JPH08501690A

JPH08501690A - 調節性炎症性シクロオキシゲナーゼを発現する安定に形質転換された哺乳動物細胞

Info

Publication number: JPH08501690A
Application number: JP6508460A
Authority: JP
Inventors: ヤング、ドナルド・エイ; オバニオン、マイケル・ケイ; ウイン、バージニア・ディー
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ロチェスター
Priority date: 1992-09-22
Filing date: 1993-09-22
Publication date: 1996-02-27
Also published as: CA2144742A1; ATE179756T1; DE69324820D1; AU688282B2; HK1013106A1; WO1994006919A2; JP2005068157A; AU5165293A; NZ256776A; WO1994006919A3; JP2004105186A; EP0667911B1; DE69324820T2; EP0667911A1

Abstract

(57)【要約】染色体が組み込まれた組換えＤＮＡを有する、哺乳類形質転換細胞系を提供する。このＤＮＡは哺乳類グルココルチコイド調節性炎症性プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ（griＰＧＨＳ）を発現する。このＤＮＡは構成ＰＧＨＳを発現しない。この細胞系は内在性のＰＧＨＳ活性を発現しない。

Description

【発明の詳細な説明】調節性炎症性シクロオギシゲナーゼを発現する安定に形質転換された哺乳動物細胞［発明の背景］本発明は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）より与えられた助成金（Ｎｏ．ＤＫ１６１７７）の下、政府援助を受けて行われた。政府は本発明の権利を持つ。（ＰＧＥ₂、ＰＧＤ₂、ＰＧＦ_2a、ＰＧＩ₂および他の関連化合物を含む）プロスタグランジン類は、脂肪酸代謝由来のオートクリン群およびパラクリンホルモン群の１つで、天然エイコサノイド（プロスタグランジン類、トロンボキサン類およびコイコトリエン類）に属する。エイコサノイドそれ自体は細胞内に貯えられていることはなく、アラキドン酸（細胞膜リン脂質の分解に由来する炭素数２０個の脂肪酸）から、必要に応じて生合成される。正常状況下のエイコサノイド産生は微量だが、細胞の種類によって大きく異なる多数の細胞機能の重要な情報伝達物質（メディエーター）として作用する。しかし、プロスタグランジン類は病態生理学においても極めて重要な役割を果たしている。特に炎症の開始とその維持は、少なくとも部分的には、損傷を受けた細胞内でプロスタグランジン類が過剰に産生されることによる。プロスタグランジン類が炎症で果たす中心的役割は、多くの病的炎症状態の治療において最も効果的であるアスピリン様非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）が、プロスタグランジンの合成を阻害することですべて作用しているという事実によって強調される。残念ながら、非ステロイド性抗炎症剤は正常細胞内のプロスタグランジン類も減少させ、正常な生理の維持に必要なオートクリンおよびパラクリン機能が損なわれる結果生じる副作用（消化管出血、潰瘍、腎不全など）のため、その使用が限られてしまうことが多い。他の細胞内でのプロスタグランジン産生を変化させずに、炎症細胞内のプロスタグランジン類のみを減少させることによって、さらに特異的に作用する新薬を開発することは、今後の薬物治療の大きな目標の１つである。プロスタグランジン類合成経路の第１段階はシクロオキシゲナーゼ反応である。まず、プロスタグランジンＧ／Ｈの合成作用を有する酵素（ＰＧＨＳ）が、アラキドン酸をエンドペルオキシドＰＧＧ₂に変換すると、これが分解してＰＧＨ₂ になる（この２つの反応は１つの酵素が触媒する）。続いて、ＰＧＨ₂は１つもしくは複数のプロスタグランジン合成酵素（ＰＧＥ₂シンターゼ、ＰＧＤ₂シンターゼなど）によって代謝され、最終産物である「２つのシリーズ」、すなわちプロスタグランジンシリーズ（ＰＧＥ₂ 、ＰＧＤ₂、ＰＧＦ_2a、ＰＧＩ₂）、およびトロンボキサン（ＴＸＡ₂）のような他のシリーズを生成する。第１段階（ＰＧＨＳ）はプロスタグランジン合成の律速段階である。それはさておき、ＰＧＨＳの触媒反応は抗炎症剤作用の主要な標的である。そして、ＮＳＡＩＤＳ（アスピリン、インドメサシン、ナプロキセン、およびａ）炎症細胞中のプロスタグランジン類の過剰産生を抑制する（望ましい治療目標）と同時に、ｂ）非炎症細胞中のプロスタグランジン類の正常な産生も減少させる（好ましくない副作用を生じる）ようなその他の抗炎症剤）の薬理作用は、主にＰＧＨＳ作用の阻害による。炎症に関連する異常な変化以外にも、複数の因子が実験条件下でプロスタグランジン産生に影響を及ぼすことが知られている。これには成長因子、ｃＡＭＰ、発癌プロモーター、がん遺伝子ｓｒｃの活性化、インターロイキン１および２などが含まれるが、これらすべての因子は全細胞のＰＧＨＳ活性を亢進させる。副腎グルココルチコイドホルモンおよびこれに関連する合成抗炎症ステロイドもプロスタグランジンの合成を阻害するが、これらの代謝作用部位はあまり明らかではない。ヒト、ヒツジ、ネズミの各ｃＤＮＡがＰＧＨＳ−１用にクローンされている。これらの配列は互いに似ており、ノーザンブロット法で２．８〜３．０キロベース（ｋｂ）のｍＲＮＡとハイブリッドを形成する。しかし、最近幾つかの研究グループが、ＰＧＨＳ−１に関連があると報告されているタンパク質の配列をある方法で同定し推測した。１９９０年にJ.S．Hanらは、『ＰＮＡＳＵＳＡ』８７巻３３７３頁（１９９０年５月）において、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞がラウス肉腫ウイルスの温度感受性突然変異株ＬＡ９０に感染した後に、ポリペプチドｐｐ６０^v-srcによって生じるタンパク質合成の変化について報告した。巨大２次元ゲル電気泳動の結果、抗シクロオキシゲナーゼ抗体で確認可能な、７２〜７４キロダルトン（ｋＤａ）の１対のタンパク質が検出された。このタンパク質の合成は、血小板由来の成長因子の暴露によっても一時的に促進され、またデキサメサゾン治療によって阻害された。このようなタンパク質合成の変化は、シクロオキシゲナーゼ活性の変化と密接に関係していた。対になっているタンパク質は、マウスＣ１２７線維芽細胞でも認められた。この線維芽細胞でのタンパク質合成は、血清およびデキサメサゾンによって調節されていることが判明し、またシクロオキシゲナーゼ活性と関連があった。『J．Biol．Che m.』２６６巻２３２６１頁（１９９１年１２月５日）掲載のM.K．O'Banionらの報告を参照のこと。 W．Xieらは、ｐｐ６０^v-srcに相当する１組のｃＤＮＡ（直ちに誘発可能な、ニワトリ胚線維芽細胞中の初期遺伝子）の分離を過去に報告しているが、ＣＥＦ −１４７と呼ばれる遺伝子がＰＧＨＳ−１に関連するタンパク質をコード化していることを、『ＰＮＡＳＵＳＡ』８８巻２６９２頁（１９９１年４月）で報告した。彼らはこのｐｐ６０^v-srcを、有糸分裂促進因子（ミトゲン）を誘発できるＰＧＨＳ_chickenという意味で、誘発型「ｍｉＰＧＨＳｃｈ」と名付けた。Xie らは、プロスタグランジン合成がｓｒｃ産生媒介性細胞形質転換において、ある役割を果たしているのだろうと推測したが、ｍｉＰＧＨＳｃｈをもう１つのシクロオキシゲナーゼとして、あるいは単にヒツジＰＧＨＳ−１である「ＰＧＨＳｏｖ」のニワトリの同族体として、実験で識別することはできなかった。他の１連の実験において、D.A．Kujubuらは、有糸分裂促進因子に応答するＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞（ＴＩＳ１０）をクローンした１次応答遺伝子の１つが、３’側に長い非翻訳領域を持っており、マウスＰＧＨＳ−１と約６０％同じである６６ｋＤａの「推測」タンパク質をコード化していることを、『J．Biol．Che m.』２６６巻１２８６６頁（１９９１年）で報告した。この推測上のタンパク質の配列は、Xieらのタンパク質配列と本質的に同じであった。配列の類似性から、Kujubuらは、ＴＩＳ１０遺伝子がコード化しているタンパク質の酵素活性は、他の哺乳類のＰＧＨＳ−１の酵素活性とおそらく同じだろうと推測した。彼らは、『しかし、この推測の証明には、発現可能なプラスミドからのこの遺伝子産生の非相同発現と、トランスフェクシヨンされた細胞あるいはＴＩＳ１０タンパク質の精製製剤またはその両者におけるシクロオキシゲナーゼ活性の直接的な測定が必要である』と結論づけた。プロスタグランジン合成経路の活動の評価方法および調節方法の開発の重要性が増している。前述したとおり、アスピリンやインドメサシンのような非ステロイド性抗炎症剤は、アラキドン酸をＰＧＧ₂およびＰＧＨ₂に変換するシクロオキシゲナーゼを阻害する。したがって、分子レベルで、従来の抗炎症剤の効果の調査方法、および潜在的な抗炎症剤の効果の評価方法を改良する必要があると同時に、このような方法で使用する試薬が必要である。［発明の概要］本発明は、染色体に組み込まれた組換えＤＮＡ配列を有する哺乳類細胞系を提供する。このＤＮＡ配列は哺乳類、特にヒトのグルココルチコイド調節性炎症性ＰＧＨＳを発現する。この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性を発現しない。ここでは簡単に、グルココルチコイド調節性炎症性ＰＧＨＳを「ｇｒｉＰＧＨＳ」または「ＰＧＨＳ−２」と呼び、2.8〜3.0ｋｂのｍＲＮＡ（ＥＣ１.１４.９９.１）がコード化し、技術者が認識している哺乳類ＰＧＨＳを「構成シクロオキシゲナーゼ」または「構成ＰＧＨＳ」または「ＰＧＨＳ−１」と呼ぶ。「自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性」が存在しないという記述は、組換えＤＮＡ配列が発現するＰＧＨＳ活性は別にして、細胞系がＰＧＨＳ活性を発現不可能であることに関連している。自己のＰＧＨＳは「内在性」ＰＧＨＳ活性と技術者の間で呼ばれることもある。本発明は、Hanらが報告した７２〜７４ｋＤＡのシクロオキシゲナーゼ、Xieらが報告したｍｉＰＧＨＳｃｈ、およびKujubuらが報告したＴＩＳ１０タンパク質が本質的にどれも同一のものであること、そしてこれらは別のシクロオキシゲナーゼであることを、我々が発見した結果である。