JPH02427A - ｃ−ｍｙｂタンパク質のエピトープを認識するモノクローナル抗体、および該抗体を産生するハイブリドーマセルライン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ｃ−ｍｙｂタンパク質のエピトープを認識す
るモノクローナル抗体、該抗体を産生ずるハイブリドー
マセルライン、該抗体を用いることを特徴とするｃ−ｍ
ｙｂタンパク質発現の検出方法、該抗体を含有する検出
用キットおよび医薬組成物に関する。

従来技術 トリ（鳥類）骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）は、他の急
性形質転換ウィルス群と同様、そのヘルパーウィルスと
宿主細胞のＤＮＡ配列の間の組換えによって生成する。

トリ　ｃ−ｍｙｂ原−腫瘍遺伝子に由来するこの導入Ｄ
ＮＡ配列ｖ−ｍｙｂが、このウィルスの発癌特性の原因
である。ＡＭＶは、ニワトノにおいて急性の骨髄芽球性
白血病を引き起こし、そしてインビトロで造血細胞を形
質転換するが、培徨線維芽細胞の形態学的な形質転換は
誘導しない。このことは、限定された標的細胞集団だけ
がその１［工費転換遺伝子産物に応答することを示唆し
ている。ｖ−ｍｙｂ腫瘍遺伝子は、分子ｆｆ１４８，０
００のタンパク質、即ちｐ４８ｖ−′″ｙｂをコードし
ている。ＡＭＶだけがｖ−ｍｙｂ　ＩＩＩ瘍遺伝子含有
のウィルスというわけではない。トリ白血病ウィルスＥ
２６は、別の複製欠損発癌性レトロウィルスであり、そ
のゲノムには、ＡＭＶのものよりは小さいトリｃ１ｙｂ
遺伝子の内部セグメントが含まれている。Ｅ２６による
腫瘍形成には、単一のタンパク質ｐ１３５”’−“ｙｂ
−ｓｔｓが仲介しているようである。Ｅ２６およびＡＭ
Ｖに共通している骨髄性の白血病誘発特性は、共通のｖ
−ｍｙｂ配列と関係しているが、Ｅ２６特有の赤色白血
病遺伝子性はｖ−ｅｔｓと関係している。

一般に、原−腫瘍遺伝子は、細胞増殖および／または分
化を調節する細胞内現象に関与しているようである。特
に、核の原−腫瘍遺伝子ｃ−ｍｙｃ１ｃ曙ｙｂ、および
ｃ−「ｏｓは、おそらくは細胞ＤＮＡとの相互作用によ
って遺伝子の発現および複製に調節的な役割を有してい
るのであろう。

細胞性の原−腫瘍遺伝子ｃ−Ｉｌｌｙｂの活性化は、変
性遺伝子産物の合成につながる解読領域の構造変化、ま
たは調節要素の変化によって引き起こされる原−腫瘍遺
伝子の増強された発現のどちらかに関与しているものと
考えられている。このＤＮＡの再配列および変化したｃ
−ｍｙｂ原−腫瘍遺伝子の発現は、マウスの形質細胞リ
ンパ肉腫、ヒトの骨髄および結腸腫瘍で報告されている
。

このｃ−ＩＩｌｙｂ原−腫瘍遺伝子、即ちトリ骨髄芽球
ウィルスＡＭＶの形質転換遺伝子ｖ−ｍｙｂの細胞相同
体は、造血組織、特に初期段階の造血細胞分化に富んで
いる組織で発現される。ヒト（Φ瘍セルラインを分析す
ると、高レベルのｃ−ｒａｙｂ転写体は、ヒト結腸腺癌
（Ｃｏｌｏ　２０５）由来のセルラインにおける増幅さ
れたヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子の異常な発現を除くと、もっ
ばら、Ｔ−細胞および顆粒球マクロファージ系統由来の
造血前駆体セルライン中に見い出された。急性の前骨髄
球白血病の患者から確立したこのヒトｃ−ｍｙｂ発現セ
ルラインＨＬ−６０をインビトロで誘導して成熟顆粒球
に分化させることができる（平行して、ｃ−ｍｙｂ　Ｉ
ＩＩＲＮＡの発現か減少する）。種々のタイプの新鮮な
ヒト腫１αでの原−腫瘍遺伝子転写体を分析すると、Ｃ
ｍｙｂ遺伝子は、骨髄およびリンパ球白血病で生じる最
高のｃ−ＩＩｌｙｂ　ｍＲＮ　Ａレベルの造血性悪性疾
氾においてのみ有意に発現されることかわかった。

Ａ　Ｍ　Ｌ　ＦＪ３．者のさらに最近の研究では、ｃ−
ｍｙｂ転写体のレベルと末梢の芽の数との間で相関関係
が示唆されていた。これらの結果は、ｃ−ｍｙｂ遺伝子
が、進化的に調−節され、造血系での分化の初期段階に
おいて高レベルで発現されるのであろうことを示してい
る。

さらに、ｃ−ｍｙｂは種々の細胞タイプの細胞増殖に伴
って発現される。ｃ−ｍｙｃおよびｃ（ａｓと異なり、
ｃ−ｍｙｂは静止性のニワトリ胚線維芽細胞の血清刺激
に対する即時応答には関与していないが、発現の増加を
受ける（これは、細胞周期の進行と関係しているようで
ある）。同様に、休止ヒトＴリンパ球をフィトヘマグル
チニン刺激すると、ＣｍｙｂｍＲＮＡの発現が顕著に増
加する（もっと初期のｃ−ｅｙｅ　ｍＲＮ　Ａの発現が
先行する）。同調させたヒトＴ−細胞を細胞周期の種々
段階で分離すると、ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮ　Ａはもっばら
６１期中に発現されたが、ｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮ　Ａは受
容能力期中増加した。Ｃｍｙｂ発現が細胞周期に依存し
ておらず、かつ高レベルのｃ−Ｉｌｙｂ　ＬＩＩＲＮ　
Ａが、おそらくは胸腺−特異的なプロモーター／エンハ
ンサ−に起因する絶対速度の大きい転写から得られる胸
腺の場合とは対照的に、細胞の活性化および増殖中のｃ
−ｍｙｂ　ｍＲＮΔレベルの変化は転写後コントロール
の結果であるしのと思われる。

ｃ−ｍｙｂ発現の分析は、はとんどｍＲＮＡの決定に限
定されていたが、最近の研究にはタンパク質発現に関す
るものも含まれている。ｃ−ｍｙｂ遺伝子産物は、７５
ｋＤａの分子であり、そのウィルス性対応物ｖ−ｍｙｂ
と同様、インビトロでＤＮＡと結合する。ヒトｃ−ｍｙ
ｂおよびｖ−ｍｙｂタンパク質は少なくとも２個のエピ
トープを共有し、これらに対して交叉反応するモノクロ
ーナル抗体が記載されている。このｃ／ｖ−ｍｙｂタン
パク質の最近の研究で、これが核に多く位置していると
いう結果が得られた。

配列を比較すると、細胞性ｍｙｂタンパク質は、ＡＭＶ
およびＥ　２６　ｖ−ｍｙｂタンパク質と比較したとき
、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に付加的な
アミノ酸を含んでいることがわかる。

おそらく、これらの欠失が、これらタンパク質の発癌性
に寄与しているのであろう。ニワトリ、マウスおよびヒ
トなどの様々な種由来のｖ−ｍｙｂおよびｃ−ｍｙｂの
ヌクレオチド配列を分析すると、ある領域の遺伝子に密
接な相同性が認められる。

