JPH08501456A

JPH08501456A - ホルモン非依存性乳癌細胞特異的タンパク質のマンマモジュリン

Info

Publication number: JPH08501456A
Application number: JP7503781A
Authority: JP
Inventors: エッペンベルガー，ウルス; キュング，ヴィリ; ランゲン，ハノ; シュレガー，エルンスト−ユルゲン; ヴェヤー，カール
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1993-07-06
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1996-02-20
Also published as: ZA944687B; NZ268592A; AU7185894A; RU95116901A; EP0659212A1; WO1995002052A1; CN1111910A; CA2141417A1

Abstract

(57)【要約】ホルモン非依存性乳癌細胞により発現される新規な52〜55 KDaタンパク質のマンマモジュリン（ＭＭ）は、ホルモン依存性乳癌細胞の形態、運動性、増殖およびホルモン受容体発現に影響を及ぼすことがわかった。ＭＭが例えば腫瘍生検材料に存在することは診断上の重要な指標となる。ＭＭに対するＭＡｂやＭＭアンタゴニストのような、ＭＭ活性の阻害剤は乳癌の治療および制御に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】ホルモン非依存性乳癌細胞特異的タンパク質のマンマモジュリン本発明は、自然界でこれまでに存在することが知られていなかった新規な因子で、ホルモン依存性癌細胞の形態、増殖およびホルモン受容体発現に影響を及ぼすホルモン非依存性ヒト乳癌細胞によって産生されるマンマモジュリン（mammam odulin）に関する。より詳細には、本発明は、精製された形のマンマモジュリンに関し、すなわち、自然界でそれと結合している化合物を少なくとも部分的に含まず、例えば少なくとも一部のアミノ酸配列の決定が可能となる程度にまで高度精製されたものに関する。マンマモジュリンの生産ならびに精製方法を記載し、また、この因子の発見により可能となった診断および治療方法にも関係する。ヒト乳癌の増殖は内分泌、オートクリンおよびパラクリンからのホルモンおよび増殖因子によって支配される複雑な過程である。乳癌の重要な性質はそのホルモン依存性にあり、特にエストロゲンに依存する。このホルモン依存性はしばしば癌が進行するにつれて失われ、内分泌治療を無効にし、さらには癌による攻撃的挙動と密接な関係を有する。乳癌が一旦ホルモン非依存性病期に入ると、乳癌患者の予後は極端に悪くなる。今回、マンマモジュリン（ＭＭ）と命名された、以前には知られていなかった因子がホルモン非依存性乳癌細胞によって産生されることが見いだされた。この因子はあまり攻撃的でないホルモン依存性癌細胞を剌激して一層速やかに増殖させ、一方でホルモン受容体の発現をダウンモジュレーションする。ＭＭは癌の進行過程でホルモン依存性からホルモン非依存性への表現型変換に中心的役割を果たしていると考えられる。この因子が初めて同定され、単離され、そして精製された。実質的に純粋なＭＭを利用できることは、乳癌の処置におけるさまざまな診断および治療戦略を可能にするものである。例えば、ＭＭレベルをアッセイすることにより、乳癌の病期と重症度を決定するための診断上の指標として使用することができる。ＭＭの細胞活性化特性を抑制することが観察された物質、ならびにＭＭに対するモノクローナル抗体または他のＭＭ結合剤は、ホルモン依存性細胞のＭＭ剌激をブロックすることにより、癌を安定化して癌増殖の攻撃的なホルモン非依存性病期へ進行するのを防止する治療薬として使用することができる。最後に、ＭＭ類似体はホルモン依存性細胞上のＭＭ受容体をブロックするために治療上用いることもできる。ＭＭは、高度精製調製物を10〜15％勾配ゲルのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定したところ、約52〜55キロダルトンの見かけ分子量を有するタンパク質である。ＭＭは次の部分アミノ酸配列： Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr （配列番号：１）、 Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys （配列番号：２）および X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu （配列番号：３）を含み、ここで“Ｘ”は未同定アミノ酸残基を表す。このタンパク質は全体として、生物学的活性が保持されるという条件で、全アミノ酸配列の10％まで（好ましくは５％以下）を占める残基の付加、欠失、挿入または置換を含む対立遺伝子変異を含み得ると考えられる。また、このタンパク質は種々の翻訳後修飾、例えばグリコシル化やシステイン橋の形成を含むこともできる。さらに、ＭＭは熱や酸に不安定で、トリプシンおよびメルカプトエタノールに感受性で、他のタンパク質との不均一凝集物を容易に形成する点に特徴がある。ＭＭは、本明細書中の実施例に記載したように、速やかに増殖するホルモン非依存性癌細胞の細胞培養物から抽出し、見かけ上均質になるまで精製することができる。また、ＭＭを得るにあたっては、アミノ酸配列情報を使って産生細胞系由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーンし、ＭＭ遺伝子のｃＤＮＡを得てもよい。その後、この遺伝子をクローン化し、適当な原核または真核細胞系内で発現させるために適当なベクターに導入する。精製したＭＭを抗原として用いて、通常の方法でポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生産することもできる。抗体、とりわけモノクローナル抗体は（ｉ）ＭＭをブロックし、ＭＭがホルモン依存性細胞を剌激するのを防止する治療薬として、および（ii）乳癌の生検材料においてＭＭの存在を検出することにより、癌の進行期および予後に関する有用な診断情報を得るためのアッセイ〔例えば、バイオアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、ウエスタンブロットアッセイ、およびＥＬＩＳＡ〕において、有用である。また、精製ＭＭは、ＭＭに対して親和性を有する化合物をスクリーンして同定するための結合アッセイや、ホルモン依存性細胞上のＭＭ受容体に対して親和性を有する化合物をスクリーンして同定するための競合アッセイにおいて使用することができる。この種の化合物はＭＭの生物学的活性を阻害する点で有用である。