このシクロオキシゲナーゼは、グルココルチコイドによる阻害の主要な標的であり、また非ステロイド性抗炎症剤による阻害の標的でもある。１９９１年１２月、我々は、マウスの４ＫｂのｍＲＮＡを経て、Ｃ１２７マウス線維芽細胞中の７０ｋＤａのタンパク質の合成を報告し、得られたアミノ酸の配列を発表した。４ｋｂのｍＲＮＡがコード化しているタンパク質は、そのアミノ酸の８０％が配列の決定した２４０塩基領域において、既知のマウスＰＧＨＳ−１タンパク質産物と同一である。『J．Biol．Chem.』３５巻２３２６１頁（１９９１年１２月５日発行）掲載のM．Kerry O'Banionらの報告を参照のこと。幾つかのアッセイにより、ここでｇｒｉＰＧＨＳまたはＰＧＨＳ−２と呼ぶ７０ｋＤａのタンパク質が、シクロオキシゲナーゼの分離型であることが判明した。このタンパク質は抗ＰＧＨＳ血清で沈殿した。このタンパク質の合成および同時に生じるシクロオキシゲナーゼの濃度は、血清によって急速に誘発されるが、この誘発はデキサメサゾンによって阻害される。ＰＧＨＳ−２合成の調節は、2. 8ｋｂのＰＧＨＳ−１ｍＲＮＡの濃度変化ではなく、４ｋｂのｍＲＮＡ種の濃度変化の結果行われていることが明らかになった。後者のｍＲＮＡ種は、血清処理細胞中の2.8ｋｂのＰＧＨＳ−１ＤＮＡプローブではほとんど検出不可能だが、シクロヘキシミドまたはイオノホアカルシウム処理細胞中でかなりの濃度まで蓄積する。これとは対照的に、血清、デキサメサゾン、シクロヘキシミドの各処理で、「構成ＰＧＨＳ」すなわちＰＧＨＳ−１をコード化している2.8ｋｂのｍＲＮＡの濃度に変化は認められなかった。我々はハイブリダイゼーション分析により、４ｋｂのｍＲＮＡが、2.8ｋｂのｍＲＮＡを生じる遺伝子とは異なる遺伝子の産物であったことを証明した。これらの観察結果は、シクロオキシゲナーゼ遺伝子が２種類存在することを示している。１つは構造的に2.8ｋｂのｍＲＮＡとして発現されるもので、もう一方はＰＧＨＳ−２をコード化する４ｋｂの成長因子調節性およびグルココルチコイド調節性ｍＲＮＡを生じるものである。後者の４ｋｂのｍＲＮＡの発現およびこれと同時に生じるＰＧＨＳ−２濃度の上昇が、炎症の多くの副作用を直接的または間接的に引き起こすプロスタグランジン合成促進の、すべてではないにしても、主な原因であると信じられている。本ＰＧＨＳ−２合成形質転換細胞系は、炎症性シクロオキシゲナーゼに対する潜在的生物活性剤の作用を評価するのに有用である。なぜならば、炎症の主要な証明であると共に、炎症の多くの副作用の原因であるプロスタグランジン類の濃度の上昇は、構成的に発現したシクロオキシゲナーゼすなわちＰＧＨＳ−１の変化ではなく、むしろＰＧＨＳ−２濃度の上昇によるからである。本発明は、染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を有する、別の哺乳類形質転換細胞系も提供する。このＤＮＡ配列は哺乳類（特にヒト）ＰＧＨＳ−１を発現するが、ＰＧＨＳ−２は発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性も発現しない。この別の細胞系も、霊長類、ネズミ、ヒトの細胞系である。したがって、本発明は、ＰＧＨＳ−１に対してＰＧＨＳ−２を選択的に阻害する結果、ＰＧＨＳ−２は上昇しているが構成ＰＧＨＳ−１は上昇していない、哺乳類（特にヒト）の炎症組織や哺乳類（特にヒト）宿主の他の生理的または病的状態において、亢進したプロスタグランジン合成を特異的に阻害する化合物の相対的阻害作用を評価する方法も提供する。このアッセイでは、適当な培地または緩衝液中で本ＰＧＨＳ−２発現形質転換細胞系または小胞体抽出物を、予め選択した量の被験化合物と接触させ、ここにアラキドン酸を加える。そして、この細胞系または前記小胞体抽出物を、前記被験化合物の非存在下の対照細胞系または小胞体抽出物の１部と比較して、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の合成、すなわちトロンボキサン合成、プロスタグランジン（例：ＰＧＥ₂）合成、その他のシクロオキシゲナーゼ経路固有の代謝産物の合成のレベルを測定する。本ＰＧＨＳ−２発現細胞系の代わりにＰＧＨＳ−１発現形質転換細胞系を用いて、前記操作手順を行う別のアッセイにより、化合物のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に対する選択的阻害力を評価できる。より詳細には、本発明は、哺乳類細胞中でＰＧＨＳ−２またはＰＧＨＳ−１が触媒するプロスタグランジン合成の阻害化合物の作用を測定する方法を提供する。この方法は以下のとおりである。（ａ）まず、予め選択した量の前記被験化合物を培地内の第１の哺乳類形質転換細胞系に加える。この細胞系は染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を持っており、このＤＮＡ配列は哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現するが、ＰＧＨＳ−１は発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性を発現しない。（ｂ）アラキドン酸をこの培地に加える。（ｃ）前記の細胞系によって合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する。（ｄ）この濃度を、前記被験化合物の非存在下で前記第１の細胞系が合成した前記代謝産物の濃度と比較する。（ｅ）予め選択した第２の前記被験化合物を、培地内の（ａ）とは異なる哺乳類形質転換細胞系に加える。この細胞系は染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を持っており、このＤＮＡ配列は哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現するが、ＰＧＨＳ−２は発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２活性を発現しない。（ｆ）アラキドン酸をステップ（ｅ）の前記培地に加える。（ｇ）前記第２の（ｅ）の細胞系によって合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する。（ｈ）この濃度を、前記被験化合物の非存在下で前記第２の細胞系が合成した前記代謝産物の濃度と比較する。当然のことながら、ステップ（ｄ）および（ｈ）で測定したように、代謝産物すなわちプロスタグランジンの合成を阻害する化合物の相対的作用を比較することにより、ＰＧＨＳ−２およびＰＧＨＳ−１の各阻害に関して、化合物の選択性を直接測定することが可能である。したがって、炎症細胞モデルにおいてＰＧＨＳ−２濃度が上昇することから、またシクロオキシゲナーゼ活性を阻害する薬剤の副作用は、ＰＧＨＳ−１の減少によって生じると信じられていることから、本特許請求の範囲の方法を用いてＰＧＨＳ− ２およびＰＧＨＳ−１に対する各薬剤の作用を評価する必要があるだろう。過去のin vitroアッセイに基づいた、薬剤候補の抗炎症作用の評価は誤解を招くかもしれない。なぜならば、構成および炎症性シクロオキシゲナーゼの各活性を区別していなかったからである。2.8ｋｂのｍＲＮＡがコード化している構成シクロオキシゲナーゼまたは４ｋｂのｍＲＮＡがコード化している誘発シクロオキシゲナーゼのどちらか一方を発現する、本発明の安定した細胞系を使用し、各細胞系の用量反応曲線を分析すれば、ＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に対する薬剤の特異性を決定できるだろう。ＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に対する薬剤作用の比較研究は、様々な非ステロイド性抗炎症剤の独特な臨床利用を明らかにしていくだろう。また、ＰＧＨＳ−２活性を阻害する薬剤用量の滴定を考慮し、他のシクロオキシゲナーゼ活性を保持するだろう。本発明の細胞系の利用は、ＰＧＨＳ−２の特異的阻害剤の発見または開発あるいはその両方に必要なメカニズムを提供する。このような薬剤は、プロスタグランジン生合成の全面阻害によって生じると思われる重大な副作用を引き起こすことなく、従来の薬剤が持つ重要な抗炎症作用を有すると予測される。本発明はまた、生物学的活性のあるヒトＰＧＨＳ−２をコード化する分離ＤＮＡ配列（遺伝子）と、これによってコードされた、本質的に純粋な分離ヒトＰＧＨＳ−２から成る。［図面の簡単な説明］第１図は、ｃＤＮＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）およびネズミｇｒｉＰＧＨＳ（「ＰＧＨＳ−２」）の推定アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す。− ２４でのプライマー伸長によって決定した転写開始部位に基づき、この配列の番号は２５から始まる。１７および１８番目のアミノ酸間に推定されるシグナルペプチド切断部位を矢印で示す。推定アスピリン修飾セリンの位置を丸印で、また潜在的なＮ−糖鎖形成部位には２本線を引いて示した。第２図は、ネズミの2.8および4.1ｋｂのＲＮＡをコード化したシクロオキシゲナーゼ用タンパク質配列およびｃＤＮＡの比較を示す概略図である。第３図は、インターロイキン−１（既知の炎症メディエーター）処理に対する応答において、ヒトの単球で発現されるように、ｇｒｊＰＧＨＳおよび構成ＰＧＨＳ−１をコード化する遺伝子の発現をモニターするノーザンブロット法によって得られた、オートラジオグラフィーの写真である。第４図は、ｇｒｉＰＧＨＳ発現ベクターの構造を示す概略図である。ｇｒｉＰＧＨＳの３’側の非翻訳領域中の点は、５’−ＡＵＵＵＡ−３’ ｍＲＮＡ不安定化配列の位置を示す。第５図は、予め選択した量の数種類の非ステロイド性抗炎症剤による、トランスフェクションされた哺乳類安定細胞系中のネズミｇｒｉＰＧＨＳ活性の阻害を示すグラフである。第６図は、ヒトＰＧＨＳ−２遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を示す。第７図は、本発明のヒトＰＧＨＳ−２のアミノ酸配列（図の上段）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）とHlaらが発表したアミノ酸配列（下段）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）の比較を示す。