JPH08502353A

JPH08502353A - ストロメリシン開裂産生物を検出する抗体

Info

Publication number: JPH08502353A
Application number: JP6509137A
Authority: JP
Inventors: マムフオード，リチヤード・エイ; ラーク，ミツシエル・ダブリユ; ベイン，エレン・ビー・ケイ; ホールナー，ロリー・エイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-21
Publication date: 1996-03-12
Also published as: AU687758B2; WO1994007511A1; US5387504A; CA2144843A1; AU5134393A; EP0668767A1; EP0668767A4

Abstract

(57)【要約】特異的ストロメリシン開裂によって生成された結合組織タンパク質アグレカンフラグメントに対して特異的な単一特異性抗体を産生する。該単一特異性抗体は、ストロメリシンによるアグレカンの特異的開裂によって生じたアグレカンポリペプチドフラグメントを検出するアッセイシステムで使用される。アグレカンポリペプチドフラグメントの存在はストロメリシン活性の存在を示す。変形性関節症、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化障害、通風、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、ある種の癌、関節障害、及び多数の炎症性疾病ではストロメリシンの増加が見られる。本発明の単一特異性抗体及びアッセイシステムは、アグレカンポリペプチドフラグメントをストロメリシン活性の情報として定量し且つ潜在的ストロメリシン阻害物質を評価するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】ストロメリシン開裂産生物を検出する抗体発明の背景本発明は、ある種の動物モデルにおける、またストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）が主な及び／又は中心的な役割を果たすと考えられる病状における、ｉｎｖｉｖｏのストロメリシン活性を反映する抗血清及びアッセイの開発に関する。この抗血清及びアッセイは更に、前述のような種々の病気における、ストロメリシンの特異的及び選択的阻害物質の評価も可能にする。何らかの筋骨格疾患をかかえているアメリカ人は３千２百万を超え、そのうちの半分は変形性関節症（ＯＡ）にかかっている。ＯＡは慢性関節リウマチ（ＲＡ）よりかなり多い。ＲＡ及びＯＡのどちらでも、軟骨のアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）及びコラーゲンの崩壊及び損失が起こり、最終的にはその下の骨が崩壊する。この二種類の病気は最終結果は類似しているが、これらの病気が発生し進行するメカニズムは異なると思われる。ＲＡは、ＩＬ−１及びＴＮＦαのような種々のサイトカインが関与して滑膜を剌激し、崩壊酵素（ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅ）を急増、産生させる炎症性疾患である。これに対し、ＯＡは軟骨の内部から発生すると思われる疾患であり、生化学的及び生物機械的因子が主な役割を果たす。例えば、関節を不安定にする十字靭帯及び半月障害の患者はＯＡがより速く進展し易い。ＯＡでは、軟骨細胞による崩壊プロテイナーゼの合成が行われると思われ、病気が進むと滑膜肥大及び炎症が発生する。崩壊プロテイナーゼであるストロメリシン（ＳＬＮ）はＯＡ及びＲＡに共通しており、これらの疾患のどちらにも観察される軟骨結合組織の破壊に関与している可能性がある。ＳＬＮは軟骨細胞及び滑膜細胞によって合成され、その合成はｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの両方で炎症サイトカインにより支配される（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。ＳＬＮの発現は、慢性関節リウマチの動物モデル、並びにＯＡ、ＲＡ及び関節外傷の患者に強く見られる。ＳＬＮは、アグレカン、結合タンパク質及びIX型コラーゲンを含む主要軟骨結合組織エレメントを崩壊させる能力を有する。アグレカンは、軟骨の耐圧性の保持に関与する大きな陰イオンプロテオグリカンである。これは、ＯＡ軟骨から失われる最初の分子の一つである。この分子の放出は、II型コラーゲンのコラーゲン分解性崩壊に先立って要求されるものと思われる。７２ｋＤａ及び９５ｋＤａゼラチナーゼは、アグレカンを崩壊させる能力を有する別の二つのメタロプロテイナーゼ類メンバーである。しかしながら、７２ｋＤａ酵素の発現はＯＡ又はＲＡの場合に支配されない。また、ＳＬＮはコラゲナーゼ（ＣＬＮ）及び９５ｋＤａゼラチナーゼ（ＧＥＬ）両方の活性化に関与し得る。従ってＳＬＮを阻害すれば、直接的又は間接的に、ＯＡにおける総ての主要軟骨高分子の崩壊を阻止し得且つ崩壊速度を低下させ得る。現在、アグレカンの定量には、一般的な免疫学的アッセイ［Ｈｅｉｎｅｇａｒｄら，（１９８５），Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ．，４５，ｐｐ．４２１−４２７；ＡｒｔｉｃｕｌａｒＣａｒｔｉｌａｇｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋ．Ｅ．Ｋｅｕｔｔｎｅｒ，Ｒ．Ｓｃｈｌｅｙｅｒｂａｃｈ及びＶ．Ｃ．Ｈａｓｃａｌｌ編，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８６，ｐｐ．５９−７３に記載のＣａｔｅｒｓｏｎら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｇａｉｎｓｔＣａｒｔｉｌａｇｅＰｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎＡｎｄＬｉｎｋＰｒｏｔｅｉｎ］、及び染料ベースアッセイ［Ｆａｒｎｄａｌｅら，（１９８６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，８８３，ｐｐ．１７３−１７７］が使用されている。これらのアッセイでは、崩壊したアグレカン分子と健全なアグレカン分子とを識別していない。図面の簡単な説明第１図は、非ヨウ素化ペプチドからのヨウ素化合成アグレカンプローブペプチドの分離を示すＨＰＬＣ（筆写）の説明図である。第２図は、単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の種々の希釈度に関するＲＩＡデータを示している。第３図は、単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の感度を、非標識ペプチドの添加によって該抗血清が放射性標識ペプチドへの結合を阻止する能力を測定することにより示す説明図である。第４図は、認識のためにペプチド配列ＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎのＣ末端Ａｓｎが必要とされることを示す、単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の特異性の説明図である。第５図は、Ａｓｎ³⁴⁰の置換又は修飾がアミド側鎖での抗体への結合能力を激減させることを示すことにより、単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の特異性を明らかにする説明図である。第６図は、抗体がアグレカンのストロメリシン開裂部位にわたって延びるペプチドを認識しないことを示す、単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の特異性の説明図である。第７図は、配列Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｎにおいてＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−中のアミノ酸のいずれか一つでも置換されていると、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清による認識が失われることを示す、単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の特異性の説明図である。第８図は、ＳＬＮ開裂アグレカンフラグメントをアミノ末端側で延長したものに対応する６個の異なるペプチドを認識する単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の特異性を示す説明図である。第９図は、アミノ末端側で切頭したＰｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ −Ｇｌｕ−Ａｓｎペプチドを認識する単一特異性抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清の特異性を示す説明図である。第１０図Ａは、完全なアグレカンではない、ＳＬＮ開裂したヒトアグレカンフラグメントの検出と該フラグメントに対するアッセイの特異性とを明らかにするＲＩＡデータを示す説明図である。第１０図Ｂは、７２ｋＤＡゼラチナーゼ開裂ヒトアグレカンフラグメントではない、ＳＬＮ開裂ヒトアグレカンフラグメントの検出と該フラグメントに対するアッセイの特異性とを明らかにするＲＩＡデータを示す説明図である。第１０図Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＬＮ開裂ヒトアグレカンフラグメントの検出を示すウェスタンブロットの説明図である。第１１図は、ＳＬＮ開裂ヒトアグレカンに対するアッセイの特異性をＣＬＮ開裂ヒトアグレカンと比較して示すＲＩＡデータの説明図である。第１２図Ａは、ＳＬＮ開裂ウサギアグレカンフラグメントの検出と該フラグメントに対するアッセイの特異性とを９２ｋＤａゼラチナーゼ開裂ウサギアグレカンフラグメントと比較して示すＲＩＡデータの説明図である。