JPH08502029A

JPH08502029A - オリゴペプチドコラーゲン誘導体類及び続発性白内障予防へのそれらの使用

Info

Publication number: JPH08502029A
Application number: JP6503018A
Authority: JP
Inventors: ドゥベン，ジャン−ベルナールレニュ; シャンボン，オディール; ボンヌ，クロード
Original assignee: ラボラトワールショーバン
Priority date: 1992-07-01
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 1996-03-05
Also published as: FR2693107A1; CA2139429A1; EP0651763A1; WO1994001456A1; FR2693107B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つの続発性白内障予防薬への使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴペプチドコラーゲン誘導体類及び続発性白内障予防へのそれらの使用本発明は、続発性白内障予防のための新規手段を提供する。続発性白内障は、白内障化されたレンズの抜粋後、多くの患者に生じる不透明化である。続発性白内障を予防するためには、レンズの抜粋の間又はその後、目の前眠房又は後眠房中に、抗体、たとえば抗コラーゲン及び上皮細胞の増殖を阻害できる細胞毒素の接合体をしみ込ませることがEP-A-0299467にすでに提案されている。細胞毒素によりたぶん接合される特異的モノクローナル抗体の投与により続発性白内障を予防することがWO-A-89/12093にまた提案されている。本発明は、続発性白内障予防のための新規手段を提供する。従って、本発明は、下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基、Ｎ−保護基、特に基−COR₃又は−CO−OR₃（ここで、Ｒ₃はＣ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、アリール、特にフェニル基、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、ヒドロキシル基、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ基、モノ−又はポリヒドロキシル化Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、モノ−又はポリ（Ｃ₁−Ｃ₆ アルコキシ）（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）基、アミノ基、モノ−又はジ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）アミノ基、アセトアミド基及びスルホンアミド基から成る群から選択された１又は複数の置換基を担持するアリール基、又は（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基、特に（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）フェニル基である）を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基、特に（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）フェニル基を表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを投与することから成る、続発性白内障予防のための方法に関する。本発明は、上記に定義されるような式Ｉの化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを、目薬用溶媒に溶解された目薬組成物にも関する。本発明はまた、上記に定義されたような式Ｉの化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを導入された又は付着された移植物及びわなにも関する。