各配列は標準的な１文字コードで示した。第８図は、４種類の非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）による、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−２活性の阻害を示すグラフである。第９図は、４種類のＮＳＡＴＤによる、形質転換された安定ＣＯＳ細胞内のヒトＰＧＨＳ−１活性の阻害を示すグラフである。［発明の詳細な説明］本発明は、組換えＤＮＡ配列、好ましくは染色体を組み込んだ組換えＤＮＡ配列を有する形質転換細胞系に関するものである。このＤＮＡ配列は調節性炎症性シクロオキシゲナーゼであるｇｒｉＰＧＨＳすなわち「ＰＧＨＳ−２」をコード化する遺伝子から成る。さらに、この細胞系は組換えＤＮＡ配列がコード化するＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２以外に、自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２を発現しない。組換えＤＮＡも構成ＰＧＨＳ−１（ＥＣ 1.14.99.1 ）をコード化してしない。本発明の一実施例は、染色体を組み込んだ、遺伝子操作された（「組換え」）ＤＮＡ配列を有する哺乳類形質転換細胞系である。このＤＮＡ配列は哺乳類（特にヒト）ＰＧＨＳ−２を発現するが、哺乳類構成ＰＧＨＳ−１を発現しない。また、この細胞系は自己のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２を発現しない。この細胞系は、例証されたサル腎臓ＣＯＳ細胞系のようにヒトまたは霊長類由来であるが、ニワトリやハムスター、ネズミ、ヒツジなど、他の種由来の細胞系も利用できる。ここでいう「形質転換」には、組換えＤＮＡ配列の存在によって変化した遺伝子型である、あらゆる細胞または細胞系が含まれる。このようなＤＮＡ配列は、遺伝子工学の技術において、「非相同ＤＮＡ」、「外来性ＤＮＡ」、「遺伝子操作された」あるいは「異質ＤＮＡ」と呼ばれている。遺伝子工学の技術により、前記ＤＮＡは細胞または細胞系の遺伝子型またはゲノムに導入された。ここで使用したように、「組換えＤＮＡ配列」は、あらゆる生物から山来あるいは分離され、その後化学的に変化され、哺乳類細胞に導入されたＤＮＡ配列のことである。ある生物「由来の」組換えＤＮＡ配列の例は、ある特定の生物中で有用な断片として同定されるＤＮＡ配列である。同定後、これは本質的に純粋な形態で化学的に合成される。ある生物から「分離された」組換えＤＮＡ配列の例は、化学的方法（例：制限エンドヌクレーゼの利用）によって、その生物から除去または切除される有用なＤＮＡ配列であり、その結果、遺伝子工学の方法論により、発明中の利用目的でさらに操作を加える（例：増幅する）ことができる。したがって、「組換えＤＮＡ配列」には、完全合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生物から分離したＤＮＡ、導入ＲＮＡ由来のＤＮＡがある。一般に、組換えＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の受け手（レシピエント）である遺伝子型に本来備わっていないか、あるいは備わっていても発現されない。ここで形質転換に使用された分離組換えＤＮＡ配列は環状または直線状、１本鎖または２本鎖である。一般に、ＤＨＡ配列はキメラの直線状ＤＮＡであるか、またはプラスミドあるいはウイルス発現ベクター中に存在する。これらは、結果として生じる細胞系の組換えＤＮＡの発現を促進する調節配列に接するコード領域も持つことができる。例えば、組換えＤＮＡ配列は、哺乳類の細胞内で活性のあるプロモーターから成ることもあれば、形質転換の標的である遺伝子型に既に存在するプロモーターを利用することもある。このようなプロモーターには、ＳＶ４０後期プロモーターやレトロウイルスのＬＴＲｓ（長い末端反復要素）の他に、第４図に示したＣＭＶプロモーターがある。標的細胞の形質転換が可能な組換えＤＮＡを生成する一般的な方法は、技術に熟練している者にはよく知られており、ここで有用なＤＮＡを生成するのに、同様な組成および生成方法を利用できる。例えば、Ｊ．Sambrookらは『Molecular Cloning：A LabGratory Manual』（Cold Spring Harbor Laboratory Press 第２版、１９８９年）の中で、適切な生成方法を紹介している。ＰＧＨＳ−１やＰＧＨＳ−２、その他の部分用の転写単位として作用する組換えＤＮＡ配列の他に、組換えＤＮＡの１部が転写されずに、調節または構造的機能を果たすことがある。細胞内に導入される組換えＤＮＡ配列は、一般に、形質転換細胞の選択および同定を促進する、選択可能な標識遺伝子またはレポーター遺伝子、あるいはその両方を含んでいる。代わりに、選択標識が別のＤＮＡに存在して、これを一緒に形質転換過程に利用することがある。選択標識およびレポーター遺伝子は適当な調節配列に接して、哺乳類の細胞での発現を可能にしている。有用な選択標識は技術者によく知られており、例えば抗生物質および除草剤抵抗性遺伝子がある。本発明で有用なＤＮＡ配列の製造源には哺乳類細胞のポリＡＲＮＡがある。ｇｒｉＰＧＨＳをコード化する約４ｋｂのｍＲＮＡがこれに由来し、技術者に知られている方法で、相当するｃＤＮＡの合成に用いられる。このような製造源には、『J．Biol．Chem.』２６６巻２３２６１頁（１９９１年）でM.K．O'Banion らが述べているように、血清およびシクロヘキシミドで処理したＣ１２７ネズミ線維芽細胞から分離し、大きさで分けたポリＡＲＮＡのラムダＺＡＰII（Stra tagene）ライブラリーがある。Xieらは、『ＰＮＡＳＵＳＡ』８８巻２６９２頁（１９９１年）で述べているとおり、ニワトリのｇｒｉＰＧＨＳをコード化するｍＲＮＡを入手した。ｇｒｉＰＧＨＳをコード化するヒトｍＲＮＡの製造源には、M.K. O'Banionらの『ＰＮＡＳＵＳＡ』８９巻４６８８頁（１９９２年６月）によると、インターロイキン−１およびシクロヘキシミドで処理したヒト単球由来のＲＮＡがある。ＰＧＨＳ−１をコード化するヒトｍＲＮＡの製造源も技術者によく知られている。殺菌性化合物に対する抵抗性を伝える酵素をコード化する選択標識遺伝子を、下の表１にまとめる。レポーター遺伝子は、潜在的な形質転換細胞の同定および調節配列の機能性の評価に用いられる。簡単にアッセイ可能な標識タンパク質をコード化するレポーター遺伝子は、技術者によく知られている。一般に、レポーター遺伝子は、宿主生物または組織に存在しないか、存在しても発現されない遺伝子であり、簡単に検出可能な何らかの性質（例：酵素活性）によって発現が証明されるタンパク質をコード化している。優先遺伝子には、大腸菌のＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）、大腸菌のｕｊｄＡ座のβ- グルクロニダーゼ遺伝予（ｇｕｓ）、ホタルのPhotinus pyralis由来のルシフェラーゼ遺伝子がある。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、適当な時間を置いてからアッセイする。イントロンやエンハンサー、ポリアデニル化配列のような他の要素も、時に組換えＤＮＡ配列の１部分となる。これらの要素はＤＮＡ機能に必要なこともあれば、必要でないこともあるが、ｍＲＮＡの安定性や転写などに影響を及ぼすことでＤＮＡの発現を亢進させることがある。細胞内でＤＮＡを最大限に形質転換させる目的で、これらの要素はＤＮＡに含まれることがある。組換えＤＮＡ配列は、ウイルス発現ベクターのような発現ベクターを用いてトランスフェクションすることにより、標的細胞に容易に導入できる。発現ベクターは、リン酸カルシウム沈降法の変法（C．Chenら：Mol．Cell．Biol.，7；2745 ，1987）により、ｇｒｉＰＧＨＳすなわちＰＧＨＳ−１をコード化するｃＤＮＡから成る。トランスフェクションは、リポフェクション法を始め、市販のキット（例：ＢＲＬ提供のキット）を用いた他の方法でも可能である。次に詳細な例を参照して本発明をさらに詳しく説明する。例１ネズミＰＧＨＳ−２遺伝子の分離、クローニングおよびシークエンシングＡ．細胞および細胞培養 Peter Howley氏（ＮＩＨ）よりＣ１２７マウス線維芽細胞を入手し、ブドウ糖含有量の多いダルベッコ変法イーグル培地に、抗生物質を含まない１０％ウシ胎児血清（HyClone Laboratories）を加えて増殖させた。D.R. Lowyらの『J. Viol .』26巻291頁（1978年）を参照のこと。培養は、T.R. Chenの方法（Exp.Cell Re s., 104； 255，1977）に従い、マイコプラズマ混入についてHoechst 33258染色でモニターした。幾何級数的に増殖する亜集密（６０〜８０％）細胞単層（３５ｍｍの層）を、メチオニンを含まないダルベッコ変法イーグル培地（GIBCO）で、２００μCi/ml のTran³⁵Ｓの標識（＞１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＩＣＮ）を１５〜３０分間加えて、標識を行った。ウシ胎児血清（１０％）が標識中に存在した例もあった。２００μlのＡ８緩衝液（９．５M尿素、２％（w/v）Nonidet Ｐ−４０、２％（w /v）アンホリン（ＬＫＢ、１．６％ｐＨ５〜８、０４％ｐＨ３．５〜１０）、５％（w/v）２−メルカプトエタノール）での溶解の前に、メチオニンを含む氷冷ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で単層を２回すすいだ。タンパク質への標識取り込みはトリクロロ酢酸沈降で測定した。デキサメサゾン（Ｓｉｇｍａ）をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で新たに調製し（２５０nnで１．５×１０⁴l /mol/cmのモル消失係数に基づく株濃度）、１μMまで加えた。イオノホアカルシウムＡ２３１８７（Calbiochem）を、エタノール中で２．５ｍＭ株から５μMの濃度で使用した。シクロヘキシミド（Sigma）を、水で１００×株から２５μMの濃度で使用した。この濃度は１５分以内に９７％以上タンパク質合成を阻害する。対照培養には適切な量の溶剤を与えた。