第１２図Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＬＮ開裂ウサギアグレカンフラグメントの検出を示すウェスタンブロットの説明図である。第１３図は、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清によって認識されるアグレカンフラグメントをヒトＯＡ軟骨から単離できることを示すウェスタンブロットの説明図である。第１４図は、ＳＬＮ阻害化合物１又はベヒクルのみ（阻害物質を含まない）を予め投与したウサギの、関節内ＳＬＮ注射後の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌｆｌｕｉｄ）中のアグレカンフラグメントのＳＬＮ誘発開裂レベルを定量するＲＩＡデータを示す説明図である。第１５図Ａは、ＳＬＮを関節内注射したウサギの軟骨（検査軟骨）中の蛍光を、注射していない関節（対照）の軟骨と比較して示す免疫蛍光データの説明図である。第１５図Ｂは、ストロメリシンを注射した関節の軟骨（化合物１で処理していない検査軟骨）中の蛍光を、ストロメリシン注射の前に化合物１で処理した動物の軟骨（化合物１で処理した検査軟骨）と比較して示す免疫蛍光データの説明図である。発明の概要ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントのようなストロメリシン開裂産生物を、在来のＲＩＡ又は在来のイムノローカリゼーション（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）法により、ウサギポリクローナル抗血清を用いて測定する。該抗血清は、ストロメリシン開裂アグレカンを、（ａ）ｉｎｖｉｔｒｏで精製ウサギ、ウシ及びヒトアグレカンのＳＬＮ消化物中で検出し、（ｂ）ｉｎｖｉｖｏでＳＬＮを関節内注射したモデル系（即ちウサギ膝関節）の開裂アグレカンにおいて検出する。この抗血清をストロメリシン活性の測定手段として使用し、（ａ）種々のサイトカイン（即ちＩＬ−１及びＴＮＦα）により内因性ストロメリシン合成が刺激されるモデル、並びに（ｂ）ＲＡ及びＯＡのような種々のヒト疾患、におけるストロメリシン開裂アグレカンを定量する。この抗体を使用すれば、種々の薬物動態学的／薬理学的動物モデル並びに種々のヒト疾患、例えばＲＡ及びＯＡにおけるＳＬＮ阻害物質の評価も可能である。発明の詳細な説明本発明は、ストロメリシン活性の尺度としてのストロメリシン開裂アグレカンフラグメントの定量及び位置決定に関する。本発明は、ｉｎｖｉｖｏでストロメリシン阻害物質の効力を評価するアッセイシステムにも関する。ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントの定量は、種々の病気、例えば非限定的具体例として変形性関節症（ＯＡ）及び慢性関節リウマチ（ＲＡ）、ＩＢＤ、ＩＰＦ、通風、アテローム性動脈硬化病変、関節障害及びある種の癌の診断に有用であり得る。ストロメリシン阻害物質の同定は、例えばＯＡ及びＲＡのような病気を治療するための薬剤の開発につながり得る。より特定的には、本発明は、ストロメリシン開裂アグレカンポリペプチドフラグメントのようなストロメリシン開裂産物を検出する単一特異性抗体に関する。プロテイナーゼ活性をその場で（ｉｎｓｉｔｕ）モニターする方法の一つは、プロテイナーゼ仲介崩壊産物をアセイすることである。アグレカンは主要な軟骨マトリクス分子、ＳＬＮ基質であり、ＯＡの場合に軟骨から失われる最初の分子の一つであるため、本発明は前記目的のために、ＳＬＮ開裂アグレカンフラグメントを定量する試薬の開発に焦点をおく。細胞外マトリクスアグレカン分子中の所定の開裂部位をもたらすための試薬が開発されたのはこれが最初である。今までのところ、アグレカンの定量には一般的な免疫学的アッセイ［Ｈｅｉｎｅｇａｒｄら，前出文献；Ｃａｔｅｒｓｏｎら，前出文献］及び染料ベースアッセイ［Ｆａｒｎｄａｌｅら，前出文献］が使用されている。これらのアッセイでは、崩壊した分子と完全な（無傷の）分子とを識別していない。本明細書に記載の抗血清は、崩壊した無傷ではないアグレカンを認識するだけでなく、メタロプロテイナーゼストロメリシンによって特異的に開裂されたアグレカンも認識する。この種の抗血清を使用すれば、ストロメリシン開裂アグレカン分子を特異的に定量し且つ位置決定することができる。ＳＬＮはアグレカンを、該分子の球体間領域（ｉｎｔｅｒｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）内のＡｓｎ³⁴⁰−Ｐｈｅ³⁴¹結合の間で開裂することが判明した。開裂部位にわたって延びる合成ペプチド（Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ −Ｇｌｕ−Ａｓｎ−−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ［配列番号：１］）も所期の部位でＳＬＮにより開裂される。この部位でのヒトアグレカンの開裂は、関節軟骨から滑液中へのカルボキシ末端フラグメント（Ｐｈｅ³⁴²−Ｈｉｓ²³¹⁶）の放出を可能にする。アミノ末端フラグメント（Ｖａｌ¹−Ａｓｎ³⁴¹）は軟骨のヒアルウロン酸と結合して止まるか、又はやはり滑液中に放出され得る。本明細書中のアミノ酸の３文字及び１文字の名称は総て、当業界で標準となっている下記のリストに示す名称と合致する：アラニンＡｌａＡロイシンＬｅｕＬアルギニンＡｒｇＲリシンＬｙｓＫアスパラギンＡｓｐＮメチオニンＭｅｔＭアスパラギン酸ＡｓｎＤフェニルアラニンＰｈｅＦシステインＣｙｓＣプロリンＰｒｏＰグルタミン酸ＧｌｕＥセリンＳｅｒＳグルタミンＧｌｎＱトレオニンＴｈｒＴグリシンＧｌｙＧトリプトファンＴｒｐＷヒスチジンＨｉｓＨチロシンＴｙｒＹイソロイシンＩｌｅＩバリンＶａｌＶストロメリシン開裂産物に関する本発明のアッセイは、種々の疾患におけるＳＬＮ活性の増加を示し、種々の動物モデル及びヒトにおける特異的且つ選択的ＳＬＮ阻害物質の効果をモニターするための診断ツールとして使用される。ウサギＩＬ−１モデルでは、ＳＬＮ阻害化合物の効果が、関節軟骨及び滑液のＳＬＮ崩壊アグレカンフラグメントを定量することにより評価される。従って、アミノ末端及びカルボキシ末端のＳＬＮ生成アグレカンフラグメント（ＳＬＮ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄａｇｇｒｅｃａｎｆｒａｇｍｅｎｔ）を両方ともモニターするアッセイは、ＳＬＮ阻害物質の特性を決定するのに有用である。ヒトの場合は、関節軟骨を患者から得ることが難しいため、軟骨のアグレカンフラグメントを生化学的効果の情報としてアッセイすることは困難である。ヒトにおけるＳＬＮ阻害化合物の効果をモニターするためには、滑液、血液、尿又は他の体液中に放出されるカルボキシ末端又はアミノ末端アグレカンフラグメントをモニターする。本明細書では、これらのアッセイを開発するために本発明で使用する手法を説明する。アグレカンのストロメリシン開裂部位は既に同定されており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐｐ．１００８−１０１４，［１９９２］）、この部位はアグレカンの「二重球体（ｄｏｕｂｌｅｇｌｏｂｅ）」領域中であると確認された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，ｐｐ．１５５７９−１５５８２，［１９９１］）。アグレカンにおけるストロメリシンの開裂部位はＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎ／ＰｈｅＰｈｅＧｌｙＶａｌＧｌｙである［配列番号：２］。ストロメリシン開裂部位の周囲のペプチドを合成的に製造し、これらのペプチドに対するポリクローナル抗血清を生成して、これらのネオエピトープを同定するための免疫試薬として使用する。アグレカンのアミノ末端ヒアルウロン酸結合領域は軟骨から抽出され、このＧ１の一部分は、ストロメリシン開裂と一致するＣ末端アミノ酸を有する。ストロメリシン開裂によって形成されたアグレカンのアミノ末端フラグメント（Ｖａｌ¹−Ａｓｎ³⁴¹）のＣ末端とカルボキシ末端フラグメント（Ｐｈｅ³⁴²− Ｈｉｓ²³¹⁶）のＮ末端とを認識する単一特異性抗ペプチド抗体を生成する。これらの抗体は、この部位での分子の開裂を定量するためのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の開発に使用する。アミノ末端フラグメントのＣ末端（ＶａｌＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎ³⁴¹、配列番号：３）に対する抗体を生成した。これらの抗体は、ＳＬＮ消化したヒト及びウサギアグレカンの両方を認識するが、無傷のヒト又はウサギアグレカンは認識しない。この抗体によって認識されるｉｎｖｉｔｒｏ生成ＳＬＮ開裂アグレカンフラグメントと類似の分子量を有するフラグメントが、ヒトＯＡ軟骨から単離される。これは配列データ（実施例６）と同じく、ＳＬＮ開裂と一致するアグレカンフラグメントをヒトＯＡ軟骨から単離できることを示す。この抗体を用いてＲＩＡを開発した。このアッセイは、ヒト及びウサギの軟骨、滑液、血液、尿又は他の体液中のアミノ末端アグレカンフラグメント（Ｖａｌ¹−Ａｓｎ³⁴¹）を定量するために使用する。このアッセイは１０〜２０ｐＭの検出限度を有する。この抗血清の特異性を決定するために、一連のペプチドを合成した。Ｃ末端がより短い（即ちＡｓｎ残基を欠く）ペプチドは、該抗血清によって認識されない（一万の一以下の感度）。また、Ｃ末端がより長い（即ちＰｈｅを含む）ペプチドも、この抗血清によって認識されない。最適な認識のためには、少なくともアミノ酸６個の配列Ｖａ１−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（配列番号：３）が必要である。Ｃ末端Ａｓｎ³⁴¹をＡｓｎ −ＮＨ₂又はＡｓｐに置換すると、認識が百分の一〜千分の一に減少する。このデータは、該抗血清による最適認識のためにはＡｓｎ³⁴¹上に遊離カルボキシル基が必要であることを示すものであり、Ａｓｎ³⁴¹の遊離カルボキシルがＰｈｅ³ ⁴² とアミド結合されている無傷のアグレカンが該抗血清によって認識されないという理由を説明するものである。前述の最適なアミノ酸６個より大きい種々の長さを有するペプチドも使用するのに適している。カルボキシ末端フラグメントのＮ末端配列（Ｐｈｅ³⁴²−Ｇｌｙ³⁴⁷）の結合体を形成し、ウサギに注射して、軟骨から放出された大きなアグレカンフラグメントの定量に使用する抗血清を製造した。