さらに、癌細胞、特に乳癌細胞、例えばホルモン非依存性乳癌細胞によるＭＭの発現を阻害し、そして／または癌細胞、特に乳癌細胞、例えばホルモン非依存性乳癌細胞上のマンマモジュリン受容体に対して親和性を有する化合物は新規で、有用である。ＭＭの強力な阻害剤であることが知られている唯一の化合物はヘパリンである。実施例１ホルモン非依存性細胞培養物からのＭＭ含有調整培地の調製ヒト乳癌細胞系MDA-MB-231を５％ウシ胎児血清を補給したＨＬ培地で増殖させた。最適化ＨＬ培地は、ヨーロッパ特許出願公開第417563号に記載されるような、ヒト白血病細胞系ＨＬ60のために開発されたものである。細胞を５％ＣＯ₂− 均衡空気および96％水飽和のもとでＴフラスコ内で約22〜24時間の倍加時間にて付着様式で増殖させた。集密状態に達したら、増殖培地を無血清ＨＬ培地に取り替えた。マンマモジュリン（ＭＭ）は増殖中ばかりでなく非増殖集密状態でも培地中に放出される。ＭＭ生産のスケールアップのために、多少改良した23Ｌのエアリフト型発酵槽（Chemap AG，スイス）を使用した。ドラフトチューブの外側容積に8.5kgのラッシヒリング（Raschig ring，８ｘ８ｘ５mm，ストーンウェア）と10個のシラフ（ Siraf）25リング（25ｘ25ｘ2mm，多孔質ガラスラッシヒリング，Schott，ドイツ）を充填し、約2 0ｍ²の利用可能な表面積を得た。発酵槽に２セルファクトリーユニット（Nunc， 6000cm²/ユニット）からトリプシン処理 MDA-MB-231細胞を接種した。15日の増殖期間中、培地の交換を２回行った。エアリフト型発酵槽に１標準リットル／分の空気を通気し、溶存酸素含量（30％）、ｐＨ（7.2）および温度（37℃）を連続的にモニターした。使用済みのＭＭ含有培地は、17〜18Ｌの無血清強化ＨＬ培地（グルコースを５ｇから7.5ｇへ、グルタミンを５mMから6.5mMへ、プリマトンＲＬを0.25％から0. 3％へ強化）を毎日変えることによって集めた。記載されるように（Schumpp B.a ndSchlaeger E.J.,J.Cell.Sci.97:639-647［1990］）、グルコースとグルタミンの消費および乳酸とアンモニアの生成を測定することによって全発酵過程での細胞の代謝状態をモニターした。ＭＭの力価は生産の間中一定していた。ＭＭを含有する無細胞発酵槽容量は、２本のSlOYlOらせん巻きカートリッジ（ 1.8m²の膜面積、ＭＷカットオフ 10 kDa）を備えたアミコン SP20 限外濾過装置（Amicon，スイス）を使って（100Ｌから5.5Ｌへ）20倍に濃縮した。ＭＭ含有濃縮液を−80℃で凍結させた。実施例２４クロマトグラフ工程によるMDA-MB-231細胞の上清からのＭＭの部分純化への精製特に記載しないかぎり、全操作を室温で行った。精製実験の画分は280 nmでの吸光度の測定により、Laemmli, U.K., Nature227, 680-685（197 0）に従って還元したSDS-PAGEにより、さらに実施例６に記載した生物学的活性についてのアッセイにより同定した。 5.5 Ｌの凍結した濃縮上清（実施例１に記載のごとく調製したもの、もとの上清の100 Ｌに相当する）を解凍し、3000ｇで15分（４℃）遠心した。容量mlを掛けた１cm路長で280 nmでの上清の吸光度（＝ＯＤ₂₈₀）は35000 であった。アッセイにおける全活性は5.8×10⁶Ｕ（100％）で、比活性は165 Ｕ／ＯＤ₂₈₀であった。次に、上清を12Ｌの緩衝液Ａ：８Ｍ尿素 0.3mM ３-｛（３-コラミドプロピル）- ジメチルアンモニオ｝- １-プロパンスルホネート（CHAPS） 30mM トリス/HCl ｐＨ 7.5 および1.7 Ｌの蒸留水で希釈した。この溶液をその後Ｑ−セファロースＦＦカラム（Pharmacia,Dubendorf，スイス）にかけた。カラム（1.2Ｌ，４〜８℃）を予め緩衝液Ｂ：６Ｍ尿素 0.2mM CHAPS 20mM トリス/HCl ｐＨ 7.5 で平衡化しておいた。カラムを１カラム容量の緩衝液Ａで洗い、次に100％緩衝液Ｂから40％緩衝液Ｂと60％緩衝液Ｃ：６Ｍ尿素 0.2mM CHAPS 20mM トリス/HCl 500mM NaCl ｐＨ 7.5 までの直線勾配を用いて７時間36分で溶出（10ml／分，室温）した。30〜50％の緩衝液Ｃ（1550 ml）で溶出した画分は2630ＯＤ₂₈₀、7.5×10⁶Ｕ（130％）を含み、比活性は2852Ｕ／ＯＤ₂₈₀ であった。クロマトグラムを図１に示す。画分をプールし、４つのPTGCカセット（Millipore,Volketswil，スイス）を備えたミリポアミニタンシステム（Millipore Minitan System）により210 mlまで濃縮（４〜８℃）した。この濃縮液を緩衝液Ｄ：１mM N-ドデシル-N，N-ジメチル-３-アンモニオ- プロパンスルホネート（Zwittergent 3-12） 50μM エチレングリコール-ビス（β- アミノエチルエーテル） N,N,N',N'-四酢酸（EGTA） 50mM トリス/HCl 150mM NaCl 0.02% NaN₃ ｐＨ 7.6 で１：15に希釈し、3150 mlの容量とした。これを緩衝液Ｄで前もって平衡化しておいたヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ Pharmacia，４〜８℃）の80 mlカラムにかけた。このカラムを24カラム容量の緩衝液Ｄで洗い、次に100％緩衝液Ｄから100％緩衝液Ｅ：１mM Zwittergent 3-12 50μM EGTA 50mM トリス/HCl 1350mM NaCl 0.02% NaN₃ ｐＨ 7.6 までの直線勾配により溶出（３ml／分，室温）した。39〜64％の緩衝液Ｅ（240 ml）で溶出した画分は19.1ＯＤ₂₈₀、7.7×10⁶Ｕ（134％）を含み、比活性は403 000 Ｕ／ＯＤ₂₈₀であった（クロマトグラムについては図２を参照のこと）。画分をプールし、YM10メンブラン（Amicon,Zurich,スイス）を備えた400 mlアミコン攪拌セルを使って80 mlまで濃縮（４〜８℃）した。80ml の緩衝液Ｆ：６Ｍ塩酸グアニジン 2.5mM Zwittergent 3-12 50μM EGTA 50mM トリス/HCl ｐＨ 7.5 を加え、濃縮／希釈の手順を３回繰り返した。最後に、溶液を濃縮して2.6 mlとした。この容量をスーパーデックス（Superdex）200カラム（Pharmacia, 1.6×6 0, 120 ml, 1ml／分）にかけた。このカラムは予め緩衝液Ｆで平衡化しておいた。47〜63％のカラム容量（20 ml）で溶出する画分は3.8 ＯＤ₂₈₀、４×10⁶ Ｕ（69％）を含み、比活性は1,050,000 Ｕ／ＯＤ₂₈₀であった（クロマトグラムについては図３を参照のこと）。