これらの保存領域は、遺伝子産物の重要な機能をコード
しているので進化的に安定である。

トリ細胞由来のｃ−ｍｙｂ原−腫瘍遺伝子は、分子ｆｆ
１７５，０００のタンパク質をコードしている。

最近になって、ヒト細胞性ｍｙｂ（ヒトｃ−ｍｙｂ）タ
ンパク質は、分子ａ８ｏ、ｏｏｏまたは７５．０００の
分子であると同定された。

発明の目的 本発明は、ｃ−ｍｙｂタンパク質のエピトープ、特に親
水性であり、そして／または脊椎動物のｃ−ｒａｙｂタ
ンパク質中に保存されているエピトープを認識するモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルライン、
およびこれらセルラインから得られるモノクローナル抗
体に関する。本発明者は、トリｖ−ｍｙｂおよびヒトｃ
−ｍｙｂタンパク質に存在する保存性の親水性エピトー
プと反応性であるハイブリドーマセルラインを得た。ま
た、本発明は、該セルラインから得られるモノクローナ
ル抗体に関する。さらに、本発明は、該モノクローナル
抗体を用いる、ｃ−ｍｙｂ発現細胞の蛍光活性化細胞選
別、ならびにヒト組織、細胞およびセルラインでのｃ−
ｍｙｂタンパク質発現の免疫細胞化学的な検出に関する
。加えて、本発明は、該モノクローナル抗体と薬学的に
許容しうる担体を含有してなる医薬組成物に関する。

発明の構成 ヒトｃ−ｍｙｂタンパク質に対するモノクローナル抗体
の単離 ΔＭＶ由来のｖ−ｍｙｂ遺伝子のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ
フラグメント（該遺伝子の３′−末端部分から得られ、
全遺伝子の約７０％に相当する）を、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ　、　Ｂａｍ１−Ｉ　Ｉ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｐｓｔｌ
、Ｂｇｌｌ＋、およびＸｂａｌに対する切断部位を有す
るポリリンカー含有の既知の熱誘導性発現ベクターｐＰ
Ｌｃ２４にクローンした。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で
発現させて得られるタンパク質は、融合タンパク質Ｍ　
Ｓ　２−ｖ−ｍｙｂであり、バクテリオファージＭＳ２
のレプリカーゼ遺伝子の最初の９９アミノ酸とｖ、−ｍ
ｙｂの２６９アミノ酸からなっている。分子量は４７．
０００である。

この大腸菌発現したＭ　Ｓ　２−ｖ−ｍｙｂ融合融合タ
ンパクモノクローナル抗体製造用の抗原として用いた。

腫瘍細胞から単離されたか、または組換え法によって製
造された他のｖ−ｍｙｂまたはｃ−ｍｙｂタンパク質も
類似方法でのモノクローナル抗体製造の抗原となりうる
。モノクローナル抗体製造の方法および操作は既知であ
る：例えば、ガルフレおよびミルシュタイン（Ｇａｌｆ
ｒｅ　ａｎｄ　ＭｉｌｓＬｅｉｎ、　　１９８１）、お
よびグライサーービルケ等（Ｇｒｅｉｓｅｒ−ＩＦｉｌ
ｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９８１）を参照。ハイブリ
ドーマ上清を、ＭＳ２−ｖ−ｍｙｂタンパク質を用いる
ウェスタンプロットおよびＥＬＩＳＡ、ならびに［３５
Ｓ］メチオニン代謝法ラベル化ＢＭ−２およびＭ　ｏ　
Ｉ　ｔ　−４細胞リゼイトを用いる間接免疫沈澱によっ
てスクリーニングした。ＢＭ−２はＡＭＶ形質転換した
トリ骨髄セルラインであり、Ｍｏ１ｔ−４はヒトＴ−リ
ンパ芽球セルラインである。陽性のハイブリドーマ培養
物を、それらが培養物中で安定になるまで、終点希釈で
繰り返しサブクローンした（通常は３回）。１ダース以
−Ｌのモノクローナル抗体のうちの１つ、クローン４／
１４だけが、ウィルス性およびヒトｃ−ｍｙｂタノバク
質を認識した。市販のサブグループ特巽的な抗血清を用
いて、このクローンの免疫グロブリンサブグループがＩ
ｇＧｔａであると同定した。

間接免疫沈澱分析において、［”Ｓ］メチオニン代代謝
シラベル化ヒトリンパ球たは骨髄細胞セルラインＭ　ｏ
　ｌ　ｔ　−４、ＨＬ−６０、およびＫＧ−１からの、
またはヒト結腸腺癌セルラインＣｏ１ｏ２０５からのリ
ゼイトを、ｄ４／１４ハイブリドーマ上清または他のｃ
−ｍｙｂ特異的なハイブリドーマの上清で処理すると、
ｐ７５　ｃ−ｍｙｂタンパク質を検出することができる
（第１図）。細菌発現させたｍｙｂタンパク實を過剰量
用いてモノクローナル抗体を遮断する競争実験を行うと
、ｐ７５ｃｍ１ｙｂの免疫沈澱が妨げられ、反応の特異
性が示される（第１図）。

ｖ−ｍｙｂの発現と比較するため、永久ラインＢ　Ｍ−
２として確立されたＡＭＶ形質転換の骨髄細胞を代謝法
でラベルし、平行して処理した。沈澱研究用の標定１の
細胞タンパク質を用いると、ヒト腫瘍セルラインにおけ
るｐ７５　ｃ−Ｂｂタンパク質よりも、ＢＭ−２細胞に
おいてｐ４８　ｖ−ｔｎｙｂタンパク質が高レベルで発
現される。多価のウサギ血清により、ｌｌ１ｙｂタンパ
ク質発現における差異がモノクローナル抗体の反応性の
差異によるのではな（、発現レベルによることが確認さ
れる。

主要な親水性領域を１つオリゴペプチド合成用に選択す
ることによって（この分子が免疫原性抗原であると仮定
して）、ｖ−＋ａｙｂタンパク質に対する抗体を得よう
とした。親水性領域は免疫系に関与していることが多く
、従って抗体応答においである役割を演じているものと
仮定される。カイトおよびドーリトル（Ｋｙｔｅ　ａｎ
ｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　　１９ｇ２）のコンピー−
タープログラムを用いるヌクレオチド配列のコンピュー
ター分析によってこれらを同定した。これをもとに選択
した配列は１９アミノ酸（Ｙ　Ｔ　Ｄ　Ｅ　Ｄ　Ｐ　Ｅ
　Ｋ　Ｅ　Ｋ　ＲＩ　Ｋ　Ｅ　Ｌ　Ｅ　Ｌ　Ｌ　Ｌ）か
らなり、ヒトｃ−１ｌｙｂのアミノ酸配列と比較すると
保存性が高いことがわかった。これは１つだけ誤対合（
位置２　ＴのかわりにＮ）を含んでいた（第３Ｂ図祭照
）。このオリゴペプチドは、沈澱抗体を生成せず、モノ
クローナル抗体と効率よ（競合した（第２図）。即ち、
このモノクローナル抗体はこのオリゴペプチド配列で作
られたドメインを認識した。このペプチドの代わりに、
抗原それ自体またはそのフラグメントを競合分析用に、
特に同定されていないエピトープに対するモノクローナ
ル抗体用に用いることができる。