ＳＬＮ生成アグレカンフラグメント（ＡｇｇＦｇｍ）に対する単一特異性抗体を、ＡｇｇＦｇｍと反応する抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載の方法を用いて、ＡｇｇＦｇｍと反応するモノクローナル抗体として製造する。本明細書中の単一特異性抗体は、ＡｇｇＦｇｍに対する均一結合特性を有する単一抗体種又は多重抗体種であると定義される。本明細書中の均一結合（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｂｉｎｄｉｎｇ）とは、抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のようなＡｇｇＦｇｍに会合したものと結合する能力を意味する。ＡｇｇＦｇｍ特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを、免疫アジュバントを使用して、又は使用せずに、適当な濃度のＡｇｇＦｇｍ又は該フラグメント中の配列に基づく合成ペプチド結合体で免疫感作することにより発生させる。最初の免疫感作に先立ち、免疫前血清を採取する。各動物に、約０．１μｇ〜約１０００ｐｇのＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体を許容し得るアジュバントと共に投与する。このような許容し得るアジュバントの非限定的具体例としては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ含有油中水滴エマルジョン及びｔＲＮＡが挙げられる。最初の免疫感作は、ＡｇｇＦｇｍ、又はアミノ末端フラグメント（ＶａｌＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎ）配列番号：３）のＣ末端もしくはＣ末端フラグメント（ＰｈｅＰｈｅＧｌｙＶａｌＧｌｙＧｌｙ、配列番号：４）のＮ末端をベースとする合成ペプチドとウシチログロブリンとの結合体を、好ましくはフロイントの完全アジュバント中で、複数の部位に皮下（ＳＣ）注射、筋内（ＩＭ）注射、腹膜組織内（ＩＰ）注射するか又はこれらの注射を組合わせて行うことからなる。ＡｇｇＦｇｍ又は合成ペプチドは、当業者に公知のものを含む別の担体分子、例えば非限定的具体例としてキーホールリンペットヘモシアニン及びＢＳＡと結合してもよい。予め決定した規則的間隔で各動物の採血を行って、抗体力価を調べる。動物には最初の免疫感作の後で追加免疫注射をしても、又はしなくてもよい。応答を示さなかったか又は力価の低かった動物には、最初の免疫感作後に追加免疫注射をする。追加免疫注射すべきこれらの動物には通常、フロイントの不完全アジュバント中等量のＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体を同一ルートで注射する。追加免疫注射は、最大力価が得られるまで約３週間の間隔で行う。各追加免疫感作から約１０〜１４日後、又は単一免疫感作後に約２週間に一度の割合で動物の採血を行い、血清を集め、アリコートを約−２０℃で貯蔵する。ＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体で免疫感作することにより製造する。これらのマウスは、同量の前述のような許容し得るアジュバントに混入した約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水中約０．１μｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１μｇのＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体を、ＩＰ又はＳＣルートで投与することにより免疫感作する。好ましくはフロイントの完全アジュバントを使用する。これらのマウスは０日目に最初の免疫感作を行い、約３〜３０週間休ませる。免疫したマウスに、リン酸塩緩衝食塩水のような緩衝溶液中約０．１〜約１０μｇのＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体を静脈（ＩＶ）注射することにより、一回以上の追加免疫感作を行う。抗体陽性マウスに由来するリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当業者に公知の標準的方法で免疫感作マウスから脾臓を取り出すことによって得る。脾リンパ球を、安定なハイブリドーマを形成させる条件下で、適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより、ハイブリドーマ細胞を製造する。融合相手の非限定的具体例としては、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳＩ／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ −１９４及びＳｐ２／０が挙げられる。好ましいのはＳｐ２／０である。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、約３０％〜約５０％の濃度で、分子量約１０００のポリエチレングリコール中で融合させる。融合ハイブリドーマ細胞は、当業者に公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを添加したダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させることにより選択する。約１４日目、１８日目及び２１目に増殖陽性ウェルから上清液を集め、ＡｇｇＦｇｍ又はペプチド結合体を抗原として用いて固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより、抗体産生に関するスクリーニングを行う。培養液をオクタロニー沈降アッセイでも検査して、ｍＡｂのイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９７３に記載のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｎｉｑｕｅｓの軟寒天法のような方法でクローニングする。プリスタン感作（ｐｒｉｓｔａｎｅｐｒｉｍｅｄ）したＢａｌｂ／ｃマウスに、感作から約４日後にマウス当たり約０．５ｍｌで約２×１０⁶〜約６×１０⁶ 個のハイブリドーマ細胞を注射して、モノクローナル抗体をｉｎｖｉｖｏで産生する。細胞トランスファーから約８〜１２日後に腹水を集め、モノクローナル抗体を当業者に公知の方法で精製する。約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることにより抗ＡｇｇＦｇｍｍＡｂのｉｎｖｉｔｒｏ産生を実施して、十分な量の特異的ｍＡｂを得る。該ｍＡｂは当業者に公知の方法で精製する。腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例として、沈降、受身凝集反応、酵素結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により決定する。類似のアッセイを用いて、体液又は組織及び細胞抽出物中のＡｇｇＦｇｍの存在を検出する。当業者には容易に理解されるように、単一特異性抗体を産生するための前述の方法は、ＡｇｇＦｇｍに特異的な抗体を産生するのに使用し得る。この抗体は、ＳＬＮ生成アグレカンフラグメントの検出及びその量（レベル）の測定のための診断アッセイシステムの形成に有用である。ＳＬＮ生成アグレカンフラグメントの量の決定は、患者の体液の分析に基づいており、ＯＡ、ＲＡ及び他の疾患の発生を診断する上で有用である。また、この抗体は、生検／組織試料中のＳＬＮ産生フラグメントのイムノローカリゼーションに有用である。この種の分析は、細胞外マトリクス中のＳＬＮ活性の部位をその場で決定するができる。ストロメリシン阻害物質の効果を評価するために、動物にストロメリシン阻害物質を投与し、ストロメリシン活性のモニターとしてＲＩＡを用いて、ストロメリシン生成アグレカンフラグメントの量を測定する。一連の動物にストロメリシンを関節内注射し、軟骨中の、又は滑液、血液もしくは他の体液中に放出されたストロメリシン生成アグレカンフラグメントの量をＲＩＡで測定する。酵素の注射後、関節をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、骨から軟骨を切除する。軟骨をカオトロピック緩衝液［Ｈａｓｃａｌｌ及びＫｉｍｕｒａ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ８２：ｐｐ．７６９−８００（１９８２）］で抽出し、軟骨抽出物、滑液、血液又は他の体液中のストロメリシン生成アグレカンフラグメントの量をＲＩＡで測定する。二組目の一連の動物に阻害物質を予備投与し（ｉ．ｖ．又はｐ．ｏ．）、前述のように軟骨、滑液又は血液中のストロメリシン消化アグレカンフラグメントの量を定量する。阻害の程度は、阻害物質を与えなかった場合に生じたストロメリシン開裂フラグメントに対する、阻害物質を与えた場合に生じたストロメリシン開裂フラグメントの割合（％）として計算する。同じ方法を用いて、サイトカインを関節内注射した場合のストロメリシン活性の阻害を定量する。同じアッセイを用いて、滑液、血液又は他の体液中のストロメリシン生成アグレカンフラグメントの減少をモニターすることにより、ヒトＲＡ、ＯＡ又は他の関節疾患における阻害物質の活性を評価する。前記減少は、薬剤処理の前のフラグメントの定量と、その後の薬剤処理後のフラグメントの定量とによって測定する。このアッセイを用いて、関節疾患の動物モデル、及びＯＡ、ＲＡもしくは他の関節疾患を有するヒトに由来する軟骨中のストロメリシン生成アグレカンフラグメントを定量する。ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントに対して形成した抗血清は、標準的イムノローカリゼーション法により、軟骨中のフラグメントの位置決定にも使用する。この方法を用いて、ストロメリシン活性の部位をその場で検出する。阻害物質の存在下でのＳＬＮ生成フラグメントの量は、阻害物質を注射しなかった対照動物のそれと比べて著しく低い。