徴とする請求の範囲１９に記載のキメラ分子。２２請求の範囲１または２で請求された核酸分子，請求の範囲１１から１６の一で請求されたタンパク，請求の範囲１７または１８の一で請求された合成ペプチド，または請求の範囲１９から２１の一で請求されたキメラ分子および生理学的に許容される担体で特徴づけられる免疫原性組成物。２３請求の範囲１１から２２のいずれかで請求されたタンパク，ペプチドまたは免疫原性組成物に特異的な抗血清または抗体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 8310−2Ｊ (72)発明者ヤン、ヤン−ピンカナダ国、エム２アール３エヌ７オンタリオ州、ウィロウデイル、トレスデイルアヴェニュー 120 アパートメント 1709 (72)発明者ルースモア、シーナカナダ国、エル４ジー４アール４オンタリオ州、オーロラ、クロフォードローズドライヴ 70 (72)発明者シア、ドゥオー、ユアン、チャールズカナダ国、エル４ジェイ２ゼット７オンタリオ州、ソーンヒル、マブリークレセント 189 (72)発明者クライン、マイケルカナダ国、エム２ピー１ビー９オンタリオ州、ウィロウデイル、マンローブルヴァード 16 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくともＤ１５外膜タンパクをコードした部分を有し、（ａ）図１Ａ〜１Ｅのいずれかに記載のＤＮＡ配列またはその相補ストランド、および（ｂ）厳しい条件下で（ａ）に定義したＤＮＡ配列にハイブリッド化するＤＮＡ配列のいずれかを有する精製および単離した核酸分子、２．（ｂ）に定義した上記のＤＮＡ配列が、（ａ）に定義した配列と同じ配列を少なくとも９０％有する請求項１に記載の分子３．（ｂ）に定義した上記のＤＮＡ配列が、図１Ｆに記載する共通配列を含む請求項１記載の分子。４．ホストの形質転換に適応する組換えプラスミドであって、組換えプラスミドは請求項１、２または３に記載のＤＮＡ分子の少なくとも１８ｂｐフラグメントを含むＤＮＡフラグメントを挿入したプラスミドベクターを含む。５．１９９３年１１月４日に寄託したＡＴＣＣ受入番号７５６０４を有するプラスミドＤＳ−７１２−２−１および１９９３年１１月４日に寄託したＡＴＣＣ受入番号７５６０６を有するプラスミドＪＢ−１０４２−５−１のいずれかである請求項４に記載の組換えプラスミド。６．ホスト細胞の形質転換に適応する組換えベクターであって、組換えベクターは、少なくとも請求項１、２または３に記載のＤＮＡ分子の少なくとも１８ＢＰフラグメントを含むＤＮＡフラグメントおよびこれによりホスト細胞中にコード化した遺伝子生成物の表現のためのＤＮＡフラグメントに人為的に結合させた表現手段を含む。７．１９９３年１１月４日に寄託し、ＡＴＣＣ受入番号７５６０５を有するプラスミドＤＳ−８８０−１−２であり、インフルエンザ菌ＳＢ３３のＤ１５遺伝子生成物をコード化した請求項６に記載の組換えベクタ。８．上記のＤＮＡフラグメントが少なくとも残基６個のポリペプチドをコード化している請求項６に記載の組換えベクター。９．上記のポリペプチドが、表２に記載したもののいずれかである請求項８に記載の組換えベクター。１０．上記のＤＮＡフラグメントが上記のＤ１５外膜タンパクのコード配列よりも大きくない、請求項６、７、８または９に記載の組換えベクター。１１．ＤＮＡフラグメントが、さらに上記のホストからの上記の遺伝子生成物の送り出しのためのリーダー配列をコード化している核酸配列を含む請求項１０に記載の組換えベクター。１２．請求項１０または１１に記載の組換えベクター中に含まれるＤＮＡフラグメントによりコード化された精製および単離したタンパク。１３．精製および単離したＤ１５外膜タンパクまたはその部廷１４．Ｄ１５外膜タンパクがヘモフィルスＤ１５外膜タンパクである請求項１３に記載のタンパク。１５．Ｄ１５外膜タンパクがインフルエンザ菌Ｄ１５外膜タンパクである請求項１４に記載のタンパク。１６．インフルエンザ菌がｂ型インフルエンザ菌株である請求項１５に記載のタンパク。１７．ｂ型インフルエンザ菌株が、Ｃａ、ＭｉｎｎＡおよびイーガン株のいずれかである請求項１６に記載のタンパク。１８．インフルエンザ菌が型別不能インフルエンザ菌株である請求項１５に記載のタンパク。１９．型別不能インフルエンザ菌株が、ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３株のいずれかである請求項１８に記載のタンパク。２０．請求項１１〜１９のいずれかに記載のタンパクまたはその部分のアミノ酸配列または免疫原性を保存している変異体または突然変異体に相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチド。２１．表２に記載のアミノ酸配列のいずれかである請求項２０に記載のペプチド。２２．請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子と、請求項１２〜１４のいずれかに記載のタンパクと、請求項２０または２１に記載のペプチドおよび生理学的に許容されるキャリヤーとを含む免疫原性組成物。２３．ヘモフィルスにより起きる疾病に対する防御のためにin vivo投与するためのワクチンとして配合した請求項２２に記載の免疫原性組成物。２４．微粒子状調剤、カプセル調剤またはリポソーム調剤として配合した請求項２３に記載の免疫原性組成物。２５．免疫系の所定の細胞または粘液面に投与するために標的分子と組み合わせる請求項２３に記載の免疫原性組成物２６．ヘモフィルス疾病に対する防御的免疫を得るために、請求項２２〜２５のいずれかに記載の免疫原性組成物の有効量を対象に投与することを含むヘモフィルスにより起きる疾病に対する防御を誘発する方法。２７．請求項１２〜２５のいずれかに記載のタンパク、ペプチドまたは免疫原性組成物に特異的な免疫血清または抗体。２８．その他のポリペプチドまたはタンパクまたは多糖類にリンクしている請求項１２〜１９のいずれかに記載のタンパク、または請求項２０または２１に記載のペプチドを含むキメラ分子。２９．上記のその他のポリペプチドまたはタンパクが、病原菌からの表面タンパクまたはこれに相当するペプチドを含む請求項２８に記載のキメラ分子。３０．上記のその他のポリペプチドまたはタンパクが、インフルエンザ菌のＰ１、Ｐ２またはＰ６外膜タンパクを含む請求項２９に記載のキメラ分子。３１．上記の多糖類がインフルエンザ菌からのＰＲＰ分子を含む請求項２８記載のキメラ分子。