画分をプールし、YM10メンブランを備えた50 mlアミコン攪拌セルを使って５mlまで濃縮し、これを５mlの緩衝液Ｇ：６Ｍ尿素 0.3mM Zwittergent 3-12 20mM トリス/HCl ｐＨ 7.5 で希釈した。濃縮／希釈を１回繰り返し、溶液を1.6 mlに濃縮し、その後１：30 に希釈して最終容量を48 mlとした。この容量を緩衝液Ｇで予め平衡化しておいたMono Sカラム（１ml，Pharmacia）にかけた。このカラムを12カラム容量の緩衝液Ｇで洗い、次に100％緩衝液Ｇから100％緩衝液Ｈ：６Ｍ尿素 0.3mM Zwittergent 3-12 20mM トリス/HCl 500mM NaCl ｐＨ 7.5 までの直線勾配で溶出（0.5 ml／分）した。36〜56％の緩衝液Ｈで溶出する画分は0.27ＯＤ₂₈₀、4.4×10⁶ Ｕを含み、比活性は16,000,000Ｕ／ＯＤ₂₈₀ であった（クロマトグラムについては図４を参照のこと）。活性に基づいた総収率は76 ％で、精製倍率は97000であった。図５はSDS-PAGEにより調べた画分のタンパク質組成を示す。生物学的活性は、クーマシー 250で染色した12.5 ％ＴのSDS-PAGE（還元型）により分析したとき、41〜45 kDの分子量を示すタンパク質バンドの強度と相関していた。画分の一部をさらに精製した（実施例４を参照のこと）。実施例３Ａ）５クロマトグラフ工程によるMDA-MB-231細胞の上清からのＭＭの高純度への精製実施例２に記載した実験と同様にして、130 Ｌの上清からＭＭを精製した。実施例２と相違する点として、Ｑ−セファロースの通り抜け画分中により多くのＭＭが存在したため、通り抜け画分を用いてこのクロマトグラフィーを繰り返した。ヘパリン−セファロースおよびスーパーデックス200によるクロマトグラフィーも２回ずつ行った。Mono Sクロマトグラフィーの勾配を次のように改良した： 48分で０％緩衝液Ｈから40％緩衝液Ｈへ 120分で40％緩衝液Ｈから60％緩衝液Ｈへ 46分で60％緩衝液Ｈから100％緩衝液Ｈへ 42〜45.5％の緩衝液Ｈで溶出した画分は0.61ＯＤ₂₈₀、4.1×10⁶Ｕを含み、比活性は6.70×10⁶ Ｕ／ＯＤ₂₈₀であった。更なる精製のために、これらの画分をYM10メンブランを備えた10 mlアミコン攪拌セルを使って濃縮した。容量を11 mlから0.7 mlに減少させた。2.5 mlの緩衝液Ｆを加え、容量を0.7 mlに減少させた。希釈と濃縮を１回繰り返し、0.7 ml の試料を緩衝液Ｆで予め平衡化しておいたスーパーデックス200カラム（１×30c m，0.5 ml／分）にかけた（クロマトグラムについては図６を参照のこと）。得られた画分の50μl-アリコートを、PharmaciaSMARTシステムと接続した高速脱塩カラム（Pharmacia）を使って緩衝液Ｇに移した。得られた試料をSDS-PAGE（還元型、12.5％Ｔ、クーマシー染色、図７を参照のこと）により調べた。主要画分（ｍ）が41〜45 kDの範囲にただ１つのタンパク質バンドを示した。この画分の収量は0.12ＯＤ₂₈₀、活性４×10⁶Ｕで、比活性は33×10⁶Ｕ／ＯＤ₂₈₀であった。活性に基づいた総収率は36％で、精製倍率は170,000であった。主要画分（ｍ）の後に溶出する画分（ｎ）はさらに精製した（実施例４を参照のこと）。Ｂ）８クロマトグラフ工程によるMDA-MB-231細胞の上清からのＭＭの高純度への精製実施例２に記載した実験と同様にして、146 Ｌの上清から下記の工程（Ｑ−セファロースによるクロマトグラフィーを省く）によりＭＭを精製した。すなわち、6.6 Ｌの濃縮液を希釈し、界面活性剤として１mM CHAPSを用いてヘパリン−セファロース（80ml）のカラムにかけた。溶出した活性画分を希釈し、界面活性剤として１mM CHAPSを、全緩衝液中の添加剤として２ mMスペルミジンを用いてヘパリン−セファロース（50ml）のカラムにかけた。活性画分をプールし、界面活性剤として4 mM Zwittergent 3-12を含有する緩衝液で希釈し、ヘパリン−セファロース（10ml）のカラムにかけた。活性画分（8ml）をプールし、６Ｍ塩酸グアニジンを補給した後に、それぞれ２mlを用いて４回の操作でスーパーデックス 200カラム（120ml）により精製した。活性画分をプールし、希釈し、10mlおよび２mlのヘパリン−セファロースカラムを用いて２工程で濃縮した。最終工程の最大活性（２×10^-6Ｕ／ml）画分を実施例５Ｃに記載した増殖実験において使用した。この画分をＳＤＳアクリルアミド勾配ゲル（10〜15％，Ph ast Gel，Pharmacia）で泳動した。銀染色後、それは約52 kDaの主要バンドを示した。実施例４見かけ上均一になるまでのＭＭの精製試料中に高塩濃度（緩衝液Ｆ）が存在するため、実施例２から得られた物質（画分ｆ〜ｈ）を手順Ａに従って精製し、実施例３から得られた画分ｎを手順Ｂに従って濃縮した。手順Ａ：実施例２からの物質のイオン強度を４倍希釈により低下させ、次にSM ARTクロマトグラフィーシステム（Pharmacia）でMono S（PCI.6/5）（Pharmacia ,Uppsala，スウェーデン）カラムにより濃縮した。カラムは流速100μｌ／分で緩衝液Ｇから緩衝液Ｈ（緩衝液の組成については実施例２参照）までの直線勾配（12.5％／分）により展開した。50μｌ画分を集め、活性画分（活性試験については実施例６参照）をプールした。ＭＭの濃縮の典型的なクロマトグラムを図８に示す。手順Ｂ：実施例３からの物質をPharmacia社製のSMARTクロマトグラフィーシステムでLC Packings（アムステルダム，オランダ）により充填した逆相カラムPor os R/H（PerseptiveBiosystems，Cambridge，MA，USA）（内径0.8mm，長さ10cm ）により次の緩衝液を用いて濃縮した。緩衝液Ｊ：水中の0.1％ＴＦＡ緩衝液Ｋ：アセトニトリル中の0.09％ＴＦＡカラムは流速50μｌ／分で緩衝液Ｊから緩衝液Ｋ（緩衝液の組成については実施例２参照）までの直線勾配（５％／分）により展開した。25μｌ画分を集め、活性画分をプールした。手順ＡおよびＢから得られた試料はアガロースゲル（FMCBioproductsからのPr oSieve Gel System，Rockland，ME，USA）にかけ、高品質グレードのＳＤＳを用いる非還元条件下で製造会社の指示どおりに泳動を行った。電気泳動の完了後に、アガロースゲルをアノードからカソードへ２ｍｍの切片に切りだし、タンパク質を周囲温度で少なくとも４時間にわたり緩衝液Ｉ：６Ｍ尿素 20mM トリス／HCI，pH 7.5 0.3mM Zwittergent 3-12 0.3M NaCl 中に溶出した。 45〜55kDaの切片に相当するゲル溶出物において活性を測定することができた。活性溶出物をプールした。