JPH0838175A - 不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及びこれを配合した化粧料 - Google Patents
不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及びこれを配合した化粧料Info
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- JPH0838175A JPH0838175A JP19789494A JP19789494A JPH0838175A JP H0838175 A JPH0838175 A JP H0838175A JP 19789494 A JP19789494 A JP 19789494A JP 19789494 A JP19789494 A JP 19789494A JP H0838175 A JPH0838175 A JP H0838175A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 不溶性担体に共有結合により固定化された不
溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及び不溶性担体に固
定化されたセリンプロテアーゼを配合することを特徴と
する化粧料である。 【効果】 各種薬品、温度、ｐＨの広い範囲にわたり安
定で、長期間にわたり高い酵素活性を保持することが可
能な不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供するこ
とができる。化粧料の製造又は貯蔵中における酵素活性
の失活を防止し、化粧料使用時にその効果を発揮し得る
と同時に、経皮吸収されず角質のみに作用することによ
って、表皮を適正な状態に維持できる化粧料を提供する
ことができる。
溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及び不溶性担体に固
定化されたセリンプロテアーゼを配合することを特徴と
する化粧料である。 【効果】 各種薬品、温度、ｐＨの広い範囲にわたり安
定で、長期間にわたり高い酵素活性を保持することが可
能な不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供するこ
とができる。化粧料の製造又は貯蔵中における酵素活性
の失活を防止し、化粧料使用時にその効果を発揮し得る
と同時に、経皮吸収されず角質のみに作用することによ
って、表皮を適正な状態に維持できる化粧料を提供する
ことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は不溶性担体に共有結合に
より固定化されたセリンプロテアーゼ及びこれを配合し
た化粧料に関するものである。
より固定化されたセリンプロテアーゼ及びこれを配合し
た化粧料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】皮膚は角質層によって保護されている。
この角質層は角質細胞からなり、角質細胞間は脂質によ
って満たされ、細胞同志の接着には蛋白質が関与してい
ることが、近年証明されつつある。
この角質層は角質細胞からなり、角質細胞間は脂質によ
って満たされ、細胞同志の接着には蛋白質が関与してい
ることが、近年証明されつつある。
【０００３】セリンプロテアーゼは、この細胞間接着蛋
白質に作用し角層細胞の剥離に作用しているため、その
機能が低下すると落層が発生したり肌荒れ状態を生じ
る。したがって、セリンプロテアーゼを角層に供給する
ことにより、異常角化や角層ターンオーバーの異常をコ
ントロールし、表皮を適正な状態に維持することができ
る。
白質に作用し角層細胞の剥離に作用しているため、その
機能が低下すると落層が発生したり肌荒れ状態を生じ
る。したがって、セリンプロテアーゼを角層に供給する
ことにより、異常角化や角層ターンオーバーの異常をコ
ントロールし、表皮を適正な状態に維持することができ
る。
【０００４】しかしながら、このセリンプロテアーゼ
を、直接表皮に塗布すると、経皮吸収され、かえって皮
膚全体のバランスを崩してしまう。したがって、最外層
の角質のみに作用する剤形で供給することが望ましい。
を、直接表皮に塗布すると、経皮吸収され、かえって皮
膚全体のバランスを崩してしまう。したがって、最外層
の角質のみに作用する剤形で供給することが望ましい。
【０００５】また、セリンプロテアーゼは各種の薬品、
ｐＨ、温度などに対し極めて不安定であるので、そのま
ま化粧料に配合すると失活が早く、貯蔵中に、または製
造中に失活し、化粧料使用時にその効果を期待すること
が難しい。
ｐＨ、温度などに対し極めて不安定であるので、そのま
ま化粧料に配合すると失活が早く、貯蔵中に、または製
造中に失活し、化粧料使用時にその効果を期待すること
が難しい。
【０００６】一方、酵素活性の安定性などの点から、各
種酵素を各種担体に固定化することは従来行われていた
が、セリンプロテアーゼ特有の酵素活性に注目し、この
特有の酵素活性を有効に利用する観点から、固定化すべ
き不溶性担体の研究及び固定化する際の結合方法などの
研究は、セリンプロテアーゼの特性特にトリプシン及び
キモトリプシンの特性のみに注目した形では現在まで注
意深く行われたことはなかった。
種酵素を各種担体に固定化することは従来行われていた
が、セリンプロテアーゼ特有の酵素活性に注目し、この
特有の酵素活性を有効に利用する観点から、固定化すべ
き不溶性担体の研究及び固定化する際の結合方法などの
研究は、セリンプロテアーゼの特性特にトリプシン及び
キモトリプシンの特性のみに注目した形では現在まで注
意深く行われたことはなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、細胞
間接着蛋白質に作用するセリンプロテアーゼを、不溶性