外因性アラキドン酸基質（３０μM３７℃１５分間）を加えることにより、培地でシクロオキシゲナーゼ活性を測定した後、プロスタグランジンＥ産物をメチルオキシメート型に変換した。続いて、この２環式誘導体をラジオイムノアッセイ（Amersham社のキット）で定量した。Ｂ．ＲＮＡの生成イソチオシアン酸グアニジン溶解を用いて、total ＲＮＡを１５cmの平板から分離した後、塩化セシウムクッションで遠心分離を行った（J.M. Chirgwinら：Biochemistry，18；5294，1979）。H．Avivらが『PNAS USA』69巻1408頁（197 2年）に発表したように、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルコースカラムによる２経路で生成した。ＲＮＡを２６０nmの吸光度測定で定量した。Ｃ．ｃＤＮＡ合成 J． Sambrookらが前記雑誌に発表したように、血清およびシクロヘキシミド（２５μM）で２時聞半処理したＣ１２７細胞のＲＮＡを多く含むポリＡ５０μｇを、１０mMのＣＨ₃ＨｇＯＨ存在下に１０〜３０％ショ糖勾配で分画した。他のすべての分画について、任意プライミングで標識した１．６kbのヒツジＰＧＨＳｃＤＮＡの５’末端（Oxford Biomedical Research社から入手）を用いて、４k bのｍＲＮＡの存在をノーザンブロット法でアッセイした。ＲＮＡサンプルおよび分子量マーカー（３μｇ；Bethesda Research Laboratories ＲＮＡラダー）について、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動を行った後（J． Sambrook ら：前述に引用したMolecular Cloning；7.30〜7.32）、１０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）での一晩毛細管転移により、ナイロン膜（Duralon，Stratagene）にブロットした。ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライミンダにより４kbのｍＲＮＡに富む分画から生成し（U． Gublerら：Gene（Amst.），25；263，1988）、λ−ＺＡＰIIに結合させた（（J.M. Shcrtら：Nucleic Acids Res., 16；7583，1988）Stratagene ）。緊縮性が低下した状態下で（３０％ホルマミド、ハイブリダイゼーション温度を４２℃まで低下、５５℃で２×ＳＳＣ＋0.1％ＳＤＳで洗浄したフィルター）、２５万個のプラークがヒツジＰＧＨＳプローブでスクリーニングされた。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて、欠失サブクローンを組み込んだＥｘｏ III の２本鎖ジヂオキシターミネーションシークエンシングを、両方向に行った。He inikoffの）『Gene』28巻351頁（1984年）およびG．Del Salらの『Bio-Techniques』7巻514頁（1989年）を参照のこと。Ｄ．in vitroでの転写・翻訳、免疫沈降、プライマー伸長 Bluescriptベクター（Stratagene）中のｃＤＮＡ１μｇを、３’末端でＸｈｏＩで直線状にし、キャップ形成剤ｍ⁷Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Stratagen eのキット）を含む反応中でＴ３ＲＮＡポリメラーゼで転写した。精製後、転写されたＲＮＡの５分の１と、前記ようにシクロヘキシミドおよび血清処理Ｃ１２７細胞から精製したポリＡＲＮＡ2.5μｇを、製造元（Promega）が述べたとおり³⁵Ｓ−メチオニンを含む別のin vitro反応中で翻訳した。ただし、ＲＮＡはあらかじめ3.5mMのＣＨ₃ＨｇＯＨで、室温で１０分間インキュベーションした。反応を修正ＲＩＰＡ緩衝液で希釈し、多クローン性抗ＰＧＨＳ血清（Oxford Bio medical Research社）で沈降させた。あるいは、５０μｌ/mlタンパク質Ａ−セファロース（Pharmacia LKB Biotechnology社；５０％（v/v））で３０分間インキュベーションすることにより、あらかじめまず安全を証明した。0.01の分量の抗血清またはウサギ血清を溶解産物に加え、４℃で２時間インキュベーションした後、タンパク質Ａ−セファロースで沈降させた。ペレット状ビーズを免疫沈降緩衝液で４回洗浄し、室温で３０分間 Laemmli溶解緩衝液に再び懸濁した。免疫沈降産物を標準１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、蛍光間接撮影法により視覚化した。プライマー伸長分析については、血清およびシクロヘキシミドで２時間処理したＣ１２７細胞由来のポリＡＲＮＡの２μｇを、配列決定された4.1kbのｃＤＮＡのヌクレオチド（ｎｔ）５５〜７５に相補的な³²Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドを用いて、C．C．Bakerらが『EMBO J．』6巻1027頁（1987年）で述べたとおり、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（BRL）で逆転写した。同じプライマーを利用するB luescriptベクター中のｃＤＮＡの³⁵Ｓ標識ジデオキシシークエンシング反応と並行し、反応産物を標準シークエンシングゲルで電気泳動した。Ｅ．ｃＤＮＡ発現およびＰＧＥ測定 4.1kbのｍＲＮＡがシクロオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコード化しているか否かを調べるために、ｃＤＮＡをＳＶ４０後期プロモーター発現ベクター（ＳＶＬ、（R．Breatnachら：Nucleic Acid Res.,11：7119，（1983）））に挿入した。D．L．DeWittらが『J．Bjol．Chem.』265巻5192頁（1990年）に報告したように、ＣＯＳ細胞は自己のオキシゲナーゼ活性をほとんどあるいは全く持たない。したがって、この細胞に、2.5または５μｇのベクター単独あるいは4.1kbのｃＲＮＡを有するベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション細胞由来の³⁵Ｓ標識タンパク質の２次元ゲル電気泳動の結果、4.1kbのｃＤＮＡ発現細胞中に、タンパク質対（72/74kD a、p17.5）が認められた。このタンパク質対は、合成が成長因子で促進し、ダルココルチコイドホルモンで抑制されるＣ１２７マウス線維芽細胞で認められた、免疫沈降シクロオキシゲナーゼタンパク質対に正確に一致する。トランスフェクション細胞のシクロオキシゲナーゼ活性もアッセイした。4.1k bのｃＤＮＡを発現するＣＯＳ細胞は、対照細胞よりも約２等級多くプロスタグランジンＥ₂を産生した（表２）。さらに、プロスタグランジン産生は、トランスフェクションされたＤＮＡの量に応じて増加した。これらの結果は、4.1kbのｍＤＮＡが、「グルココルチコイド調節性炎症性ＰＧＨＳ（ｇｒｉＰＧＨＳ）」と名付けられた活性シクロオキシゲナーゼをコード化していることを明らかに示している。表２ＣＯＳ細胞中の4.1kbのｃＤＮＡが発現されると、プロスタグランジンが合成される。２重になっている６０mmの平板中の亜集密ＣＯＳＡ．２細胞に、指示された量の発現ベクター単独（SVL）または4.1kbのｃＤＮＡを有する発現ベクター（SVL-4.1）をトランスフェクションし、ＰＧＥ産生について２日後にアッセイした。ＰＧＥ₂産生アッセイのため、あらかじめ暖めたＤＭＥＭで細胞を１回すすぎ、３０μMのアラキドン酸を含むＤＭＥＭを１ml加えた。１０〜１５分後に上澄みを採取し、短時間の遠心分離でこれを清浄化し、メチルオキシメート型に変換後、ラジオイムノアッセイでＰＧＥ₂をアッセイした（Amersham社のキット）。単層は0.5Ｎ水酸化ナトリウムで可溶化し、１Ｎ塩酸で中和し、遠心分離で清浄化してから、タンパク質濃度を測定した。Ｆ．ノーザンブロット分析Ｃ１２７細胞由来のＲＮＡ（2.5μｇ）に富むポリＡをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動で分画に分け、膜（Duralon，Stratagene）に転移させた。A .P． Feinbergらが『Anal．Biochem.』132巻6頁（1983年）に発表したように、任意プライミングにより³²Ｐで標識した4.1kbのｃＤＮＡの1.2kbの５’ＥｃｏＲ１断片を用いて、M.K．O'Banionらが『J．Virol.』65巻3481頁（1991年）で述べたようにハイブリダイゼーションを行った。2.8kbのヒツジＰＧＨＳｃＤＮＡ（Oxford Biomedical Research社）を同様に標識した断片（1.6kbの５’末端）と、β−チューブリンに相補的な末端標識４０−ｍｅｒ（Oncor）で、もう１度後で膜のハイブリダイゼーションを行った。ＲＮＡ分子量マーカー（SRL）を臭化エチジウム染色で視覚化した。同様の分析を、グアニジニウム酸フェノール抽出法（P．Chomczynskiら：Anal．Biochem.，162；156，1987）で、ヒト単球から分離したtotal ＲＮＡ（５μｇ/lane）についても行った。Ｇ．結果方向をクローンしたｃＤＮＡライブラリーは、４kbのｍＲＮＡに富むショ糖勾配分画由来のλ−ＺＡＰIIで作成され、緊縮性の低い状態下で、2.8kbのＰＧＨＳｃＤＮＡの放射性ラベルをした断片でスクリーニングした。陽性プラークを幾つか分離かつ分析した。長さ約4.1kbのプラークについて、完全にシークエンシングを行った。このクローンは、抗シクロオキシゲナーゼ血清で特異的に沈降する、７０kDaのタンパク質をコード化しており、in vitroで翻訳されたポリＡ−ｍＲＮＡ由来の免疫沈降タンパク質産物と同じ移動をする。配列のｎｔ７５から始まる２０−ｍｅｒを利用したプライマー伸長分析の結果、転写はｃＤＮＡクローンの２４塩基上流で始まることが明らかになった。4.1kbの配列（第１図）を、以前にクローンした2.8kbのマウスＰＧＨＳｃＤＮＡの配列（ヒツジおよびヒト組織からクローンした配列と非常に類似している）と比較した結果、2.8kbのＰＧＨＳｃＤＮＡがコード化するタンパク質と６４％同一のアミノ酸を持つ、１つのオープンリーディングフレーム（読み枠）が明らかになった。推定タンパク質配列は同一直線上にある。ただし、 4.1kbのｃＤＮＡのアミノ末端は短く、カルボキシ末端は長い。