JPH08502353A - ストロメリシン開裂産生物を検出する抗体 - Google Patents
ストロメリシン開裂産生物を検出する抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
特異的ストロメリシン開裂によって生成された結合組織タンパク質アグレカンフラグメントに対して特異的な単一特異性抗体を産生する。該単一特異性抗体は、ストロメリシンによるアグレカンの特異的開裂によって生じたアグレカンポリペプチドフラグメントを検出するアッセイシステムで使用される。アグレカンポリペプチドフラグメントの存在はストロメリシン活性の存在を示す。変形性関節症、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化障害、通風、炎症性腸疾患(IBD)、特発性肺線維症(IPF)、ある種の癌、関節障害、及び多数の炎症性疾病ではストロメリシンの増加が見られる。本発明の単一特異性抗体及びアッセイシステムは、アグレカンポリペプチドフラグメントをストロメリシン活性の情報として定量し且つ潜在的ストロメリシン阻害物質を評価するために使用される。
Description
【発明の詳細な説明】
ストロメリシン開裂産生物を検出する抗体発明の背景
本発明は、ある種の動物モデルにおける、またストロメリシン(strome
lysin)が主な及び/又は中心的な役割を果たすと考えられる病状における
、in vivoのストロメリシン活性を反映する抗血清及びアッセイの開発に
関する。この抗血清及びアッセイは更に、前述のような種々の病気における、ス
トロメリシンの特異的及び選択的阻害物質の評価も可能にする。何らかの筋骨格
疾患をかかえているアメリカ人は3千2百万を超え、そのうちの半分は変形性関
節症(OA)にかかっている。OAは慢性関節リウマチ(RA)よりかなり多い
。RA及びOAのどちらでも、軟骨のアグレカン(aggrecan)及びコラ
ーゲンの崩壊及び損失が起こり、最終的にはその下の骨が崩壊する。この二種類
の病気は最終結果は類似しているが、これらの病気が発生し進行するメカニズム
は異なると思われる。RAは、IL−1及びTNFαのような種々のサイトカイ
ンが関与して滑膜を剌激し、崩壊酵素(de
gradative enzyme)を急増、産生させる炎症性疾患である。こ
れに対し、OAは軟骨の内部から発生すると思われる疾患であり、生化学的及び
生物機械的因子が主な役割を果たす。例えば、関節を不安定にする十字靭帯及び
半月障害の患者はOAがより速く進展し易い。OAでは、軟骨細胞による崩壊プ
ロテイナーゼの合成が行われると思われ、病気が進むと滑膜肥大及び炎症が発生
する。崩壊プロテイナーゼであるストロメリシン(SLN)はOA及びRAに共
通しており、これらの疾患のどちらにも観察される軟骨結合組織の破壊に関与し
ている可能性がある。
SLNは軟骨細胞及び滑膜細胞によって合成され、その合成はin vitr
o及びin vivoの両方で炎症サイトカインにより支配される(upreg
ulated)。SLNの発現は、慢性関節リウマチの動物モデル、並びにOA
、RA及び関節外傷の患者に強く見られる。SLNは、アグレカン、結合タンパ
ク質及びIX型コラーゲンを含む主要軟骨結合組織エレメントを崩壊させる能力を
有する。アグレカンは、軟骨の耐圧性の保持に関与する大きな陰イオンプロテオ
グリカンである。これは、OA軟骨から失わ
れる最初の分子の一つである。この分子の放出は、II型コラーゲンのコラーゲン
分解性崩壊に先立って要求されるものと思われる。72kDa及び95kDaゼ
ラチナーゼは、アグレカンを崩壊させる能力を有する別の二つのメタロプロテイ
ナーゼ類メンバーである。しかしながら、72kDa酵素の発現はOA又はRA
の場合に支配されない。また、SLNはコラゲナーゼ(CLN)及び95kDa
ゼラチナーゼ(GEL)両方の活性化に関与し得る。従ってSLNを阻害すれば
、直接的又は間接的に、OAにおける総ての主要軟骨高分子の崩壊を阻止し得且
つ崩壊速度を低下させ得る。現在、アグレカンの定量には、一般的な免疫学的ア
ッセイ [Heinegardら, (1985),Scand.J.Clin
.Lab Invest.,45,pp.421−427;Articular
Cartilage Biochemistry,K.E.Keuttner
,R.Schleyerbach及びV.C.Hascall編,Raven
Press,New York,1986,pp.59−73に記載のCate
rsonら,Monoclonal Antibodies Against
Cartilage Proteoglycan
And Link Protein]、及び染料ベースアッセイ[Farnda
leら,(1986),Biochem.Biophys Acta,883,
pp.173−177]が使用されている。これらのアッセイでは、崩壊したア
グレカン分子と健全なアグレカン分子とを識別していない。図面の簡単な説明
第1図は、非ヨウ素化ペプチドからのヨウ素化合成アグレカンプローブペプチ
ドの分離を示すHPLC(筆写)の説明図である。
第2図は、単一特異性抗VDIPEN抗血清の種々の希釈度に関するRIAデ
ータを示している。
第3図は、単一特異性抗VDIPEN抗血清の感度を、非標識ペプチドの添加
によって該抗血清が放射性標識ペプチドへの結合を阻止する能力を測定すること
により示す説明図である。
第4図は、認識のためにペプチド配列Asp IlePro Glu Asn
のC末端Asnが必要とされることを示す、単一特異性抗VDIPEN抗血清の
特異性の説明図である。
第5図は、Asn340の置換又は修飾がアミド側鎖での抗体への結合能力を激
減させることを示すことにより、単一特異性抗VDIPEN抗血清の特異性を明
らかにする説明図である。
第6図は、抗体がアグレカンのストロメリシン開裂部位にわたって延びるペプ
チドを認識しないことを示す、単一特異性抗VDIPEN抗血清の特異性の説明
図である。
第7図は、配列Val−Asp−Ile−Pro−Glu−AsnにおいてI
le−Pro−Glu−中のアミノ酸のいずれか一つでも置換されていると、抗
VDIPEN抗血清による認識が失われることを示す、単一特異性抗VDIPE
N抗血清の特異性の説明図である。
第8図は、SLN開裂アグレカンフラグメントをアミノ末端側で延長したもの
に対応する6個の異なるペプチドを認識する単一特異性抗VDIPEN抗血清の
特異性を示す説明図である。
第9図は、アミノ末端側で切頭したPhe−Val−Asp−Ile−Pro
−Glu−Asnペプチドを認識する単一特異性抗VDIPEN抗血清の特異性
を示す説明図である。
第10図Aは、完全なアグレカンではない、SLN開裂したヒトアグレカンフ
ラグメントの検出と該フラグメントに対するアッセイの特異性とを明らかにする
RIAデータを示す説明図である。
第10図Bは、72kDAゼラチナーゼ開裂ヒトアグレカンフラグメントでは
ない、SLN開裂ヒトアグレカンフラグメントの検出と該フラグメントに対する
アッセイの特異性とを明らかにするRIAデータを示す説明図である。
第10図Cは、SDS−PAGEによるSLN開裂ヒトアグレカンフラグメン
トの検出を示すウェスタンブロットの説明図である。
第11図は、SLN開裂ヒトアグレカンに対するアッセイの特異性をCLN開
裂ヒトアグレカンと比較して示すRIAデータの説明図である。
第12図Aは、SLN開裂ウサギアグレカンフラグメントの検出と該フラグメ
ントに対するアッセイの特異性とを92kDaゼラチナーゼ開裂ウサギアグレカ
ンフラグメントと比較して示すRIAデータの説明図である。
第12図Bは、SDS−PAGEによるSLN開裂ウサギアグレカンフラグメ
ントの検出を示すウェスタンブロッ
トの説明図である。
第13図は、抗VDIPEN抗血清によって認識されるアグレカンフラグメン
トをヒトOA軟骨から単離できることを示すウェスタンブロットの説明図である
。
第14図は、SLN阻害化合物1又はベヒクルのみ(阻害物質を含まない)を
予め投与したウサギの、関節内SLN注射後の滑液(synovial flu
id)中のアグレカンフラグメントのSLN誘発開裂レベルを定量するRIAデ
ータを示す説明図である。
第15図Aは、SLNを関節内注射したウサギの軟骨(検査軟骨)中の蛍光を
、注射していない関節(対照)の軟骨と比較して示す免疫蛍光データの説明図で
ある。
第15図Bは、ストロメリシンを注射した関節の軟骨(化合物1で処理してい
ない検査軟骨)中の蛍光を、ストロメリシン注射の前に化合物1で処理した動物
の軟骨(化合物1で処理した検査軟骨)と比較して示す免疫蛍光データの説明図
である。発明の概要
ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントのようなストロメリシン開裂産生
物を、在来のRIA又は在来のイム
ノローカリゼーション(immunolocalization)法により、ウ
サギポリクローナル抗血清を用いて測定する。該抗血清は、ストロメリシン開裂
アグレカンを、(a)in vitroで精製ウサギ、ウシ及びヒトアグレカン
のSLN消化物中で検出し、(b)in vivoでSLNを関節内注射したモ
デル系(即ちウサギ膝関節)の開裂アグレカンにおいて検出する。この抗血清を
ストロメリシン活性の測定手段として使用し、(a)種々のサイトカイン(即ち
IL−1及びTNFα)により内因性ストロメリシン合成が刺激されるモデル、