担体に共有結合させて、各種薬品、温度、ｐＨの広い範
囲にわたり安定で、長期間にわたり酵素活性を保つこと
が可能な不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供す
ることにある。
間接着蛋白質に作用するセリンプロテアーゼを、不溶性
担体に共有結合させて、各種薬品、温度、ｐＨの広い範
囲にわたり安定で、長期間にわたり酵素活性を保つこと
が可能な不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供す
ることにある。
【０００８】さらに、不溶性担体固定化セリンプロテア
ーゼを化粧料に配合することにより、製造又は貯蔵中の
酵素活性の失活を防止し、化粧料使用時にその効果を発
揮し得ると同時に、経皮吸収されず角質のみに作用する
ことによって、表皮を適正な状態に維持できる化粧料を
提供することを本発明の目的とする。
ーゼを化粧料に配合することにより、製造又は貯蔵中の
酵素活性の失活を防止し、化粧料使用時にその効果を発
揮し得ると同時に、経皮吸収されず角質のみに作用する
ことによって、表皮を適正な状態に維持できる化粧料を
提供することを本発明の目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、不溶性担体に
共有結合によりセリンプロテアーゼを固定化してなる不
溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供するものであ
る。
共有結合によりセリンプロテアーゼを固定化してなる不
溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供するものであ
る。
【００１０】また、本発明は、固定化される不溶性担体
が疎水性表面を有することを特徴とする共有結合により
固定化された不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提
供するものである。
が疎水性表面を有することを特徴とする共有結合により
固定化された不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提
供するものである。
【００１１】さらに、本発明は、固定化される不溶性担
体がポリメチルシロキサンで被覆されていることを特徴
とする共有結合により固定化された不溶性担体固定化セ
リンプロテアーゼを提供するものである。
体がポリメチルシロキサンで被覆されていることを特徴
とする共有結合により固定化された不溶性担体固定化セ
リンプロテアーゼを提供するものである。
【００１２】また、本発明は、不溶性担体を、セリンプ
ロテアーゼと共有結合可能な官能基を有する化合物で被
覆し、セリンプロテアーゼを該官能基と共有結合して固
定化することを特徴とする不溶性担体固定化セリンプロ
テアーゼを提供するものである。
ロテアーゼと共有結合可能な官能基を有する化合物で被
覆し、セリンプロテアーゼを該官能基と共有結合して固
定化することを特徴とする不溶性担体固定化セリンプロ
テアーゼを提供するものである。
【００１３】さらに、本発明は、Ｓｉ-Ｈ部分を少なく
とも１個をもつシリコーンポリマーで不溶性担体を被覆
し、さらに該Ｓｉ-Ｈ部分と反応可能な化合物を、不溶
性担体に被覆したシリコーンポリマーのＳｉ-Ｈ部分に
付加させることによって、付加した前記化合物から誘導
されるアミノ基、カルボキシル基、スルホ基、水酸基、
ポリアルキレンエーテル基又はエポキシ基から選ばれた
少なくとも１種以上の官能基基と直接又はスペーサー化
合物を介して共有結合によりセリンプロテアーゼを固定
化することを特徴とする不溶性担体固定化セリンプロテ
アーゼを提供するものである。
とも１個をもつシリコーンポリマーで不溶性担体を被覆
し、さらに該Ｓｉ-Ｈ部分と反応可能な化合物を、不溶
性担体に被覆したシリコーンポリマーのＳｉ-Ｈ部分に
付加させることによって、付加した前記化合物から誘導
されるアミノ基、カルボキシル基、スルホ基、水酸基、
ポリアルキレンエーテル基又はエポキシ基から選ばれた
少なくとも１種以上の官能基基と直接又はスペーサー化
合物を介して共有結合によりセリンプロテアーゼを固定
化することを特徴とする不溶性担体固定化セリンプロテ
アーゼを提供するものである。
【００１４】また、本発明は、テトラメチルシクロテト
ラシロキサンを不溶性担体表面で重合させて、ポリメチ
ルシロキサンで被覆された不溶性担体を製造し、次に、
アリルグリシジルエーテルを該不溶性担体に反応させて
担体表面にエポキシ基を導入し、次いで該エポキシ基に
アルキルアミンを反応させて担体表面にアミノ基を導入
し、該アミノ基と共有結合によりセリンプロテアーゼを
固定化することを特徴とする不溶性担体固定化セリンプ
ロテアーゼを提供するものである。
ラシロキサンを不溶性担体表面で重合させて、ポリメチ
ルシロキサンで被覆された不溶性担体を製造し、次に、
アリルグリシジルエーテルを該不溶性担体に反応させて
担体表面にエポキシ基を導入し、次いで該エポキシ基に
アルキルアミンを反応させて担体表面にアミノ基を導入
し、該アミノ基と共有結合によりセリンプロテアーゼを
固定化することを特徴とする不溶性担体固定化セリンプ
ロテアーゼを提供するものである。
【００１５】さらに、本発明は、上記セリンプロテアー
ゼがトリプシン又はキモトリプシンであることを特徴と
する不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供するも
のである。
ゼがトリプシン又はキモトリプシンであることを特徴と
する不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供するも
のである。
【００１６】また、本発明は、上記記載の不溶性担体固
定化セリンプロテアーゼを配合することを特徴とする化