完全な配列はGen Bankに寄託してあり、受託番号はＭ８８２４２号である。４つの潜在的なＮ−糖鎖形成部位のうち３つは２分子間で保存され、推定軸状ヘム結合ドメイン周囲の領域（アミノ酸２７３−３４２）、および推定アスピリン修飾セリン⁵¹⁶周囲の領域（アミノ酸５０４−５５０）に特に高い類似性がある。２つのｃＤＮＡにおけるはるかに大きい相違は、4.1kbのｃＤＮＡにある2.1kbの３’非翻訳領域の存在である。この領域は、多くのサイトカインおよびプロトオンコジーンｍＲＮＡの安定性低下に関連のある５’-AUUUA-３’モチーフに富んでいる。このようなモチーフの存在は、シクロヘキシミドによる4.1kbのｍＲＮＡの大きな重複誘発性に一致しているが、これは2.8kbのｍＲＮＡでは認められない。ネズミ2.8および4.1kbのｍＲＮＡをコード化するシクロオキシゲナーゼのｃＤＮＡおよびタンパク質配列を第２図で比較する。ネズミＣ１２７細胞からクローンした4.1kbのｃＤＮＡ構造およびネズミの2.8kbのｃＤＮＡ（D.L．Dewittら：J ．Biol．Chem.，265；5192，（1990））構造を、図の上部および下部に太い直線で示す。4.1kbのｃＤＮＡはプライマー伸長データに基づいて番号を付けてある。2.8kbのマウスｍＲＮＡの５’末端が決定されていないため、翻訳開始部位および終了部位に番号は付けられていない。他のｃＤＮＡクローンから確立されたもう１つのポリアデニル化部位を「Ａ」で示し、５’-AUUUnA-３’モチーフを配列の下に点で明確にした。このモチーフは2.8kbのｃＤＮＡでは認められない。推定タンパク質配列を、ギャップ（4.1kbのｍＲＮＡ産物のアミノ末端の１７ａａおよび2.8kbのｍＲＮＡ産物のカルボキシ末端の１８ａａ）を付け、線で結んで同一直線上に示す。2.8kbのＰＧＨＳの２６番目のアミノ酸（ａａ）リーダー配列を示す。この伸長は正確には判明していないが、１８番目のアミノ酸のＮ末端を持つｇｒｉＰＧＨＳ用の、非相同性の短いリーダー配列が存在するようである。潜在的なＮ糖鎖形成部位（ＮＸＳ／Ｔ，”Ｎ” ）および保存されたアスピリン修飾セリンが、各分子に認められる。各分子中央付近のハッチ領域は、前記DeWittらが提案したように、推定軸状ヘム結合部位（ TIWLREHNRV（SEQ ID NO:7）、２分子間で同一）および遠位ヘム結合部位（KAL GH（SEQ ID NO:8／ROLGH（SEQ ID NO:9））を含む。図中央の配列は、２つのマウスＰＧＨＳタンパク質（非保存Ｎ末端およびＣ末端は省略）の間の類似性を、２０個のアミノ酸グループの同一残基のパーセンテージで示している。配列枠内の斜線の密度が大きくなるにつれて、各々４０〜５５％（斜線なし）、６０〜７５％、８０〜９５％、１００％の同一性を表す。全体の同一性は６４％で、保存的変化を伴う類似性指数は７９％である。例２ヒト単球におけるｇｒｉＰＧＨＳの発現 N.J．Robertsらが『J．Immunol.』121巻1052頁（1978年）で述べたように、健康供与者から分離された粘着ヒト単球を、血清を含まないＭ１９９培地に１×１０⁶ 細胞/ml懸濁させた。５mlポリプコピレン製チューブ中の１mlアリコットを、ゆるい栓を付けて時々振りながら、３７℃の５％ＣＯ₂中でインキュベーションした。第３図Ａに示したオートラジオグラフを得るため、P．Chomczynskiらが前記雑誌で述べた方法でtotal ＲＮＡを分離する前に、デキサメサゾン（１μM；Si gma）の存在下または非存在下で、単球を４時間インキュベーションした。M.K. O'Banionらが『J．Biol．Chem.』34巻23261頁（1991年）で述べたように、１× １０⁹cpm/μｇ以上の比活性まで任意プライミング（Boehringer-Mannheim社のキット）で標識した指定のプローブを用いて、５μｇのＲＮＡにノーザンブロット分析を行った。第３図Ｂに示したオートラジオグラフを得るため、total ＲＮＡを分離する前に、デキサメサゾン（１μM）およびＩＬ−１β（１０半最高単位；Collaborative Research）またはそのどちらか一方で単球を指示された時間処理した。サイトカインまたはホルモンを加える１５分前に、１組のインキュベーションにシクロヘキシミド（２５μM；Sigma）を加えた。第３図に総単球ＲＮＡのノーザンブロットを示す。これは、4.8kbのｍＲＮＡ種がマウスｇｒｉＰＧＨＳ 4.1kbのプローブで検出されることを示している。 β−チューブリンのハイブリダイゼーションシグナル単位当たり、ｇｒｉＰＧＨＳｍＲＮＡ濃度はデキサメサゾンで４時間で下方調節される（本例で５倍）が、2.8kbのＰＧＨＳｍＲＮＡ濃度は影響を受けない。この実験で、４時間のインキュベーション後、上澄み中に蓄積されたＰＧＥ₂濃度は、デキサメサゾンにより１０⁴単球当たり122.5pgから52.5pgに低下した。別の実験で、ＩＬ−１βで処理した単球では、ｇｒｉＰＧＨＳｍＲＮＡ濃度は４時間後（対照の2.5倍）および１２時間後（１４倍）に上昇した（第３図）。デキサメサゾンが存在する時、この上昇は有意に小さかった。さらに、ＩＬ−１βの誘発および豊富なｇｒｉＰＧＨＳｍＲＮＡのデキサメサゾン抑制は、シクロヘキシミドの存在下で生じ、4.8kbのｍＲＮＡの重複誘発が明らかに著明であった（第３図）。これとは対照的に、2.8kbのｍＲＮＡ濃度ば、ＩＬ−１β、デキサメサゾン、シクロヘキシミドの各処理により、β−チューブリンに関して有意な変化はなかった。例３ｇｒｉＰＧＨＳトランスフェクタントを用いた薬剤アッセイＡ．発現ベクターの構築 J.M. Shortらが『Nucleic Acids Res.』16巻7583頁（1988）で述べた方法論に従い、4.1 ｇｒｉＰＧＨＳｃＤＮＡクローンをin vivoで、λ−ＺＡＰ IIベクターおよびアンピシリン平板上で分離したｇｒｉＰＧＨＳ−Bluescript構築から切除した。Acc Ｉでの消化、Klenow補充およびNot Iでの消化により、ｐＲＣ／ＣＭＶ発現ベクター（Invitrogen）への定方向サブクローニング用のｇｒｉＰＧＨＳを生成した。ｃＤＮＡ末端から５０塩基上流のNot I部位からｎｔ１９４７まで伸びるこの断片を、ゲル電気泳動で分離した。そして、これは５’-AUUUA -３’ｍＲＮＡ不安定化領域の直前で切断された完全コード領域を含む。ｐＲＣ／ＣＭＶベクターＤＮＡをまずXba Iで消化し、Klenowを補充し、続いてN ot Iで消化した。さらに、これを子ウシの腸のアルカリホスファターゼで処理した。受容能力を持つＤＨ５α細胞（Library Efficiency；Life Scicnce Technol ogies）への形質転換後、結合させたｐＲｃ／ＣＭＶ−ｇｒｉＰＧＨＳ組換え体をアンピシリン平板から分離し、ＤＮＡミニ標本の制限分析で確認した。構築を第４図に示す。Ｂ．安定した細胞系の樹立およびトランスフェクション６０mm平板の亜集密ＣＯＳＡ２細胞は、自己のシクロオキシゲナーゼをほとんどあるいは全く持たない。これを１または2.5μgの精製ｐＲＣ／ＣＭＶ−ｇｒｉＰＧＨＳ、あるいはベクター単独に、製造元（Life Science Technologies）の指示に従って２３時間のリポフェクション法によりトランスフェクションした。正常培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）で２日間増殖させた後、ＣＯＳ細胞にとって有毒であることがすでに判明している濃度、８００μg/mlのGenetici n（Ｇ４１８、活性成分６５７μg/ml；Life Science Technologies）を含む培地にトランスフェクション細胞を移した。培地は３日毎に交換した。２週間後、組換え体またはベクター単独をトランスフェクションした培地には、多くの独立したコロニーが認められたが、トランスフェクションＤＮＡを含まない培地には認められなかった。３６個のｐＲＣ／ＣＭＶ−ｇｒｉＰＧＨＳトランスフェクションコロニーおよび１２個のベクタートランスフェクションコロニーを、クローニングシリンダーを用いて分離した。これらの大部分は、クローン細胞系増殖中、８００μg/mlのＧ４１８での連続選択でも生存した。樹立された培養は、４００ μg/mlのＧ４１８と共に、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で維持する。Ｃ．薬剤試験プロスタグランジンアッセイを前記とおり行った。薬剤試験については、細胞を無血清ＤＭＥＭ中で様々な濃度の薬剤に３０分間曝露し、ＤＭＥＭ中の２５× 株から直接、アラキドン酸を加えた。１５分後、上澄みを採取した。対照は、最高濃度の賦形剤（１％メタノールまたはエタノール）で処理したウェルおよび薬剤を含まない。各薬剤はSigma社から入手し、２００mM株溶液として（アセトアミノフェンおよびイブプロフェンはメタノールで、インドメタシンはエタノールで、ナプロキセンは水で）調製した。Ｄ．結果１．発現ベクターの選択ｐＲＣ／ＣＭＶ真核生物発現ベクター（第４図）は、我々の目的に明らかに有利な性質を幾つか提供する。細菌宿主でも真核生物宿主でも選択しやすいことに加え、我々のクローン化したｃＤＮＡの発現は強力なＣＭＶプロモーターで生じる。また、このベクターは、ｇｒｉＰＧＨＳ３’非翻訳配列を含まない（翻訳終止コドンから１２塩基対（ｂｐ）で終わる）ために必要であるポリＡシグナルも提供する。急速なｍＲＮＡの分解用のシグナル（５’ -AUUUA-３’）をin vivoで提供するため、これらの配列の除去は重要である。そして、このベクターは、自己のシクコオキシゲナーゼ活性をほとんどあるいは全く持たないＣＯＳ細胞での使用に非常に適している。２．細胞系の特徴づけ３６個のｇｒｉＰＧＨＳ−ｐＲｃ／ＣＭＶクローンネオマイシン抵抗性コロニーおよび１２個のベクター単独クローンネオマイシン抵抗性コロニーのうち、各々２９個および９個のＰＧＥ₂産生について調べた。全例で、ベクター単独トランスフェクタントのＰＧＥ₂産生は、１アッセイ当たり８pg未満であった（数字は、２０μlの収集した培地で１０〜１５分後に分泌されたＰＧＥ₂の量を反映している）。しかし、ｇｒｉＰＧＨＳトランスフェクションクローンは、幅広いプロスタグランジン産生を示した。これらのうち、１１個のプロスタグランジン産生クローンおよび２個のベクター単独含有クローンをさらに増殖させ、再試験を行った。ｇｒｉＰＧＨＳ構造を持つクローンが分泌したＰＧＥ₂の量は、10.6〜72.2pg/ μg細胞タンパク質であった（表３）。表右側の値は、３０μMアラキドン酸に１０分間曝露させた時のプロスタグランジンの分泌量を示し、総回収細胞タンパク質当たりで表してある。