本発明はまた、本発明の実施のための化合物にも関する。それらの化合物は、式Ｉ〔式中、Ｘ₁は上記に定義されたようなＮ−保護わされる基を表わす〕で表わされる化合物及び医薬的に許容できる酸とのそれらの付加塩である。 “医薬的に許容できる酸との付加塩”とは、いづれの所望しない効果をも伴わないで、遊離塩基の生物学的性質を付与する塩を言及するものとして理解される。それらの塩は特に、無機酸、たとえば塩酸、臭酸、硫酸、硝酸及びリン酸により形成される塩；酸性金属塩、たとえばオルトリン酸二ナトリウム及び硫酸−カリウム；及び有機酸、たとえば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、蓚酸、フマル酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸及びパモール酸(pamoic acid)により形成された塩である。式Ｉの化合物は、Ｃ−末端からＮ−末端に導入されるべき種々のアミノ酸残基、並びにＮ−末端及び反応性側鎖の連続的カップリングにより、液相又は固相でのペプチド合成による従来の手段で調製され得、ここで前記鎖の残基は下記基により前もってブロックされている： −BOC,Fmoc及びアシル基によりブロックされたＮ−末端； −エステル及びアミド基によりブロックされたＣ−末端； −アスパルチルの側端：エステル基、たとえばベンジルエステルによりブロックされた； −アルギニルの側端：Ｈ⁺（プロトン化）又はトシル基によりブロックされている。下記の種々のカップリング法を用いることもまた可能である：１）触媒（HOBT）又は他のカップリング剤（EEDQ）を伴って又は伴わないでカルボジイミド（たとえばDCC，EDC）による残基のカップリング；２）使用されるアミノ酸の対称無水物の使用；３）使用されるアミノ酸の活性化されたエステル（たとえばHOBT、エステル、ｐ−ニトロフェニルエステル）の使用。式Ｉの化合物の液相合成は、６段階、又は最終アミノ酸、すなわちＮα−置換のアルギニンが市販されていない場合、８段階で実施され得る。使用される溶媒は最とも多くはジメチルホルムアミド（DMF）、テトラヒドロフラン（THF）及び１，４−ジオキサンであり；カップリング試薬はジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）であり；そして触媒はヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）である。合成スケム（スケムＩ）（ここで、ＧＰ₁，ＧＰ₂，ＧＰ₃及びＧＰ₄はＮ−保護基を示す）の例が下記に与えられる。第１段階（段階Ａ）はまず、適切な溶媒においてカップリング剤及び触媒の存在下でＮα−及びＣβ−保護されたアスパラギン酸とアミンHNR₁R₂とを反応せしめることによってその酸のＣα−アミド類似体を調製することから成る。精製及びその純度の調整の後、生成物を、保護基GP１の特徴を有する脱保護剤により脱保護する（段階Ｂ）。精製した後すぐに、このアミノ酸誘導体は、適切な溶媒においてカップリング剤及び触媒の存在下で、そのアミノ基（保護基GP４）上で保護されるグリシン残基との反応によりジペプチドに転換される（段階Ｃ）。１当量のトリエチルアミン（又は立体的にヒンダードされた塩基）の添加は、アスパルチル誘導体がプロトン化された形で得られる場合に必要である。このようにして得られた保護ジペプチドが精製される。段階Ｄは、保護基GP４に対して特異的な脱保護段階である。精製の後、そのようにして得られたジペプチドは、適切な溶媒において、カップリング剤及び触媒の存在下でＮα−及びＮ_G（Ｈ⁺）−保護されたアルキニン残基と反応される（段階Ｅ）。１当量のトリエチルアミンの添加は、脱保護されたジペプチドがプロトン化された形で得られる場合に実施される。得られたトリペプチド生成物が精製され、そして次に、保護基GP２のための脱保護剤により処理され、アスパラギン酸残基のカルボキシレート機能が生ぜしめられ（段階Ｆ）、式Ｉの末端トリペプチドが付与される。次の例は、式Ｉの化合物の調製を例示する。それらの例において、使用される特徴化法は次の通りである：１）薄層クロマトグラフィー： −UV及びＩ₂検出によるMerck 5719シリカ支持体 −移動溶媒 −合成中間体のためのCH₂CL₂：CH₃OH(16／１〜16／４) −最終生成物のためのCH₃OH：AcOH(0.3〜0.5のRf)。