粧料を提供するものである。
定化セリンプロテアーゼを配合することを特徴とする化
粧料を提供するものである。
【００１７】さらに、本発明は、上記記載の不溶性担体
固定化セリンプロテアーゼ及び保湿剤を配合することを
特徴とする化粧料を提供するものである。
固定化セリンプロテアーゼ及び保湿剤を配合することを
特徴とする化粧料を提供するものである。
【００１８】また、本発明は、上記セリンプロテアーゼ
がトリプシン又はキモトリプシンであることを特徴とす
る化粧料を提供するものである。
がトリプシン又はキモトリプシンであることを特徴とす
る化粧料を提供するものである。
【００１９】以下に本発明を詳述する。本発明に使用す
るセリンプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン
を含み、豚膵臓、牛膵臓などより抽出されたものが市販
されている。本発明においてはこれらの市販のセリンプ
ロテアーゼのいかなるものでも使用可能であるが、好ま
しくは、トリプシン又はキモトリプシンであり、さらに
好ましくはトリプシンである。
るセリンプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン
を含み、豚膵臓、牛膵臓などより抽出されたものが市販
されている。本発明においてはこれらの市販のセリンプ
ロテアーゼのいかなるものでも使用可能であるが、好ま
しくは、トリプシン又はキモトリプシンであり、さらに
好ましくはトリプシンである。
【００２０】不溶性担体とは水に不溶の固体材料を言
い、セリンプロテアーゼが共有結合により固定化されそ
の活性を維持できるものであれば寸法、形状、及び材質
などの点において特に限定されない。
い、セリンプロテアーゼが共有結合により固定化されそ
の活性を維持できるものであれば寸法、形状、及び材質
などの点において特に限定されない。
【００２１】しかしながら、例えば、その用途がある製
品に添加する配合成分の場合には粉体が好ましく、例え
ば、化粧料に配合する場合においては、雲母、シリカ、
酸化チタンなどの無機質粉体が好ましく使用される。
品に添加する配合成分の場合には粉体が好ましく、例え
ば、化粧料に配合する場合においては、雲母、シリカ、
酸化チタンなどの無機質粉体が好ましく使用される。
【００２２】本発明において、特に不溶性担体の表面は
疎水性であることが好ましく、担体表面が疎水性を有す
るように、不溶性担体の表面をセリンプロテアーゼと共
有結合可能な官能基を有する化合物で被覆することが好
ましい。疎水性を有する化合物で被覆した後に、共有結
合可能な官能基を担体の疎水性表面に導入することも好
ましい方法である。特に、好ましくは、ポリメチルシロ
キサンで被覆した不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ
である。
疎水性であることが好ましく、担体表面が疎水性を有す
るように、不溶性担体の表面をセリンプロテアーゼと共
有結合可能な官能基を有する化合物で被覆することが好
ましい。疎水性を有する化合物で被覆した後に、共有結
合可能な官能基を担体の疎水性表面に導入することも好
ましい方法である。特に、好ましくは、ポリメチルシロ
キサンで被覆した不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ
である。
【００２３】不溶性担体に、セリンプロテアーゼを共有
結合により固定化するとは、不溶性担体が有する官能基
とセリンプロテアーゼのアミノ基またはカルボキシル基
とが直接共有結合を形成して固定化されたり、あるい
は、担体が有する官能基とセリンプロテアーゼのアミノ
基又はカルボキシル基の間にスペーサーとなり得る媒体
化合物を通して共有結合により固定化されている場合を
言う。結果として、セリンプロテアーゼがその活性を維
持した状態で不溶性担体に共有結合していればよい。不
溶性担体自身が初めからセリンプロテアーゼと共有結合
できる官能基を有していてもよいが、直接有していない
場合においても、担体を該官能基を有する化合物で被覆
したり、あるいはある化合物で被覆した後に、他の化合
物（スペーサー）との化学反応により官能基を導入して
本発明に使用することが可能である。
結合により固定化するとは、不溶性担体が有する官能基
とセリンプロテアーゼのアミノ基またはカルボキシル基
とが直接共有結合を形成して固定化されたり、あるい
は、担体が有する官能基とセリンプロテアーゼのアミノ
基又はカルボキシル基の間にスペーサーとなり得る媒体
化合物を通して共有結合により固定化されている場合を
言う。結果として、セリンプロテアーゼがその活性を維
持した状態で不溶性担体に共有結合していればよい。不
溶性担体自身が初めからセリンプロテアーゼと共有結合
できる官能基を有していてもよいが、直接有していない
場合においても、担体を該官能基を有する化合物で被覆
したり、あるいはある化合物で被覆した後に、他の化合
物（スペーサー）との化学反応により官能基を導入して
本発明に使用することが可能である。
【００２４】好ましくは、セリンプロテアーゼのアミノ
基またはカルボキシル基と共有結合可能なエポキシ基、
アミノ基またはカルボキシル基を有するポリマーで不溶
性担体を被覆して、これにセリンプロテアーゼを反応さ
せ、ペプチド結合により不溶性担体固定化セリンプロテ
アーゼを製造することができる。
基またはカルボキシル基と共有結合可能なエポキシ基、
アミノ基またはカルボキシル基を有するポリマーで不溶
性担体を被覆して、これにセリンプロテアーゼを反応さ
せ、ペプチド結合により不溶性担体固定化セリンプロテ
アーゼを製造することができる。
【００２５】また、セリンプロテアーゼと共有結合可能
なエポキシ基、アミノ基またはカルボキシル基は、不溶
性担体表面での化学反応により担体表面に導入すること
も可能である。本発明の好ましい態様としては、Ｓｉ−
Ｈ部分を少なくとも１個有するシリコーンポリマー皮膜