細胞系Ａ２およびＡ５はベクターのみを含み、他の細胞系にはｇｒｉＰＧＨＳ−ｐＲｃ／ＣＭＶをトランスフェクションした。ベクターのみを有する細胞以上にＰＧＥ₂産生が上昇しなかった細胞系が、１つだけあった（Ｆ１４；星印２個（＊＊）付き）。 cyropreservation用に各細胞系を増殖させ、培養の簡単さおよび有意なＰＧＥ₂ 産生で、１種類（Ｅ９）の細胞系を選び、これをさらなる研究に使用した。この細胞系のサンプルは、ブダペスト条約の規定の下、American Type Culture Co llection（米国メリーランド州ロックヴィル）に受託番号ＡＴＣＣ１１１１９号で寄託してある。３．ＰＧＥ産生の安定性Ｅ９細胞系でのシクロオキシゲナーゼ活性発現の安定性について、ＰＧＥ₂産生を最低５代の細胞系に渡って比較して調べた。これらの細胞は、６週間後も高濃度のＰＧＥ₂を産生した。タンパク質測定による細胞数の標準化を行わなかった例もあるため、数字を直接比較することはできないが、この標準アッセイでのＥ９細胞系のＰＧＥ₂分泌量は（２０μlアッセイ培地当たり）35〜90pgであった。さらに、実験の範囲内で、Ｅ９細胞系のＰＧＥ₂産生濃度はウェル毎に非常に一定していた。例えば、調べた１２の上澄みで、ＰＧＥ₂濃度は48.4＝3.5pg/20 μｌ（平均±ＳＥＭ）であった。４．薬剤試験我々の細胞系の薬剤試験での有用性を証明するため、Ｅ９細胞の重複ウェルをある範囲の用量（0.2μM〜2mM）の４種類の非ステロイド性抗炎症剤（アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン）に曝露させた。薬剤を含む無血清培地に細胞を３０分間置いた後、（培地に直接加えた）アラキドン酸に１５分間曝露させた。次に、合成されたＰＧＥ₂を、我々の標準ラジオイムノアッセイで上澄みから定量した。結果を第５図に示す。この結果から、各薬剤について特異的な用量反応曲線が明らかになった。ｇｒｉＰＧＨＳ活性に対する作用は、インドメタシンが最も大きく、アセトアミノフェンが最も小さかった。各例における最大阻害（ただし、完全阻害には２mMでも明らかに不十分であったアセトアミノフェンは除く）は、ベクターのみを有するＣＯＳ細胞（３〜８ pg）でみられた阻害と同じであった。低用量の各薬剤は、未処理対照の値（平均 48.4pg）に相当するレベルを示した。対照では、１％賦形剤（メタノールまたはエタノール；２mM薬剤条件での曝露に匹敵する）の有無によるＰＧＥ₂産生の違いはなかった。例４小胞体抽出物の生成およびin vitroでのシクロオキシゲナーゼ活性試験小胞体抽出物の生成および細胞シクロオキシゲナーゼ活性の測定は、基本的に A．Razらが『J．Biol．Chem.』263巻3022頁（1989年）および『PNAS USA』86巻1 657頁（1989年）に述べたとおりに行った。細胞を氷冷ＰＢＳ（ｐＨ＝7.4）で１回すすぎ、使い捨てのプラスチック製スクレーパー（Gibco）でディッシュから剥がし、1.5ml滅菌チューブに氷冷ＰＢＳと共に入れ、遠心分離（８００×gで８分間）によりペレット状にする。上澄みを除去し、細胞ペレットをＰＢＳですすぐ。この時点で、細胞ペレットは−７０℃で保存可能である。抽出物を得るため、ペレットを可溶化緩衝液（５０mM Tris、１mMジエチルジチオカルバミド酸（ナトリウム塩）、１０mMＥＤＴＡ、１％（v/v）ツウィーン２０、0.2mg/mlα₂−マクログロブリン（ｐＨ＝８．０））に再び懸濁した後、音波処理（５×１０秒バースト、低出力設定）を行う。抽出物を４℃で遠心分離（１６，０００×gで２０分間）で清浄化する。タンパク質測定用にアリコットを取り、１００mM塩化ナトリウム、２０mMホウ酸ナトリウム、1.5mMＥＤＴＡ、1 .5mMＥＧＴＡ、0.3mMＰＭＳＦ、１０mMＮＥＭ、0.5％ＢＳＡ、0.5％TritonＸ−1 00、１mMエピネフリンおよび１mMフェノール（ｐＨ9.0）を含む溶液で、５０μlアリコットを５００μlに希釈する。前記緩衝液中のアラキドン酸を１００μMの小胞体抽出物に加えて反応させ、３７℃で３０分間インキュベーションする。その結果生じたＰＧＥ₂を、ＲＩＡキット製造元（Amersham社）の指示どおリメチルオキメート型に定量変換した後、ＲＩＡで測定する。非ステロイド性抗炎症化合物の効果を調べるため、アラキドン酸との反応の５分前に、薬剤を様々な用量で加える。例５ヒトＰＧＨＳ−１およびヒトＰＧＨＳ−２ｃＤＮＡクローンの生成ＲＮＡは、血清およびシクロオキシゲナーゼで４時間処理したヒト線維芽細胞系（Ｗ１３８）から分離した。total ＲＮＡは、グアニジニウム溶解の後、塩化セシウムクッション遠心分離により分離した（J.M. Chirgwinら：Biochem.，18 ；5294，1977）。ヒトＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２に特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを生成し、１転写または他のコード領域を増幅させた（表４）。続いて行うクローニング用に、５’末端プライマーにはＨｉｎｄ制限部位が、３’末端プライマーにはＮｏｔＩ制限部位がある。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、E.S. Kawasakiが『PCR Protocols：A Guid e to Methods and Applications』（M.A. Innisら編集、Academic Press、ニューヨーク、1990年）で述べているとおり、２kbの特異的プライマー生成ＰＣＲ産物を用いて行った。例６配列決定およびトランスフェクション用プラスミド構築の生成Ｈｉｎｄ IIIおよびＮｏｔＩでの消化および精製の後、２つのＰＣＲ産物をｐＲＣ／ＣＭＶベクター（Invitrogen社）に各々結合させた（第４図参照）。受容能力を持つＤＨ５ａ細胞（BRL）への形質転換後、結合させたｐＲＣ／ＣＭＶ−ＰＧＨＳ組換えプラスミドを、アンピシリン平板から分離した。制限地図生成により、ＰＧＨＳ挿入の有無についてクローンをスクリーニングした。３つのＰＧＨＳ−２クローンについて、Applied Biosystems製自動シークエンサー（Model＃３７３Ａ）で両方向にシークエンシングを行った。トランスフェクションには、第６図に示したＰＧＨＳ−２遺伝子配列から成るクローンを選択した。HlaおよびNeilsonが『PNAS』89巻7384頁（1992）で発表したように、この配列はヒトＰＧＨＳ−２配列とは異なる。ＰＧＨＳ−２遺伝子産物の１６５番目のアミノ酸が、グリシン（ｗ）ではなくグルタミン酸（Ｅ）である（第７図）。ＰＧＨＳ−２遺伝子配列は、別のＰＣＲ法から得られた他の２つのｈＰＧＨＳ− ２クローンの配列の同一性を確立することで確認した。その結果、観察された相違はＰＣＲアーチファクトではないことが判明している。さらに、第１図に示すように、マウスＰＧＨＳ−２も同じ位置にグルタミン酸を持っている。ＰＧＨＳ −１クローンを同様にスクリーニングし、ＰＧＨＳ−１遺伝子配列および酵素が、C. Tokoyamaらが『Biochem. Biophys. Res. Commun.』165巻888頁（1989年）に発表し、第２図に示したもの（SEQ IDNO：６）と同一であることが確認された。T. Hlaの『Prostaglandins』32巻829頁（1986年）も参照のこと。例７安定トランスフェクション哺乳類細胞系の生成６０mm平板の５０％集密ＣＯＳ−Ａ２（サル）細胞には、シクロオキシゲナーゼ活性がほとんどまたは全くない。これに１〜2.5μgの精製ｐＲＣ／ＣＭＶ；ｈＰＧＨＳ−２プラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ；ｈＰＧＨＳ−２プラスミド、あるいはｐＲＣ／ＣＭＶベクター単独を、リン酸カルシウム沈降法（Chenら：Mol. Cel l. Biol.，７；2745，（1987））でトランスフェクションした。３５℃、３％ＣＯ₂で２４時間、平板を正常培地（ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＤ）＋１０％ウシ胎児血清）でインキュベーションした。暖めたＤＭＥＭで２回すすいだ後、平板を３７℃、５％ＣＯ₂中に移し、さらに２４時間インキュベーションした。続いて、ＣＯＳ細胞にとって有毒な濃度に相当する８００μgのGeneticin （active component G418，657μg/ml，Life Science Technologies）を含む正常培地で、選択を開始した。３日毎に培地を交換した。２週間後、組換えＰＧＨＳベクターまたはベクターのみをトランスフェクションしたディッシュに、多くの独立したコロニーが認められた。しかし、トランスフェクションＤＮＡを含まないディッシュには、コロニーは認められなかった。各トランスフェクションから１２〜２４個のコロニーを、クローニングシリンダーで分離した。これらの大部分は、クローン細胞系の増殖中、連続Ｇ４１８選択でも存在し続けた。樹立された培養は、４００μg/mlのＧ４１８と共に、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で維持する。例８Ｇ４１８抵抗性細胞系試験およびＰＧＨＳ−２活性とＰＧＨＳ−１活性の安定発現１２穴のプレートに置いたトランスフェクションＣＯＳ細胞をほぼ集密になるまで増殖させ、暖めた無血清培地で２回すすいだ後、３００μlの３０μMアラキドン酸（ナトリウム塩；Sigma）で被った。１５分後、上澄みを氷上のEppendorf チューブに入れて、１５，０００×gで２分間遠心分離し、メチルオキシメート型に変換後、イムノアッセイでＰＧＥ₂産生を調べた（Amersham社のキット）。 BioRadの薬品を用いてタンパク質濃度を測定するため（Bradford変法アッセイ）、細胞単層を0.5M水酸化ナトリウムで可溶化し、１M塩酸で中和した。ＰＧＨＳ活性を発現する細胞系をさらに増殖させ、１０％ＤＭＳＯを加えた培地で凍結させた。ＰＧＨＳ−２を発現する細胞系４Ｂ４およびＰＧＨＳ−１を発現する細胞系Ｈ１７Ａ５を、１９９３年３月５日にAmerican Type Culture Collection（米国メリーランド州ロックヴィル）に寄託した（細胞系４Ｂ４はＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１２８４号、細胞系Ｈ１７Ａ５はＡＴＣＣＣＲＬ１１２８３号とした）。