プールした物質はSMARTクロマトグラフィーシステム（Pharmacia）でＬＣ Pa ckings（アムステルダム，オランダ）により充填した逆相カラムPoros R/H（Per septive Biosystems,Cambridge,MA,USA）（内径 0.8mm，長さ 10cm）にかけた。カラムは流速50μｌ／分で緩衝液Ｊから緩衝液Ｋまでの直線勾配（2.5％／分）により展開した。１２μｌ画分を集め、活性画分（実施例６参照）をプールした。逆相カラムによるＭＭの分離の典型的なクロマトグラムを図９に示す。精製した産物のアリコー卜はＳＤＳゲル（Phast Gel 10-15％；Pharmacia）で非還元および還元条件下に低分子量のタンパク質標品（例えば、Bｉｏ-Rａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）ら入手可能、８ng／レーン／タンパク質，レーン１）とともに泳動し、銀で染色した（図10ａ）。レーンｌ〜３の走査も行い、これらを図10 ｂに示してある。配列決定にあたって230ピコモルの精製産物を用いた。ＭＭを還元し、S-カルボキシ-アミドメチル化し、そしてエンドプロテイナーゼLys-C（Wako,Neuss，ドイツ）を用いて37℃で16時間消化した。酵素対基質の比は1: 100とした。リン酸カリウム中の20％アセトニトリル（pH 2.5）で平衡化したMini Sカチオン交換カラム（３×0.5 cm）にて消化物を集めた。カラムをNaCl勾配により展開し、ピーク含有画分を集めた。ピークをさらに精製するためにVydac C4（0.1×15 cm）またはBrownlee RP-300（0.1×10 cm）逆相カラムにかけ、水／アセトニトリル-0. 1％ＴＦＡ勾配を用いて展開した。そして、475Aまたは477Aシークエネーター(Ap plied Biosystems，Foster City，CA）を使って配列決定を行った。次のアミノ酸配列： Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr （配列番号：１）、 Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys （配列番号：２）および X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu （配列番号：３）を有する３種のペプチドの配列が得られ、ここで“Ｘ”はアミノ酸を同定することができなかった配列決定サイクルを表す。実施例５ホルモン依存性細胞に対するＭＭの効果Ａ）形態：ホルモン非依存性ヒト乳癌細胞MDA-MB-231からの調整培地にZR-75- 1ホルモン依存性細胞をさらすことにより誘導された形態的変化を図11の顕微鏡写真により示す。コラーゲンIV型を塗布した細胞培養皿に１cm²あたり50,000個のホルモン依存性細胞（ZR-75-1，例えば米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手可能）をまき、無血清条件下で３日間増殖させた。次に、培地をホルモン非依存性MDA-MB-231細胞からの無血清調整培地と取り替えた。培地交換の直前（図11a）と、剌激の１５分後（図11b）、35分後（図11c）そして３時間後（図11d）に連続位相差顕微鏡写真を撮った。顕微鏡写真は、剌激を受けなかったホルモン依存性細胞が密な細胞間接触を伴う上皮細胞様の斑（patch）として培養下で増殖することを示している（図11ａ）。周辺部の細胞は波打ち膜（ruffling membrane)を示し、産生細胞からのＭＭ含有調整培地または全精製工程の精製タンパク質調製物による剌激の数分以内に膜状仮足を形成し始める1図11ｂ）。コロニーは細胞の平坦化のために相当に大きくなり、そして細胞と細胞の接触が次の時期に次第に弱くなる（図11cおよび114ｄ）。高度精製ＭＭによる応答細胞の活性化は数時間持続した。その後、細胞はもとの斑様形態に再び戻った。形態的変化の持続期間はＭＭの濃度に依存し、より高い濃度ではより長く続いた。細胞の活性化は、表Ｉに示すように、さまざまなホルモン依存性細胞において観察された。表Ｉに掲げた細胞系はすべて、例えば米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。ホルモン非依存性ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３は、精製ＭＭまたはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの調整培地で剌激した際に、形態的変化を伴って応答せず、また、ＺＲ−７５−１またはＴ−４７Ｄ細胞の膜波打ちを活性化する因子を分泌しなかった。Ｂ）運動性：ホルモン依存性応答細胞は、速やかに増殖するホルモン非依存性細胞の培地または精製ＭＭにさらした際に、繊維芽細胞様の細胞形状と関連したランダム運動の一時的活性化を示した。この誘導された運動性のため、再群集後に形成された細胞斑はＭＭ剌激前の斑と同じ細胞によって構成されることはないだろう。Ｃ）増殖：１．エストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞T47-Dの細胞増殖に対するＭＭの効果前もってコラーゲンＩＶ型を塗布した９６ウェルの細胞培養プレートに、10,0 00細胞／ウェルの密度でホルモン依存性Ｔ47-D細胞をまき、血清もフェノールレッドも含まない培地で増殖させた。実施例３Ｂ）に記載のごとく調製した精製マンマモジュリンを20Ｕ／mlの濃度で使用した。比較のために、マンマモジュリンの不在下または存在下で、マイトジェンであるインスリン様増殖因子Ｉ型（IGF- I）およびエストラジオール（Ｅ２）ならびに増殖阻害剤である腫瘍壊死因子− α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１α（ＩＬ−１）の作用を測定した。５日後、ウェルの細胞数をKungら，Analyt.Biochem.182,16-19,1989に記載のごとく測定した。染色中に固定細胞によって取り込まれた可溶化染料（クリスタルバイオレット）の590nmでのＯＤは細胞数と直線状に相関していた。図12 に示すように、精製したマンマモジュリンはホルモン依存性細胞系T47-D の増殖を剌激した。この図において、棒線は４反復実験の平均および標準偏差を表している。使用濃度でのＩＧＦ−Ｉは細胞を最大限に剌激したが、マンマモジュリンは細胞増殖に対して追加の効果を及ぼさなかった。エストラジオール単独では細胞増殖にほとんど影響を与えないが、マンマモジュリンはこれらの細胞がより速く増殖するように剌激した。Ｔ４７−Ｄ増殖に対するＴＮＦ−αおよびＩＬ−1の阻害作用は、少なくとも部分的に、マンマモジュリンの同時添加によって逆転された。２．エストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞MCF-7の細胞増殖に対するＭＭの効果細胞培養マイクロウェルプレート（Falcon）にウェルあたり7,000個のMCF-7細胞をまき、血清もフェノールレッドも含まない規定された条件〔Kungら，Contr ．0ncol.23，26-32（1986）〕下で25Ｕ／mlのマンマモジュリンまたは１×10^-19 のエストラジオールの存在下または不在下に増殖させた。この実験に使用したＭＭ調製物は図９（プール物質）に示すような逆相カラムからの最高純度の物質であった。この物質のアリコートをカラムからの溶出直後に無血清培地で希釈した。３日後、培養物に再供給した。７日後、細胞を固定し、Kungら（1989）前掲に記載のごとくクリスタルバイオレットアッセイで細胞数を測定した。染色中に固定細胞によって取り込まれた可溶化染料（クリスタルバイオレット）の590nmでのＯＤは細胞数と直線状に相関していた。図１７に示すように、MCF-7の増殖は25Ｕ／mlのマンマモジュリンによって強く刺激された。細胞の正常機能の対照として用いられたエストラジオール（Ｅ２）によっても細胞は剌激された。図１７では、剌激を受けた培養物の細胞数の増加を対照培養物から得られたデータのパーセントとして表してある。この値は４反復実験の平均および標準偏差を表す。Ｄ）マイトジェン活性：フローサイトメトリーによる細胞周期の分析は、ＭＭが合成（Ｓ）期にホルモン依存性細胞の比率を著しく増加させることを実証した。細胞周期分析の実験を開始する２日前と１日前に、血清およびフェノールレッドを含まない培地でホルモン依存性MCF-7、ZR-75-1およびT47-D細胞の培養物を２回洗浄した。その後、培地に25Ｕの高純度ＭＭ調製物（図９の逆相カラムのプールから得られたもの）を補給した。剌激後24時間で細胞を収穫し、FACScanアナライザー（Becton Dickinson,CellFITプログラム）の標準プロトコールを用いて分析した。結果は、高純度ＭＭによる処理がMCF-7、ZR-75-1およびT47-D細胞のＳ期細胞のパーセンテージをかなり増加させたことを示した。MCF-7細胞は対照細胞を越えて186％の増加を、ZR-75-1細胞は243％の増加を、そしてT47-D細胞は 161％の増加を示した。これら細胞についてＭＭと既知マイトジェンとの比較基準を提供するために、細胞を高濃度のインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１，１0⁸ -Ｍ）またはエストラジオール（３×10^-5Ｍ）で処理した。ＩＧＦ−Ｉまたはエストラジオールによって誘導されたＳ期増加値は、MCF-7細胞の場合がそれぞれ176％と158％、ZR-75-1細胞の場合が２８０％と１８０％、そしてＴ４７−Ｄ細胞の場合が２０３％と１０５％であった。Ｅ）ホルモン依存性細胞の変換：速やかに増殖するホルモン非依存性細胞系MD A-MB-231から得られたＭＭ含有調整培地は、ホルモン依存性細胞のエストロゲン受容体（ＥＲ）のレベルを明らかに低下させた。トリチル化エストロゲン（17− βエストラジオール）を用いる無傷細胞による結合アッセイで測定したところ、 MCF-7細胞では、ＭＭ含有培地（30Ｕ／ｍｌ）への２日間の暴露がＥＲの数を約5 5％±10 ％（５回の測定からの標準偏差）に低下させ、そしてZR-75-1細胞では、未処理細胞と比べて、ＥＲの数が約32％±20％であった。また、ＭＭはMCF-7ホルモン依存性細胞においてＥのｍＲＮＡ発現を抑制することがわかった。血清およびフェノールレッドを含まない培地中のMCF-7細胞（2 .5×１０⁶）を２０Ｕ／ｍｌの高度精製ＭＭ（実施例２、MonoS画分ｇ〜ｈ）で、あるいはＭＭの不在下または存在下に１×10^-9Ｍのエストラジオールで刺激した。処理の５時間後に細胞を収穫した。次に、細胞からＲＮＡを抽出し、予備充填スパンカラム（Pharmacia）でｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡ濃縮物を測定し、2 .5μｇの各抽出液をアガロースゲルに載せ、分離した。膜に移行させた（ノーザンブロット）後、ヒトＥＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによりＥＲメッセージについてｍＲＮＡを精査した（図13）。ＥＲｍＲＮＡはMCF-7対照細胞において発現された（図13，レーン１）。10^-9ＭのエストラジオールはＥＲｍＲＮＡ発現を剌激した（図13，レーン２）。ＭＭは 10^-9Ｍのエストラジオールの不在下（図13，レーン３）および存在下（図１３，レーン４）でｍＲＮＡ発現をかなり低下させた。別の実験において、血清およびフェノールレッドを含まない培地中の2.5×10⁶ 個のMCF-7細胞を高度精製ＭＭ（実施例３、図６の画分ｍ）、１×10^-10Ｍのエストラジオールまたはこれらの組合せで24時間剌激した。この時点で、細胞からｍＲＮＡを抽出し、Pharmacia社製のQuickPrep微量ｍＲＮＡ調製キットを使って精製した。ｍＲＮＡ調製物を1.1％アガロースゲルで分離し、ノーザンブロッティングによりニトロセルロース膜に移行させた。ブロットを放射性ＥＲプローブとハイブリダイズさせた。結果（図14）は、エストラジオールがＥＲのｍＲＮＡ発現を阻害したことを示す。ＭＭはＥＲのｍＲＮＡレベルを著しく低下させた。この効果は、エストラジオールとＭＭとを同時に使用したとき強化された。ＥＲおよびプロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質を、剌激したMCF-7細胞の抽出およびエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）の使用により測定した。12ウェルの細胞培養プレート（Costar）に５％ＦＣＳの存在下で150,000細胞／ウェルの密度にてMCF-7細胞をまいた。翌日、培地を血清−およびフェノールレッド −不含培地と交換した。次の日、２通りのウェルの細胞をＭＭ（200 Ｕ／ml）またはエストラジオール（１×10^-9）で剌激した。６および48時間後に培地を除き、細胞を-70℃で少なくとも12時間凍結した。解凍後、細胞をMadedduらにより記載された方法〔Eur. J. Cancer Clin. Oncol．24, 385-390(1988)〕に従って225μｌの抽出緩衝液（500mM KCl，10mM KH₂PO₄，1.5mM EDTAおよび5mM Na−モリブデートを含む）を加えることにより抽出した。ｐＨを１ＭのＫＯＨで7.4に調整した。β‐ メルカプトエタノールを0.01％の濃度で使用前に新たに加えた。この緩衝液は４ ℃であった。90分後、抽出液を１ｍｌのエッペンドルフチューブに入れて12,000 ×ｇ、４℃で５分間遠心した。