で粉体を被覆し、該被覆粉体に、同一分子内に不飽和結
合と、エポキシ基、アミノ基又はカルボキシル基を有す
る化合物を反応させることにより、Ｓｉ−Ｈ部分に該化
合物が付加することによって、エポキシ基、アミノ基ま
たはカルボキシル基を有する不溶性担体を得ることがで
き、これにセリンプロテアーゼを反応させ、ペプチド結
合により共有結合されて得られた不溶性担体固定化セリ
ンプロテアーゼである。
なエポキシ基、アミノ基またはカルボキシル基は、不溶
性担体表面での化学反応により担体表面に導入すること
も可能である。本発明の好ましい態様としては、Ｓｉ−
Ｈ部分を少なくとも１個有するシリコーンポリマー皮膜
で粉体を被覆し、該被覆粉体に、同一分子内に不飽和結
合と、エポキシ基、アミノ基又はカルボキシル基を有す
る化合物を反応させることにより、Ｓｉ−Ｈ部分に該化
合物が付加することによって、エポキシ基、アミノ基ま
たはカルボキシル基を有する不溶性担体を得ることがで
き、これにセリンプロテアーゼを反応させ、ペプチド結
合により共有結合されて得られた不溶性担体固定化セリ
ンプロテアーゼである。
【００２６】さらに好ましい態様としては、テトラメチ
ルシクロテトラシロキサンを不溶性担体表面で重合させ
て、ポリメチルシロキサンで被覆された不溶性担体を製
造し、次に、アリルグリシジルエーテルを該不溶性担体
に反応させて担体表面にエポキシ基を導入し、次いで該
エポキシ基にアルキルアミンを反応させて担体表面にア
ミノ基を導入し、該アミノ基と共有結合によりセリンプ
ロテアーゼ、特にはトリプシンまたはキモトリプシンを
固定化することを特徴とした不溶性担体固定化セリンプ
ロテアーゼである。
ルシクロテトラシロキサンを不溶性担体表面で重合させ
て、ポリメチルシロキサンで被覆された不溶性担体を製
造し、次に、アリルグリシジルエーテルを該不溶性担体
に反応させて担体表面にエポキシ基を導入し、次いで該
エポキシ基にアルキルアミンを反応させて担体表面にア
ミノ基を導入し、該アミノ基と共有結合によりセリンプ
ロテアーゼ、特にはトリプシンまたはキモトリプシンを
固定化することを特徴とした不溶性担体固定化セリンプ
ロテアーゼである。
【００２７】このようにして得られた不溶性担体固定化
セリンプロテアーゼは、セリンプロテアーゼの活性を損
なわない範囲で、化粧水、クリーム、ローション、ファ
ンデーションなどに配合することにより、表皮を適正な
状態に維持する本発明の化粧料を提供することができ
る。
セリンプロテアーゼは、セリンプロテアーゼの活性を損
なわない範囲で、化粧水、クリーム、ローション、ファ
ンデーションなどに配合することにより、表皮を適正な
状態に維持する本発明の化粧料を提供することができ
る。
【００２８】さらに、この化粧料に、保湿剤を添加する
と角質中の水分量が増加し、セリンプロテアーゼ特には
トリプシン又はキモトリプシンの酵素作用を高めること
がことが可能となり、本発明のさらに優れた化粧料を提
供することができる。
と角質中の水分量が増加し、セリンプロテアーゼ特には
トリプシン又はキモトリプシンの酵素作用を高めること
がことが可能となり、本発明のさらに優れた化粧料を提
供することができる。
【００２９】用いる保湿剤としては、グリセリン、１、
３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソル
ビット、トレハロース、マルチトール、マンニット、マ
ルトース、水アメ、マロニエエキスなどが挙げられる。
特に好ましくは、上記の不溶性担体固定化トリプシン又
は不溶性担体固定化キモトリプシンと、グリセリンまた
はジプロピレングリコールの組合せである。
３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソル
ビット、トレハロース、マルチトール、マンニット、マ
ルトース、水アメ、マロニエエキスなどが挙げられる。
特に好ましくは、上記の不溶性担体固定化トリプシン又
は不溶性担体固定化キモトリプシンと、グリセリンまた
はジプロピレングリコールの組合せである。
【００３０】
【実施例】以下に本発明の好ましい実施例を説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００３１】［不溶性担体の製造例１］焼成セリサイト
５００ｇと、テトラメチルシクロテトラシロキサン４０
ｇとを別々の容器に入れ、真空デシケーター中に入れて
８０℃に加温し、１６時間放置した。反応終了後、テト
ラメチルシクロテトラシロキサンを取り除き、３回減圧
脱気を繰返して吸着しているテトラメチルシクロテトラ
シロキサンを除去した。こうして製造した不溶性担体で
ある粉体の赤外吸収スペクトルおよび元素分析を行っ
た。
５００ｇと、テトラメチルシクロテトラシロキサン４０
ｇとを別々の容器に入れ、真空デシケーター中に入れて
８０℃に加温し、１６時間放置した。反応終了後、テト
ラメチルシクロテトラシロキサンを取り除き、３回減圧
脱気を繰返して吸着しているテトラメチルシクロテトラ
シロキサンを除去した。こうして製造した不溶性担体で
ある粉体の赤外吸収スペクトルおよび元素分析を行っ
た。
【００３２】赤外吸収スペクトルはＦＴＩＲ−８１００
Ｍ（島津製作所製）を用いて拡散反射法で、粉体をその
まま測定した。測定条件は、分解能８ｃｍ-1で６００〜
４０００ｃｍ-1の範囲で測定した。また、元素分析はＣ
ＨＮ２４００型元素分析装置（パーキンエルマー製）を
用いて行った。
Ｍ（島津製作所製）を用いて拡散反射法で、粉体をその
まま測定した。測定条件は、分解能８ｃｍ-1で６００〜
４０００ｃｍ-1の範囲で測定した。また、元素分析はＣ
ＨＮ２４００型元素分析装置（パーキンエルマー製）を
用いて行った。
【００３３】赤外吸収スペクトルの結果から、不溶性担
体である粉体は、未処理の焼成セリサイトと比較して、
２９７０ｃｍ-1にＣ−Ｈ非対称伸縮振動、２９０５ｃｍ
-1にＣ−Ｈ対称伸縮振動、２１６０ｃｍ-1にＳｉ−Ｈ対