このモノクローナル抗体か認識するエピトープを、大腸
菌発現タンパク質のサブクローンを用いて別個にマツピ
ングした。ＥｃｏＲＩ　／　Ｘｂａ　Ｉフラグメントの
代わりに、ｖ−ｍｙｂのＥｃｏＲｌ　／　Ｓ　ａｌ　Ｉ
およびＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌフラグメントを、もう−度
ｐＰＬｃ２４をベクターとして用いてＭＳ−２融合タン
パク質として発現させた。このＥｃｏＲ１／５ａｌｌフ
ラグメントを既知のｐＵＣ３ベクターにサブクローンし
てｐＰＬｃ２４ベクター用の適当な制限部位を創製しな
ければならなかった。第３図でｌ、２および３と番号を
付した３つの融合タンパク質の分子量はそれぞれ４７，
０００．２３，０００および２１，０００ダルトンであ
る。約１１゜０００ダルトンの分子量については、融合
ＭＳ２のポリメラーゼ部分の９９アミノ酸が寄与してい
る。マツピング分析用に、ハイブリドーマクローン４／
１４を用いるウェスタンプロットでこれらのタンパク質
を試験した。タンパク質のＭＳ２部分に対して指向する
別のモノクローナル抗体がこれらの同定を可能にした。

第３図に示した結果は、クローン４／１４がフラグメン
ト３とは反応しないことを示している（アミノ酸２０８
と２３２の間の認識部位をマツピングしている）。この
ｖ−ｍｙｂ遺伝子と、カイトおよびドーリトル（ＫｙＬ
ｅａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　１！１１８２）によ
るコンピューター計算した親水性のプロットを並べると
、ペプチドを選択した最も主要な親水性領域とエピトー
プとの同一性が裏付けられる（第３Ｂ図）。

ＨＬ−６０セルラインは、種々の試薬で誘導して分化さ
せることが可能なヒト前骨髄法白血病セルラインである
と報告されている。ジメチルスルホキンド（ＤＭＳＯ）
およびレチン酸はＨＬ−６０細胞を誘導して顆粒球に分
化させる一方、ホルボール　１２−ミリステート　１３
−アセテート（ＰＭＡ）で処理すると単球となる。両分
化の過程はｃ−ｍｙｃ転写体の減少と関係している。顆
粒球分化の場合、ｃ−ｍｙｂ　ｍＲＮ　Ａの減少も同様
に報告されている。モノクローナル抗体ｃ１４／１４お
よびポリクローナルｌｌ１ｙｂ−特異性ウサギ血清によ
り、タンパク質発現のレベルでこれらの観察を確認し、
ｌ４Ｌ−６０の単球分化に展開する。［”Ｓｌ−メチオ
ニンまたは［３ＳＳ］−システィンを用いて代謝法でラ
ベルした誘導試薬で細胞を処理し、次いで溶菌し、間接
免疫沈澱にかけた。多価ウサギ血清を用いてｃ−ｍｙｃ
タンパク質の発現を平行して分析した。定量分析用に、
等ｍの細胞リゼイトからの免疫沈澱をトリクロロ酢酸−
不溶性の放射活性で測定して比較した。第４図に示した
ように、ｃ−ｍｙｂおよびＣｍｙｃタンパク質発現の減
少の効果は、ＤＭＳＯ処理した後に最も劇的であり、レ
チン酸またはＰＭＡ処理した後には比較的少ない。レチ
ン酸処理に続く２４または４８時間は、ｃ−ＩＩＩｙｂ
およびｃ−ｍｙｃタンパク質の発現がさらに減少すると
いうことはなかった。

本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＣｌｌ１ｙ
ｂタンパク質の保存性かつ親水性のエピトープは、ｖ−
ｎ＋ｙｂタンパク質のアミン末端にマツピングされる領
域に指向性である最近報告の別のモノクローナル抗体と
は異なっている［クレンブナウアー等（Ｋｌｅｍｐｎａ
ｕｅｒ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　１９８６）コ。

抗−ｍｙｂモノクローナル抗体ｃ１４／１４は、免疫細
胞化学法および免疫組織化学法によるヒトｃ１ｙｂタン
パク質の検出を可能にし、これによると、第２の抗体に
結合される酵素であるペルオキシダーゼあるいはアルカ
リホスファターゼの間に有意差は観察されなかった。こ
の後者の酵素を、アルカリホスファターゼ−抗アルカリ
ホスファターゼ曳合体からなる、いわゆるＡＰＡＡＰサ
ンドイッチ法に用いた。第５Ａ図は、核を染色すること
になる、ｃ１４／１４を用いるＭ　ｏ　Ｉ　ｔ　−４細
胞の免疫細胞化学的な分析を示すものである。細菌で発
現させたＢｂタンパク質によるモノクローナル抗体の前
吸収は染色を遮断し、反応が特異的であることを示した
（第５Ｂ図）。

モノクローナル抗体４／１４を用いる６９８Ｍ２細胞の
核の免疫細胞化学法による染色を第６図に示す。

また、モノクローナル抗体クローン４／１４は、蛍光活
性化細胞の選別によって造血およびリンパ系からヒト腫
瘍細胞を検出するのにも有用である。

造血およびリンパ系の代表的な腫瘍細胞の例を挙げると
、ＢまたはＴタイプの急性リンパ芽球白血病、慢性のリ
ンパ球白血病、免疫芽球リンパ腫、形質芽球リンパ腫、
中心芽球／中心細胞リンパ腫である。免疫細胞化学によ
る検定を第７図に模式ヒトｃ−ＩＩｌｙｂ発現は未熟増
殖細胞に限定されず、刺激して増殖させたときの完全に
分化したリンパ球においてもｍＲＮＡレベルで検出され
た。これらの分析を、免疫細胞化学法を用い、ｃ１４／
１４によるタンパク質レベルで確認した。休止Ｔ８”リ
ンパ球はｃ１４／１４による陽性の染色を全く示さなか
った（第８Ａ図）。さらに、刺激されていない末梢血液
単核細胞（ＰＢＭＣ）、ならびに休止Ｔ４゛あるいはＢ
−細胞はｃ−Ｂｂタンパク質発現に関して陰性であった
。ＰＨＡ刺激の３日後では、Ｔ８°リンパ球は強い免疫
染色シグナルを、はとんど細胞質に局在して示す（第８
Ｂ図）。同一の細胞質染色が、ＰＨＡ刺激の３日後のＰ
ＢＭＣならびにＴ４”細胞で観察された。スタフィロコ
ッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　
ａｕｒｅｕｓ）刺激をしたＢ−細胞は極めて弱い染色を
示したにすぎず、主としてゴルジ領域に限定されていた
。刺激されたリンパ球でのｃ−ｍｙｂタンパク質の細胞
質局在を、細胞分画および別に得られた抗体の使用など
の別法により確認した。

骨髄およびリンパ系の７０のヒト腫瘍のスクリーニング
を、ｃ１４／１４を用いて、凍結切片の免疫組織化学法
による染色によって行った。腫瘍の形態学的な特徴に加
えて、通常のマーカー抗体のいくつかを腫瘍の分類に用
いた。これらのマーカーにはＫ　ｉ−６７およびＫ１−
１抗体が含まれる。Ｋ１−６７抗体はすべての増殖細胞
の核をラベルし、従ってリンパ腫の増殖活性の測定を可
能にする。

Ｋｉ刊抗体は、Ｔ−あるいはＢ−細胞型の活性化リンパ
細胞を起源としＫｉ刊リンパ腫と称されている、特定の
脱分化大細胞非ホンキン（ｎｏｎ−１ｏｄｇｋｉｎ）リ
ンパ腫の表面に結合する。第９Ａ図は、ｃ−ｍｙｂタン
パク質を発現しているＫｉ刊リンパ腫を示している。約
５〜６０％の腫瘍細胞が、主として核において陽性に染
色されている。第９Ｂ図に示した別のＫｉ刊リンパ腫は
極めてわずかのｍｙｂ−発現細胞しか含んでおらず、ｃ
−Ｂｂ陰性と評価された。