２）¹H NMR： −Brucker 250 MHz。すべての中間体及び最終生成物の分光分析研究による１〜２％以内への純度の調節。３）質量分光分析法：個々の末端トリペプチドがグリセロール又はチオグリセロールマトリックスにおいてPositive Fast Atom Bombardment(FAB⁺)モードで研究される。例１〔Ｎα−アセチル−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ（Ｈ）−Ｃａ）〔Ｎα−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｃβ−ベンジルエステル〕−ベンジルアスパルタミドの調製〔Ｎα−（ｔ−Boc）−Ｃβ−（ベンジルエステル）〕アスパラギン酸（８ｇ；0.025モル）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（3.37ｇ；0.025モル）を、TH F 160mlに０〜５℃で溶解する。最少THF中、DCC(5.15ｇ；0.025モル）の溶液をこの混合物に添加し、そしてその溶液を撹拌する。DCU沈殿物の形成の開始で、ベンジルアミン（2.68ｇ；0.025モル）を添加する。次にその混合物を24時間、撹拌しながら、室温に暖める。DCUを最終的に濾過し、そしてTHFを蒸発する。残留物を過剰のエチルエーテルに取り、そして不溶性物質を濾過する。エーテルを蒸発し、そして残留物をクロマトグラフィー処理し（SiO₂；CH₂Cl₂：CH₂OH 90/1 0）、所望するアミドを得る（９ｇ；87％）。¹ H NMR：（CDCl₃）．1.42（一重項；9H；BOC）；2.93（分離されたAB；2H；CH₂a sp.）；4.39-4.70（分離されたｑ．＋分離されなかった多重項；3H：H asp＋ＣＨ₂ベンジルアミド）；5.13(s；2H；CH₂ベンジルエステル）；5.69（ｄ広い；1H ：NHカルバメート）；6.80（d広い；1H；NHベンジルアミド）；7.19-7.5（分離されなかった多重項；10H；H ar.）TLC：SiO₂；CH₂Cl₂：CH₃OH 90／10；Rf＝0.8 -0.9. ｂ）〔Ｃβ−ベンジルエステル−Ｃα−ベンジル〕−アスパルタミド塩酸塩の調製上記アスパラギン酸誘導体（９ｇ；0.0218モル）を酢酸エチル（200ml）に０〜５℃で溶解する。続いて、気体HClをその温度で前記溶液に通し、そしてそれを４時間撹拌する。次に、形成された沈殿物を濾過し、そして乾燥し、白色粉末の形で所望する塩酸塩を得る（７ｇ；0.02モル；92％）。¹ H NMR：（DMSO-d₆）．2.98（t；2H；CH₂ asp.）；4.12（t；1H；H asp.）；4.3 0（d；2H；CH₂ベンジルアミド）；5.14（s；2H；CH₂ ベンジルエステル）；7.10 −7.15（分離されなかった多重項；10H；Har.）；8.28（s．広い；3H；Hアンモニウム）；8.95（t；1H；Hアミド）． TLC：SiO₂；移動しない。ｃ）〔Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−グリシル〕−〔Ｃβ−ベンジルエステル−Ｃα−ベンジル〕−アスパルタミドの調製Ｎα−（ｔ−Boc）−グリシン（3.5ｇ；0.02モル）、HOBT(2.7ｇ；0.02モル）及びDCC（4.12ｇ；0.02モル）を、THF（40ml）に０〜５℃で溶解する。その混合物をその温度で２０分間撹拌し、続いてｂ）で得られた生成物及びトリエチルアミン（等モル；ｂ）で得られた生成物７ｇ（0.02モル）；２ｇのNEt₃（0.02モル））と最少量のTHF（＃10ml）との混合物を添加する。前記混合物を24時間撹拌し（TLCモニターする）、そして形成されたDCUを濾過する。THFを蒸発し、そして残留物をエチルエーテルに取る。再び形成する沈殿物（DCU）を濾過し、そして溶媒を蒸発する。この残留物をCH₂Cl₂に溶解し、再び濾過し、そしてクロマトグラフィー処理し（SiO₂；CH₂Cl₂：CH₃OH 9／1）、石油エーテルと共に粉砕することにより結晶化する油状形で所望する生成物（８ｇ；0.017モル；85％）を得る。¹ H NMR：(CDCl₃)．1.39(s.；9H；BOC)；2.94(分離された二対称AB；2H；CH₂ asp .）