並びに(b)RA及びOAのような種々のヒト疾患、におけるストロメリシン開
裂アグレカンを定量する。この抗体を使用すれば、種々の薬物動態学的/薬理学
的動物モデル並びに種々のヒト疾患、例えばRA及びOAにおけるSLN阻害物
質の評価も可能である。発明の詳細な説明
本発明は、ストロメリシン活性の尺度としてのストロメリシン開裂アグレカン
フラグメントの定量及び位置決定に関する。本発明は、in vivoでストロ
メリシン阻害物質の効力を評価するアッセイシステムにも関する。スト
ロメリシン開裂アグレカンフラグメントの定量は、種々の病気、例えば非限定的
具体例として変形性関節症(OA)及び慢性関節リウマチ(RA)、IBD、I
PF、通風、アテローム性動脈硬化病変、関節障害及びある種の癌の診断に有用
であり得る。ストロメリシン阻害物質の同定は、例えばOA及びRAのような病
気を治療するための薬剤の開発につながり得る。より特定的には、本発明は、ス
トロメリシン開裂アグレカンポリペプチドフラグメントのようなストロメリシン
開裂産物を検出する単一特異性抗体に関する。
プロテイナーゼ活性をその場で(in situ)モニターする方法の一つは
、プロテイナーゼ仲介崩壊産物をアセイすることである。アグレカンは主要な軟
骨マトリクス分子、SLN基質であり、OAの場合に軟骨から失われる最初の分
子の一つであるため、本発明は前記目的のために、SLN開裂アグレカンフラグ
メントを定量する試薬の開発に焦点をおく。細胞外マトリクスアグレカン分子中
の所定の開裂部位をもたらすための試薬が開発されたのはこれが最初である。今
までのところ、アグレカンの定量には一般的な免疫学的アッセイ[Heineg
ardら,前出文献
;Catersonら,前出文献]及び染料ベースアッセイ[Farndale
ら,前出文献]が使用されている。これらのアッセイでは、崩壊した分子と完全
な(無傷の)分子とを識別していない。本明細書に記載の抗血清は、崩壊した無
傷ではないアグレカンを認識するだけでなく、メタロプロテイナーゼストロメリ
シンによって特異的に開裂されたアグレカンも認識する。この種の抗血清を使用
すれば、ストロメリシン開裂アグレカン分子を特異的に定量し且つ位置決定する
ことができる。SLNはアグレカンを、該分子の球体間領域(interglo
bular domain)内のAsn340−Phe341結合の間で開裂すること
が判明した。開裂部位にわたって延びる合成ペプチド(Asp−Ile−Pro
−Glu−Asn−−Phe−Phe−Gly−Val−Gly[配列番号:1
])も所期の部位でSLNにより開裂される。この部位でのヒトアグレカンの開
裂は、関節軟骨から滑液中へのカルボキシ末端フラグメント(Phe342−Hi
s2316)の放出を可能にする。アミノ末端フラグメント(Val1−Asn341)
は軟骨のヒアルウロン酸と結合して止まるか、又はやはり滑液中に放出され得る
。
本明細書中のアミノ酸の3文字及び1文字の名称は総て、当業界で標準となっ
ている下記のリストに示す名称と合致する:
アラニン Ala A ロイシン Leu L
アルギニン Arg R リシン Lys K
アスパラギン Asp N メチオニン Met M
アスパラギン酸 Asn D フェニルアラニン Phe F
システイン Cys C プロリン Pro P
グルタミン酸 Glu E セリン Ser S
グルタミン Gln Q トレオニン Thr T
グリシン Gly G トリプトファン Trp W
ヒスチジン His H チロシン Tyr Y
イソロイシン Ile I バリン Val V
ストロメリシン開裂産物に関する本発明のアッセイは、種々の疾患におけるS
LN活性の増加を示し、種々の動物モデル及びヒトにおける特異的且つ選択的S
LN阻害物質の効果をモニターするための診断ツールとして使用される。ウサギ
IL−1モデルでは、SLN阻害化合物の効果が、関節軟骨及び滑液のSLN崩
壊アグレカンフラグメントを定量することにより評価される。従って、アミノ末
端及び
カルボキシ末端のSLN生成アグレカンフラグメント(SLN−generat
ed aggrecan fragment)を両方ともモニターするアッセイ
は、SLN阻害物質の特性を決定するのに有用である。ヒトの場合は、関節軟骨
を患者から得ることが難しいため、軟骨のアグレカンフラグメントを生化学的効
果の情報としてアッセイすることは困難である。ヒトにおけるSLN阻害化合物
の効果をモニターするためには、滑液、血液、尿又は他の体液中に放出されるカ
ルボキシ末端又はアミノ末端アグレカンフラグメントをモニターする。本明細書
では、これらのアッセイを開発するために本発明で使用する手法を説明する。
アグレカンのストロメリシン開裂部位は既に同定されており(J.Biol.
Chem.,267,pp.1008−1014,[1992])、この部位は
アグレカンの「二重球体(double globe)」領域中であると確認さ
れた(J.Biol.Chem.,266,pp.15579−15582,[
1991])。アグレカンにおけるストロメリシンの開裂部位はAsp Ile
Pro Glu Asn/Phe Phe Gly ValGlyである[配
列番号:2]。ストロメリシン開裂部位
の周囲のペプチドを合成的に製造し、これらのペプチドに対するポリクローナル
抗血清を生成して、これらのネオエピトープを同定するための免疫試薬として使
用する。アグレカンのアミノ末端ヒアルウロン酸結合領域は軟骨から抽出され、
このG1の一部分は、ストロメリシン開裂と一致するC末端アミノ酸を有する。
ストロメリシン開裂によって形成されたアグレカンのアミノ末端フラグメント
(Val1−Asn341)のC末端とカルボキシ末端フラグメント(Phe342−
His2316)のN末端とを認識する単一特異性抗ペプチド抗体を生成する。これ
らの抗体は、この部位での分子の開裂を定量するためのラジオイムノアッセイ(
RIA)の開発に使用する。アミノ末端フラグメントのC末端(Val Asp
Ile Pro Glu Asn341、配列番号:3)に対する抗体を生成し
た。これらの抗体は、SLN消化したヒト及びウサギアグレカンの両方を認識す
るが、無傷のヒト又はウサギアグレカンは認識しない。この抗体によって認識さ
れるin vitro生成SLN開裂アグレカンフラグメントと類似の分子量を
有するフラグメントが、ヒトOA軟骨から単離される。これは配列データ(実施
例6)と同
じく、SLN開裂と一致するアグレカンフラグメントをヒトOA軟骨から単離で
きることを示す。この抗体を用いてRIAを開発した。このアッセイは、ヒト及
びウサギの軟骨、滑液、血液、尿又は他の体液中のアミノ末端アグレカンフラグ
メント(Val1−Asn341)を定量するために使用する。このアッセイは10
〜20pMの検出限度を有する。この抗血清の特異性を決定するために、一連の
ペプチドを合成した。C末端がより短い(即ちAsn残基を欠く)ペプチドは、
該抗血清によって認識されない(一万の一以下の感度)。また、C末端がより長
い(即ちPheを含む)ペプチドも、この抗血清によって認識されない。最適な
認識のためには、少なくともアミノ酸6個の配列Va1−Asp−Ile−Pr
o−Glu−Asn(配列番号:3)が必要である。C末端Asn341をAsn
−NH2又はAspに置換すると、認識が百分の一〜千分の一に減少する。この
データは、該抗血清による最適認識のためにはAsn341上に遊離カルボキシル
基が必要であることを示すものであり、Asn341の遊離カルボキシルがPhe3 42
とアミド結合されている無傷のアグレカンが該抗血清によって認識されないと
いう理由を説明するものである。前述の
最適なアミノ酸6個より大きい種々の長さを有するペプチドも使用するのに適し
ている。カルボキシ末端フラグメントのN末端配列(Phe342−Gly347)の
結合体を形成し、ウサギに注射して、軟骨から放出された大きなアグレカンフラ
グメントの定量に使用する抗血清を製造した。
SLN生成アグレカンフラグメント(AggFgm)に対する単一特異性抗体
を、AggFgmと反応する抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はK
ohler及びMilstein,Nature 256:495−497(1
975)に記載の方法を用いて、AggFgmと反応するモノクローナル抗体と
して製造する。本明細書中の単一特異性抗体は、AggFgmに対する均一結合
特性を有する単一抗体種又は多重抗体種であると定義される。本明細書中の均一
結合(homogenous binding)とは、抗体種が特定の抗原又は
エピトープ、例えば前述のようなAggFgmに会合したものと結合する能力を
意味する。AggFgm特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、
ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを、免疫アジュバントを使用して
、又は使用せずに、適当な濃度のAggFgm又は該フラグメント
中の配列に基づく合成ペプチド結合体で免疫感作することにより発生させる。
最初の免疫感作に先立ち、免疫前血清を採取する。各動物に、約0.1μg〜
約1000pgのAggFgm又はペプチド結合体を許容し得るアジュバントと
共に投与する。このような許容し得るアジュバントの非限定的具体例としては、
フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン
沈降物、Corynebacterium parvum含有油中水滴エマルジ
ョン及びtRNAが挙げられる。最初の免疫感作は、AggFgm、又はアミノ
末端フラグメント(Val Asp Ile Pro Glu Asn)配列番
号:3)のC末端もしくはC末端フラグメント(Phe Phe Gly Va
l Gly Gly、配列番号:4)のN末端をベースとする合成ペプチドとウ
シチログロブリンとの結合体を、好ましくはフロイントの完全アジュバント中で
、複数の部位に皮下(SC)注射、筋内(IM)注射、腹膜組織内(IP)注射
するか又はこれらの注射を組合わせて行うことからなる。AggFgm又は合成
ペプチドは、当業者に公知のものを含む別の担体分子、例えば非限定的具体例と
してキーホールリンペットヘモシアニン及びBSAと結合してもよい。予め決定
した規則的間隔で各動物の採血を行って、抗体力価を調べる。動物には最初の免
疫感作の後で追加免疫注射をしても、又はしなくてもよい。応答を示さなかった
か又は力価の低かった動物には、最初の免疫感作後に追加免疫注射をする。追加
免疫注射すべきこれらの動物には通常、フロイントの不完全アジュバント中等量
のAggFgm又はペプチド結合体を同一ルートで注射する。追加免疫注射は、
最大力価が得られるまで約3週間の間隔で行う。各追加免疫感作から約10〜1
4日後、又は単一免疫感作後に約2週間に一度の割合で動物の採血を行い、血清
を集め、アリコートを約−20℃で貯蔵する。
AggFgm又はペプチド結合体と反応するモノクローナル抗体(mAb)を
、近交系マウス、好ましくはBalb/cをAggFgm又はペプチド結合体で
免疫感作することにより製造する。これらのマウスは、同量の前述のような許容
し得るアジュバントに混入した約0.5mlの緩衝液又は食塩水中約0.1μg
〜約10μg、好ましくは約1μgのAggFgm又はペプチド結合体を、IP
又はSCルートで投与することにより免疫感作する。好ましく
はフロイントの完全アジュバントを使用する。これらのマウスは0日目に最初の
免疫感作を行い、約3〜30週間休ませる。免疫したマウスに、リン酸塩緩衝食
塩水のような緩衝溶液中約0.1〜約10μgのAggFgm又はペプチド結合
体を静脈(IV)注射することにより、一回以上の追加免疫感作を行う。抗体陽
性マウスに由来するリンパ球、好ましくは脾リンパ球を、当業者に公知の標準的
方法で免疫感作マウスから脾臓を取り出すことによって得る。脾リンパ球を、安
定なハイブリドーマを形成させる条件下で、適当な融合相手、好ましくは骨髄腫
細胞と混合することにより、ハイブリドーマ細胞を製造する。融合相手の非限定
的具体例としては、マウス骨髄腫P3/NSI/Ag4−1;MPC−11;S
−194及びSp2/0が挙げられる。好ましいのはSp2/0である。抗体産
生細胞及び骨髄腫細胞は、約30%〜約50%の濃度で、分子量約1000のポ
リエチレングリコール中で融合させる。融合ハイブリドーマ細胞は、当業者に公
知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを添加したダルベッ
コの改質イーグル培地(DMEM)で増殖させることにより選択する。約14日
目、18日目及び21目に増殖陽性
ウェルから上清液を集め、AggFgm又はペプチド結合体を抗原として用いて
固相イムノラジオアッセイ(SPIRA)のようなイムノアッセイにより、抗体
産生に関するスクリーニングを行う。培養液をオクタロニー沈降アッセイでも検
査して、mAbのイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ
細胞を、Tissue Culture Methods and Appli
cations,Kruse及びPaterson編,Academic Pr
ess,1973に記載のMacPherson,Soft Agar Tec
niquesの軟寒天法のような方法でクローニングする。
プリスタン感作(pristane primed)したBalb/cマウス
に、感作から約4日後にマウス当たり約0.5mlで約2×106〜約6×106
個のハイブリドーマ細胞を注射して、モノクローナル抗体をin vivoで産
生する。細胞トランスファーから約8〜12日後に腹水を集め、モノクローナル
抗体を当業者に公知の方法で精製する。
約2%のウシ胎児血清を含むDMEM中でハイブリドーマを増殖させることに
より抗AggFgm mAbのin
vitro産生を実施して、十分な量の特異的mAbを得る。該mAbは当業
者に公知の方法で精製する。
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を、種々の血清学的又は免疫学的ア
ッセイ、例えば非限定的具体例として、沈降、受身凝集反応、酵素結合イムノソ
ルベント抗体(ELISA)法及びラジオイムノアッセイ(RIA)法により決
定する。類似のアッセイを用いて、体液又は組織及び細胞抽出物中のAggFg
mの存在を検出する。
当業者には容易に理解されるように、単一特異性抗体を産生するための前述の
方法は、AggFgmに特異的な抗体を産生するのに使用し得る。この抗体は、
SLN生成アグレカンフラグメントの検出及びその量(レベル)の測定のための
診断アッセイシステムの形成に有用である。SLN生成アグレカンフラグメント
の量の決定は、患者の体液の分析に基づいており、OA、RA及び他の疾患の発
生を診断する上で有用である。また、この抗体は、生検/組織試料中のSLN産
生フラグメントのイムノローカリゼーションに有用である。この種の分析は、細
胞外マトリクス中のSLN活性の部位をその場で決定するができる。
ストロメリシン阻害物質の効果を評価するために、動物
にストロメリシン阻害物質を投与し、ストロメリシン活性のモニターとしてRI
Aを用いて、ストロメリシン生成アグレカンフラグメントの量を測定する。一連
の動物にストロメリシンを関節内注射し、軟骨中の、又は滑液、血液もしくは他
の体液中に放出されたストロメリシン生成アグレカンフラグメントの量をRIA
で測定する。酵素の注射後、関節をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、骨から軟骨を
切除する。軟骨をカオトロピック緩衝液[Hascall及びKimura,M
ethods Enzymol 82:pp.769−800(1982)]で
抽出し、軟骨抽出物、滑液、血液又は他の体液中のストロメリシン生成アグレカ
ンフラグメントの量をRIAで測定する。二組目の一連の動物に阻害物質を予備
投与し(i.v.又はp.o.)、前述のように軟骨、滑液又は血液中のストロ
メリシン消化アグレカンフラグメントの量を定量する。阻害の程度は、阻害物質
を与えなかった場合に生じたストロメリシン開裂フラグメントに対する、阻害物
質を与えた場合に生じたストロメリシン開裂フラグメントの割合(%)として計
算する。同じ方法を用いて、サイトカインを関節内注射した場合のストロメリシ
ン活性の阻害を定量する。同じアッセイ
を用いて、滑液、血液又は他の体液中のストロメリシン生成アグレカンフラグメ
ントの減少をモニターすることにより、ヒトRA、OA又は他の関節疾患におけ
る阻害物質の活性を評価する。前記減少は、薬剤処理の前のフラグメントの定量
と、その後の薬剤処理後のフラグメントの定量とによって測定する。このアッセ
イを用いて、関節疾患の動物モデル、及びOA、RAもしくは他の関節疾患を有
するヒトに由来する軟骨中のストロメリシン生成アグレカンフラグメントを定量
する。
ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントに対して形成した抗血清は、標準
的イムノローカリゼーション法により、軟骨中のフラグメントの位置決定にも使
用する。この方法を用いて、ストロメリシン活性の部位をその場で検出する。阻
害物質の存在下でのSLN生成フラグメントの量は、阻害物質を注射しなかった
対照動物のそれと比べて著しく低い。薬剤で処理した動物の組織中のフラグメン
トの分布を薬剤で処理しなかった動物の組織と比べることにより、ストロメリシ
ン阻害の分布を決定する。この方法を、ストロメリシンを注射した動物、ストロ
メリシンを内因的に生成すべくサイトカインを注射した動物、他の一般的関
節炎動物モデルに由来する組織、又はOA、RAもしくは他の関節疾患の患者に
由来する外科的試料で使用する。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するもので
はない。
実施例1
ペプチド免疫原
ヒトアグレカンにおける特異的ストロメリシン開裂部位の解明は、SLN開裂
部位に隣接するアミノ末端及びカルボキシ末端を表す抗原性ペプチド及びペプチ
ドプローブの同定を可能にした。SLN開裂によって生じたアミノ末端アグレカ
ンフラグメントのカルボキシ末端に結合した特異的アミノ酸配列はPhe−Va
l−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn341(配列番号:4)であり、S
LN開裂によって生じたカルボキシ末端アグレカンフラグメントのアミノ末端に
結合した配列は342Phe−Phe−Gly−Val−Gly−Gly−Glu
(配列番号:7)である。
ペプチド抗原及びペプチドプローブを、t−ブチルオキシカルボニル(t−B