薬剤で処理した動物の組織中のフラグメントの分布を薬剤で処理しなかった動物の組織と比べることにより、ストロメリシン阻害の分布を決定する。この方法を、ストロメリシンを注射した動物、ストロメリシンを内因的に生成すべくサイトカインを注射した動物、他の一般的関節炎動物モデルに由来する組織、又はＯＡ、ＲＡもしくは他の関節疾患の患者に由来する外科的試料で使用する。以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。実施例１ペプチド免疫原ヒトアグレカンにおける特異的ストロメリシン開裂部位の解明は、ＳＬＮ開裂部位に隣接するアミノ末端及びカルボキシ末端を表す抗原性ペプチド及びペプチドプローブの同定を可能にした。ＳＬＮ開裂によって生じたアミノ末端アグレカンフラグメントのカルボキシ末端に結合した特異的アミノ酸配列はＰｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ³⁴¹（配列番号：４）であり、ＳＬＮ開裂によって生じたカルボキシ末端アグレカンフラグメントのアミノ末端に結合した配列は³⁴²Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号：７）である。ペプチド抗原及びペプチドプローブを、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）又はフルオレニルメトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いて、ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で合成した。ｔ−Ｂｏｃ化学の場合は、ペプチド酸を標準的フェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上で合成し、ペプチドアミドをメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上で合成した。合成は、ＡＢＩ４３０ＡＯｐｅｒａｔｏｒｓＭａｎｕａｌ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ．，１９８８）に詳述されている、ヒドロキシベンジルトリアゾール（ＨＯＢＴ）エステル仲介カップリングである、Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）／ＨＯＢＴ手順に従って実施した。ペプチジル樹脂は、ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎフッ化水素装置、又はＭｕｌｔｉｐｌｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｓｔｅｍｓフッ化水素装置で、ＡＢＩ４３０ＡＯｐｅｒａｔｏｒｓＭａｎｕａｌに記載の手順に従って、無水フッ化水素で開裂し脱保護した。ペプチドは、ＷａｔｅｒｓＤｅｌｔａＰａｋＣ１８カラムで、０．１％トリフロオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液中２→５０％のアセトニトリル勾配で逆相ＨＰＬＣにかけて精製した。個々のペプチドの純度は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳｐｈｅｒｉ− ５Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより測定した。これらのペプチドの構造を、高速原子衝撃又は電子噴霧イオン化を用いた質量分析法により確認した。Ｆｍｏｃ合成の場合は、ペプチド酸を標準的Ｗａｎｇ樹脂上で合成し、ペプチドアミドをＲｉｎｋアミド樹脂上で合成した。合成は、ＡＢＩ４３０ＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＮｏｔｅｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，１９９２）に詳述されているベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）仲介のカップリングについてのＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）手順に従って実施した。ペプチジル樹脂は、ＡＢＩ４３０ＡＯｐｅｒａｔｏｒｓＭａｎｕａｌに記載の手順に従いＴＦＡで開裂し脱保護した。ペプチドの精製及び構造決定は、ｔ−Ｂｏｃ化学について述べたように実施した。ヒトアグレカンのストロメリシン開裂によって生じたアミノ末端フラグメントのカルボキシ末端に結合した一次抗原Ｐｈｅ³³⁵−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ³⁴¹（配列番号：４）は、更に二つのアミノ酸残基を用いて合成する。合成ペプチドＰｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎにシステイン−ノルロイシンを結合して、抗原Ｃｙｓ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ− Ａｓｎ（配列番号：５）を形成する。末端アスパラギン残基上のカルボキシル基の保全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に変化はなかった。システインは結合アミノ酸である。なぜなら、この抗原を免疫原性担体に結合させるからである。ノルロイシンは、単一免疫原性担体に結合した抗原分子の実際の数を調べるために内部マーカーとして加えた。ストロメリシンによって生じたカルボキシ末端アグレカンフラグメントのアミノ末端に結合した一次抗原Ｐｈｅ³⁴²−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ³⁴⁹（配列番号：７）は、更に二つのアミノ酸残基を用いて合成する。システイン−ノルロイシンを合成ペプチドＰｈｅ³⁴²−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ抗原に結合して、抗原Ｐｈｅ³⁴ 2−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ｃｙｓ（配列番号：９）を形成する。システインは、抗原を免疫原性担体に結合させる結合アミノ酸である。ノルロイシンは、単一免疫原性担体に結合した抗原分子の実際の数を測定するために内部マーカーとして加えた。実施例２担体への抗原の結合担体タンパク質への抗原性ペプチドの結合を、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：３４０３−３４０７（１９８１）に記載のＬｅｒｎｅｒらの方法を改変した方法で、ヘテロニ官能カップリング試薬Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）を用いて実施した。ペプチド抗原は、２．５ｍｌの脱気リン酸塩緩衝液２０ｍＭ、ｐＨ８．０に溶解した１０ｍｇのＴＧと、４．２ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＭＢＳとを混合し、撹拌しながら室温で３０分間インキュベートすることにより、担体ウシ−チログロブリン（ＴＧ）に結合させた。前記担体−カップリング試薬混合物は次いで、脱気５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化した使い捨てＰＤ−１０ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。６マイクロモルの精製凍結乾燥ペプチド抗原を入れた小バイアルをカラムの出口の下に配置し、更に３．５ｍｌのｐＨ７．０緩衝液で活性化ＴＧ画分をバイアル内に溶離した。ペプチド抗原−活性化担体複合体を静かに撹拌しながら４℃で一晩反応させた。最終的反応混合物のアリコートを採取し、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムに通して残留遊離ペプチド及び／又は反応副産物を除去することにより、ＶＤＩＰＥＮ結合体のカップリング度を測定した。ＦＦＧＶＧチログロブリン免疫原複合体（４０μｇ）のカップリング度は、透析及び凍結乾燥の後に直接測定した。なぜなら、ＦＦＧＶＧ免疫原複合体はカップリング反応中に沈殿するため、前述の方法は使用できないからである。Ａ₂₈₀で調べたチログロブリン免疫原複合体を含む画分のアリコート（５０μ ｌ）を蒸発乾固させて、アミノ酸分析を行った。アミノ酸分析では、１１０℃に維持した２００μ１の０．１％フェノール含有６．０ＮＨＣｌを用いて、試料を２４時間加水分解した。試料を、ＢｅｃｋｍａｎＭｏｄｅ１６３００アミノ酸分析機を用いて分析した。分析の結果、ＴＧ−Ｃｙｓ−Ｎｌｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（配列番号：８）免疫原の場合はＴＧ１モル当たり２５．３モルの抗原ペプチドが存在し、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｎｌｅ−Ｃｙｓ−ＴＧ（配列番号：９）免疫原の場合はＴＧ１モル当たり７８．８モルのペプチドが存在することが判明した。合成プローブ及び特異性ペプチド抗体特異性を決定し且つＳＬＮ開裂アグレカンフラグメントの存在及び量を評価するための抗原プローブを、前述の方法で合成した。開裂産物の存在及び量を測定するために使用する抗原プローブは、該プローブが¹²⁵Ｉにカップルできるように、エピトープに対して遠い方の末端にチロシン残基を含むように設計した。抗体力価を測定するために最初に使用したプローブは、アグレカンのＶａｌ³³ ⁶ −Ａｓｎ³⁴¹のアミノ酸配列＋アミノ末端チロシン残基をベースとする合成ペプチドＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（配列番号：１０）である。抗体力価を測定するために使用した次のプローブは、Ｔｈｒ³³¹− Ａｓｎ³⁴¹のアミノ酸配列＋３３０位の天然Ｔｙｒ残基をベースとする合成プローブ、Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（第１図）（配列番号：１１）である。