称伸縮振動、１４０８ｃｍ-1にＣ−Ｈ非対称変角振動、
および１２６５ｃｍ-1にＣ−Ｈ対称変角振動を示唆する
ピークがそれぞれ観測された。このことから、この処理
によって焼成セリサイトの表面はポリメチルシロキサン
で被覆されたことがわかる。
体である粉体は、未処理の焼成セリサイトと比較して、
２９７０ｃｍ-1にＣ−Ｈ非対称伸縮振動、２９０５ｃｍ
-1にＣ−Ｈ対称伸縮振動、２１６０ｃｍ-1にＳｉ−Ｈ対
称伸縮振動、１４０８ｃｍ-1にＣ−Ｈ非対称変角振動、
および１２６５ｃｍ-1にＣ−Ｈ対称変角振動を示唆する
ピークがそれぞれ観測された。このことから、この処理
によって焼成セリサイトの表面はポリメチルシロキサン
で被覆されたことがわかる。
【００３４】ポリメチルシロキサン被覆量は、処理前後
の元素分析により炭素含有量の差から２．６５％、テト
ラメチルシクロテトラシロキサンの分子量に換算して４
４２μｍｏｌ・ｇ-1であった。このようにして得た処理
焼成セリサイトをクロロホルム等の溶媒で洗浄してもポ
リメチルシロキサンは表面から除去されなかった。
の元素分析により炭素含有量の差から２．６５％、テト
ラメチルシクロテトラシロキサンの分子量に換算して４
４２μｍｏｌ・ｇ-1であった。このようにして得た処理
焼成セリサイトをクロロホルム等の溶媒で洗浄してもポ
リメチルシロキサンは表面から除去されなかった。
【００３５】エタノール１５００ｍｌに、上記で得たポ
リメチルシロキサン被覆焼成セリサイトの粉体４００
ｇ、アリルグリシジルエーテル５７．０ｇおよび塩化白
金酸−トリブチルアミン塩２０ｍｇを添加し、５０℃、
６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下
１００℃で１６時間乾燥し、エポキシ基を導入した不溶
性担体を得た。
リメチルシロキサン被覆焼成セリサイトの粉体４００
ｇ、アリルグリシジルエーテル５７．０ｇおよび塩化白
金酸−トリブチルアミン塩２０ｍｇを添加し、５０℃、
６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下
１００℃で１６時間乾燥し、エポキシ基を導入した不溶
性担体を得た。
【００３６】赤外吸収スペクトルを測定した結果、ポリ
メチルシロキサン被覆焼成セリサイトに存在した２１６
０ｃｍ-1のＳｉ−Ｈ対称伸縮振動のピークがなくなり、
３０５０ｃｍ-1にエポキシ環を含むメチレン基及びメチ
ン基のＣ−Ｈ伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、ＳｉＨにアリルグリシジルエーテルが付
加して、エポキシ基が導入されたことがわかる。
メチルシロキサン被覆焼成セリサイトに存在した２１６
０ｃｍ-1のＳｉ−Ｈ対称伸縮振動のピークがなくなり、
３０５０ｃｍ-1にエポキシ環を含むメチレン基及びメチ
ン基のＣ−Ｈ伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、ＳｉＨにアリルグリシジルエーテルが付
加して、エポキシ基が導入されたことがわかる。
【００３７】アリルグリシジルエーテル付加量は、元素
分析による炭素含有量の差から２．６９％、分子量から
換算して２３６μｍｏｌ・ｇ-1であった。
分析による炭素含有量の差から２．６９％、分子量から
換算して２３６μｍｏｌ・ｇ-1であった。
【００３８】［不溶性担体の製造例２］エタノール１５
０ｍｌに、上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０
ｇ、エチレンジアミン０．９６ｇを添加し、７５℃で６
時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下１
１０℃で１６時間乾燥した。
０ｍｌに、上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０
ｇ、エチレンジアミン０．９６ｇを添加し、７５℃で６
時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下１
１０℃で１６時間乾燥した。
【００３９】赤外吸収スペクトルを測定した結果、３０
５０ｃｍ-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピ
ークが消失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１
級アミンのＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測
された。このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基
が導入されたことがわかる。エチレンジアミンの付加量
は１８２μｍｏｌ・ｇ-1であった。
５０ｃｍ-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピ
ークが消失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１
級アミンのＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測
された。このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基
が導入されたことがわかる。エチレンジアミンの付加量
は１８２μｍｏｌ・ｇ-1であった。
【００４０】［不溶性担体の製造例３］エタノール１５
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
ジエチレントリアミン１．６５ｇを添加し、７５℃で６
時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下１
１０℃で１６時間乾燥した。