oc)又はフルオレニルメトキシ−カルボニル(Fmoc)化学を用いて、AB
I 430A
ペプチド合成機(Applied Biosystems,Inc.)で合成し
た。t−Boc化学の場合は、ペプチド酸を標準的フェニルアセトアミドメチル
(PAM)樹脂上で合成し、ペプチドアミドをメチルベンズヒドリルアミン(M
BHA)樹脂上で合成した。合成は、ABI 430A Operators
Manual(Applied Biosystems,Foster Cit
y,CA.,1988)に詳述されている、ヒドロキシベンジルトリアゾール(
HOBT)エステル仲介カップリングである、N−メチル−ピロリドン(NMP
)/HOBT手順に従って実施した。ペプチジル樹脂は、Protein Re
search Foundationフッ化水素装置、又はMultiple
Peptide Systemsフッ化水素装置で、ABI 430A Ope
rators Manualに記載の手順に従って、無水フッ化水素で開裂し脱
保護した。ペプチドは、Waters DeltaPak C18カラムで、0
.1%トリフロオロ酢酸(TFA)水溶液中2→50%のアセトニトリル勾配で
逆相HPLCにかけて精製した。個々のペプチドの純度は、Applied B
iosystems Spheri−
5 C18カラムでの逆相HPLCにより測定した。これらのペプチドの構造を
、高速原子衝撃又は電子噴霧イオン化を用いた質量分析法により確認した。Fm
oc合成の場合は、ペプチド酸を標準的Wang樹脂上で合成し、ペプチドアミ
ドをRinkアミド樹脂上で合成した。合成は、ABI 430A Synth
esis Notes(Applied Biosystems,1992)に
詳述されているベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホス
フェート(HBTU)仲介のカップリングについてのFastMoc(登録商標
)手順に従って実施した。ペプチジル樹脂は、ABI 430A Operat
ors Manualに記載の手順に従いTFAで開裂し脱保護した。ペプチド
の精製及び構造決定は、t−Boc化学について述べたように実施した。ヒトア
グレカンのストロメリシン開裂によって生じたアミノ末端フラグメントのカルボ
キシ末端に結合した一次抗原Phe335−Val−Asp−Ile−Pro−G
lu−Asn341(配列番号:4)は、更に二つのアミノ酸残基を用いて合成す
る。合成ペプチドPhe−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asnに
システイン−ノルロイシンを結合し
て、抗原Cys−Nle−Phe−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−
Asn(配列番号:5)を形成する。末端アスパラギン残基上のカルボキシル基
の保全性(integrity)に変化はなかった。システインは結合アミノ酸
である。なぜなら、この抗原を免疫原性担体に結合させるからである。ノルロイ
シンは、単一免疫原性担体に結合した抗原分子の実際の数を調べるために内部マ
ーカーとして加えた。ストロメリシンによって生じたカルボキシ末端アグレカン
フラグメントのアミノ末端に結合した一次抗原Phe342−Phe−Gly−V
al−Gly−Gly−Glu349(配列番号:7)は、更に二つのアミノ酸残
基を用いて合成する。システイン−ノルロイシンを合成ペプチドPhe342−P
he−Gly−Val−Gly−Gly−Glu抗原に結合して、抗原Phe34
2−Phe−Gly−Val−Gly−Gly−Glu−Nle−Cys(配列
番号:9)を形成する。システインは、抗原を免疫原性担体に結合させる結合ア
ミノ酸である。ノルロイシンは、単一免疫原性担体に結合した抗原分子の実際の
数を測定するために内部マーカーとして加えた。
実施例 2
担体への抗原の結合
担体タンパク質への抗原性ペプチドの結合を、Proc.Nat.Acad.Sci
.USA 78:3403−3407(1981)に記載のLerner
らの方法を改変した方法で、ヘテロニ官能カップリング試薬Sulfo−MBS
(Pierce Chemical Co.)を用いて実施した。ペプチド抗原
は、2.5mlの脱気リン酸塩緩衝液20mM、pH8.0に溶解した10mg
のTGと、4.2mgのSulfo−MBSとを混合し、撹拌しながら室温で3
0分間インキュベートすることにより、担体ウシ−チログロブリン(TG)に結
合させた。前記担体−カップリング試薬混合物は次いで、脱気50mMリン酸塩
緩衝液、pH7.0で平衡化した使い捨てPD−10SephadexG−25
カラム(Pharmacia)にかけた。6マイクロモルの精製凍結乾燥ペプチ
ド抗原を入れた小バイアルをカラムの出口の下に配置し、更に3.5mlのpH
7.0緩衝液で活性化TG画分をバイアル内に溶離した。ペプチド抗原−活性化
担体複合体を静かに撹拌しながら4℃で一晩反応させた。最終的反応混合物のア
リコートを採取し、PBSで平衡化したPD−10 Se
phadex G−25カラムに通して残留遊離ペプチド及び/又は反応副産物
を除去することにより、VDIPEN結合体のカップリング度を測定した。FF
GVGチログロブリン免疫原複合体(40μg)のカップリング度は、透析及び
凍結乾燥の後に直接測定した。なぜなら、FFGVG免疫原複合体はカップリン
グ反応中に沈殿するため、前述の方法は使用できないからである。
A280で調べたチログロブリン免疫原複合体を含む画分のアリコート(50μ
l)を蒸発乾固させて、アミノ酸分析を行った。
アミノ酸分析では、110℃に維持した200μ1の0.1%フェノール含有
6.0N HClを用いて、試料を24時間加水分解した。試料を、Beckm
an Mode1 6300アミノ酸分析機を用いて分析した。分析の結果、T
G−Cys−Nle−Phe−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−As
n(配列番号:8)免疫原の場合はTG1モル当たり25.3モルの抗原ペプチ
ドが存在し、Phe−Phe−Gly−Val−Gly−Gly−Glu−Nl
e−Cys−TG(配列番号:9)免疫原の場合はTG1モル当たり78.8モ
ルのペプチドが存在
することが判明した。
合成プローブ及び特異性ペプチド
抗体特異性を決定し且つSLN開裂アグレカンフラグメントの存在及び量を評
価するための抗原プローブを、前述の方法で合成した。開裂産物の存在及び量を
測定するために使用する抗原プローブは、該プローブが125Iにカップルできる
ように、エピトープに対して遠い方の末端にチロシン残基を含むように設計した
。抗体力価を測定するために最初に使用したプローブは、アグレカンのVal33 6
−Asn341のアミノ酸配列+アミノ末端チロシン残基をベースとする合成ペプ
チドTyr−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn(配列番号:1
0)である。抗体力価を測定するために使用した次のプローブは、Thr331−
Asn341のアミノ酸配列+330位の天然Tyr残基をベースとする合成プロ
ーブ、Tyr−Thr−Gly−Glu−Asp−Phe−Val−Asp−I
le−Pro−Glu−Asn(第1図)(配列番号:11)である。抗体特異
性を調べ、この特異性がアグレカンVal336−Asn341アミノ酸配列に存在す
ることを立証するために使用した合成ペプチドを下記の表1に示す。
単一特異性抗体の産生
ニュージーランド・ホワイト・ラビット及びHartley近交系モルモット
を免疫原で免疫感作した。最初の免疫感作では、各ウサギにフロイントの完全ア
ジュバント(FCA)1ml当たり333μgの免疫結合体を筋内注射した。7
日目、FCA中333μgの免疫原を再度動物に投与し、35日目に、合計33
3μgの免疫原を6〜10の部位で皮下注射した。45日目に動物の採血を行い
、次いで333μgの免疫原で追加免疫した。55日目、再度動物の追加免疫を
行い、10日後に採血した。この追加免疫及び採血スケジュールを3〜5回続け
て、適当な供給量の抗血清を得た。モルモットも前述のように免疫感作した(6
7μg)。抗血清は全部−20℃で貯蔵した。
アッセイプローブの放射性ヨウ素化を、クロラミンTとの反応によって実施し
た。ペプチドプローブは濃度220μg/mlで水に溶解した。この溶液の50
μl容(11μg含有)を10μlの0.5Mリン酸塩(K+)緩衝液、pH7
.5に加え、次いで2mCiの125INa及び10μlの新しく調製した水中ク
ロラミンT(0.1mg/ml)と混合した。該混合物を30秒間反応させ、1
0μlの1mg/ml NaI+1mg/mlチオ硫酸ナトリウムで反応を停止
させた。放射性ヨウ素化プローブを、Supelco C−8カラム(0.4×
25cm)を用いてHPLCで精製した。ヨウ素化プローブは、99%溶離液A
−1%溶離液B→36%溶離液A−64%溶離液Bの35分間の1%/分勾配に
より、流速1ml/分で溶離した。溶離液Aは水中0.1%トリフルオロ酢酸か
らなり、溶離液Bはアセトニトリル中0.1%トリフルオロ酢酸からなっていた
。非ヨウ素化Tyr−336−341ペプチドの精製は第1図に示す。
実施例 3
ストロメリシン開裂産物のラジオイムノアッセイ
一般的イムノアッセイ手順
該アッセイは、0.1%ゼラチン、0.01%チメラゾール及び1.0mM