抗体特異性を調べ、この特異性がアグレカンＶａｌ³³⁶−Ａｓｎ³⁴¹アミノ酸配列に存在することを立証するために使用した合成ペプチドを下記の表１に示す。単一特異性抗体の産生ニュージーランド・ホワイト・ラビット及びＨａｒｔｌｅｙ近交系モルモットを免疫原で免疫感作した。最初の免疫感作では、各ウサギにフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）１ｍｌ当たり３３３μｇの免疫結合体を筋内注射した。７日目、ＦＣＡ中３３３μｇの免疫原を再度動物に投与し、３５日目に、合計３３３μｇの免疫原を６〜１０の部位で皮下注射した。４５日目に動物の採血を行い、次いで３３３μｇの免疫原で追加免疫した。５５日目、再度動物の追加免疫を行い、１０日後に採血した。この追加免疫及び採血スケジュールを３〜５回続けて、適当な供給量の抗血清を得た。モルモットも前述のように免疫感作した（６７μｇ）。抗血清は全部−２０℃で貯蔵した。アッセイプローブの放射性ヨウ素化を、クロラミンＴとの反応によって実施した。ペプチドプローブは濃度２２０μｇ／ｍｌで水に溶解した。この溶液の５０ μｌ容（１１μｇ含有）を１０μｌの０．５Ｍリン酸塩（Ｋ＋）緩衝液、ｐＨ７．５に加え、次いで２ｍＣｉの¹²⁵ＩＮａ及び１０μｌの新しく調製した水中クロラミンＴ（０．１ｍｇ／ｍｌ）と混合した。該混合物を３０秒間反応させ、１０μｌの１ｍｇ／ｍｌＮａＩ＋１ｍｇ／ｍｌチオ硫酸ナトリウムで反応を停止させた。放射性ヨウ素化プローブを、ＳｕｐｅｌｃｏＣ−８カラム（０．４× ２５ｃｍ）を用いてＨＰＬＣで精製した。ヨウ素化プローブは、９９％溶離液Ａ −１％溶離液Ｂ→３６％溶離液Ａ−６４％溶離液Ｂの３５分間の１％／分勾配により、流速１ｍｌ／分で溶離した。溶離液Ａは水中０．１％トリフルオロ酢酸からなり、溶離液Ｂはアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸からなっていた。非ヨウ素化Ｔｙｒ−３３６−３４１ペプチドの精製は第１図に示す。実施例３ストロメリシン開裂産物のラジオイムノアッセイ一般的イムノアッセイ手順該アッセイは、０．１％ゼラチン、０．０１％チメラゾール及び１．０ｍＭＥＤＴＡを加えた総量３００μｌのダルベッコのカルシウム及びマグネシウム無含有リン酸塩緩衝食塩水中で実施した。１００μｌの緩衝液又は試料に１００μ ｌの抗血清を加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日、同じ緩衝液中の放射性プローブを、各試料又は対照に約３０，０００ｃｐｍが加えられるように調製した。該アッセイ混合物を４℃で一晩インキュベートし、０．３％のデキストランコーティングした木炭で停止させた。遠心分離で木炭を沈降させた後、上清液をデカンテーションで除去し、放射能の量を測定した。この手順で、１００μｌ容中の添加抗血清の希釈度を変えながら、抗血清力価を測定した。競合実験で使用する抗体希釈度は約３０％の放射性プローブ結合率が得られるように選択した。種々の既知量の合成プローブペプチド（Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ）を含む試料を用いて抗体感度を決定した。（Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ）ペプチドによって生じた変位曲線（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｃｕｒｖｅ）を、推定上の交差反応性ペプチドによって生じた変位曲線と比較することにより、特異性を決定した。試料の存在下で得たプローブの対照抗体結合を、既知の濃度の標準ペプチド、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ −Ｇｌｙ−Ａｓｎ及びＴｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡＳｎを用いて生じた標準曲線と比較することにより、未知の試料中のペプチド濃度を決定した。抗体結合の決定ペプチド抗原に対する最も活性なウサギ抗血清の抗体力価を、ラジオイムノアッセイを用いて決定した。抗血清は、１００μｌ当たり１：５００〜１：６４，０００の範囲の希釈度で、アッセイ緩衝液中で希釈した（第２図参照）。希釈した抗血清を¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ放射性標識プローブと接触させた。該放射性プローブはアッセイ緩衝液中で希釈して、アリコート１００μｌ当たり約３０，０００ｃｐｍとした。アッセイ液量は、１００μｌのアッセイ緩衝液の添加によって３００μｌにした。総ての測定は重複して行った。４℃で一晩インキュベートした後、抗体非結合プローブをデキストランコーティング木炭に吸着させるか、又は抗体結合プローブを正常ウサギ血清とヤギ抗ウサギＩｇＧとの複合体に吸着させることにより、抗体結合放射性プローブと抗体非結合放射性プローブとを分離した。木炭溶液の場合は、平均分子量７０，０００のＴ−７０デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を０．２５％ｗ／ｖ含むｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸塩緩衝液に、局方活性炭を濃度３％ｗ／ｖで懸濁して、デキストランコーティング木炭を製造した。前記混合物は一晩静置し、遠心分離で沈降させ、前述のようなデキストラン含有リン酸塩緩衝液中で一回洗浄し、次いでデキストラン含有アッセイ緩衝液中に濃度３％まで再懸濁した。アッセイで使用する直前に、デキストランコーティング木炭をダルベッコのＰＢＳ中で１０倍に希釈し、１ｍｌを各アッセイ管に加えた。氷／水スラリー中で１０分間インキュベートした後、木炭を３，０００×ｇで１０分間の遠心分離で沈降させ、上清液をデカンテーションにより除去し、ガンマ計数器で計測した。このアッセイは、総計数を決定するための木炭無含有対照（１ｍｌのＰＢＳを添加）と、非特異的結合を決定するための抗体無含有対照とを含んでいた。ヤギ抗ウサギＩｇＧ／正常ウサギＩｇＧ（ＧＡＲＧＧ／ＮＲＳ）法（二抗体）の場合は、２００ μｌのＧＡＲＧＧ／ＮＲＳ複合体を各管に加えた。ＧＡＲＧＧ／ＮＲＳ複合体は、２ｍｌのヤギ抗ウサギ血清を１．０ｍｌの正常ウサギ血清と混合し、沈殿させ（４℃で２時間〜一晩）、次いで３〜４回洗浄して血清成分を除去することにより調製した。ペレットはＲＩＡ緩衝液で５０ｍｌまで再懸濁し、激しく撹拌した。この懸濁液を各アッセイ管に２００μｌ加えた後、管を室温で９０分間静置した。該アッセイ混合物を３０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレット中の放射能の量をガンマ計数器で測定した。総計数、非特異的結合計数（抗体を含まない管）及び１００％結合計数（抗体のみの管）を決定した。各抗血清希釈度での特異的結合率を、抗体無含有又は非特異的結合値を各抗体結合値から差し引き、システムの総計数で割ることによって算出した。抗体感度の決定種々の濃度の非標識プローブが放射性標識プローブへの結合を阻止する能力を評価することにより、抗体感度を決定した。抗血清をアッセイ緩衝液中で濃度１：３０００に希釈し、１００μｌを各アッセイ試料中で使用した。非標識プローブ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ− Ｇｌｕ−Ａｓｎをアッセイ緩衝液中で希釈して、最終濃度を１０^-16〜１０^-13モル／１００μｌとした。該非標識プローブ及び抗体を一晩４℃で反応させた。翌日、放射性プローブ、¹²⁵Ｉ−チロシル−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（３０，０００ｃｐｍ／１００μｌ）を加え、一晩４℃で反応させた。該アッセイは、対照と対比しての結合レベルを決定するために、非特異的結合を決定するための無抗体対照と、抗体＋プローブ含有対照とを含んでいた。測定は総て重複して行った。アッセイ試料及び対照は、木炭又は二抗体法によって実施した。比対照結合率は、各プローブ濃度毎に重複試料の平均ｃｐｍを計算し、非特異的結合の平均ｃｐｍを差し引き、得られた数値を抗体のみの計数値で割ることによって算出した。結果は第８図に示す通りである。抗体特異性の決定種々の長さの非標識ペプチド特異性プローブ（表１参照）が¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ− Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ放射性プローブの結合を阻止する能力を評価することによって、抗体特異性を決定した。実施例１で述べたアグレカンのストロメリシン開裂部位をベースとするＶａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ免疫原に対して調製されたウサギ抗血清を、アッセイ緩衝液中で希釈率１：３０００で希釈した。表１の特異性ペプチドを、アッセイ緩衝液中で、約１０^-6〜１０^-13モルのペプチド／管の範囲の濃度で希釈した。１００μｌの各希釈物を１００μｌの抗血清に加え、一晩４℃で反応させた。翌日、１００μｌの放射性プローブ、¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（配列番号：１０）（１００μ ｌ中３０，０００ｃｐｍ）を４℃で一晩反応させた。該アッセイは、対照のプローブ結合レベルを決定するため、非特異的結合を決定するための無抗体対照と、抗体＋プローブ含有対照とを含んでいた。測定は総て重複して行った。２回目の４℃で一晩のインキュベーション後に、二抗体法を用いて前述のように非抗体結合放射性プローブを分離した。該アッセイは、総計数を決定するために、１ｍｌのＰＢＳを加えた木炭無含有又はＧＡＲＧＧ／ＮＲＳ無含有対照を含んでいた。無抗体対照及びゼロペプチド抗体対照を計数して、０％結合及び１００％結合の値をそれぞれ算出する。ガンマ計数器と当業者に公知の標準的方法とを用いて、放射能を測定した。次いで検査ペプチドを含む試料を計数し、無抗体対照に付いた放射能の量を各々から差し引く。得られた正味の計数値を抗体のみの対照の正味計数値で割って、各量のペプチドの存在下での結合率を算出する。第４図〜第９図は、ストロメリシン開裂部位、Ａｓｎ³⁴¹−Ｐｈｅ³⁴²に関連した種々の合成ペプチドの交差反応性を示している。結果は第４図〜第９図に示す通りである。