；3.72（t；2H；CH₂グリシル）；4.42（分離されたd.；2H；CH₂ベンジルアミド）；4.88（m;1H;H asp）；5.11（d;3H;CH₂ベンジルエステル＋NH BOC）；7.0- 7.50（分離されなかった多重項； 12 H；H ar＋2 NH）． TLC：SiO₂；CH₂Cl₂：CH₃OH 95／5；Rf＝0.5〜0.6. ｄ）（グリシル）−〔Ｃβ−ベンジルエステル−Ｃα−ベンジル〕−アスパルタミド塩酸塩の調製ジペプチド誘導体Ｉ（８ｇ；0.017モル）を酢酸エチル（300ml）０℃で溶解する。その溶液を、気体HClによりスパージ（sparge）することによりその温度で処理する。脱保護反応をTLCにより２時間にわたってモニターする。窒素を用いてガス抜きした後、酢酸エチルをその体積の半分に室温で真空下で蒸発する。形成された結晶を濾過により回収し、エチルエーテルにより洗浄し、そして真空下で乾燥する（6.7ｇ；0.0165モル；97％）。¹ H NMR：（DMSO-d₆）．2.80（分離されたAB；2H；CH₂ asp.）；3.61(q;2H；CH₂ グリシル）；4.27（d；2H；CH₂ベンジルアミド）；4.76（q;1H；H asp.）；5.10 （s；2H；CH₂ベンジルエステル）；7.0-7.50（分離されなかった多重項；10H；H ar）；8.20（s広い；3H；アンモニウム）；8.70（t；1H；NHベンジルアミド）；8.89（d；1H；NH アミド）． TLC：SiO₂；移動しない。ｅ）〔Ｎα−アセチル−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ−ベンジルエステル−Ｃα−ベンジル〕−アスパルタミドクロリドの調製細かく微粉砕されたＮα−アセチルアルギニン二水和物（1.86ｇ；0.00738モル）及びｄ）で得られた化合物（３ｇ；0.00738モル）をDMF（200ml）に室温で溶解する。２０分間の撹拌の後、DCC(1.52ｇ；0.00738モル）及びHOBT（0.998ｇ；0.00738モル）を添加する。その混合物を３日間撹拌する。不溶性物質を濾過し、そしてDMFを真空下で蒸発する。残留物を最少量のジクロロメタンに取り、そして不溶性物質を濾過する。溶媒を蒸発し、そして残留物を酢酸エチルと共に粉砕し、そして次に、エチルエーテルと共に粉砕する。このようにして得られた固形物を濾過し、そして乾燥し、所望する化合物（３ｇ；0. 005モル；67％）を得る。¹ H NMR：（DMSO-d₆）．1.30-1.80（分離されなかった多重項；4H；2CH₂ Arg.）；1.85（s；CH₃アセチル）；2.79（分離されたAB；2H；CH₂ asp.）；3.08（d.広い；2H；CH₂ Arg.）；3.75（分離されたq.；2H；CH₂グリシル）；4.10-4.40（d+ m ；3H；CH₂ベンジルアミド＋H arg.）；4.72（m; 1H；H asp.）；5.08（s，2H ；CH₂ベンジルエステル）；6.7-7.5（m；15H；H ar.＋グアニジニウム）；7.76 （広い t；1H；NH）；8.80-8.70（m；3H；3 NH）． TLC ：SiO₂；CH₂Cl₂：CH₃OH 80／20；Rf＝0.1 ｆ）〔Ｎα−アセチル−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ（Ｈ） −Ｃα−ベンジル〕−アスパルタミドクロリドの調製ｅ）で得られる保護されたトリペプチド（3ｇ；0.005モル）を、室温で一晩、５％Pd／木炭触媒（0.3ｇ）の存在下で水素によりメタノール（100ml）中で還元する。次に、その混合物をセライト（celite）上で濾過し、そしてメタノールを蒸発し、所望する化合物を白色粉末の形で得る（2.3 ｇ；0.0045モル；90％）。¹ H NMR：（DMSO-d₆）．1.30-1.80（分離されなかった多重項；4H；2CH₂ arg.）；1.86（s；3H；CH₃アセチル）；2.65（分離されたAB；2H；CH₂ Asp.）；3.09（ d+m；2H；CH₂ Arg.）；3.72（分離されたｑ；2H；CH₂グリシル）；4.10-4.50（d +m；3H；CH₂ベンジルアミド＋H arg.）；4.61（q；1H；H Asp.）；7.24（分離されなかった多重項；10 H；H ar．