EDTAを加えた総量300μlのダルベッコのカルシウム及びマグネシウム無
含有リン酸塩緩衝食塩水中で実施した。100μlの緩衝液又は試料に100μ
lの抗血清を加え、4℃で一晩インキュベートした。翌日、同じ緩衝液中の放射
性プローブを、各試料又は対照に約30,000cpmが加えられるように調製
した。該アッセイ混合物を4℃で一晩インキュベートし、0.3%のデキストラ
ンコーティングした木炭で停止させた。遠心分離で木炭を沈降させた後、上清液
をデカンテーションで除去し、放射能の量を測定した。
この手順で、100μl容中の添加抗血清の希釈度を変えながら、抗血清力価
を測定した。競合実験で使用する抗体希釈度は約30%の放射性プローブ結合率
が得られるように選択した。種々の既知量の合成プローブペプチド(Val−A
sp−Ile−Pro−Glu−Asn)を含む試料を用いて抗体感度を決定し
た。(Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn)ペプチドによって生
じた変位曲線(displacement curve)を、推定上の交差反応
性ペプチドによって生じた変位曲線と比
較することにより、特異性を決定した。試料の存在下で得たプローブの対照抗体
結合を、既知の濃度の標準ペプチド、Tyr−Val−Asp−Ile−Pro
−Gly−Asn及びTyr−Thr−Gly−Glu−Asp−Phe−Va
l−Asp−Ile−Pro−Glu−ASnを用いて生じた標準曲線と比較す
ることにより、未知の試料中のペプチド濃度を決定した。
抗体結合の決定
ペプチド抗原に対する最も活性なウサギ抗血清の抗体力価を、ラジオイムノア
ッセイを用いて決定した。抗血清は、100μl当たり1:500〜1:64,
000の範囲の希釈度で、アッセイ緩衝液中で希釈した(第2図参照)。希釈し
た抗血清を125I−Tyr−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn
放射性標識プローブと接触させた。該放射性プローブはアッセイ緩衝液中で希釈
して、アリコート100μl当たり約30,000cpmとした。アッセイ液量
は、100μlのアッセイ緩衝液の添加によって300μlにした。総ての測定
は重複して行った。
4℃で一晩インキュベートした後、抗体非結合プローブをデキストランコーテ
ィング木炭に吸着させるか、又は抗
体結合プローブを正常ウサギ血清とヤギ抗ウサギIgGとの複合体に吸着させる
ことにより、抗体結合放射性プローブと抗体非結合放射性プローブとを分離した
。木炭溶液の場合は、平均分子量70,000のT−70デキストラン(Pha
rmacia)を0.25%w/v含むpH7.5の10mMリン酸塩緩衝液に
、局方活性炭を濃度3%w/vで懸濁して、デキストランコーティング木炭を製
造した。前記混合物は一晩静置し、遠心分離で沈降させ、前述のようなデキスト
ラン含有リン酸塩緩衝液中で一回洗浄し、次いでデキストラン含有アッセイ緩衝
液中に濃度3%まで再懸濁した。アッセイで使用する直前に、デキストランコー
ティング木炭をダルベッコのPBS中で10倍に希釈し、1mlを各アッセイ管
に加えた。氷/水スラリー中で10分間インキュベートした後、木炭を3,00
0×gで10分間の遠心分離で沈降させ、上清液をデカンテーションにより除去
し、ガンマ計数器で計測した。このアッセイは、総計数を決定するための木炭無
含有対照(1mlのPBSを添加)と、非特異的結合を決定するための抗体無含
有対照とを含んでいた。ヤギ抗ウサギIgG/正常ウサギIgG(GARGG/
NRS)法(二抗体)の場合は、200
μlのGARGG/NRS複合体を各管に加えた。GARGG/NRS複合体は
、2mlのヤギ抗ウサギ血清を1.0mlの正常ウサギ血清と混合し、沈殿させ
(4℃で2時間〜一晩)、次いで3〜4回洗浄して血清成分を除去することによ
り調製した。ペレットはRIA緩衝液で50mlまで再懸濁し、激しく撹拌した
。この懸濁液を各アッセイ管に200μl加えた後、管を室温で90分間静置し
た。該アッセイ混合物を3000×gで15分間遠心分離し、上清を吸引した。
ペレット中の放射能の量をガンマ計数器で測定した。総計数、非特異的結合計数
(抗体を含まない管)及び100%結合計数(抗体のみの管)を決定した。各抗
血清希釈度での特異的結合率を、抗体無含有又は非特異的結合値を各抗体結合値
から差し引き、システムの総計数で割ることによって算出した。
抗体感度の決定
種々の濃度の非標識プローブが放射性標識プローブへの結合を阻止する能力を
評価することにより、抗体感度を決定した。抗血清をアッセイ緩衝液中で濃度1
:3000に希釈し、100μlを各アッセイ試料中で使用した。非標識プロー
ブ、Tyr−Val−Asn−Ile−Pro−
Glu−Asnをアッセイ緩衝液中で希釈して、最終濃度を10-16〜10-13モ
ル/100μlとした。該非標識プローブ及び抗体を一晩4℃で反応させた。翌
日、放射性プローブ、125I−チロシル−Val−Asp−Ile−Pro−G
lu−Asn(30,000cpm/100μl)を加え、一晩4℃で反応させ
た。該アッセイは、対照と対比しての結合レベルを決定するために、非特異的結
合を決定するための無抗体対照と、抗体+プローブ含有対照とを含んでいた。測
定は総て重複して行った。アッセイ試料及び対照は、木炭又は二抗体法によって
実施した。比対照結合率は、各プローブ濃度毎に重複試料の平均cpmを計算し
、非特異的結合の平均cpmを差し引き、得られた数値を抗体のみの計数値で割
ることによって算出した。結果は第8図に示す通りである。
抗体特異性の決定
種々の長さの非標識ペプチド特異性プローブ(表1参照)が125I−Tyr−
Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn放射性プローブの結合を阻止
する能力を評価することによって、抗体特異性を決定した。実施例1で述べたア
グレカンのストロメリシン開裂部位をベースとする
Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn免疫原に対して調製されたウ
サギ抗血清を、アッセイ緩衝液中で希釈率1:3000で希釈した。表1の特異
性ペプチドを、アッセイ緩衝液中で、約10-6〜10-13モルのペプチド/管の
範囲の濃度で希釈した。100μlの各希釈物を100μlの抗血清に加え、一
晩4℃で反応させた。翌日、100μlの放射性プローブ、125I−Tyr−V
al−Asp−Ile−Pro−Glu−Asn(配列番号:10)(100μ
l中30,000cpm)を4℃で一晩反応させた。該アッセイは、対照のプロ
ーブ結合レベルを決定するため、非特異的結合を決定するための無抗体対照と、
抗体+プローブ含有対照とを含んでいた。測定は総て重複して行った。2回目の
4℃で一晩のインキュベーション後に、二抗体法を用いて前述のように非抗体結
合放射性プローブを分離した。該アッセイは、総計数を決定するために、1ml
のPBSを加えた木炭無含有又はGARGG/NRS無含有対照を含んでいた。
無抗体対照及びゼロペプチド抗体対照を計数して、0%結合及び100%結合
の値をそれぞれ算出する。ガンマ計数器と当業者に公知の標準的方法とを用いて
、放射能を測
定した。次いで検査ペプチドを含む試料を計数し、無抗体対照に付いた放射能の
量を各々から差し引く。得られた正味の計数値を抗体のみの対照の正味計数値で
割って、各量のペプチドの存在下での結合率を算出する。第4図〜第9図は、ス
トロメリシン開裂部位、Asn341−Phe342に関連した種々の合成ペプチドの
交差反応性を示している。結果は第4図〜第9図に示す通りである。未知の試料中のVDIPENエピトープ含有ペプチド濃度を測定するためのイム ノアッセイ手順
総ての希釈をアッセイ緩衝液中で行いながら、総量300μlでラジオイムノ
アッセイを実施した。標準溶液は1×10-9〜10-16モル/管の範囲の濃度で
調製した。該アッセイは、非特異的結合を測定するための無抗体対照と、対照と
対比してのペプチド結合レベルを測定するための、標準試料又は未知試料を添加
していない抗体+プローブ含有対照とを含んでいた。100μlの緩衝液、標準
試料又は未知試料に、アッセイ緩衝液中で1:9,000に希釈した実施例2及
び7の特異的抗血清を100μl加えた。該反応混合物を4℃で一晩インキュベ
ートした。翌日、プ
ローブペプチド125I−チロシル−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−
Asn(30,000cpm/100μl)を加え、4℃で一晩インキュベート
した。ガンマ計数器と当業者に公知の標準的方法とを用いて放射能を測定した。
無抗体対照及びゼロペプチド抗体対照を計数して、0%結合及び100%結合
の値をそれぞれ決定した。次いでアッセイ標準試料を計数し、抗体対照で割って
結合率を算出し、標準曲線を作成した。結合率を標準試料中のペプチド量の対数
の関数としてプロットすると、80%結合の境界と20%結合の境界との間で直
線に近いS字形曲線が形成される。未知試料を計数し、その対照との比率を計算
し、標準曲線と比較して、試料中に存在するペプチドの量を決定する。対照と対
比しての結合率80%〜20%の未知試料のみが有効とみなされる。
実施例 4
アッセイの手順
RIAを使用して、ヒトアグレカン(第10及び第11図)及びウサギアグレ
カン(第12図)のストロメリシン開裂を定量した。ヒト及びウサギアグレカン
は関節軟骨か