未知の試料中のＶＤＩＰＥＮエピトープ含有ペプチド濃度を測定するためのイムノアッセイ手順総ての希釈をアッセイ緩衝液中で行いながら、総量３００μｌでラジオイムノアッセイを実施した。標準溶液は１×１０^-9〜１０^-16モル／管の範囲の濃度で調製した。該アッセイは、非特異的結合を測定するための無抗体対照と、対照と対比してのペプチド結合レベルを測定するための、標準試料又は未知試料を添加していない抗体＋プローブ含有対照とを含んでいた。１００μｌの緩衝液、標準試料又は未知試料に、アッセイ緩衝液中で１：９，０００に希釈した実施例２及び７の特異的抗血清を１００μｌ加えた。該反応混合物を４℃で一晩インキュベートした。翌日、プローブペプチド¹²⁵Ｉ−チロシル−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ− Ａｓｎ（３０，０００ｃｐｍ／１００μｌ）を加え、４℃で一晩インキュベートした。ガンマ計数器と当業者に公知の標準的方法とを用いて放射能を測定した。無抗体対照及びゼロペプチド抗体対照を計数して、０％結合及び１００％結合の値をそれぞれ決定した。次いでアッセイ標準試料を計数し、抗体対照で割って結合率を算出し、標準曲線を作成した。結合率を標準試料中のペプチド量の対数の関数としてプロットすると、８０％結合の境界と２０％結合の境界との間で直線に近いＳ字形曲線が形成される。未知試料を計数し、その対照との比率を計算し、標準曲線と比較して、試料中に存在するペプチドの量を決定する。対照と対比しての結合率８０％〜２０％の未知試料のみが有効とみなされる。実施例４アッセイの手順ＲＩＡを使用して、ヒトアグレカン（第１０及び第１１図）及びウサギアグレカン（第１２図）のストロメリシン開裂を定量した。ヒト及びウサギアグレカンは関節軟骨から抽出し［Ｈａｓｃａｌｌ及びＫｉｍｕｒａ，（１９８２），ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．８２，ｐｐ．７６９−８００］、ヒアルウロン酸で凝集させた。ヒトアグレカン凝集物（３．７ｍｇ、１．８５ｎｍｏｌｅｓ）を、総量１ｍｌで、ヒトＳＬＮ（１０μｇ、０．１８２ｎｍｏｌｅｓ）で消化した。ウサギアグレカン凝集物（５ｍｇ、２．５ｎｍｏｌｅｓ）を、総量９７０μｌで、ウサギＳＬＮ（１３．５μｇ、０．２６ｎｍｏｌｅｓ）で消化した。各時点で、試料の１００μｌアリコートを採取し、ＥＤＴＡで１０ｍＭにして酵素活性を阻害した。これらのアリコートをＲＩＡでＶＤＩＰＥＮエピトープについて評価した（第１０図）。酵素を加えなかった場合には、試料中に検出可能なエピトープは存在しなかった。酵素を加えた場合には、エピトープが時間に応じて増加した。別の二つの緊密な関係にあるメタロプロテイナーゼ、即ちコラゲナーゼ（第１１図）又はゼラチナーゼ（第１０図及び第１２図）をアグレカンに加えた場合には、シグナルは１０％未満しか発生しなかった（第４図）。エピトープの生成は、ストロメリシン開裂したヒト（第１０図Ｂ）及びウサギ（第１２図Ｂ）アグレカンフラグメントに対する抗血清を用いて、ウェスタンブロットによってもモニターした。抗血清に抗原ペプチドＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎを予備吸着させた時は、ウェスタンブロットシグナルが消えた。アグレカンのＳＬＮ開裂部位にわたって延びる配列をベースとするペプチド、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂を抗血清に予備吸着させた時は、ウェスタンブロットシグナルに殆ど影響がなかった。Ｃ末端Ａｓｎをアミド化した抗原性ペプチドＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ− Ａｓｎ−ＮＨ₂を抗血清に予備吸着させた場合には、シグナルが明らかに減少したが、完全には消滅しなかった。これらの結果をまとめると、前記抗血清は最適認識のためにＣ末端Ａｓｎ（非アミド化）を必要とし、ウェスタンブロットシグナルはＴｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎに対して特異的であると結論される。実施例５阻害物質スクリーニングアッセイストロメリシンを関節内注射する１５分前に、３匹のウサギに、ストロメリシン阻害化合物１、（Ｎ−［１（Ｒ） −カルボキシエチル−α−（Ｓ）−（２−フェニルエチル）−グリシン（Ｌ）− ロイシンＮ−フェニルアミド）を３０ｍｐｋｉ．ｖ．で投与した。別の３匹の対照動物にはベヒクルのみを投与した。総ての動物の片方の後脚関節に１００μ ｇのストロメリシンを関節内注射し、もう一方の後脚関節に酵素緩衝液を注射した。１時間後、動物を殺して前記関節を１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。骨から軟骨を切除し、凍結セクションを調製し、免疫染色した（第１５図）。滑液中のエピトープ濃度をＲＩＡにより滑膜洗浄液中で測定した（第１４図）。軟骨を抗血清で染色してフラグメントの位置決定を行った（第１５図Ａ及び第１５図Ｂ）。ストロメリシンの注射後、エピトープは軟骨の上方三分の一に検出された。抗血清をＶａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎと共に予備インキュベートすると、この染色は阻止された。これは、該染色が該エピトープに特異的であることを意味する。約８０ｐｍｏｌｅ当量のエピトープが滑膜洗浄液中に検出された。阻害物質で処理すると、軟骨及び滑膜洗浄液中のエピトープが９０％以上減少した。実施例６ヒトＯＡ軟骨由来の抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清によって認識されるアグレカンフラグメントの単離関節全交換手術を受けた５人の患者に由来する膝軟骨をプロテアーゼ阻害物質中４Ｍ塩酸グアニジンで処理し［Ｋｉｍｕｒａ及びＨａｓｃａｌｌ，前出文献］、アグレカン及びアグレカンフラグメントを抽出した。ヒアルウロン酸に結合したアグレカンフラグメントを、会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）と解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ）ＣｓＣｌ密度勾配分別とを組合わせて使用して分別した［Ｋｉｍｕｒａ及びＨａｓｃａｌｌ，前出文献］。会合条件（Ａ１）下で最も大きい密度を有する画分（勾配の下から四分の一）を分離し、塩酸グアニジンで４Ｍにした。第二の勾配をこのＡ１画分について実施し、勾配の上方四分の一（Ａ１Ｄ４）を分離し、水に対して透析し、凍結乾燥した。このＡ１Ｄ４は、ヒアルウロン酸に結合することができるタンパク質及びアグレカンフラグメントを含んでいる。凍結乾燥Ａ１Ｄ４画分を水に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移動させ、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清でプローブした（第１３図）。各抽出物は、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清によって認識される分子量５０．０００のフラグメントを含んでいた。これらのフラグメントは、ｉｎｖｉｔｒｏでアグレカンのＳＬＮ開裂により生じたフラグメントと類似の大きさを有する（第１５図）。このデータは、ストロメリシン開裂物と一致するＶａｌ−Ａｓｐ− Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｎのＣ末端を有するフラグメントが、ヒトＯＡ軟骨から単離できることを示唆するものである。【配列表】配列番号：１配列の長さ：５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：２配列の長さ：６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：３配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：４配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：５配列の長さ：６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：６配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：７配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：８配列の長さ：９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：９配列の長さ：９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１０配列の長さ：７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖卜ポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１１配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１２配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖卜ポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１３配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１４配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１５配列の長さ：９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１６配列の長さ：８配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１７配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１８配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：１９配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：２０配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：２１配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：２２配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：２３配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列配列番号：２４配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月１８日【補正内容】第１１図は、ＳＬＮ開裂ヒトアグレカンに対するアッセイの特異性をＣＬＮ開裂ヒトアグレカンと比較して示すＲＩＡデータの説明図である。