試験した菌状息肉腫はすべてｃ−ｍｙｂ発現に関して完
全に陰性であった（第９Ｃ図）。１つのケースを除くと
、小末梢リンパ細胞を起源とし低増殖活性の「細胞性」
リンパ腫と分類される、慢性のリンパ性白血病は、菌状
息肉腫と同様、ｃ−ｍｙｂタンパク質発現に対して陰性
であった。スクリーニングした腫瘍でのｃ−＋＋＋ｙｂ
タンパク質発現の結果を第１表にまとめる。表中の数は
、全ケースに対する陽性の比を示している。高増殖活性
のリンパ腫の中で２つの突出した群を認めることができ
る：即ち、脱分化大細胞Ｋ１−１リンパ腫ならびにＴ−
細胞およびＢ−細胞型のリンパ芽球リンパ腫であり、そ
のうちの１つは第８Ｃ図および第９Ａ図に示されている
。免疫染色は主として核であるが、いくつかのケースで
はさらに細胞質に及ぶ。免疫芽球、形質芽球および中心
芽球リンパ腫のいくつかのケースについては、その免疫
染色シグナルは比較的弱いものではあるが、ｃ−Ｉｌｙ
ｂ陽性と評価された。

パーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）型のリンパ芽球リンパ腫
はＣ１１ｙｂ発現について陰性であった。今までのとこ
ろ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血
病（ＣＭＬ）の２つのケースについてだけ分析した。

いくつかのヒトＡＭＬでのｃ−ｍｙｂ発現が示されてい
た。本発明において分析したＡＭＬはｃ−Ｂｂ発現につ
いて陽性であるとみなされた。抗体の特異性を比較し評
価するために、正常組織からの細胞を試験した。結合組
織ならびに脂肪細胞、回腸、垂および肺はすべて陰性で
あった。陽性のシグナルは、毛包、いくつかの活性化マ
クロファージ、例えば上皮様細胞およびリンパ節洞マク
ロファージ、いくつかの内皮細胞、表皮（いくつかのケ
ースにおいてのみ）において、ならびに子宮内膜分泌細
胞（染色は細胞質性のものであった）において観察され
た。極めて少数の肝細胞および分泌胚細胞もかすかな細
胞質染色を示した。

ｍ　Ｌ、！２　ｃ−ｍｙｂに対するモノクローナル抗体
とリンパ性および骨髄性悪↑側Φ瘍との反応性 高増殖活性のＮ　Ｉ−Ｉ　Ｌ バーキット（ＢｕｒｋｉｔＬ）型のリンパ芽球　　　　
０／３前Ｂ−細胞型のリンパ芽球　　　　　　　　　　
９／＋０　　１Ｏ−８０Ｔ−細胞型のリンパ芽球　　　
　　　　　　　３／４　　１Ｏ−７０Ｂ−細胞型の免疫
芽球　　　　　　　　　　　　２１５　　　　７０形質
芽球リンパ腫　　　　　　　　　　　　　２／２　　３
０；　７０中心芽球リンパ腫　　　　　　　　　　　　
　　１／４　　　　　１Ｔ−型の大細胞Ｋ１−１リンパ
肺　　　　　　　５／８　　　５−６００−型の大細胞
Ｋ１−１リンパ腫　　　　　　　０７１中増殖活性のＮ
ＨＬ 多形性Ｔ−細胞リンパ腫　　　　　　　　　　　０／２
血管免疫芽球リンパ節症のＴ−細胞リンパ腫　０／２低
増殖活性のＮＨＬ 中心芽球／中心細胞リンパ腫　　　　　　　　２／４　
　　＜Ｉ；５リンパ細胞而漿細胞免疫細胞腫　　　　　
　　２１５　　　　　＜ＩＢ−細Ｕ皆比すンパ細胞白面
病　　　　　　　　【１５１閑状息肉腫　　　　　　　
　　　　　　　　　０／９骨髄性白血病 急性骨髄性白血病　　　　　　　　　　　　　１／１　
　　　３０慢性骨髄性白血病　　　　　　　　　　　　
　０／１その他のリンパ腫 ホジキン（ｌｌｏｄｇｋ　ｉ　ｎ）リンパ腫　　　　　
　　　　０／４ベルオキ／ダーゼまたはＡＰＡＡＰを用
いて免疫組織化学法による染色を行った（ＮＨＬ＝非ホ
ジキンリンパ腫）。

本発明のモノクローナル抗体を治療に用いることができ
る。治療学的有効量の４／１４またはその他のモノクロ
ーナル抗体を、治療を必要としている個体に投与するこ
とによって、ｃ−ｎ＋ｙｂタンパク質の過剰発現として
顕在化する症状（例えば、悪性腫瘍）の治療を行うこと
ができる。本発明のモノクローナル抗体は非経口投与で
用いることができる。別法では、モノクローナル抗体の
存在下、−時的なインビトロ培養物を用いて、単離した
骨髄を腫瘍細胞から減少させることができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

ＡＭＶで形質転換されたニワトリ骨髄芽球のＢＭ−２ラ
インならびにＫＧ刊およびＨＬ−６０ラインは報告され
ている。Ｍ　ｏ　ｌ　ｔ　−４およびＣｏ１ｏ２０５は
ヒトＴ−リンパ芽球セルラインであり、ＡＴ　ＣＣ（Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　；　Ｎｏ、　
１５８２およびＣＣＬ２２２）から入手できる。

１ｍＭ　　ピルビン酸ナトリウム、必須アミノ酸、ビタ
ミン、８％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、および２％の熱不
活性化したニワトリ血清を追加したＤＭＥＭ培地中でＢ
Ｍ−２を増殖させた。１０％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ培地
中でヒトセルラインＣｏｌ。

２０５、ＨＬ−６０、ＫＧ−１，およびＭｏ１ｔ−４を
維持した。すべての培地に、ｌｌＱあたり１００単位の
ペニシリン、１Ｊ１１２あたり２００μ２のストレプト
マイシン、および２ｍＭのグルタミンを追加した。５％
ＣＯ７雰囲気下、３７°Ｃで細胞を培養した。

５％の透析ウシ血清および５００μＣＶｘＱの［”Ｓｌ
メチオニン（＞８００Ｃｉ／ｘモル；　Ａｉｅｒｓｈａ
ｍ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）を追加したメチオニン不含の培
地中で９０分間、または５％の透析ラン血清および５０
０μＣＶｘＱの［”Ｓ］システィン（＞　８００　Ｃｉ
／１モル；＾ｍｅｒｓｈａｉ、　ＵＫ）を含むシスティ
ン不含の培地中で６０分間、代謝法ラベルを行った。

リンパ腫組織の新鮮な未固定バイオプシーは、Ｋｌｉｎ
ｉｋｕｍ　ＳｔｅｇｌｉＬｚ、　Ｆｒｅｅ　Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ　Ｂｅｒｌｉｎから人手した。液体窒素中に
浸漬することによって組織を気密プラスチックカプセル
中で凍結させ、使用前３年間まで一７０°Ｃで保存した
。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用い、す
べてのリンパ腫を、通常の形態学的な、酵素細胞化学的
な、および免疫組織学的な基準に従って分類した。すべ
ての場合において、臨床的な所見は形態学的な診断と一
致した。