ら抽出し[Hascall及びKimura,(1982),Methods
Enzymol.82,pp.769−800]、ヒアルウロン酸で凝集させた
。ヒトアグレカン凝集物(3.7mg、1.85nmoles)を、総量1ml
で、ヒトSLN(10μg、0.182nmoles)で消化した。ウサギアグ
レカン凝集物(5mg、2.5nmoles)を、総量970μlで、ウサギS
LN(13.5μg、0.26nmoles)で消化した。各時点で、試料の1
00μlアリコートを採取し、EDTAで10mMにして酵素活性を阻害した。
これらのアリコートをRIAでVDIPENエピトープについて評価した(第1
0図)。酵素を加えなかった場合には、試料中に検出可能なエピトープは存在し
なかった。酵素を加えた場合には、エピトープが時間に応じて増加した。別の二
つの緊密な関係にあるメタロプロテイナーゼ、即ちコラゲナーゼ(第11図)又
はゼラチナーゼ(第10図及び第12図)をアグレカンに加えた場合には、シグ
ナルは10%未満しか発生しなかった(第4図)。エピトープの生成は、ストロ
メリシン開裂したヒト(第10図B)及びウサギ(第12図B)アグレカンフラ
グメントに対する抗血清を用いて、
ウェスタンブロットによってもモニターした。抗血清に抗原ペプチドTyr−V
al−Asp−Ile−Pro−Glu−Asnを予備吸着させた時は、ウェス
タンブロットシグナルが消えた。アグレカンのSLN開裂部位にわたって延びる
配列をベースとするペプチド、Val−Asp−Ile−Pro−Glu−As
n−Ph−Ph e−Gly−Val−Gly−NH2を抗血清に予備吸着させ
た時は、ウェスタンブロットシグナルに殆ど影響がなかった。C末端Asnをア
ミド化した抗原性ペプチドTyr−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−
Asn−NH2を抗血清に予備吸着させた場合には、シグナルが明らかに減少し
たが、完全には消滅しなかった。これらの結果をまとめると、前記抗血清は最適
認識のためにC末端Asn(非アミド化)を必要とし、ウェスタンブロットシグ
ナルはTyr−Val−Asp−Ile−Pro−Glu−Asnに対して特異
的であると結論される。
実施例 5
阻害物質スクリーニングアッセイ
ストロメリシンを関節内注射する15分前に、3匹のウサギに、ストロメリシ
ン阻害化合物1、(N−[1(R)
−カルボキシエチル−α−(S)−(2−フェニルエチル)−グリシン(L)−
ロイシンN−フェニルアミド)を30mpk i.v.で投与した。別の3匹の
対照動物にはベヒクルのみを投与した。総ての動物の片方の後脚関節に100μ
gのストロメリシンを関節内注射し、もう一方の後脚関節に酵素緩衝液を注射し
た。1時間後、動物を殺して前記関節を1mlのリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した
。骨から軟骨を切除し、凍結セクションを調製し、免疫染色した(第15図)。
滑液中のエピトープ濃度をRIAにより滑膜洗浄液中で測定した(第14図)。
軟骨を抗血清で染色してフラグメントの位置決定を行った(第15図A及び第1
5図B)。ストロメリシンの注射後、エピトープは軟骨の上方三分の一に検出さ
れた。抗血清をVal−Asp−Ile−Pro−Glu−Asnと共に予備イ
ンキュベートすると、この染色は阻止された。これは、該染色が該エピトープに
特異的であることを意味する。約80pmole当量のエピトープが滑膜洗浄液
中に検出された。阻害物質で処理すると、軟骨及び滑膜洗浄液中のエピトープが
90%以上減少した。
実施例 6 ヒトOA軟骨由来の抗VDIPEN抗血清によって認識されるアグレカンフラグ メントの単離
関節全交換手術を受けた5人の患者に由来する膝軟骨をプロテアーゼ阻害物質
中4M塩酸グアニジンで処理し[Kimura及びHascall,前出文献]
、アグレカン及びアグレカンフラグメントを抽出した。ヒアルウロン酸に結合し
たアグレカンフラグメントを、会合(association)と解離(dis
sociative)CsCl密度勾配分別とを組合わせて使用して分別した[
Kimura及びHascall,前出文献]。会合条件(A1)下で最も大き
い密度を有する画分(勾配の下から四分の一)を分離し、塩酸グアニジンで4M
にした。第二の勾配をこのA1画分について実施し、勾配の上方四分の一(A1
D4)を分離し、水に対して透析し、凍結乾燥した。このA1D4は、ヒアルウ
ロン酸に結合することができるタンパク質及びアグレカンフラグメントを含んで
いる。凍結乾燥A1D4画分を水に再懸濁し、SDS−PAGEで電気泳動にか
け、ニトロセルロースに移動させ、抗VDIPEN抗血清でプローブした(第1
3図)。各抽出物は、抗VDIPEN抗血清によって認識される分子量50.0
00のフラグメントを含んでいた。これらのフラグメントは、in vitro
でアグレカンのSLN開裂により生じたフラグメントと類似の大きさを有する(
第15図)。このデータは、ストロメリシン開裂物と一致するVal−Asp−
Ile−Pro−Glu−AsnのC末端を有するフラグメントが、ヒトOA軟
骨から単離できることを示唆するものである。
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:5
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:2
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:3
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:4
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:5
配列の長さ:6
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:6
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:7
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:8
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:9
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:10
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
卜ポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:11
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:12
配列の長さ:16
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
卜ポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:13
配列の長さ:11
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:14
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:15
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:16
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:17
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:18
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:19
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:20
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:21
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:22
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:23
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:24
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
【手続補正書】特許法第184条の8
【提出日】1994年8月18日
【補正内容】
第11図は、SLN開裂ヒトアグレカンに対するアッセイの特異性をCLN開
裂ヒトアグレカンと比較して示すRIAデータの説明図である。
第12図Aは、SLN開裂ウサギアグレカンフラグメントの検出と該フラグメ
ントに対するアッセイの特異性とを92kDaゼラチナーゼ開裂ウサギアグレカ
ンフラグメントと比較して示すRIAデータの説明図である。
第12図Bは、SDS−PAGEによるSLN開裂ウサギアグレカンフラグメ
ントの検出を示すウェスタンブロットの説明図である。
第13図は、抗VDIPEN抗血清によって認識されるアグレカンフラグメン