第１２図Ａは、ＳＬＮ開裂ウサギアグレカンフラグメントの検出と該フラグメントに対するアッセイの特異性とを９２ｋＤａゼラチナーゼ開裂ウサギアグレカンフラグメントと比較して示すＲＩＡデータの説明図である。第１２図Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＬＮ開裂ウサギアグレカンフラグメントの検出を示すウェスタンブロットの説明図である。第１３図は、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清によって認識されるアグレカンフラグメントをヒトＯＡ軟骨から単離できることを示すウェスタンブロットの説明図である。第１５図は、ＳＬＮ阻害化合物１又はベヒクルのみ（阻害物質を含まない）を予め投与したウサギの、関節内ＳＬＮ注射後の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌｆｌｕｉｄ）中のアグレカンフラグメントのＳＬＮ誘発開裂レベルを定量するＲＩＡデータを示す説明図である。第１４図Ａは、ＳＬＮを関節内注射したウサギの軟骨（検査軟骨）中の蛍光を、注射していない関節（対照）の軟骨と比較して示す免疫蛍光データの説明図である。第１４図Ｂは、ストロメリシンを注射した関節の軟骨（化合物１で処理していない検査軟骨）中の蛍光を、ストロメリシン注射の前に化合物１で処理した動物の軟骨（化合物１で処理した検査軟骨）と比較して示す免疫蛍光データの説明図である。発明の概要ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントのようなストロメリシン開裂産生物を、在来のＲＩＡ又は在来のイムノローカリゼーション（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）法により、ウサギポリクローナル抗血清を用いて測定する。該抗血清は、ストロメリシン開裂アグレカンを、（ａ）ｉｎｖｉｔｒｏで精製ウサギ、ウシ及びヒトアグレカンのＳＬＮ消化物中で検出し、（ｂ）ｉｎｖｉｖｏでＳＬＮを関節内注射したモデル系（即ちウサギ膝関節）の開裂アグレカンにおいて検出する。この抗血清をストロメリシン活性の測定手段として使用し、（ａ）種々のサイトカイン（即ちＩＬ−１及びＴＮＦα）により内因性ストロメリシン合成が剌激されるモデル、並びに（ｂ）ＲＡ及びＯＡのような種々のヒト疾患、におけるストロメリシン開裂アグレカンを定量する。に焦点をおく。細胞外マトリクスアグレカン分子中の所定の開裂部位をもたらすための試薬が開発されたのはこれが最初である。今までのところ、アグレカンの定量には一般的な免疫学的アッセイ［Ｈｅｉｎｅｇａｒｄら，前出文献；Ｃａｔｅｒｓｏｎら，前出文献］及び染料ベースアッセイ［Ｆａｒｎｄａｌｅら，前出文献］が使用されている。これらのアッセイでは、崩壊した分子と完全な（無傷の）分子とを識別していない。本明細書に記載の抗血清は、崩壊した無傷ではないアグレカンを認識するだけでなく、メタロプロテイナーゼストロメリシンによって特異的に開裂されたアグレカンも認識する。この種の抗血清を使用すれば、ストロメリシン開裂アグレカン分子を特異的に定量し且つ位置決定することができる。ＳＬＮはアグレカンを、該分子の球体間領域（ｉｎｔｅｒｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎ）内のＡｓｎ³⁴⁰−Ｐｈｅ³⁴¹結合の間で開裂することが判明した。開裂部位にわたって延びる合成ペプチド（Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ −Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ［配列番号：１］）も所期の部位でＳＬＮにより開裂される。この部位でのヒトアグレカンの開裂は、関節軟骨から滑液中へのカルボキシ末端フラグメント（Ｐｈｅ³⁴²−Ｈｉｓ²³¹⁶）の放出を可能にする。アミノ末端フラグメント（Ｖａｌ¹−Ａｓｎ³⁴¹）は軟骨のヒアルウロン酸と結合して止まるか、又はやはり滑液中に放出され得る。本明細書中のアミノ酸の３文字及び１文字の名称は総て、当業界で標準となっている下記のリストに示す名称と合致する：アラニンＡｌａＡロイシンＬｅｕＬアルギニンＡｒｇＲリシンＬｙｓＫアスパラギンＡｓｐＮメチオニンＭｅｔＭアスパラギン酸ＡｓｎＤフェニルアラニンＰｈｅＦシステインＣｙｓＣプロリンＰｒｏＰグルタミン酸ＧｌｕＥセリンＳｅｒＳグルタミンＧｌｎＱトレオニンＴｈｒＴグリシンＧｌｙＧトリプトファンＴｒｐＷヒスチジンＨｉｓＨチロシンＴｙｒＹイソロイシンＩｌｅＩバリンＶａｌＶストロメリシン開裂産物に関する本発明のアッセイは、種々の疾患におけるＳＬＮ活性の増加を示し、種々の動物モデル及びヒトにおける特異的且つ選択的ＳＬＮ阻害物質の効果をモニターするための診断ツールとして使用される。ウサギＩＬ−１モデルでは、ＳＬＮ阻害化合物の効果が、関節軟骨及び滑液のＳＬＮ崩壊アグレカンフラグメントを定量することにより評価される。従って、アミノ末端及びカルボキシ末端のＳＬＮ生成アグレカンフラグメント（ＳＬＮ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄａｇｇｒｅｃａｎｆｒａｇｍｅｎｔ）を両方ともモニターするアッセイは、ＳＬＮ阻害物質の特性を決定するのに有用である。ヒトの場合は、関節軟骨を患者から得ることが難しいため、軟骨のアグレカンフラグメントを生化学的効果の情報としてアッセイすることは困難である。ヒトにおけるＳＬＮ阻害化合物の効果をモニターするためには、滑液、血液、尿又は他の体液中に放出されるカルボキシ末端又はアミノ末端アグレカンフラグメントをモニターする。本明細書では、これらのアッセイを開発するために本発明で使用する手法を説明する。単一特異性抗体の産生ニュージーランド・ホワイト・ラビット及びＨａｒｔｌｅｙ近交系モルモットを免疫原で免疫感作した。最初の免疫感作では、各ウサギにフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）１ｍｌ当たり３３３μｇの免疫結合体を筋内注射した。７日目、ＦＣＡ中３３３μｇの免疫原を再度動物に投与し、３５日目に、合計３３３μｇの免疫原を６〜１０の部位で皮下注射した。４５日目に動物の採血を行い、次いで３３３μｇの免疫原で追加免疫した。５５日目、再度動物の追加免疫を行い、１０日後に採血した。この追加免疫及び採血スケジュールを３〜５回続けて、適当な供給量の抗血清を得た。モルモットも前述のように免疫感作した（６７μｇ）。抗血清は全部無抗体対照及びゼロペプチド抗体対照を計数して、０％結合及び１００％結合の値をそれぞれ決定した。次いでアッセイ標準試料を計数し、抗体対照で割って結合率を算出し、標準曲線を作成した。結合率を標準試料中のペプチド量の対数の関数としてプロットすると、８０％結合の境界と２０％結合の境界との間で直線に近いＳ字形曲線が形成される。未知試料を計数し、その対照との比率を計算し、標準曲線と比較して、試料中に存在するペプチドの量を決定する。対照と対比しての結合率８０％〜２０％の未知試料のみが有効とみなされる。実施例４アッセイの手順ＲＩＡを使用して、ヒトアグレカン（第１０及び第１１図）及びウサギアグレカン（第１２図）のストロメリシン開裂を定量した。ヒト及びウサギアグレカンは関節軟骨から抽出し［Ｈａｓｃａｌｌ及びＫｉｍｕｒａ，（１９８２），ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．８２，ｐｐ．７６９−８００］、ヒアルウロン酸で凝集させた。ヒトアグレカン凝集物（３．７ｍｇ、１．８５ｎｍｏｌｅｓ）を、総量１ｍｌで、ヒトＳＬＮ（１０μｇ、０．１８２ｎｍｏｌｅｓ）で消化した。ウサギアグレカン凝集物（５ｍｇ、２．５ｎｍｏｌｅｓ）を、総量９７０μｌで、ウサギＳＬＮ（１３．５μｇ、０．２６ｎｍｏｌｅｓ）で消化した。実施例５阻害物質スクリーニングアッセイストロメリシンを関節内注射する１５分前に、３匹のウサギに、ストロメリシン阻害化合物１、（Ｎ−［１（Ｒ）−カルボキシエチル−α−（Ｓ）−（２−フェニルエチル）−グリシン（Ｌ）−ロイシンＮ−フェニルアミド）を３０ｍｐｋｉ．ｖ．で投与した。別の３匹の対照動物にはベヒクルのみを投与した。総ての動物の片方の後脚関節に１００μｇのストロメリシンを関節内注射し、もう一方の後脚関節に酵素緩衝液を注射した。１時間後、動物を殺して前記関節を１ｍｌのリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。骨から軟骨を切除し、凍結セクションを調製し、免疫染色した（第１４図）。滑液中のエピトープ濃度をＲＩＡにより滑膜洗浄液中で測定した（第１５図）。軟骨を抗血清で染色してフラグメントの位置決定を行った（第１４図Ａ及び第１４図Ｂ）。ストロメリシンの注射後、エピトープは軟骨の上方三分の一に検出された。抗血清をＶａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎと共に予備インキュベートすると、この染色は阻止された。これは、該染色が該エピトープに特異的であることを意味する。約８０ｐｍｏｌｅ当量のエピトープが滑膜洗浄液中に検出された。阻害物質で処理すると、軟骨及び滑膜洗浄液中のエピトープが９０％以上減少した。