安定トランスフェクション細胞系でのＰＧＨＳ発現レベルは、表５のデータに示すように、ＰＧＨＳ−１細胞系のほうがＰＧＨＳ−２細胞系よりもはるかに高かった。数カ月の培養後も、これらの細胞系は高いレベルのＰＧＨＳ発現を続けている。例えば、細胞系４Ｂ４を５カ月に渡って６回調べた結果、発現は５０〜６０pg PGE₂/μg細胞タンパク質である。細胞系のＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２の排他的存在は、Northern analysesにより、ＰＧＨＳ−１またはＰＧＨＳ−２に特異的なハイブリッド形成プローブを使って確認された。例９安定ヒトＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２細胞系に対する非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）の研究ＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２細胞系（４Ｂ４とＨ１７Ａ５を含む）を、血清を含まないＤＭＥＭ中で様々な濃度のＮＳＡＩＤに３０分間さらした。ＤＭＥＭ中の２５ｘストックから直接アラキドン酸を加え、１５分後に上澄み液を採取した。対照は、薬剤処理なしのものと、最高濃度の賦形剤（１％メタノールまたはエタノール）で処理した細胞とからなるものとした。薬剤はSigma Chem.社から入手し、２００mM株溶液として（アスピリンおよびイブプロフェンはメタノールで、インドメタシンはエタノールで、ナプロキセンは水で）調製した。シクロオキシゲナーゼ活性は前記方法で測定した。用量反応曲線は薬剤間で明らかに異なっており、ＰＧＨＳ−１およびＰＧＨＳ−２に各々特徴的であった。特に第８図および第９図に示したインドメタシンおよびアスピリンのように、阻害に必要な薬剤濃度はＰＧＨＳ−１発現細胞およびＰＧＨＳ−２発現細胞間で異なっていた（第８図および第９図）。本発明は、構成および炎症性シクロオキシゲナーゼの両方に対する薬剤作用のスクリーニング用に、簡単なin vitroシステムを提供する。これは、構成プロスタグランジン産生阻害による副作用を引き起こさずに、選択的に炎症を阻害する薬剤の開発に有用だろう。生きている哺乳類細胞（体内の血清薬剤濃度の作用に近い）に、または培養した細胞系から生成した小胞体抽出物に、本アッセイを行える。小胞体抽出物を用いた研究は、薬剤と酵素との直接的な相互作用のさらに正確な測定を可能にする。すべての出版物、特許および特許出版は、あたかも参考文献が各々を特異的かつ独立的に組み入れているように、参照により文献として本文である程度組み入れてある。付属の請求の範囲の意図または範囲からはずれることなく、本発明で多くの変形および変更が可能であることは、当業者には明らかであろう。配列リスト（１）一般情報（ｉ）出願人：ドナルド・エイ・ヤングエム・ケリー・オーバニオンヴァージニア・ディー・ウィン（ii）発明の名称調節性炎症性シクロオキシゲナーゼを発現する安定に形質転換された哺乳動物細胞（iii）配列数：１３（iv）連絡用住所（Ａ）宛名人：マーチャント・アンド・グールド（Ｂ）街区：ノーウェスト・センター３１００（Ｃ）市：ミネアポリス市（Ｄ）州：ミネソタ州（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：５５４０２（ｖ）コンピュータ可読形式（Ａ）媒体タイプ：フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎリリース＃１．０、バージョン＃１．２５（vi）現出願データ（Ａ）出願番号（Ｂ）出願日（Ｃ）分類（viii）弁理士／代理人情報（Ａ）氏名：ウォレン・ディー・ウェスナー（Ｂ）登録番号：３０，４４０（Ｃ）参照／整理番号：９８４０．２０−ＵＳ−０１（ix）通信情報（Ａ）電話：６１２−３３２−５３００（Ｂ）テレファックス：６１２−３３２−９０８１（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：１２００塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ＭｕｒｉｎｅｇｒｉＰＧＨＳ（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：アミノ酸６０４個（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：蛋白（vi）採取源（Ａ）対象生物：ＭｕｒｉｎｅｇｒｉＰＧＨＳのアミノ酸配列（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：２（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：１８３４塩基対（Ｂ）タィプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：３（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：アミノ酸６０４個（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：蛋白（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２のアミノ酸配列（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：４（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：アミノ酸６０４個（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：蛋白（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２のアミノ酸配列（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：５（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：１８１９塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−１遺伝子（ix）特徴（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ（Ｂ）場所：８．．１８０４（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：６（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：アミノ酸１０個（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ペプチド（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：７（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：アミノ酸５個（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ペプチド（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：８（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：９に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：アミノ酸５個（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ペプチド（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：９（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：２８塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−１ＰＣＲプライマー（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：２８塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−１ＰＣＲプライマー（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：２９塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２ＰＣＲプライマー（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ：２９塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：一本（Ｄ）形状：直線（ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ（vi）採取源（Ａ）対象生物：ヒトＰＧＨＳ−２ＰＣＲプライマー（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/88 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号０８／０３４，１４３ (32)優先日 1993年３月22日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／０５４，３６４ (32)優先日 1993年４月28日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウイン、バージニア・ディーアメリカ合衆国 14620 ニューヨーク、ロチェスター、ローリー・ストリート 139

Claims