上清を集め、受容体の測定用に100μｌの抽出液を使用した。ＥＲおよびＰＲレベルはAbbott Laboratories（North Chicago, IL ，USA）により製造されたＥＩＡキットを使って測定した。結果（図１５）は、ＭＭ剌激の６時間後にMCF-7細胞のＥＲタンパク質レベルが対照と比較してわずかに減少し、48時間後には非常に減少したことを示す。ＰＲレベルは、細胞をＭＭで剌激したとき、両時点とも対照と類似していた。 MCF-7細胞の正常な細胞機能の対照として、エストラジオールで処理した細胞においてＥＲおよびＰＲレベルも測定した。エストラジオール（Ｅ２）はＥＲｍＲＮＡとＥＲタンパク質の両方の発現を阻害し、かつMCF-7細胞のＰＲ発現を刺激することが知られている。さらに、ＰＲ発現はエストラジオールによるＥＲ活性化に依存する〔Reeら，Endocrinology, 124,2577-2583（1989）〕。対照実験は、エストラジオールがＥＲタンパク質の発現を低下させ、そしてＰＲタンパク質の発現を剌激することを示した。MCF-7細胞に関するこれらの結果は、Reeら（前掲）およびReadら〔Molec．Endocrinol．3, 295-304（1989）〕によって得られたデータと一致する。Ｆ）ホルモン依存性細胞の細胞膜タンパク質のチロシンリン酸化：精製ＭＭ（図６の画分ｍ）がMCF-7膜タンパク質のチロシンリン酸化に及ぼす効果を検討した。 MCF-7細胞を24ウェルのファルコン（Falcon）培養プレート（２cm²／ウェル）に150,000細胞／ウェルの密度で５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地にまいた。24時間後、培地を１％ＦＣＳ含有培地と交換した。翌日、剌激に先立って細胞を無血清培地を用いて２時間培養した。細胞を20および200Ｕ／mlのＭＭ濃度で処理した。剌激を受けなかった対照も含めた。細胞培養インキュベーターに入れて37℃で30分後、培地を除き、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動用の100μｌ／ウェルの還元試料緩衝液（４％ＳＤＳおよび2.5％メルカプトエタノールを含む）とともに100℃のオーブンに入れて細胞を５分間加熱することにより抽出した。60μｌの各抽出液およびＥＧＦＲ基準試料のアリコートをミニトリス−トリシン（mini Tris-Tricine）ゲル（６％）に載せて、分離した。10％メタノールを含む10mM CAPS緩衝液（pH11.0）を用いてウエスタンブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）にタンパク質を移行させ、続いてチロシンリン酸に対する抗体を用いて精査した。チロシンリン酸化タンパク質の検出は、Upstate BiotechnologyIncorporatedから得られた第２のアルカリホスファターゼ標識抗体（UBI，Lake Placid，NY，製品番号17-105）を用いて製造会社の指示どおりに行った。結果は、分子量標準およびＥＧＦ剌激Ａ４３１からのリン酸化ＥＧＦ受容体基準と比較して、約180 〜190 kDaの見かけ分子量を有するMCF-7細胞の膜タンパク質のチロシン特異的リン酸化をＭＭが剌激することを示した（図16）。リン酸化されたタンパク質が何であるかはつきとめなかった。Ｇ）ＭＭでホルモン依存性細胞を剌激した後の細胞表面ＥＧＦ受容体およびｅｒｂＢ２レベルの上昇した発現：12×10⁶個のMCF-7細胞を直径10cmのプラスチック製培養皿で血清−およびフェノールレッド−不含培地にて１日生育させ、30Ｕ／mlまたは100 Ｕ／mlの高度精製ＭＭ（図６の画分ｍ）を用いて２4時間剌激した。ヒトＥＧＦ受容体の細胞表面ドメイン（Ａｂ−１，Oncogene Science，Manh asset,NY）またはｅｒｂＢ２の細胞表面ドメインに対するマウスモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより表面受容体の数を測定し、細胞に結合したマウス抗ＥＧＦ受容体または抗ｅｒｂＢ２抗体を染色するために第２のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウス抗体（Becton Dic kinson，San Jose，CA）を加えた。細胞を皿からこすり取り、無血清培地で洗い、マイクロセルカウンター（Sysmex F-300，トーアメディカルエレクトロニクス，神戸，日本）を使って計測した。80μｌの無血清培地中の10⁶個の細胞に、20 μｌの第１抗体溶液を加え、氷上で45分間インキュベートした。次に、細胞を低温の無血清培地で３回洗い、100μｌ中に再懸濁させて、暗室にて氷上で４μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体とともに45分間インキュベートした。その後、細胞を無血清培地で２回洗い、250μｌの無血清培地に再懸濁させて、室温でフローサイトメーター（FACScan，Becton Dickinson，SanJose，CA）により分析した。各懸濁液のＦＩＴＣ蛍光の柱状図を作成するにあたって、データを平均蛍光チャンネル数として表した。フローサイトメーターでゲート化ドットプロット内の蛍光の増大した細胞の数を測定して確認したところ、全細胞の少なくとも90％が蛍光抗体で染色されていた。第２（ＦＩＴＣ標識）抗体のみとインキュベートした細胞の蛍光を、第１抗体（抗受容体抗体）およびＦＩＴＣ標識抗体とともにインキュベートした試料より得られた蛍光から差し引くことにより、結合蛍光を算出した。実験の結果を図18および19に示す。値は３回の測定の平均を表す。ＭＭで剌激したホルモン依存性MCF-7細胞では、24時間後のＥＧＦ受容体レベルが対照細胞の受容体レベルより約３倍高かった（図18）。ｅｒｂＢ−２レベルは100 Ｕ／ml のＭＭによる剌激の24時間後に35％だけ上昇することがわかった（図19）。実施例６単離の間のＭＭ活性の測定ＭＭ活性の測定は、エストロゲン受容体をもつ細胞系T47-Dの速やかな形態的変化の誘導に基づくものである。T47-D細胞を、トランスフェリン、低レベルのインスリンおよび１mg/mlウシ血清アルブミン（GibcoからのＡlbumax I）を補給した血清−およびフェノールレッド−不含培地で生育させた。細胞をまくときの密度は25,000〜35,000細胞／cm²であった。まいてから２日後、細胞をＭＭ活性試験に供した。T47-D細胞はZR-75-1細胞と同様にＭＭと反応した（図11ａと比較されたい）が、わずかにより感受性で、しかも、それらは支持体への付着がより強固であったため比較的取扱いが容易であった。試験細胞を含むウェルにＭＭ含有溶液を適量加えた。培養プレートを直ちに細胞培養インキュベーターに戻し、温度を37℃に維持した。