末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣ）は、健康な供与者から
のヘパリン処理血液のフィコール−１１イバーク（Ｆｉ
ｃｏｌｌ−１１ｙｐａｑｕｅ；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、
　　Ｌｌｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）密度遠心によ
って調製した。精製したＴ−リンパ球は、フィコール−
ハイバーク密度遠心、および２−アミノエチルイソチオ
ウロニウムーブロミドーハイドロブロミド（ΔＥＴ）−
処理したヒツジ赤血球を用いる赤血球ロゼツト生成によ
ってＰＢＭＮＣから単離した。Ｔ−リンパ球のＴ４’お
よびＴ８°部分への分離は文献記載のようにして行った
。Ｂ−細胞に富む細胞集団は、２工程の赤血球ロゼ、ト
処理およびそれに続（プラスチックあるいはガラス吸着
による単球の除去の後に得た。

実施例１　モノクローナル抗体の調製 大腸菌発現させたＭ　Ｓ　２−ｖ−ｔａｙｂ融合タンパ
ク質［メーリング等（Ｍｏｅｌｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、
、　　１９８５．　　ａｎｄ　１９８７）］をマウスの
免疫に用いた。６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスをゲル溶離し
た細菌性タンパク質で繰り返し免疫した。すべての動物
が高力価の抗体を示した。

最後の腹腔的免疫の３日後に１匹の動物を犠牲にした。

実質的に文献記載［グライサーービルケ等（Ｇｒｅｉｓ
ｅｒ−Ｗｉｌｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　　＋９８１）］の
ようにして、Ｎ５−１　ミエローマセルラインを用いて
融合を行った。６００コロニーから１８の陽性クローン
が得られ、そのうちの１２個は、終点希釈のサブクロー
ニングを数回行った後の培養物中で安定に維持された。

細菌発現させた抗原を用いるウェスタンプロットおよび
ＥＬＩＳＡによって、ならびに代謝法でラベルしたＢＭ
−２およびＭ　ｏ　Ｉ　ｔ　−４細胞を用いる間接免疫
沈澱によって、陽性の培養物をスクリーニングした。ク
ローン４／１４は、間接免疫沈澱においてヒトｃ−ｓｙ
ｂタンパク質と交叉反応性である唯一のクローンであっ
た。

実施例２間接免疫沈澱 ヒト′ｒ−リンパ芽球セルラインＭ　ｏ　ｌ　ｔ　−４
、ＫＧ６およびＣｏ１ｏ２０５、ならびにＡＭＶ形質転
換したトリ骨髄セルラインＢＭ−２の指数関数増殖細胞
を、５％の透析ウシ血清を含むメチオニン不含の培地中
、５００μＣＶｘＱの［”Ｓ］メチオニンを用い、９０
分間、代謝法によってラベルした。

細胞を冷リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　：　８ｎ＋Ｍ
　Ｎａ。

１−１１）　Ｏ，，１，５ｍＭ　ＫＨ，ＰＯ，、ｐＨ７
，４，３ｍＭ　ＫＣＱ、ｌ　４０ｍＭ　ＮａＣ（りで２
回洗浄し、溶菌緩ｉ（ｉ液［１０１１１Ｍトリス−１−
ＩＣ（、ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＮａＣＱ、　０．５％
ＮＰ−４０，０，５％デスオキシコール酸ナトリウム（
ＤＯＣ）、０．５％ドデ／ルスルホン酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）、０．５％　トラシロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ　
；　Ｂａｙｅｒ　Ｃｏ、、　Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｒｅｎ
、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭ　フェニル−
メチルスルホニル−フリリド（ｐＭｓＦ）］中、４°Ｃ
で溶菌した。この溶菌液（リゼイト）を２５Ｇニードル
に７回通してＤＮＡを切断し、次いで４°Ｃで３０分間
、ｌｏ、ｏｏｏｘｇで遠心した。溶菌液０．２ｘｌ！（
２ＸＩＯ’細胞に等しい）を、抗血清（５μｇ）または
ハイブリドーマ上清（２００μＱ）または腹水液（１０
μＱ）およびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｐａｎ
ｓ。

ｒｂｉｎ、　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｆｆｉ−Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ）で処理した。免疫化の抗原として用いた精製Ｍ　Ｓ
　２−ｖ−ｍｙｂタンパク質（５μ９）を沈澱中の競合
タンパク質として用いた。

得られた免疫コンプレックスを徹底的に洗浄し、ゲル電
気泳動（１０％ゲル）で分析した。このゲルを１Ｍサリ
チル酸ナトリウムからなる溶液中に室温で３０分間浸漬
し、乾燥し、−７０℃でオートラジオグラフィーにかけ
た。合成ペプチドとの競争実験をＩＯおよび５０ｎｇ用
いて行った。合成ペプチドはＢｉｏｃｈｒｏｍ　ＫＧ、
　Ｂｅｒｌｉｎ−１ｆｅｓｔから購入した。

第１図は、ヒトｃ−ｍｙｂタンパク質（ｐ７５　ｃ−ｍ
ｙｂ）およびウィルスｉｙｂタンパク質（ｐ４８　ｖ−
ｍｙｂ）の間接免疫沈澱を示すものである。用いた抗体
は；正常なウサギ血清（１）：ウサギ抗−ｖ−ｍｙｂ血
清（２）；ミエローマ細胞由来の対照上清（３）；抗−
ｍｙｂモノクローナル抗体（上清）（４）；細菌で発現
させたｍｙｂタンパク質でブロックした抗−ｍｙｂモノ
クローナル抗体（上清）（５）である。Ｍは分子Ｍマー
カーを示し、」二から下に、９２ｋＤａ、６８ｋＤａ、
５５ｋＤａ、４５ｋＤａ、３２ｋＤａである。暴露時間
は１週間である。

第２図は、合成のｖ−ｍｙｂ特異的なペプチドによる免
疫沈澱反応の競合を示すものである。バイブリド−マク
０−７４　／　Ｉ　４　（αｍｙｂ””）由来の腹水ｉ
（ＲＩ　Ｏμｇを用いてＭ　ｏ　ｌ　ｔ−４リゼイトの
間接免疫沈澱を行った。表示した１の合成ｖ−ｍｙｂ特
異的ペプチド（１９アミノ酸；２１３から２３１）を、
沈澱反応をブロックする競合抗原として添加した。

暴露時間は７日間である。Ｍは分子量マーカーを示し、
上から、９２に、６８に、５４Ｋ（ぼんやりしている）
、４５Ｋ、３２にである。

実施例３ ａ）先端を切ったｍｙｂ融合タンパク質の構築モノクロ
ーナル抗体４／１４が認識するｍｙｂエピトープを同定
するために、第３Ｂ図で１．２および３と番号を付した
ｖ−Ｂｂコード化領領域別個のフラグメントを大腸菌中
、ＭＳ２−融合タンパク質として発現させた。フラグメ
ントｌはＥｃｏＲｌ　／　Ｘｂａ　Ｉ　（Ｅ／　Ｘ）領
域に、２はＥｃｏＲＩ／５ａ１１（Ｅ／Ｓ）に、そして
３はＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ（Ｅ／Ｐ）に対応している。

ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ［フラグメントに加えて、ＥｃｏＲ
Ｉ　／　Ｓａｌ　ＩフラグメントおよびＥｃｏＲＩ　／
　Ｐｓｔ　Ｉフラグメントを、ポリリンカーを含有する
既知の熱誘導性ＭＳ２発現ベクターｐＰＬｃ２４の誘導
体にクローンした。このＥｃｏＲＩ／５ａｌｌフラグメ
ントを既知のｐＵＣ３ベクターにサブクローンしてｐＰ
ＬＣ２４プラスミド用の適切な制限部位を創製しなけれ
ばならなかった。９９のＭＳ２ポリメラーゼ−特異的な
アミノ酸（約１１，０００ダルトンに等しい）を含有す
る３種のＭＳ２−融合タンパク質の分子量はそれぞれ４
７，０００．２３，０００および２１，０００ダルトン
であった。

ｂ）ウェスタンプロット分析によるモノクローナル抗体
４／１４のエピトープマツピング細菌発現させたタンパ
ク質をウェスタンプロット分析によって分析した（第３
Ａ図）。細菌リゼイト約１００μ９と等しい■を電気泳
動（１２，５％ゲル）にかけ、移動緩衝液［０，０６９
Ｍグリシン、１２．５ｍＭ）リスマベース（Ｔｒｉｓｍ
ａｂａｓｅ）、０．０５％ＳＤＳ、２０％メタ／−ル］
中でニトロセルロースに移動させた（６０ｖ、２．５時
間）。室温（ＲＴ）で３０分間、ＰＢＳおよび０．３％
ツイーン２０（ＰＢＳ／Ｔ／Ｍ緩衝液）中の５％脱脂粉
乳とともにインキュベートすることによってプロットを
プロ、りした。次いで、このソートを、ＲＴで１時間、
ＰＢＳ／Ｔ／Ｍ緩衝液中１：５００に希釈した、抗−Ｍ
Ｓ２またはクローン４／１４由来の腹水液とともにイン
キュベートした。０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳでさらに
処理し、ＰＢＳ／Ｔ緩衝液で２回洗浄することによって
非特異的な結合を減少させた。ヤギ抗−マウス免疫グロ
ブリンアルカリホスファターゼコンジュゲート（ＰＢＳ
／Ｔ／Ｍ緩衝液中、１　：　１０００希釈）をＲＴで１
時間加え、次いでＰＢＳ／Ｔ緩衝液による洗浄を繰り返
した。アルカリホスファターゼは５ブロモ−４−クロロ
インドリルホスフェートを基質として用い、ニトロブル
ー−テトラゾリウムのジホルマザンへの還元における多
段反応を導き、赤色を生じる。Ｍは、キロダルトンで表
示した分子量マーカーを示す。第３Ｂ図において、斜線
の箱は、境界ウィルス領域とＫｐｎｌ（Ｋ）制限部位を
有する完全なり−ｆｆｉｙｂ遺伝子を示している。（Ａ
）に示されている３種の細菌発現ｖ−ｍｙｂタンパク質
、１．２および３は縮尺して図示されており（空の箱）
、カイトおよびドーリトル（Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ、　　１９ｇ２）のコンピュータープログ
ラムを用いる親水性カーブは、ｖ−ｍｙｂ配列と並べら
れている。

親水性は負の数で示されている。黒の箱（Ｐ／Ｓ）は、
クローン４／１４が厳格に認識するエピトープに対応し
ており、主親水性ピークとともに並べられている。アミ
ノ酸配列をその下に挙げ（ＡからＭ）、ヒトｃ１ｙｂア
ミノ酸配列と比較している（★は誤対合を示している）
。このｖ−ｍｙｂとヒトｃ−ｍｙｂの間の配列相同性は
、保存エピトープを示すものである。進化の間にこれら
の配列だけが保存され、重要な分子の機能を助けている
。合成ペプチドは点を打った箱で示されており、そのア
ミノ酸配列はＹから最後のアミノ酸までである（ただし
、アミノ酸りまで）。

実施例４　ハイブリドーマクローン４／１４を用いるヒ
ト白血病およびリンパ腫におけるｃ−ｍｙｂタンパク質
発現の免疫細胞化学分析 末梢血液または骨髄吸引液から得られる白血病１１１１
胞ヲ、通常のフィコール−バーク　クツション（Ｆｉｃ
ｏｌトＰａｑｕｅ　ｃｕｓｈｉｏｎｓ　；　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　５ｖｃｄｅｎ）による
遠心によって豊富化した。単核細胞をリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次いでｌＸｌ０’〜２Ｘ１０
’を顕微鏡スライドに細胞遠心した（１０分間、８００
　ｘｇ）。ヒト起源の樹立セルラインの場合は、細胞を
直接スライド上に細胞遠心した。この細胞を風乾し、１
５分間アセトン中で固定した。固定したスライドを、未
希釈のハイブリドーマ上清または１　：　１００〜ｌ：
５００に希釈した腹水液と室温で３０分間インキユベー
トシた。モノクローナル抗体とインキュベートした後、
スライドをＰＢＳ中で洗浄した。次いで、間接免疫ペル
オキシダーゼ法用に、Ｐ　Ｂ　Ｓで１・１０に希釈した
ペルオキシダーゼ−コンジュゲート化つサギ抗−マウス
Ｉ　ｇ（Ｄａｋｏ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　　Ｄｅ
ｎｍａｒｋ）で３０分間処理した。短時間（１分間）Ｐ
ＢＳで洗浄した後、スライドを室温で１０分間、ジアミ
ノベンジジン（０，６ｘ９／ｘｃ）および過酸化水素（
００１％）で染色し、ＰＢＳで洗浄した。ＡＰＡＡＰサ
ンドイッチ法を行うために、このスライドをＴＢＳで洗
浄し、次いでウサギ抗マウス免疫グロブリフ（Ｉｇ）血
清（ＤａｋｏｐａｔＬｓ　Ｃｏ、、　Ｃｏｐｅｎｈａｇ
ｅｎ、　Ｄｅｎｎ＋ａｒｋ）とともに３０分間インキュ
ベートし、次にアルカリホスファターゼ−抗−アルカリ
ホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）コンプレックスで３０分
間処理した［コーゲル等（Ｃｏｒｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ
、、　　＋９８４）の記載のようにして］。ウサギ抗マ
ウス１ｇ血清およびＡＰＡＡＰとのインキュベートを２
回繰り返し、次いでアルカリホスファターゼを改良Ｎｅ
ｗ　Ｆｕｃｈｓｉｎ法で可視化した。過剰の細菌発現ｍ
ｙｂタンパク質を用い、インキュベート前にｌｌ１ｙｂ
モノクロ一ナル抗体をブロックして競合実験を行った。

新鮮な組織の染色用に、凍結組織切片を顕微鏡スライド
に移し、アセｉ・ン中、次いでクロロホルト中でそれぞ
れ１５分間室温で固定した。

以下のすべての工程は、末梢血液、骨髄吸引液またはセ
ルラインからの白血病細胞の免疫染色のために上述した
ようにして行った。スライドを倍ｔ１５０〜８００の顕
微鏡下で試験する。

第５図は、抗−ｍｙｂモノクローナル抗体（σｍｙｂ）
の１１１３水液およびペルオキシダーゼ染色法を用いる
Ｍｏｆｔ−４細胞の免疫細胞化学分析を示すものである
。

免疫染色と競合させるため、（＋Ｃ）で示したように、
細菌発現のｍｙｂタンパク質を用いて抗体をブロックし
た。

第９図は、抗−ｍｙｂモノクローナル抗体の腹水液およ
びペルオキシダーゼ法（ｐｏ）を用いる２種類のヒト大
細胞Ｋ１−１リンパ腫および菌状息肉Ｉ１１１（ＭＦ）
からの凍結切片の免疫組織化学染色を示すものである。