トをヒトOA軟骨から単離できることを示すウェスタンブロットの説明図である
。
第15図は、SLN阻害化合物1又はベヒクルのみ(阻害物質を含まない)を
予め投与したウサギの、関節内SLN注射後の滑液(synovial flu
id)中のアグレカンフラグメントのSLN誘発開裂レベルを定量するRIAデ
ータを示す説明図である。
第14図Aは、SLNを関節内注射したウサギの軟骨(検査軟骨)中の蛍光を
、注射していない関節(対照)の
軟骨と比較して示す免疫蛍光データの説明図である。
第14図Bは、ストロメリシンを注射した関節の軟骨(化合物1で処理してい
ない検査軟骨)中の蛍光を、ストロメリシン注射の前に化合物1で処理した動物
の軟骨(化合物1で処理した検査軟骨)と比較して示す免疫蛍光データの説明図
である。発明の概要
ストロメリシン開裂アグレカンフラグメントのようなストロメリシン開裂産生
物を、在来のRIA又は在来のイムノローカリゼーション(immunoloc
alization)法により、ウサギポリクローナル抗血清を用いて測定する
。該抗血清は、ストロメリシン開裂アグレカンを、(a)in vitroで精
製ウサギ、ウシ及びヒトアグレカンのSLN消化物中で検出し、(b)in v
ivoでSLNを関節内注射したモデル系(即ちウサギ膝関節)の開裂アグレカ
ンにおいて検出する。この抗血清をストロメリシン活性の測定手段として使用し
、(a)種々のサイトカイン(即ちIL−1及びTNFα)により内因性ストロ
メリシン合成が剌激されるモデル、並びに(b)RA及びOAのような種々のヒ
ト疾患、におけるストロメリシン
開裂アグレカンを定量する。
に焦点をおく。細胞外マトリクスアグレカン分子中の所定の開裂部位をもたらす
ための試薬が開発されたのはこれが最初である。今までのところ、アグレカンの
定量には一般的な免疫学的アッセイ[Heinegardら,前出文献;Cat
ersonら,前出文献]及び染料ベースアッセイ[Farndaleら,前出
文献]が使用されている。これらのアッセイでは、崩壊した分子と完全な(無傷
の)分子とを識別していない。本明細書に記載の抗血清は、崩壊した無傷ではな
いアグレカンを認識するだけでなく、メタロプロテイナーゼストロメリシンによ
って特異的に開裂されたアグレカンも認識する。この種の抗血清を使用すれば、
ストロメリシン開裂アグレカン分子を特異的に定量し且つ位置決定することがで
きる。SLNはアグレカンを、該分子の球体間領域(interglobula
r domain)内のAsn340−Phe341結合の間で開裂することが判明し
た。開裂部位にわたって延びる合成ペプチド(Asp−Ile−Pro−Glu
−Asn−Phe−Phe−Gly−Val−Gly[配列番号:1])も所期
の部位でSLNにより開裂される。この部位でのヒトアグレカンの開裂は、関節
軟骨から滑液中へのカルボキシ末端
フラグメント(Phe342−His2316)の放出を可能にする。アミノ末端フラ
グメント(Val1−Asn341)は軟骨のヒアルウロン酸と結合して止まるか、
又はやはり滑液中に放出され得る。
本明細書中のアミノ酸の3文字及び1文字の名称は総て、当業界で標準となっ
ている下記のリストに示す名称と合致する:
アラニン Ala A ロイシン Leu L
アルギニン Arg R リシン Lys K
アスパラギン Asp N メチオニン Met M
アスパラギン酸 Asn D フェニルアラニン Phe F
システイン Cys C プロリン Pro P
グルタミン酸 Glu E セリン Ser S
グルタミン Gln Q トレオニン Thr T
グリシン Gly G トリプトファン Trp W
ヒスチジン His H チロシン Tyr Y
イソロイシン Ile I バリン Val V
ストロメリシン開裂産物に関する本発明のアッセイは、種々の疾患におけるS
LN活性の増加を示し、種々の動物モデル及びヒトにおける特異的且つ選択的S
LN阻害物質
の効果をモニターするための診断ツールとして使用される。ウサギIL−1モデ
ルでは、SLN阻害化合物の効果が、関節軟骨及び滑液のSLN崩壊アグレカン
フラグメントを定量することにより評価される。従って、アミノ末端及びカルボ
キシ末端のSLN生成アグレカンフラグメント(SLN−generated
aggrecan fragment)を両方ともモニターするアッセイは、S
LN阻害物質の特性を決定するのに有用である。ヒトの場合は、関節軟骨を患者
から得ることが難しいため、軟骨のアグレカンフラグメントを生化学的効果の情
報としてアッセイすることは困難である。ヒトにおけるSLN阻害化合物の効果
をモニターするためには、滑液、血液、尿又は他の体液中に放出されるカルボキ
シ末端又はアミノ末端アグレカンフラグメントをモニターする。本明細書では、
これらのアッセイを開発するために本発明で使用する手法を説明する。
単一特異性抗体の産生
ニュージーランド・ホワイト・ラビット及びHartley近交系モルモット
を免疫原で免疫感作した。最初の免疫感作では、各ウサギにフロイントの完全ア
ジュバント(FCA)1ml当たり333μgの免疫結合体を筋内注射した。7
日目、FCA中333μgの免疫原を再度動物
に投与し、35日目に、合計333μgの免疫原を6〜10の部位で皮下注射し
た。45日目に動物の採血を行い、次いで333μgの免疫原で追加免疫した。
55日目、再度動物の追加免疫を行い、10日後に採血した。この追加免疫及び
採血スケジュールを3〜5回続けて、適当な供給量の抗血清を得た。モルモット
も前述のように免疫感作した(67μg)。抗血清は全部
無抗体対照及びゼロペプチド抗体対照を計数して、0%結合及び100%結合
の値をそれぞれ決定した。次いでアッセイ標準試料を計数し、抗体対照で割って
結合率を算出し、標準曲線を作成した。結合率を標準試料中のペプチド量の対数
の関数としてプロットすると、80%結合の境界と20%結合の境界との間で直
線に近いS字形曲線が形成される。未知試料を計数し、その対照との比率を計算
し、標準曲線と比較して、試料中に存在するペプチドの量を決定する。対照と対
比しての結合率80%〜20%の未知試料のみが有効とみなされる。
実施例 4 アッセイの手順
RIAを使用して、ヒトアグレカン(第10及び第11図)及びウサギアグレ
カン(第12図)のストロメリシン開裂を定量した。ヒト及びウサギアグレカン
は関節軟骨から抽出し[Hascall及びKimura,(1982),Me
thods Enzymol.82,pp.769−800]、ヒアルウロン酸
で凝集させた。ヒトアグレカン凝集物(3.7mg、1.85nmoles)を
、総量1mlで、ヒトSLN(10μg、0.182nmole
s)で消化した。ウサギアグレカン凝集物(5mg、2.5nmoles)を、
総量970μlで、ウサギSLN(13.5μg、0.26nmoles)で消
化した。
実施例 5 阻害物質スクリーニングアッセイ
ストロメリシンを関節内注射する15分前に、3匹のウサギに、ストロメリシ
ン阻害化合物1、(N−[1(R)−カルボキシエチル−α−(S)−(2−フ
ェニルエチル)−グリシン(L)−ロイシンN−フェニルアミド)を30mpk
i.v.で投与した。別の3匹の対照動物にはベヒクルのみを投与した。総て
の動物の片方の後脚関節に100μgのストロメリシンを関節内注射し、もう一
方の後脚関節に酵素緩衝液を注射した。1時間後、動物を殺して前記関節を1m
lのリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。骨から軟骨を切除し、凍結セクションを調
製し、免疫染色した(第14図)。滑液中のエピトープ濃度をRIAにより滑膜
洗浄液中で測定した(第15図)。軟骨を抗血清で染色してフラグメントの位置
決定を行った(第14図A及び第14図B)。ストロメリシンの注射後、エピト
ープは軟骨の上方三分の一に検出された。抗血清をVal−Asp−Ile−P
ro−Glu−Asnと共に予備インキュベートすると、この染色は阻止された
。これは、該染色が該エピトープに特異的であることを意味する。約80pmo
l
e当量のエピトープが滑膜洗浄液中に検出された。阻害物質で処理すると、軟骨
及び滑膜洗浄液中のエピトープが90%以上減少した。
実施例 6 ヒトOA軟骨由来の抗VDIPEN抗血清によって認識されるアグレカンフラグ メントの単離
関節全交換手術を受けた5人の患者に由来する膝軟骨をプロテアーゼ阻害物質
中4M塩酸グアニジンで処理し[Kimura及びHascall,前出文献]
、アグレカン及びアグレカンフラグメントを抽出した。ヒアルウロン酸に結合し
たアグレカンフラグメントを、会合(association)と解離(dis
sociative)CsC1密度勾配分別とを組合わせて使用して分別した[
Kimura及びHascall,前出文献]。会合条件(A1)下で最も大き
い密度を有する画分(勾配の下から四分の一)を分離し、塩酸グアニジンで4M
にした。第二の勾配をこのA1画分について実施し、勾配の上方四分の一(A1
D4)を分離し、水に対して透析し、凍結乾燥した。このA1D4は、ヒアルウ
ロン酸に結合することができるタンパク質及びアグレカンフラグメントを含んで
いる。凍
結乾燥A1D4画分を水に再懸濁し、SDS−PAGEで電気泳動にかけ、ニト
ロセルロースに移動させ、抗VDIPEN抗血清でプローブした(第13図)。
各抽出物は、抗VDIPEN抗血清によって認識される分子量50,000のフ
ラグメントを含んでいた。これらのフラグメントは、in vitroでアグレ