10〜15分後、そして２回目の30〜45分後に、位相差顕微鏡を使って200倍の倍率で、誘導された膜の波打ち（membrane ruffling）および膜状仮足（lamellipodia）の形成について細胞を検査した。５段階の活性化レベルが区別された：ａ）活性化が全く見られない（−）、ｂ）弱くて一過性であるが、多くの細胞斑に明らかに検出可能な膜波打ちの形成が見られる（＋）、ｃ）多くの細胞斑で膜状仮足の形成が、そして全部の細胞斑で膜波打ちの形成が見られる（＋＋）、ｄ）全部の細胞斑で膜状仮足の形成が、そして多くの細胞斑で大きくなった膜状仮足の形成が見られる（＋＋＋）、ｅ）全部の細胞斑で強い膜波打ちと大きい膜状仮足の形成が見られる（＋＋＋＋）。試験結果のこの段階的変化は、ＭＭ含有培地またはクロマトグラフ画分の１：２希釈物における最後の５段階の細胞活性化パターンにおおむね一致する。１個のプラス（＋）活性を指定された希釈度が１Ｕ／mlのＭＭを含むと定義された。結果は、主に細胞培養の実際の条件（細胞密度、培養物の齢）に応じて、若干のバラツキを見せた。通常、他の時点およびT47-D細胞の他の培養物でのＭＭ活性の測定値間の差は50〜200％より大きくはなかった。実施例７ＭＭに対する抗体ＭＭはヒト以外の哺乳動物において抗原性があり、かくしてＭＭを接種した後の動物から抗体が得られる。マウスにおいて抗体の生産を誘導するには、５μｇのＭＭの２回投与で十分である。接種した動物の血液からポリクローナル抗血清を分離することができる。ＭＭに対するモノクローナル抗体は通常のKohler-Milstein法によってつくられる。すなわち、ＭＭを注入して適当な動物種を免疫し、ＭＭに対して感作された抗体産生細胞（つまり、脾細胞）を回収し、適合性のミエローマ細胞系との融合により抗体産生細胞を不滅化し、こうして樹立された不滅化細胞系からモノクローナル抗体を単離する。好ましくは、雌のBalb/cマウスにタイターマックス（ Titremax）（CytRx，150 Technology Parkway，Technology Park Atlanta, No rcross, Georgia 30092）の中のＭＭを腹腔内注射により投与する。２週間後、この注射を繰り返す。１週間後、血液サンプルを採取し、抗体の存在を例えばウエスタンブロットにより試験する。最高の抗体レベルを示すマウスを犠牲にし、それらの脾細胞とマウス（Balb/c)ミエローマ細胞とを例えばPEG 4000を使って融合させることにより不滅化し、24×24ウェルに分配する。こうして作製したハイブリドーマ細胞系を抗体の生産についてスクリーンし、選択する。実施例８クローニングおよびＭＭの発現 MDA-MB-231細胞由来のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いて作製されたランダム−プライムド（random-primed）ｃＤＮＡライブラリーからＭＭｃＤＮＡを単離することができる。ベクター、例えばラムダZAPIIベクターを利用してＭＭ−融合タンパク質を生成し、次にＭＭ抗体を用いて発現タンパク質をスクリーンする。これとは別に、ＭＭのアミノ酸配列情報を使って例えばコロニーハイブリダイゼーション法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーンすることもでき、例えばライブラリーを発現系（好ましくは、大腸菌）において発現させ、コロニーを例えばニトロセルロースフィルター上で溶菌し、その場でＤＮＡを変性してフィルター上に固定し、ＭＭのアミノ酸配列の全部または一部に対応するｃＤＮＡ塩基配列を有する少なくとも 24塩基対の標識した（好ましくは、放射性標識した）オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたコロニーを同定し、必要ならば染色体歩行法を使って、ライブラリーから対応ベクターを回収し、全ｃＤＮＡを単離、同定する。ひとたびｃＤＮＡが単離されると、適当な発現系、例えば大腸菌のような原核生物系でそれを発現させることができる。ＭＭは、例えば上記の方法を用いて、発現系の培地から単離することができる。実施例９ＭＭ阻害剤としてのヘパリンの使用ヘパリンはＭＭ活性に対する阻害作用のために乳癌の治療または制御に有効である。そのためにヘパリンを非経口的に投与することが好ましく、長期の連続静脈内注入を可能にする植え込み型ポンプを用いることが最も好ましい。ヘパリンは比較的無毒であるが、1000ユニットの試験量を通常の治療量の前に投与して、患者がアレルギー反応を起こさないことを確かめた方がよい。ヘパリン製剤としては、長期投与用にデザインされたもの、例えば低い抗凝血活性および脈管形成活性を有するものを使用すべきである。実施例10 ＭＭに対するモノクローナル抗体の治療用途ＭＭに対するモノクローナル抗体は、ＭＭ活性を阻害することによって乳癌の転移を防いだり低下させるために治療上使用することができる。適当な投与量および投与形態は当業者には明らかだろう。実施例11 ＭＭに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の診断用途ＭＭに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体（以後、集合的に抗体と記す）を用いるアッセイキットは次の成分を含むことができる：（ｉ）抗体、好ましくは凍結乾燥したもの；（ii）標識（好ましくは、放射性標識）ＭＭまたはその断片；および（iii）既知量のＭＭを含有するＭＭ標品。放射性標識ＭＭを用いる場合は、約50〜100μC i／μｇへ標識した¹²⁵Ｉ標識ＭＭが好ましい。抗体を溶解し、標識ＭＭまたは断片およびアッセイすべき試料またはＭＭ標品とともにインキュベートする。インキュベーションは好ましくは低温、例えば４ ℃で行い、少なくとも２時間、好ましくは４〜６時間続ける。反応混合物のｐＨを好ましくはクエン酸またはトリス緩衝液のような緩衝剤の助けをかりて５〜８の範囲、より好ましくは７〜８に維持する。インキュベーション後標識ＭＭまたは断片の画分を未結合画分から、例えばデキストラン塗布木炭のような木炭の使用により分離する。未結合画分を木炭に吸着させ、次いで濾過または遠心により分離する。その後、１つの画分に含まれる放射能の量を標準技法を使って、例えば第２溶質の添加後に液体シンチレーションカウンターにより測定する。抗体に結合した標識ＭＭまたは断片の割合は、未知血漿試料中のＭＭの量に逆比例する。定量分析の場合は、既知濃度のＭＭ溶液を分析することにより標準曲線を作成する。実施例12 動物モデルＭＭ作用およびアンタゴニストによるＭＭ作用の阻害効果を研究する動物モデルとしては、ヒト乳癌細胞を接種したヌードマウスが好ましい。