＋グアニジニウム）；7.80（分離されなかった多重項；1H；NH）；8.10-8.60（分離されなかった多重項；3H；3NH）；12.38（s 広い；1H；COOH）． FAB⁺：〔C₂₁H₃₂N₇O₆〕⁺に関して、Cl^-：〔Ｍ〕⁺＝478； TLC ：SiO₂；CH₃OH ；AcOH 99.75／0.25 Rf＝0.5-0.6．例２〔Ｎα−アセチル−Ｎ_G （Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ−（Ｈ） −Ｃα−イソプロピル〕アスパルタミドクロリド（Ｘ₁＝アセチル、Ｘ₂＝−NH− CH（CH₃）₂）の調製これを例１におけるようにして得る。その特徴は次の通りである：¹ H NMR 1.00-1.20（２二重項、2 CH₃イソプロピル）；1.45-1.80（分離されなかった多重項、2 CH₂ arg.）；1.90（s；CH₃アセチル）；2.60（分離されたAB，CH₂ Asp. ）；3.10（不完全に定義されたq，CH₂Arg.）；3.70（q，CH₂ Gly.）；3.85（m， Hイソプロピル）；4.20（不完全に定義されたq，CH Arg.）；4.50（不完全に定義されたq，CH Asp）；6.80-7.60（分離されなかった多重項＋d，4Hグアニジン＋N-H）；7.80（不完全に定義されたt，N-H）；8.05（d，N-H）；8.25：（d，N- H）；8.35：（t，N-H）． TLC ：SiO₂，MeOH-AcOH（20：0.05）；Rf＝0.45． FAB⁺：〔C₁₇H₃₂N₇O₆〕⁺について、Cl^-：〔Ｍ〕⁺＝4.30．例３〔Ｎα−アセチル−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ−（Ｈ）− Ｃα−シクロヘキシル〕アスパルタミドクロリドこれを例１におけるようにして得た。その特徴は次の通りである：¹ H NMR 1.00-1.80（分離されなかった多重項、5 CH₂シクロヘキシル＋2 CH₂Arg.）；1.8 8（s；CH₃アセチル）；2.50（分離されなかった多重項、DMSO＋CH₂ Asp.）；3.1 0（不完全に定義されたq，CH₂ Arg.）； 3.25-3.55（s＋分離されなかった多重項、H₂O＋Hシクロヘキシル）；3.70（d，C H₂ Gly.）；4.00-4.30（m，CH Arg.）；4.50（m，CH Asp.）；6.80-7.50（分離されなかった多重項＋d，N-H＋4Hグアニジン）；8.00-8.20（２二重項、2N-H）；8.40（t，N-H）． TLC ：SiO₂，MeOH：AcOH（20：0.05）；Rf＝0.5 FAB⁺：〔C₂₀H₃₆N₇O₆〕⁺について、CL^-〔Ｍ〕⁺＝470．例４〔Ｎα−アセチル−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ−（Ｈ）− これを例１におけるようにして得る。その特徴は次の通りである：¹ H NMR 0.99（t，CH₃エチル）；1.14（t，CH₃エチル）；1.35-1.80（分離されなかった多重項、2CH₂ Arg.）；1.89（s，CH₃アセチル）；2.22-2.80（分離された二対称 AB，2.50上に中心を有する、CH₂ Asp.）；2.95-3.50（分離されなかった多重項、H₂O＋2 CH₂エチル＋CH₂ Arg.）；3.69（d，CH₂ Gly）；4.25（分離されなかった多重項、CH Arg.）；4.9 5（q，CH Asp.）；6.70-7.60（分離されなかった多重項、広い、4Hグアニジン）；7.95（s広い、H⁺グアニジニウム）；8.10（d，N-H Asp．or Arg.）；8.22（t ，N-H Gly）；8.32（d，N-HArg．or Asp.）． TLC ：SiO₂，MeOH：AcOH（20：0.05）；Rf＝0.3． FAB⁺：〔C₁₃H₃₄N₇O₆〕⁺について、Cl^-：〔Ｍ〕⁺＝444+887でダイマー（５％）。例５〔Ｎα−ベンゾイル−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃβ−（Ｈ） −Ｃα−ベンジル〕アスパルタミドクロリド（Ｘ₁ ¹H NMR 1.40-2.00（分離されなかった多重項、2 CH₂ Arg.）；2.79（分離されなかった多重項、CH₂ Asp.）；3.12（q，CH₂ Arg.）