ハイブリドーマクローン４／１４を用いる一連のヒト白
血病およびリンパ腫の免疫染色によって、ＴおよびＢ前
駆体ＡＬＬ（急性リンパ芽球白血病）における、ならび
にい（つかの非−ホジキンリンパ腫における、高いｃ−
ｍｙｂタンパク質の発現か示される（第１表をも参照）
。

実施例５ハイブリドーマクローン４／１４を用いるｃ−
Ｉｌｌｙｂタンパク質発現ヒト白血病およびリンパ腫の
蛍光活性化細胞選択 末梢血液または骨髄吸引液またはリンパ組織の単細胞懸
濁液から得られる白血病細胞を遠心し、ＰＢＳで２回洗
浄し、室温で１０分間９５％アセトンで処理し、ＰＢＳ
に再懸濁した（１０７細胞／ＭＱ）。その１００μＱを
、クローン４／１４の未希釈ハイブリドーマ上清１００
μａを用いて染色用に処理した。室温で４５分間おいた
後、試料を遠心し、そのペレットをフルオレセインイソ
チオシアネートとコンジュゲート化したウサギ免疫グロ
ブリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、、　ＭＬｉｎｃｈｅｎ）　
１０Ｉ７（ｌ中でインキュベートした。蛍光検定は、通
常のフローサイトメーター（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏａｅＬ
ｅｒ）を用いて行う。ｌｏｏｍＷの先の強さで４８８ｎ
ｍ線に変えたアルゴンレーザーを用いて、フルオレセイ
ンを付加した免疫グロブリンからの緑の蛍光を励起する
。それぞれの細胞からの蛍光シグナルを光検出器で定量
する。ｍｙｂ−発現細胞の数を、細胞計数（Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）によって得た全細胞数と比較す
る。同じ方法を適用し、細胞表面マーカーに対する、あ
るいはリンパ腫−特異的な抗原（例えば、Ｋ１−１）に
り、１する、他のモノクローナル抗体を用いることによ
る細胞の蛍光ラベル化によって、患者の病状の識別診断
が可能になる。

及鞭咋旦旧７−６０細胞の分化の銹導 指敗関数増殖期のＨＬ−６０細胞をＩＩａあたり２ＸＩ
Ｏ’細胞の密度で蒔き、１．２％ジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）あるいは１０″６Ｍレチン酸（Ｓｉｇｍａ
　；　１０−３Ｍエタノールストックから希釈した）の
どちらかを用いて６時間処理した。ホルボール　ｌ　２
−ミリステート　１３−アセテート（ＰＭＡ）誘導を、
４０　ｎＭ　　Ｐ　Ｍ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　：エタノー
ルト７σあたりｌ、ｌ！９のストックから希釈した）を
用いて２４時間行った。次いで、細胞をリン酸緩衝食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄し、誘導試薬の存在下、代謝法によ
ってラベルした。次いで、この細胞を、実施例２の記載
と同様にして間接免疫沈澱にかけた。

第１１図は、レチン酸（ＲＡ）、ジメチルスルホキンド
（ＤＭＳＯ）あるいはホルボールエステル（ｐＭＡ）に
よる処理を行ったかく＋）、または行っていない（−）
、ＨＬ−６０細胞由来のヒトｃ−ｍｙｂタンパク質（ｐ
７５−ｍｙｂ）およびヒトｃ−１Ｉｌｙｃタンパク質（
ｐ６４　ｃ−ｍｙｃ）の間接免疫沈澱を示すものである
。免疫沈澱は、正常なウサギ血清（Ｎ　ＲＳ　）、ウサ
ギ抗ｖ−ｍｙｃおよびウサギ抗−ｖ−ｍｙｂｌｆｎ清（
Ｒａｔａｙｃ、　Ｒａｍｙｂ）、ミエローマ細胞由来の
対照上清（Ｎ　Ｓ　−１）、および抗−Ｂｂモノクロー
ナル抗体からの腹水液（αｍｙｂ’″ｏｎｏ）を用いて
行った。Ｍは第１図に記載したものと同じ分子ｍマーカ
ーである。暴露時間は３〜１０日である。

実施例７　ミトゲン刺激 ｌＯ％ＦＣ３、抗生物質、およびｌ　ｔｔ９／Ｍ（１（
Ｄ　ＰＨＡ（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ）を追加したＲＰＭＩ培地
に、１Ｒ（ｌあたりＩＱ”の濃度で蒔いた、ＰＢＭＮＣ
，精ラフした′■゛−リンパ球、Ｔ４’あるいはＴ８’
細胞を用いてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）による刺
激を行った。ｌ）　ＨＡ処理のＯｌｌ、２および３日後
に、細胞懸濁液を細胞遠心（Ｓｈａｎｄｏｎ　Ｃｏ、　
）によりスライド」二に、免疫細胞化学染色用に処理し
た。ホルマＪン固定シたスタフィロコッカス・アウレウ
スＣｏｗａｎ　ｌ細菌２　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’（ｖ／ｖ）を
念むＲＰＭＩ培地中、ｌｊ！σあたり２Ｘ１０５の濃度
で蒔いた、Ｂ−細胞に富む集団を用いて、スタフィロコ
ッカス・アウレウスによる刺激を行った。細胞を集め、
細胞遠心にかけ、０、ｌ、２および３日目に免疫細胞化
学染色にかけた。

第８図は、抗−ｍｙｂモノクローナル抗体の腹水液およ
びＡＰＡＡＰ法を用いて、Ｐ　Ｉ−Ｉ　Ａ刺激を行う前
（Δ）、およびＰ　ＨＡ刺激の３日目（Ｂ）のヒトＴ８
゛細胞、ならびにプレロー細胞型のリンパ芽球リンパ腫
（Ｃ）について免疫細胞化学染色を行った結果を示すも
のである。

ハイプリドーマセルラインクローン４／１４は、ブダペ
スト協定に基づき、１９８７年６月２２日にＮ　ＣＡ　
ＣＣ（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）に
寄託され、寄託番号Ｎｏ、　８７０６２３０１を受けた
。

参照文献 コーゲル、ファリニ、エルバー、ゴーシュ、アブドゥラ
ジッツ、マクドナルド、プルフォード、スティンおよび
メイゾン［Ｃｏｒｄｅｌ　ｌ、　Ｊ、　Ｌｌ、　Ｆａｌ
ｉｎｉ。

Ｂ、、　Ｅｒｂｅｒ、Ｗ、Ｎ、、　Ｇｈｏｓｈ、＾、に
、、＾ｂｄｕｌａｚｉｚ、Ｚ、、　Ｍａｃｄｏｎａｌｄ
、Ｓ、、　Ｐｕ１ｆｏｒｄ、に、Ａ、Ｆ、、　５ｔｅｉ
ｎ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｍａｓｏｎ、　Ｄ、　Ｙ、　（１９
１１１４）　　Ｊ、　１ＩｉｓＬｏｃｈｅＩＩ１．　Ｃ
ｙｔｏ−ｃｈｅｌｌ、　。

３２、２１９−２２９］ ガルフレおよびミルシュタイン［Ｇａ１ｆｒｅ、Ｇ、　
ａｎｄｌｌｉｌｓｔｅｉｎ、ｃ、　　（１９ｇ＋）　　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、７３．３　ｅｔ　５ｅｑｑ、］］グライサーー
ビルケオーワダおよびメーリング［Ｇｒｅｉｓｅｒ−Ｙ
ｉｌｋｅ、　１．、　Ｏｗａｄａ、ｔＫ、　ａｎｄ　Ｍ
ｏｅｌｌｉｎｇ。