例えば、ヌードマウスにホルモン依存性乳癌細胞（例えば、MCF-7細胞）を接種し、進行しつつある癌をヘパリンのようなＭＭ阻害剤、中和ＭＡｂおよびＭＭ受容体阻害剤の不在下または存在下でＭＭ（注入）により処置し、応答細胞に対するＭＭのin vivo作用を検討する。また、ヌードマウスにホルモン非依存性乳癌細胞（例えば、MDA-MB-231細胞）を接種し、進行しつつある癌をヘパリン、ＭＭに対する阻止ＭＡｂまたはＭＭ受容体阻害剤で処置し、in vivoで産生細胞の増殖におけるＭＭの役割を検討する。表Ｉ膜の波打ちおよび細胞の運動性を誘導する因子（マンマモジュリン、ＭＭ）を産生するまたは該因子に応答するヒト癌および正常乳房細胞（¹）結果は表示した細胞の調整培地（ＣＭ）によるマンマモジュリン応答細胞Z R-75-1およびT-47Dの剌激後の形態的変化の観察に基づく。各細胞の集密的培養物（無血清で生育させたもの）に新鮮な無血清培地を加え、試験のために３日後に回収した。試験は実施例６に記載のごとく行った。“＋”は100μg/mlのヘパリンで阻害される明らかに検出可能な細胞活性化を表し、（＋）はわずかな細胞活性化を表す。（²）高度精製因子（図６の画分ｍ）。（³）癌細胞系および（⁴）筋上皮細胞系（同一癌検体に由来）。（⁵）BT-474細胞は極めて低レベルのＥＲおよびＰＲを発現する。（⁶）形成不全型乳房組織に由来する。 Hs578Bst、MDA-MB-453およびBT-20は培養下で低い増殖速度を有しかつ極めて少量のまたは検出不能な量のマンマモジュリン活性を産生するエストロゲン受容体陰性細胞である。配列表配列番号：１配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部配列配列番号：２配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部配列配列番号：３配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｔ 9284−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ０７Ｋ 14/82 8318−4Ｈ 16/32 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (72)発明者ランゲン，ハノドイツ連邦共和国ディー―79585 スタイネン，イムヴォルフィシュビュール 27／４番地 (72)発明者シュレガー，エルンスト−ユルゲンドイツ連邦共和国ディー―79588 エフリンゲン―キルヘン，ノイシュトラーセ 63番地 (72)発明者ヴェヤー，カールドイツ連邦共和国ディー―79414 バッドベリンゲン，イムルムペル 16番地

Claims

【特許請求の範囲】１．精製されたマンマモジュリン。２．ａ）10−15％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約52〜55キロダルトンの分子量を有するタンパク質であり、ｂ）次の部分アミノ酸配列： Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr （配列番号：１） Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys （配列番号：２）および X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu （配列番号：３）（ここで、“Ｘ”は未同定アミノ酸残基を表す）を含み、ｃ）熱および酸に不安定で、トリプシン−およびメルカプトエタノール−感受性であり、そしてｄ）ホルモン非依存性乳癌細胞から得ることができる、請求項１に記載のマンマモジュリン。３．請求項１または２に記載のマンマモジュリンをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ。４．ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製するための請求項１または２に記載のマンマモジュリン。５．マンマモジュリンの活性を阻害する化合物を同定するための請求項１または２に記載のマンマモジュリン。６．請求項１または２に記載のマンマモジュリンの調製方法であって、ａ）ホルモン非依存性乳癌細胞を培養し、そしてｂ）培地からマンマモジュリンを単離する、各段階を含む方法。７．請求項１または２に記載のマンマモジュリンの調製方法であって、ａ）請求項３に記載のＤＮＡまたはｃＤＮＡをベクターに挿入し、ｂ）原核または真核細胞系を該ベクターでトランスフェクトし、ｃ）トランスフェクトした細胞系からマンマモジュリンを発現する細胞を選択し、ｄ）選択した細胞を適当な培地で培養し、そしてｅ）バイオマスからマンマモジュリンを抽出する、各段階を含む方法。８．マンマモジュリンの生物学的活性を阻害するヘパリン以外の化合物。９．少なくとも１つの次の活性：ａ）癌細胞、特に乳癌細胞におけるマンマモジュリン発現の阻害；ｂ）マンマモジュリンに対する親和性；またはｃ）癌細胞、特に乳癌細胞上のマンマモジュリン受容体に対する親和性；を有する請求項８に記載の化合物。 10．請求項１または２に記載のマンマモジュリンの少なくとも１つのエピトープを認識することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 11．モノクローナルである請求項10に記載の抗体。 12．１種またはそれ以上の次のマンマモジュリン活性阻害剤：ａ）請求項８または９に記載の化合物；および／またはｂ）請求項10または11に記載のマンマモジュリンに対する抗体；を医薬上許容される担体または希釈剤とともに含有する、乳癌の治療および抑制用の医薬組成物。 13．請求項10または11に記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含有するマンマモジュリンレベルのアッセイ用キット。 14．マンマモジュリン活性を阻害する化合物を同定する方法であって、マンマモジュリンおよびホルモン依存性乳癌細胞を含む試験系において、試験すべき化合物が、１つまたはそれ以上の次のパラメーター：ａ）ホルモン依存性細胞の形態；ｂ）ホルモン依存性細胞の運動性；ｃ）ホルモン依存性細胞の増殖；ｄ）ホルモン依存性細胞におけるマイトジェン活性；またはｅ）ホルモン依存性細胞のホルモン非依存性細胞への転換；に及ぼす効果を測定する段階を含む方法。 15．ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製するための請求項１または２に記載のマンマモジュリンの使用。 16．マンマモジュリン活性を阻害する化合物を同定するための請求項１または２に記載のマンマモジュリンの使用。 17．請求項６または７に記載の方法によって調製された請求項１または２に記載のマンマモジュリン。 18．本明細書に記載したすべての新規な産物、方法および用途。