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
ジエチレントリアミン１．６５ｇを添加し、７５℃で６
時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下１
１０℃で１６時間乾燥した。
【００４１】赤外吸収スペクトルの結果、３０５０ｃｍ
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。ジエチレントリアミンの付加量は１
４８μｍｏｌ・ｇ-1であった。
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。ジエチレントリアミンの付加量は１
４８μｍｏｌ・ｇ-1であった。
【００４２】［不溶性担体の製造例４］エタノール１５
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
トリエチレンテトラミン２．３４ｇを添加し、７５℃で
６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下
１１０℃で１６時間乾燥した。
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
トリエチレンテトラミン２．３４ｇを添加し、７５℃で
６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧下
１１０℃で１６時間乾燥した。
【００４３】赤外吸収スペクトルの結果、３０５０ｃｍ
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。トリエチレンテトラミンの付加量は
１１７μｍｏｌ・ｇ-1であった。
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。トリエチレンテトラミンの付加量は
１１７μｍｏｌ・ｇ-1であった。
【００４４】［不溶性担体の製造例５］エタノール１５
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
テトラエチレンペンタミン３．０３ｇを添加し、７５℃
で６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧
下１１０℃で１６時間乾燥した。
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
テトラエチレンペンタミン３．０３ｇを添加し、７５℃
で６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧
下１１０℃で１６時間乾燥した。
【００４５】赤外吸収スペクトルの結果、３０５０ｃｍ
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。テトラエチレンペンタミンの付加量
は１０７μｍｏｌ・ｇ-1であった。
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。テトラエチレンペンタミンの付加量
は１０７μｍｏｌ・ｇ-1であった。
【００４６】［不溶性担体の製造例６］エタノール１５
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
ペンタエチレンヘキサミン３．７２ｇを添加し、７５℃
で６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧
下１１０℃で１６時間乾燥した。
０ｍｌに上記製造例１で得た不溶性担体の粉体４０ｇ、
ペンタエチレンヘキサミン３．７２ｇを添加し、７５℃
で６時間反応を行った。反応終了後、濾過、洗浄、減圧
下１１０℃で１６時間乾燥した。
【００４７】赤外吸収スペクトルの結果、３０５０ｃｍ
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。ペンタエチレンヘキサミンの付加量
は８３μｍｏｌ・ｇ-1であった。
-1のエポキシ環に起因するＣ−Ｈ伸縮振動のピークが消
失し、３５００〜３４００ｃｍ-1にかけて第１級アミン
のＮ−Ｈ対称伸縮振動を示唆するピークが観測された。
このことから、エポキシ環が開裂し、アミノ基が導入さ
れたことがわかる。ペンタエチレンヘキサミンの付加量
は８３μｍｏｌ・ｇ-1であった。
【００４８】「不溶性担体固定化セリンプロテアーゼの
実施例１」ウッドワード試薬Ｋ（2-Ethy1-5-phenylisox
azolium-3'-sulfonate）６ｇを０．１Ｍリン酸暖衡液に
溶解したものに、製造例２の不溶性担体２０ｇを懸濁
し、５℃、１時間攪拌し、粉体にウッドワード試薬Ｋを
十分に含浸させた後、遠心分離により過剰のウッドワー
ド試薬Ｋ溶液を除去した。この沈殿をトリプシン１．４
４ｇ／０．１Ｍリン酸暖衡液（ｐＨ８．５）１００ｍｌ
に再懸濁し、５℃、２４時間反応を行った。この懸濁液
を濾過し、１ＭＮａＣｌ溶液（ｐＨ２．２）で洗浄した
後、減圧下室温で、１６時間乾燥した。こうしてできた
不溶性担体固定化トリプシンのタンパク質量は以下のよ
うに測定した。
実施例１」ウッドワード試薬Ｋ（2-Ethy1-5-phenylisox
azolium-3'-sulfonate）６ｇを０．１Ｍリン酸暖衡液に
溶解したものに、製造例２の不溶性担体２０ｇを懸濁
し、５℃、１時間攪拌し、粉体にウッドワード試薬Ｋを
十分に含浸させた後、遠心分離により過剰のウッドワー
ド試薬Ｋ溶液を除去した。この沈殿をトリプシン１．４
４ｇ／０．１Ｍリン酸暖衡液（ｐＨ８．５）１００ｍｌ
に再懸濁し、５℃、２４時間反応を行った。この懸濁液
を濾過し、１ＭＮａＣｌ溶液（ｐＨ２．２）で洗浄した
後、減圧下室温で、１６時間乾燥した。こうしてできた
不溶性担体固定化トリプシンのタンパク質量は以下のよ
うに測定した。
【００４９】不溶性担体固定化トリプシン０．１ｇを６