実施例６ヒトＯＡ軟骨由来の抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清によって認識されるアグレカンフラグメントの単離関節全交換手術を受けた５人の患者に由来する膝軟骨をプロテアーゼ阻害物質中４Ｍ塩酸グアニジンで処理し［Ｋｉｍｕｒａ及びＨａｓｃａｌｌ，前出文献］、アグレカン及びアグレカンフラグメントを抽出した。ヒアルウロン酸に結合したアグレカンフラグメントを、会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）と解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ）ＣｓＣ１密度勾配分別とを組合わせて使用して分別した［Ｋｉｍｕｒａ及びＨａｓｃａｌｌ，前出文献］。会合条件（Ａ１）下で最も大きい密度を有する画分（勾配の下から四分の一）を分離し、塩酸グアニジンで４Ｍにした。第二の勾配をこのＡ１画分について実施し、勾配の上方四分の一（Ａ１Ｄ４）を分離し、水に対して透析し、凍結乾燥した。このＡ１Ｄ４は、ヒアルウロン酸に結合することができるタンパク質及びアグレカンフラグメントを含んでいる。凍結乾燥Ａ１Ｄ４画分を水に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移動させ、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清でプローブした（第１３図）。各抽出物は、抗ＶＤＩＰＥＮ抗血清によって認識される分子量５０，０００のフラグメントを含んでいた。これらのフラグメントは、ｉｎｖｉｔｒｏでアグレカンのＳＬＮ開裂により生じたフラグメントと類似の大きさを有する（第１２図）。このデータは、ストロメリシン開裂物と一致するＶａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｎのＣ末端を有するフラグメントが、ヒトＯＡ軟骨から単離できることを示唆するものである。請求の範囲１．ストロメリシン阻害物質の効果を評価する方法であって、ａ）アグレカンを含むストロメリシン基質をストロメリシン阻害物質と結合し、ｂ）ステップａ）で結合したストロメリシン基質とストロメリシン阻害物質とを、前記基質からストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントを生成するのに十分な時間にわたって反応混合物中でストロメリシンと反応させ、ストロメリシンがアグレカンを、ＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎＰｈｅＰｈｅＧｌｙＶａｌＧｌｙ（配列番号：４）からなるアグレカンアミノ酸配列のＡｓｎ残基とＰｈｅ残基との間で開裂して前記フラグメントを生成し、ｃ）前記反応混合物の試料と、前記ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの末端でエピトープに特異的に結合するが非開裂アグレカンには結合しない単一特異性抗体とを、該抗体が前記試料中に存在する前記フラグメントに結合するのに十分な時間にわたって接触させ、ｄ）ステップｃ）で抗体が結合した前記試料中のストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの量を、ステップｂ）で生成された前記フラグメントの量の尺度として測定し、ｅ）ステップｄ）で測定した前記フラグメントの量を、ストロメリシン阻害物質をストロメリシン基質と混合しなかった対照アッセイで測定したフラグメントの量と比較して、前記阻害物質の効果を決定することからなる前記方法。２．アグレカンを含むストロメリシン基質が骨関節の軟骨である請求項１に記載の方法。３．ステップｂ）のストロメリシンとの反応を、ストロメリシンの関節内注射によって生起させる請求項２に記載の方法。４．反応混合物の試料が、該反応混合物からの液体の試料、又は該反応混合物と接触した液体の試料である請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。５．接触ステップｂ）の後でストロメリシン基質を洗浄して、ストロメリシン及び阻害物質を基質との接触から解除する操作をも含み、反応混合物の試料が洗浄基質の試料である請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。６．単一特異性抗体がカルボキシル末端アミノ酸配列ＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎ（配列番号：１）からなるアミノ末端側ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントのカルボキシル末端エピトープに特異的に結合し、非開裂アグレカンには結合しない請求項１に記載の方法。７．試料中のストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの存在及び量を検出するためのアッセイであって、ａ）ＡｓｐＩｉｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎＰｈｅＰｈｅＧｌｙＶａｌＧｌｙ（配列番号：４）からなるアグレカンアミノ酸配列のＡｓｎ残基とＰｈｅ残基との間の部位でのストロメリシンによるアグレカンの開裂によって生成されたストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントを含むと思われる試料と、前記ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの末端でエピトープに特異的に結合するが非開裂アグレカンには結合しない単一特異性抗体との混合物を、前記抗体が前記試料中に存在する前記フラグメントに結合するのに十分な時間にわたって形成し、ｂ）前記混合物に、前記抗体に結合する標識ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントからなる標識プローブを加え、そしてｃ）前記抗体が結合した標識プローブの量を測定して、試料中のストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの存在及び量を決定することからなる前記アッセイ。８．単一特異性抗体が、カルボキシル末端アミノ酸配列ＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎ（配列番号：１）からなるアミノ末端側ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントのカルボキシル末端エピトープに特異的に結合し、非開裂アグレカンには結合しない請求項７に記載の方法。９．単一特異性抗体が、アミノ末端アミノ酸配列ＰｈｅＰｈｅＧｌｙＶａｌＧｌｙＧｌｙ（配列番号：５）からなるカルボキシ末端側ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントのアミノ末端エピトープに特異的に結合し、非開裂アグレカンには結合しない請求項７に記載の方法。１０．請求項１から９のいずれか一項に記載のアッセイを実施するためのパッケージ又はキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ラーク，ミツシエル・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤーシイ・ 08520、イースト・ウインザー、ミードウ・レーン・14 (72)発明者ベイン，エレン・ビー・ケイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤーシイ・ 07090、ウエストフイールド、トウドア・オーバル・131 (72)発明者ホールナー，ロリー・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤーシイ・ 07076、スコツチ・プレインズ、アバーデイーン・ロード・８

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質のストロメリシン開裂フラグメントに特異的に結合する単一特異性抗体であって、非開裂タンパク質には結合しない前記単一特異性抗体。２．ストロメリシン開裂タンパク質がアグレカンである請求項１に記載の抗体。３．アミノ末端側ストロメリシン生成アグレカンペプチドフラグメントのカルボキシル末端に結合する請求項２に記載の抗体。４．アグレカンペプチドフラグメントがカルボキシル末端アミノ酸配列ＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎを有する請求項３に記載の抗体。５．ストロメリシン開裂アグレカンの主たる開裂ペプチドのカルボキシル末端に位置するペプチドに対して発生した単一特異性抗体であって、前記ペプチドがＡｓｐＩｌｅＰｒｏＧｌｕＡｓｎであり、前記抗体が非開裂アグレカンには結合しない前記単一特異性抗体。６．（ａ）ストロメリシン基質をストロメリシン阻害物質と混合するステップと、（ｂ）ストロメリシンを加えるステップと、（ｃ）ストロメリシン生成ペプチドフラグメントの量を請求項１に記載の抗体を用いてイムノアッセイで測定するステップとを含む、ストロメリシン阻害物質スクリーニングアッセイシステム。７．（ａ）ストロメリシン基質をストロメリシン阻害物質と混合するステップと、（ｂ）ストロメリシンを加えるステップと、（ｃ）ストロメリシン活性を請求項１に記載の抗体を用いて免疫組織化学的に位置決定するステップとを含む、ストロメリシン阻害物質スクリーニングアッセイシステム。８．イムノアッセイが、アグレカンのストロメリシン開裂フラグメントに特異的に結合する単一特異性抗体を含み、前記抗体が非開裂アグレカンには結合しない、請求項６に記載のアッセイ。９．免疫組織化学的位置決定を、アグレカンのストロメリシン開裂フラグメントに特異的に結合する単一特異性抗体を用いて実施し、前記抗体が非開裂アグレカンには結合しない、請求項７に記載のアッセイ。１０．ストロメリシン生成アグレカン開裂産物を検出するためのアッセイであって、（ａ）ストロメリシン生成アグレカン開裂産物を含む試料を標識プローブと混合するステップと、（ｂ）請求項１に記載の抗体をストロメリシン生成アグレカン開裂産物と共にインキュベートするステップと、（ｃ）前記標識プローブに結合している抗体の量を測定するステップとを含むアッセイ。１１．ストロメリシン開裂産物の検出又は測定に使用できる、請求項１に記載の単一特異性抗体を含むパッケージ又はキット。