；3.79（m，CH₂ Gly.）；4.29（d，C H₂フェニル）；4.44（m，CH，Arg.）；4.60（q，CH，Asp.）；6.75-8.12（分離されなかった多重項、10 H ar.＋5 Hグアニジニウム）；8.29（分離されなかった多重項、2N-H）；8.40（不完全に定義されたt，N-H Gly）；8.64（d，N，H）． TLC ：SiO₂，MeOH：AcOH（20：0.05）；Rf＝0.75． FAB⁺：〔C₂₆H₃₄N₇O₆〕⁺について、Cl^-：〔Ｍ〕⁺＝540 例６〔Ｎ−Boc−Ｎ_G（Ｈ⁺）−アルギニル〕−グリシル−〔Ｃ−（Ｈ）−Ｃ−ベンジル〕アスパルタミドクロリド（Ｘ₁＝Boc、Ｘ₂ ¹H NMR 1.20-1.80（分離されなかった多重項＋s，3 CH₃ Boc＋2CH₂ Arg.）；2.55-3.20 （分離されなかった多重項、CH₂ Arg.＋CH₂ Asp.）；3.75（不完全に定義された d，CH₂ Gly.）；3.92（m，CH Arg.）；4.20-4.70（d＋m，CH₂−フェニル＋CH As p.）；6.70-7.60（分離されなかった多重項、5H Ar.＋N-H Boc＋4Hグアニジン）；7.70（不完全に定義されたt，N-H）；8.05-8.40（分離されなかった多重項、2 N-H）． TLC ：SiO₂，MeOH：AcOH（20：0.05）；Rf＝0.8（分解）． FAB⁺：〔C₂₄H₃₈N₇O₇〕⁺について、Cl_-：〔Ｍ〕⁺＝436．続発性白内障予防における式Ｉの化合物の値を示す試験結果が下記に与えられる。レンズ被膜（capsule）への上皮細胞の付着の阻害試験ａ）ウシレンズ被膜の調製レンズを、後方顔面を通して雄牛の目から取り出す。そのレンズを、カルシウム−及びマグネシウム−フリーのリン酸塩緩衝液（リン酸緩衝溶液）に貯蔵する。このレンズを、この段階で−20℃で凍結する。前方被膜を小さなハサミを用いて切除し、そして培養皿の底に沈める。１％Triton X100と共に３０分間のインキュベーションは、レンズ被膜に付着するレンズ上皮細胞の分離を可能にする。続いて、その被膜をPBSにより３度すすぐ。使用の前、個々の被膜を光学顕微鏡下で研究し、被膜からの細胞の完全な不在を確かめる。ｂ）³Ｈ−ロイシンによるウシレンズ上皮細胞のラベリング D.L〔（4.5）−³Ｈ〕−ロイシンの溶液を、２％エタノール水溶液として、Amershamから得る。その比活性は25〜50Ci／ｍモルである。使用される ³Ｈ−ロイシンの溶液を、使用のすぐ前に、DMEM培養培地（ダルベッコ変性必須培地）に希釈する。細胞ラベリングのためには、40μCiが10⁶個の細胞当たりに使用される。CO₂オーブンにおける37℃での18〜20時間のインキュベーションは、ロイシンの細胞タンパク質への導入を可能にする。DMEMによる３度の洗浄の後、細胞を0.05％トリプシン−EDTAにより分離し、そしてDMEMにおける細胞の懸濁液を水浴上で１時間、37℃で撹拌しながら貯蔵する。この方法は、2〜10dpm／細胞の比活性を有する細胞のラベルを可能にする。ｃ）被膜へのウシレンズ上皮細胞の付着被膜をNo.9直径（18mm）のコルク穴あけ器具により切断し、そしてそれぞれ直径20mmの24個のウェルを含む複数ウェル培養皿のウェルの底に広げる。ゴム製Ｏリングシールをウェルの底に固定し、被膜を正しく結合する。被膜を、それらの使用まで、PBS＋（10mMのCaCl₂、5mMのMgCl₂）においてインキュベートする。付着培地＝DMEM培養培地＋2mg／mlのウシ血清アルブミン（DMEM＋0.2％ BSA）。式Ｉの試験化合物の濃縮溶液を、使用のすぐ前に調製し、それらを前記付着培地において所望する濃度に希釈する。合計体積150μｌをウェル当たりに添加し、ここでそれらは高まる濃度の試験化合物の存在下で10,000個の細胞を含む。 CO₂を含むオーブンにおいて37℃で１時間インキュベートした後、ウェルをカルシウム、マグネシウムPBSにより３度洗浄する。0.2ＮのNaOH 1.5ml及び１％ナトリウムのドデシル硫酸ナトリウムによる一晩の溶解は、シンチレーションカウンターでのカウントを可能にする。ｄ）結果個々の試験化合物に関して、化合物の濃度の関数としての付着曲線をプロットする。付着の50％阻害（IC₅₀）が観察される用量を計算する。