Ｎ塩酸２．０ｍｌに懸濁し、１０５℃、２４時間タンパ
ク質分解反応を行った。反応終了後、遠心分離により反
応液を回収、蒸発乾燥した後、暖衡液でｐＨ６に調整し
た。ニンヒドリン２．０ｇ、ヒドリンダンチン０．３ｇ
をメチルセロソルブ７５ｍｌに完全に溶解し、４Ｍ酢酸
暖衡液２５ｍｌと混合したものを発色試薬とした。試料
溶液０．５ｍｌに発色試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、
１００℃、１５分間呈色反応を行い、反応後、冷水で冷
却し、希釈溶液として６０％エタノール水溶液を用いて
５７０ｎｍで比色し、分解生成アミノ酸を定量した。比
色は日本分光製ＵＶ／ＶＩＳスペクトロメーターＶ−５
５０を用いた。その結果、不溶性担体の重量当たりのタ
ンパク質固定化量は１．７ｍｇ・ｇ-1であった。
Ｎ塩酸２．０ｍｌに懸濁し、１０５℃、２４時間タンパ
ク質分解反応を行った。反応終了後、遠心分離により反
応液を回収、蒸発乾燥した後、暖衡液でｐＨ６に調整し
た。ニンヒドリン２．０ｇ、ヒドリンダンチン０．３ｇ
をメチルセロソルブ７５ｍｌに完全に溶解し、４Ｍ酢酸
暖衡液２５ｍｌと混合したものを発色試薬とした。試料
溶液０．５ｍｌに発色試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、
１００℃、１５分間呈色反応を行い、反応後、冷水で冷
却し、希釈溶液として６０％エタノール水溶液を用いて
５７０ｎｍで比色し、分解生成アミノ酸を定量した。比
色は日本分光製ＵＶ／ＶＩＳスペクトロメーターＶ−５
５０を用いた。その結果、不溶性担体の重量当たりのタ
ンパク質固定化量は１．７ｍｇ・ｇ-1であった。
【００５０】「不溶性担体固定化セリンプロテアーゼの
実施例２」実施例１と全く同様に製造例３の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．６ｍｇ・ｇ-1であった。
実施例２」実施例１と全く同様に製造例３の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．６ｍｇ・ｇ-1であった。
【００５１】「不溶性担体固定化セリンプロテアーゼの
実施例３」実施例１と全く同様に製造例４の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．６ｍｇ・ｇ-1であった。
実施例３」実施例１と全く同様に製造例４の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．６ｍｇ・ｇ-1であった。
【００５２】「不溶性担体固定化セリンプロテアーゼの
実施例４」実施例１と全く同様に製造例５の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．５ｍｇ・ｇ-1であった。
実施例４」実施例１と全く同様に製造例５の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．５ｍｇ・ｇ-1であった。
【００５３】「不溶性担体固定化セリンプロテアーゼの
実施例５」実施例１と全く同様に製造例６の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．３ｍｇ・ｇ-1であった。
実施例５」実施例１と全く同様に製造例６の不溶性担体
の粉体を用いてトリプシンの固定化反応を行った。その
結果、不溶性担体の重量当たりのタンパク質固定化量は
１．３ｍｇ・ｇ-1であった。
【００５４】「カゼイン分解活性の測定」実施例１から
５までの不溶性担体固定化セリンプロテアーゼにつきカ
ゼイン分解活性を測定した。活性の測定方法は、カゼイ
ン（ハマルステン氏法、和光純薬工業製）２．５ｇを水
１０ｍｌと０．２Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌの混液に
溶かし、これに水６０ｍｌを加え透明溶解した後、０．
１Ｎ塩酸を用い、ｐＨ７．８に調節し、全量を１００ｍ
ｌにした後、９０℃で１５分間熱したものを基質溶液と
した。
５までの不溶性担体固定化セリンプロテアーゼにつきカ
ゼイン分解活性を測定した。活性の測定方法は、カゼイ
ン（ハマルステン氏法、和光純薬工業製）２．５ｇを水
１０ｍｌと０．２Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌの混液に
溶かし、これに水６０ｍｌを加え透明溶解した後、０．
１Ｎ塩酸を用い、ｐＨ７．８に調節し、全量を１００ｍ
ｌにした後、９０℃で１５分間熱したものを基質溶液と
した。
【００５５】試験管に酵素液と０．１Ｍホウ酸ナトリウ
ム暖衡液（ｐＨ７．８）を１．０ｍｌづつとり、基質溶
液１．０ｍｌを加え反応を開始し、３０℃、３０分間放
置した後、１０％トリクロロ酢酸２．０ｍｌを加え、反
応を停止し、３０℃、２０分間放置した。ここで生じた
沈殿を遠心分離により除去し、上清の２７５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。活性の単位は、酵素で作成した検
量線より求めた。
ム暖衡液（ｐＨ７．８）を１．０ｍｌづつとり、基質溶
液１．０ｍｌを加え反応を開始し、３０℃、３０分間放
置した後、１０％トリクロロ酢酸２．０ｍｌを加え、反
応を停止し、３０℃、２０分間放置した。ここで生じた
沈殿を遠心分離により除去し、上清の２７５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。活性の単位は、酵素で作成した検
量線より求めた。
【００５６】さらにこの上清０．４ｍｌに対し、２％炭
酸ナトリウム５０ｍｌと０．５％硫酸銅溶液１ｍｌの混
液２．０ｍｌを添加し、室温にて１０分間以上放置した
後、１Ｎフェノール試薬０．２ｍｌを添加し、充分に攪