カンのSLN開裂により生じたフラグメントと類似の大きさを有する(第12図
)。このデータは、ストロメリシン開裂物と一致するVal−Asp−Ile−
Pro−Glu−AsnのC末端を有するフラグメントが、ヒトOA軟骨から単
離できることを示唆するものである。
請求の範囲
1. ストロメリシン阻害物質の効果を評価する方法であって、
a)アグレカンを含むストロメリシン基質をストロメリシン阻害物質と結合し、
b)ステップa)で結合したストロメリシン基質とストロメリシン阻害物質とを
、前記基質からストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントを生成する
のに十分な時間にわたって反応混合物中でストロメリシンと反応させ、ストロメ
リシンがアグレカンを、Asp Ile ProGlu Asn Phe Ph
e Gly Val Gly(配列番号:4)からなるアグレカンアミノ酸配列
のAsn残基とPhe残基との間で開裂して前記フラグメントを生成し、
c)前記反応混合物の試料と、前記ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラ
グメントの末端でエピトープに特異的に結合するが非開裂アグレカンには結合し
ない単一特異性抗体とを、該抗体が前記試料中に存在する前記フラグメントに結
合するのに十分な時間にわたって接触させ、
d)ステップc)で抗体が結合した前記試料中のストロメリシン開裂アグレカン
ペプチドフラグメントの量を、ステップb)で生成された前記フラグメントの量
の尺度として測定し、
e)ステップd)で測定した前記フラグメントの量を、ストロメリシン阻害物質
をストロメリシン基質と混合しなかった対照アッセイで測定したフラグメントの
量と比較して、前記阻害物質の効果を決定する
ことからなる前記方法。
2. アグレカンを含むストロメリシン基質が骨関節の軟骨である請求項1に記
載の方法。
3. ステップb)のストロメリシンとの反応を、ストロメリシンの関節内注射
によって生起させる請求項2に記載の方法。
4. 反応混合物の試料が、該反応混合物からの液体の試料、又は該反応混合物
と接触した液体の試料である請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。
5. 接触ステップb)の後でストロメリシン基質を洗浄して、ストロメリシン
及び阻害物質を基質との接触から解除する操作をも含み、反応混合物の試料が洗
浄基質の試料
である請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
6. 単一特異性抗体がカルボキシル末端アミノ酸配列Asp Ile Pro
Glu Asn(配列番号:1)からなるアミノ末端側ストロメリシン開裂ア
グレカンペプチドフラグメントのカルボキシル末端エピトープに特異的に結合し
、非開裂アグレカンには結合しない請求項1に記載の方法。
7. 試料中のストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの存在及び
量を検出するためのアッセイであって、
a)Asp Iie Pro Glu Asn PhePhe Gly Val
Gly(配列番号:4)からなるアグレカンアミノ酸配列のAsn残基とPh
e残基との間の部位でのストロメリシンによるアグレカンの開裂によって生成さ
れたストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントを含むと思われる試料
と、前記ストロメリシン開裂アグレカンペプチドフラグメントの末端でエピトー
プに特異的に結合するが非開裂アグレカンには結合しない単一特異性抗体との混
合物を、前記抗体が前記試料中に存在する前記フラグメントに結合するのに十分
な時間にわたって
形成し、
b)前記混合物に、前記抗体に結合する標識ストロメリシン開裂アグレカンペプ
チドフラグメントからなる標識プローブを加え、そして
c)前記抗体が結合した標識プローブの量を測定して、試料中のストロメリシン
開裂アグレカンペプチドフラグメントの存在及び量を決定する
ことからなる前記アッセイ。
8. 単一特異性抗体が、カルボキシル末端アミノ酸配列Asp Ile Pr
o Glu Asn(配列番号:1)からなるアミノ末端側ストロメリシン開裂
アグレカンペプチドフラグメントのカルボキシル末端エピトープに特異的に結合
し、非開裂アグレカンには結合しない請求項7に記載の方法。
9. 単一特異性抗体が、アミノ末端アミノ酸配列Phe Phe Gly V
al Gly Gly(配列番号:5)からなるカルボキシ末端側ストロメリシ
ン開裂アグレカンペプチドフラグメントのアミノ末端エピトープに特異的に結合
し、非開裂アグレカンには結合しない請求項7に記載の方法。
10. 請求項1から9のいずれか一項に記載のアッセイを実施するためのパッ
ケージ又はキット。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AU,BB,BG,BR,BY,CA,
CZ,FI,HU,JP,KR,KZ,LK,LV,M
G,MN,MW,NO,NZ,PL,RO,RU,SD
,SK,UA,US
(72)発明者 ラーク,ミツシエル・ダブリユ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤーシイ・
08520、イースト・ウインザー、ミード
ウ・レーン・14
(72)発明者 ベイン,エレン・ビー・ケイ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤーシイ・
07090、ウエストフイールド、トウドア・
オーバル・131
(72)発明者 ホールナー,ロリー・エイ
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤーシイ・
07076、スコツチ・プレインズ、アバーデ
イーン・ロード・8
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. タンパク質のストロメリシン開裂フラグメントに特異的に結合する単一特 異性抗体であって、非開裂タンパク質には結合しない前記単一特異性抗体。 2. ストロメリシン開裂タンパク質がアグレカンである請求項1に記載の抗体 。 3. アミノ末端側ストロメリシン生成アグレカンペプチドフラグメントのカル ボキシル末端に結合する請求項2に記載の抗体。 4. アグレカンペプチドフラグメントがカルボキシル末端アミノ酸配列Asp Ile Pro Glu Asnを有する請求項3に記載の抗体。 5. ストロメリシン開裂アグレカンの主たる開裂ペプチドのカルボキシル末端 に位置するペプチドに対して発生した単一特異性抗体であって、前記ペプチドが Asp Ile Pro Glu Asnであり、前記抗体が非開裂アグレカン には結合しない前記単一特異性抗体。 6. (a)ストロメリシン基質をストロメリシン阻害物質と混合するステップ と、 (b)ストロメリシンを加えるステップと、 (c)ストロメリシン生成ペプチドフラグメントの量を請求項1に記載の 抗体を用いてイムノアッセイで測定するステップとを含む、ストロメリシン阻害 物質スクリーニングアッセイシステム。 7. (a)ストロメリシン基質をストロメリシン阻害物質と混合するステップ と、 (b)ストロメリシンを加えるステップと、 (c)ストロメリシン活性を請求項1に記載の抗体を用いて免疫組織化学 的に位置決定するステップとを含む、ストロメリシン阻害物質スクリーニングア ッセイシステム。 8. イムノアッセイが、アグレカンのストロメリシン開裂フラグメントに特異 的に結合する単一特異性抗体を含み、前記抗体が非開裂アグレカンには結合しな い、請求項6に記載のアッセイ。 9. 免疫組織化学的位置決定を、アグレカンのストロメリシン開裂フラグメン トに特異的に結合する単一特異性抗体を用いて実施し、前記抗体が非開裂アグレ カンには結合しない、請求項7に記載のアッセイ。 10. ストロメリシン生成アグレカン開裂産物を検出するためのアッセイであ って、 (a)ストロメリシン生成アグレカン開裂産物を含む試料を標識プローブと混合 するステップと、 (b)請求項1に記載の抗体をストロメリシン生成アグレカン開裂産物と共にイ ンキュベートするステップと、 (c)前記標識プローブに結合している抗体の量を測定するステップとを含むア ッセイ。 11. ストロメリシン開裂産物の検出又は測定に使用できる、請求項1に記載 の単一特異性抗体を含むパッケージ又はキット。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/954,213 US5387504A (en) | 1992-09-30 | 1992-09-30 | Monospecific antibodies and assay system for detecting stromelysin cleavage products |
US954,213 | 1992-09-30 | ||
PCT/US1993/008940 WO1994007511A1 (en) | 1992-09-30 | 1993-09-21 | Antibodies detecting stromelysin cleavage products |
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