【特許請求の範囲】１．染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しないことを特徴とする、形質転換哺乳類細胞系。２．霊長類の細胞系である、請求の範囲第１項に記載の細胞系。３．ネズミの細胞系である、請求の範囲第１項に記載の細胞系。４．ヒトの細胞系である、請求の範囲第１項に記載の細胞系。５．組換えＤＮＡ配列がプロモーターをも含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の細胞系。６．組換えＤＮＡ配列が選択標識遺伝子もしくはレポーター遺伝子をも含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の細胞系。７．プラスミドベクター中、ウイルス発現ベクター中、もしくは分離されたＤＮＡ配列として、前記組換えＤＮＡを有する哺乳類細胞系のトランスフェクションによって形質転換哺乳類細胞系が産生されることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の細胞系。８．組換えＤＮＡ配列がヒトＰＧＨＳ−２を発現することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の細胞系。９．組換えＤＮＡ配列がネズミＰＧＨＳ−２を発現することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の細胞系。１０．ＡＴＣＣ１１１１９の識別特徴を有する形質転換霊長類細胞系。１１．ＡＴＣＣＣＲＬ１１２８４の識別特徴を有する形質転換霊長類細胞系。１２．染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−２を発現せず、前記細胞系が自己のＰＧＨＳ−２もしくはＰＧＨＳ−１活性を発現しないことを特徴とする、形質転換哺乳類細胞系。１３．霊長類の細胞系である、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。１４．ネズミの細胞系である、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。１５．ヒトの細胞系である、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。１６．組換えＤＮＡ配列がプロモーターをも含むことを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。１７．組換えＤＮＡ配列が選択標識遺伝子もしくはレポーター遺伝子をも含むことを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。１８．プラスミドベクター中、ウイルス発現ベクター中、もしくは分離されたＤＮＡ配列として、前記組換えＤＮＡを有する哺乳類細胞系のトランスフェクションによって形質転換哺乳類細胞系が産生されることを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。１９．哺乳類ＰＧＨＳ−１がヒトＰＧＨＳ−１であることを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の細胞系。２０．ＡＴＣＣＣＲＬ１１２８３の識別特徴を有する霊長類細胞系。２１．哺乳類細胞内でＰＧＨＳ−２が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を判定する方法であって、（ａ）予め選択した量の前記化合物を、細胞系が染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、そのＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡがＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、培地中の形質転換哺乳類細胞系に加える段階と、（ｂ）前記培地にアラキドン酸を加える段階と、（ｃ）前記細胞系が合成したＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する段階と、（ｄ）前記濃度を、前記化合物の非存在下で前記細胞系が合成した前記代謝産物の濃度と比較する段階とを含む方法。２２．代謝産物がプロスタグランジンであることを特徴とする、請求の範囲第２１項に記載の方法。２３．哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする、請求の範囲第２１項に記載の方法。２４．ＰＧＨＳ−２が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を判定する方法であって、（ａ）染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、形質転換哺乳類細胞系の小胞体抽出物を調製する段階と、（ｂ）小胞体抽出物の一部分と予め選択した量の前記化合物とを含む、緩衝水性混合液を形成する段階と、（ｃ）前記混合液にアラキドン酸を加える段階と、（ｄ）前記混合液中で合成された、ＰＧＨＳ媒介アラキドン酸代謝産物の量を測定する段階と、（ｅ）前記量を、アラキドン酸は存在するが前記化合物は存在しない条件の下で、前記小胞体抽出物の第二の部分が合成した前記代謝産物の量と比較する段階とを含む方法。２５．前記代謝産物がプロスタグランジンであることを特徴とする、請求の範囲第２４項に記載の方法。２６．前記哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする、請求の範囲第２４項に記載の方法。２７．哺乳類細胞内でＰＧＨＳ−２もしくはＰＧＨＳ−１が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を測定する方法であって、（ａ）予め選択した量の第１の前記化合物を、細胞系が染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、前記細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、培地中の第１の形質転換哺乳類細胞系に加える段階と、（ｂ）前記培地にアラキドン酸を加える段階と、（ｃ）前記第１の細胞系が合成した、ＰＧＨＳ媒介アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する段階と、（ｄ）前記濃度を、前記化合物の非存在下で前記第１の細胞系が合成した、前記代謝産物の濃度と比較する段階と、（ｅ）予め選択した量の第２の前記化合物を、細胞系が染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現し、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現せず、前記細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、培地中の第２の形質転換哺乳類細胞系に加える段階と、（ｆ）前記培地にアラキドン酸を加える段階と、（ｇ）前記第２の細胞系が合成した、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の濃度を測定する段階と、（ｈ）前記濃度を、前記化合物の非存在下で前記第２の細胞系が合成した、前記代謝産物の濃度と比較する段階とを含む方法。２８．段階（ａ）において、哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする、請求の範囲第２７項に記載の方法。２９．段階（ｅ）において、哺乳類ＰＧＨＳ−１がヒトＰＧＨＳ−１であることを特徴とする、請求の範囲第２７項に記載の方法。３０．段階（ｃ）および（ｇ）において、代謝産物がプロスタグランジンであることを特徴とする、請求の範囲第２７項に記載の方法。３１．段階（ａ）および（ｅ）において、形質転換哺乳類細胞系が霊長類の細胞系であることを特徴とする、請求の範囲第２７項に記載の方法。３２．ＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２が触媒するプロスタグランジン合成に対する、化合物の阻害力を測定する方法であって、（ａ）染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現し、前記ＤＮＡ配列がＰＧＨＳ−１を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−１もしくはＰＧＨＳ−２活性を発現しない、第１の形質転換哺乳類細胞系の第１の小胞体抽出物を調製する段階と、（ｂ）第１の小胞体抽出物の一部分と予め選択した量の第１の化合物とを含む第１の緩衝水性混合液を形成する段階と、（ｃ）前記第１の混合液にアラキドン酸を加える段階と、（ｄ）前記第１の混合液中で合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の量を測定する段階と、（ｅ）前記量を、アラキドン酸は存在するが前記化合物は存在しない条件の下で、前記小胞体抽出物の第二の部分が合成した前記代謝産物の量と比較する段階と、（ｆ）染色体に組み込んだ組換えＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−１を発現し、前記ＤＮＡ配列が哺乳類ＰＧＨＳ−２を発現せず、細胞系が自己のＰＧＨＳ−２もしくはＰＧＨＳ−１活性を発現しない、第２の形質転換哺乳類細胞系の小胞体抽出物を調製する段階と、（ｇ）段階（ｆ）の小胞体抽出物の一部分と予め選択した量の第２の前記化合物とを含む、第二の緩衝水性混合液を形成する段階と、（ｈ）段階（ｇ）に前記混合液にアラキドン酸を加える段階と、（ｉ）段階（ｇ）に前記混合液中で合成された、ＰＧＨＳ媒介性アラキドン酸代謝産物の量を測定する段階と、（ｊ）前記量を、アラキドン酸は存在するが前記化合物は存在しない条件の下で、段階（ｆ）の前記小胞体抽出物の第二の部分が合成した前記代謝産物の量と比較する段階とを含む方法。３３．段階（ａ）において、哺乳類ＰＧＨＳ−２がヒトＰＧＨＳ−２であることを特徴とする、請求の範囲第３２項に記載の方法。３４．段階（ｆ）において、哺乳類ＰＧＨＳ−１がヒトＰＧＨＳ−１であることを特徴とする、請求の範囲第３２項に記載の方法。３５．段階（ｄ）および（ｉ）において、代謝産物がプロスタグランジンであることを特徴とする、請求の範囲第３２項に記載の方法。３６．段階（ａ）および（ｆ）において、形質転換哺乳類細胞系が霊長類の細胞系であることを特徴とする、請求の範囲第３２項に記載の方法。３７．ヒトＰＧＨＳ−２をコード化する単離ＤＮＡ配列。３８．SEQ ID No.3に一致するヒトＰＧＨＳ−２をコード化する単離ＤＮＡ配列。３９．単離ヒトＰＧＨＳ−２。４０．SEQ ID No.4に一致するアミノ酸配列を有する単離ヒトＰＧＨＳ−２。