次の表は結果を要約している：式Ｉの化合物は特に下記の形で投与され得る： −手術介入の間、開かれた目に注入される、注射器にパッケージされた滅菌溶液、 −それらの化合物が前もって導入されている又はその表面が設置の前、含浸されているマトリックス中に、レンズ移植体、 −１回の用量又は複数回の用量ボトルにパッケージされた及び手術後に滴下される滅菌目薬。上記目薬組成物は、使用される式Ｉの化合物の水性媒体における安定性に依存して、すぐ使用できる溶液の形で又はすぐ使用の前に調製される溶液（凍結乾燥物及び溶媒）の形で供給され得る。それらは、目薬としての使用により課せられる、滅菌性、中性及び等張性に従う。目薬溶液の例が下記に与えられる。組成物１目薬溶液において、その組成はリン酸緩衝溶液に相当する。組成物２複数回投与の容易に使用できる目薬、この保存は、クロロブタノール又はいづれか他の抗菌剤により確保される。組成物３１回の投与の容易に使用できる目薬、この粘度はヒドロキシプロピルメチルセルロース又はいづれか他の増粘剤により得られる。組成物４凍結乾燥物溶媒使用のすぐ前に調製される目薬は、活性成分を含む凍結乾燥物及びデキストラン 70.000又はいづれか他のテキスチャー剤（textureagent）の充填物；抗菌剤、塩化ベンズアルコニウムを含む溶媒（これは使用の前、凍結乾燥物の再水和化を可能にする）から成る。さらに、本発明の新規化合物は、血小板凝集の阻害の興味ある活性を示すことがわかった。この活性は、次の試験で示された：血小板凝集の阻害についての試験：ａ）血小板の調製。血小板を腹部大動脈から採血されたラット動脈血から単離する。血小板に富む血漿（PRP）及び次に、血小板に富まない血漿（PPP）を遠心分離により調製する（120ｇ×10分及び次に2000ｇ×15分）。PRP及びPPPを、MICHAELIS 緩衝液（Diagnostica Stage）に希釈し、１μｌ当たり3×10⁵個の血小板を含む溶液をPRPにより得る。ｂ）血小板凝集の阻害。 PRP 300mlを、アグレゴメーターマイクロキュベットにおいて試験されるべき種々のペプチド10μｌと共にインキュベートする；１分後、血小板を6.25μＭの ADP 10μｌにより剌激する。化合物の抗−凝集効果を示す結果が下記表に示される。血小板凝集の50％阻害が観察される用量が計算された。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年１１月２４日【補正内容】補正された請求の範囲〔1993年11月24日国際事務局で受領された（24.11.93）；クレーム4が補正され；クレーム8〜11が付加され；他のクレームは補正されなかった（５ページ）〕１．下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つの続発性白内障予防薬の調製への使用。２．下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを、目薬用溶媒に含んで成る目薬組成物。３．下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを含んで成るレンズ移植物及びレンズわな。４．下記式：〔式中、Ｘ₁はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、ベンジル基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物及び医薬的に許容できる酸とのその付加塩。５．式Ｉにおいて、Ｘ₁が基−COR₃又は-CO-OR₃を表わし、Ｒ₃がＣ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、アリール基、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、ヒドロキシル基、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ基、モノ−又はポリヒドロキシル化Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、モノ−又はポリ（Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ）（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）基、アミノ基、モノ−又はジ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）アミノ基、アセトアミド基及びスルホンアミド基から選択された１又は複数の置換基を担持するアリール基、又は（Ｃ₁ −Ｃ₄アルキル）アリール基である請求の範囲第４項記載の化合物。