に、　　（＋９８１）　　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　３９
．３２５−３２９］クレンブナウアー、ボニファーおよ
び／、ベル［Ｋｌｅｍｐｎａｕｅｒ、に、−１１，、Ｂ
ｏｎｉｆｅｒ、Ｃ，ａｎｄ　５ｉｐｐｅｌ、＾Ｅ（＋９
８６）　　ＥＭＢＯＪ、、　５．１９０３−１９１１］
カイトおよびドーリトル［ＫｙＬｅ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｄ
ｏｏｌｉＬｔＩｅ、Ｒ，Ｐ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　　１５７．　１０５−Ｈ２］メ
ーリング、ハイマン、ペイムリング、ベブラ、ケプラー
　へイブマンおよびパルツアー［Ｍｏｅｌｉｎｇ、に、
、　ｌｌｅｉｍａｎｎ、Ｂ、、　Ｂｅｉｍｌｉｎｇ、Ｐ
、、　Ｂｅｐｌｅｒ、Ｇ、。

Ｋ６ｐｐｌｅｒ、Ｉｌ、、　ｌｌａｖｅｍａｎｎ、に、
　ａｎｄ　Ｂａ１ｚｅｒ、Ｔ、　（１９８７）Ｃｏｎｔ
ｒ、　０ｎｃｏ１．、　Ｖｏｌ、２４．７６−８６］メ
ーリング、バッフ、ベウグ、ペイムリング、ブンテ、シ
ャシーおよびグラフ［Ｍｏｅｌｌｉｎｇ、に、、　Ｐｆ
ａｆｆ、Ｅ、、　Ｂｅｕｇ、Ｉｆ、、　Ｂｅｉｍｌｉｎ
ｇ、Ｐ、、　Ｂｕｎｔｅ、Ｔ、、　５ｃｈａ１１ｅｒ、
１１．Ｅ、　ａｎｄ　Ｇｒａｆ、Ｔ、　　（１９８５）
　　Ｃｅ１ｌ　　４０　９８３９９０］

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトｃ−ｍｙｂタンパク質（ｐ７５　ｃ−ｍ
ｙｂ）およびウィルスｆｆ１ｙｂタンパク質（ｐ４８　
ｖ−ｍｙｂ）の間接免疫沈澱の結果を示す模式図であり
、第２図は、合成のｖ−ＩＩｌｙｂ特異的なペプチドに
よる免疫沈澱反応の競合の結果を示す模式図であり、第
３図は、ｖ−ｍｙｂコード化領化合域限酵素で切断して
得られた３種のフラグメントを大腸菌中で発現させ、そ
の発現タンパク質をウェスタンプロットにかけた結果を
示す模式図（Ａ）、ならびに完全なり−ｍｙｂ遺伝子、
その制限酵素切断フラグメントおよび合成ペプチドの位
置関係を示す模式図、完全なり７ｍｙｂ遺伝子の親水性
カーブを示すグラフ、およびｖ−ｍｙｂとヒトｃ−ｍｙ
ｂのアミノ酸の配列図（Ｂ）であり、第４図は、ＨＬ−
６０細胞由来のヒトｃ−ｍｙｂタンパク質（ｐ７５−ｍ
ｙｂ）およびヒトｃ−ｔａｙｃタンパク質（ｐ６４ｃｍ
ａｙｅ）について間接免疫沈澱を行った結果を示す模式
図であり、第５図は、抗−Ｂｂモノクローナル抗体（ｌ
！ｌ１ｙｂ）の腹水液およびペルオキシダーゼ染色法を
用いてＭｏ１ｔ−４細胞を免疫細胞化学分析にかけた結
果を示す模式図であり、第６図は、モノクローナル抗体
４／１４を用いてトリ８Ｍ−２細胞の核を免疫細胞化学
法によって染色したときの結果を示す模式図であり、第
７図は、免疫細胞化学法による検定を説明する模式図で
あり、第８図は、ＰＨＡ刺激をしたヒトＴ８°細胞、お
よびブレＢ細胞型のリンパ芽球リンパ腫について免疫細
胞化学染色を行った結果を示す模式図であり、第９図は
、抗−ｍｙｂモノクローナル抗体の腹水液およびベルオ
キ／ダーゼ法（ｐｏ）を用いて、２種類のヒト大細胞Ｋ
１−１’Ｊンパ腫および菌状息肉腫（Ｍ　Ｆ　）由来の
凍結切片について免疫組織化学染色を行った結果を示す
模式図である。 特許出願人　マノクスープランクーゲゼル／ヤフト・ツ
ア・フエルデルング・デア・ヴイッセンシャフテン・ニ
ー・ファウ 代理人弁理士　青白　葆　外１名 図面の浄書（内容に変更なし） 第２図 ｐ７５ｈ＋−ｃ−ｍｙｂ 第３図 第５７ （ｆｍｙｂ”” αＭＳ２ 日 Ｍｏ１ｔ−４＋（ｙ＋ｙｂ ヒ ト ＡＩＱＲＨＹＮＩ）ＥＤＰＥＫＥＫＦ？工ＫＥＬＥＬＬ
ＬＭＭｏＬｔ−４＋　ｃｕｒｒｙｂ　＋　Ｃ第４ ＭＡ　− ＭＡ ＲΔ　− Ｎ７図 第８図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、親水性であり、そして／または脊椎動物のｃ−ｍｙ
   ｂタンパク質中に保存されているエピトープと反応性で
   あるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセル
   ライン。 ２、ヒトｃ−ｍｙｂタンパク質の、アミノ酸配列：【遺
   伝子配列があります】 からなるエピトープを認識し、そしてウィルスおよびヒ
   トｃ−ｍｙｂタンパク質の両者と反応性であるモノクロ
   ーナル抗体を分泌する請求項１記載のセルライン。 ３、親水性であり、そして／または脊椎動物のｃ−ｍｙ
   ｂタンパク質中に保存されているエピトープと反応性で
   あるモノクローナル抗体。 ４、ヒトｃ−ｍｙｂタンパク質の、アミノ酸配列：【遺
   伝子配列があります】 からなるエピトープを認識し、そしてウィルスおよびヒ
   トｃ−ｍｙｂタンパク質の両者と反応性であるモノクロ
   ーナル抗体。 ５、ｃ−ｍｙｂタンパク質を発現するヒト組織、細胞ま
   たはセルラインを含んでいると疑われている試料との免
   疫細胞化学反応において、請求項３または４に記載のモ
   ノクローナル抗体を用いることを特徴とする、該ヒト組
   織、細胞またはセルラインにおけるｃ−ｍｙｂタンパク
   質の発現を免疫細胞化学的に検出する方法。 ６、細胞が造血系およびリンパ系細胞である請求項５記
   載の方法。 ７、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いる請求項
   ５または６に記載の方法。 ８、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンプロット法または間接免
   疫沈澱法を用いる請求項５または６に記載の方法。 ９、請求項３または４に記載のモノクローナル抗体、対
   照抗体、洗浄用緩衝液、放射活性によってラベルされて
   いるかまたはペルオキシダーゼあるいはアルカリホスフ
   ァターゼなどの指示薬でラベルされている第２のポリク
   ローナルまたはモノクローナル抗体、および基質からな
   る、ヒト腫瘍細胞中のｃ−ｍｙｂを検出するためのキッ
   ト。 １０、請求項３または４に記載のモノクローナル抗体の
   有効量と薬学的に許容しうる担体からなる、ｃ−ｍｙｂ
   タンパク質を過剰産生する細胞を除去するための医薬組
   成物。