６．式Ｉにおいて、Ｘ₁がアセチル基であり、そしてＸ₂がベンジルアミノ基である請求の範囲第４項記載の化合物。７．式Ｉにおいて、Ｘ₁がアセチル基であり、そしてＸ₂がシクロヘキシルアミノ基である請求の範囲第４項記載の化合物。８．続発性白内障予防のための方法であって、下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩から選択された化合物の治療的有効量を投与することから成る方法。９．前記化合物の目への投与を含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 10．レンズを取り出すことが意図された手術介入の間、前記化合物の滅菌溶液を投与することを含んで成る請求の範囲第９項記載の方法。 11．レンズを取り出した後、滅菌目薬を投与することを含んで成る請求の範囲第９項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ボンヌ，クロードフランス国，エフ―34000 モンペリエール，アブニュドッシタニウ，316

Claims

【特許請求の範囲】１．下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つの続発性白内障予防薬の調製への使用。２．下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ_２はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを、目薬用溶媒に含んで成る目薬組成物。３．下記式：〔式中、Ｘ₁は水素原子、Gly残基又はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂はヒドロキシル基、Ser残基、Ser-Pro又はSer-Pro-Cys基、又は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物又は医薬的に許容できる酸とのその付加塩の１つを含んで成るレンズ移植物及びレンズわな。４．下記式：〔式中、Ｘ₁はＮ−保護基を表わし、そしてＸ₂は下記式：（式中、Ｒ₁及びＲ₂はお互い独立しており、Ｃ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基を表わし、Ｒ₁はさらに、水素原子をたぶん表わし、又はＲ₁及びＲ₂は一緒に、及びそれらが結合する窒素原子と共に、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル基により任意に置換されているピロリジノ、ピペリジノ又はピペラジニル基又は４−ヒドロキシピペリジノ基を形成する）で表わされる基を表わす〕で表わされる化合物及び医薬的に許容できる酸とのその付加塩。５．式Ｉにおいて、Ｘ₁が基−COR₃又は−CO−OR₃を表わし、Ｒ₃がＣ₁−Ｃ₁₈アルキル基、Ｃ₃−Ｃ₈シクロアルキル基、アリール基、Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、ヒドロキシル基、Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ基、モノ−又はポリヒドロキシル化Ｃ₁−Ｃ₆アルキル基、モノ−又はポリ（Ｃ₁−Ｃ₆アルコキシ）（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）基、アミノ基、モノ−又はジ（Ｃ₁−Ｃ₆アルキル）アミノ基、アセトアミド基及びスルホンアミド基から選択された１又は複数の置換基を担持するアリール基、又は（Ｃ₁−Ｃ₄アルキル）アリール基である請求の範囲第４項記載の化合物。６．式Ｉにおいて、Ｘ₁がアセチル基であり、そしてＸ₂がベンジルアミノ基である請求の範囲第４項記載の化合物。７．式Ｉにおいて、Ｘ₁がアセチル基であり、そしてＸ₂がシクロヘキシルアミノ基である請求の範囲第４項記載の化合物。