拌した後、室温にて３０分以上放置し、７５０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。
酸ナトリウム５０ｍｌと０．５％硫酸銅溶液１ｍｌの混
液２．０ｍｌを添加し、室温にて１０分間以上放置した
後、１Ｎフェノール試薬０．２ｍｌを添加し、充分に攪
拌した後、室温にて３０分以上放置し、７５０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。
【００５７】図１に、実施例１〜５で製造したスペーサ
ーのポリエチレンイミンの鎖長が異なる不溶性担体固定
化トリプシン（ＮＨ2）の酵素活性を示す。エチレンジ
アミンからペンタエチレンヘキサミンまで、スペーサー
の分子量が大きくなるに従って官能基の付加量は減少し
たが、担体の粉体重量当たりの活性には大きな差はなか
った。
ーのポリエチレンイミンの鎖長が異なる不溶性担体固定
化トリプシン（ＮＨ2）の酵素活性を示す。エチレンジ
アミンからペンタエチレンヘキサミンまで、スペーサー
の分子量が大きくなるに従って官能基の付加量は減少し
たが、担体の粉体重量当たりの活性には大きな差はなか
った。
【００５８】「角質剥離測定」実施例１の不溶性担体固
定化トリプシンについて、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で角質剥離の測定
を行った。
定化トリプシンについて、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で角質剥離の測定
を行った。
【００５９】インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の測定
は、９０℃、３０分間加熱処理して角層内の酵素を失活
させた角層シート３．５ｍｇを、２ｍＭドデシルジメチ
ルアミンオキサイド／８ｍＭドデシル硫酸ナトリウム混
合溶液（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ６０μｇ／ｍｌ含有）５ｍ
ｌ中にいれ、実施例１の不溶性担体固定化トリプシンま
たはトリプシン１３．８ｕｎｉｔｓを添加して、３７
℃、９０時間放置した後、角質細胞の分散レベルを肉眼
観察した。分散レベルはスコア０〜３の４段階評価を行
い、変化なしを０、断片化を１、細片化を２、完全分離
を３とした。
は、９０℃、３０分間加熱処理して角層内の酵素を失活
させた角層シート３．５ｍｇを、２ｍＭドデシルジメチ
ルアミンオキサイド／８ｍＭドデシル硫酸ナトリウム混
合溶液（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ６０μｇ／ｍｌ含有）５ｍ
ｌ中にいれ、実施例１の不溶性担体固定化トリプシンま
たはトリプシン１３．８ｕｎｉｔｓを添加して、３７
℃、９０時間放置した後、角質細胞の分散レベルを肉眼
観察した。分散レベルはスコア０〜３の４段階評価を行
い、変化なしを０、断片化を１、細片化を２、完全分離
を３とした。
【００６０】角質シートを用いたインビトロ（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ）における角質剥離（除去）効果の実施例１の
角質分散レベルは、９０時間後に細片化しており（スコ
ア２）、同じ活性量のトリプシンの角質分散レベルと同
じであった。このことから、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ）において実施例１の不溶性担体固定化トリプシン
はトリプシンと同様に角質除去能力を持つと考えられ
る。
ｉｔｒｏ）における角質剥離（除去）効果の実施例１の
角質分散レベルは、９０時間後に細片化しており（スコ
ア２）、同じ活性量のトリプシンの角質分散レベルと同
じであった。このことから、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ）において実施例１の不溶性担体固定化トリプシン
はトリプシンと同様に角質除去能力を持つと考えられ
る。
【００６１】インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の測定は、イ
オン交換水に対して粉末量４０％に調製したペースト
を、ガーゼ付絆創膏に塗布し、スケールの肌部位に貼っ
て２４時間閉寒状態においた。絆創膏を剥がした後、サ
ンプルを水洗除去し、３０分後に肉眼観察、スキンアナ
ライザーによるスケールの観察、およびレプリカによる
皮溝の観察および解析を行った。
オン交換水に対して粉末量４０％に調製したペースト
を、ガーゼ付絆創膏に塗布し、スケールの肌部位に貼っ
て２４時間閉寒状態においた。絆創膏を剥がした後、サ
ンプルを水洗除去し、３０分後に肉眼観察、スキンアナ
ライザーによるスケールの観察、およびレプリカによる
皮溝の観察および解析を行った。
【００６２】ヒト皮膚のスケールに実施例１の不溶性担
体固定化トリプシンを塗布したインビトロ（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）における角質剥離（除去）効果の評価（ｎ＝２）
の結果、スキンアナライザーによる観察では、どちらの
パネルにおいてもコントロールの未処理焼成セリサイト
塗布部位と比較してスケールの減少が認められた。
体固定化トリプシンを塗布したインビトロ（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）における角質剥離（除去）効果の評価（ｎ＝２）
の結果、スキンアナライザーによる観察では、どちらの
パネルにおいてもコントロールの未処理焼成セリサイト
塗布部位と比較してスケールの減少が認められた。
【００６３】レプリカテストの結果を表１に示す。いず
れのパネルにおいても、固定化トリプシン塗布部位はコ
ントロールの未処理焼成セリサイド塗布部位と比較し
て、画像解析により皮溝形状の凹凸を示すＫＳＤ値の上
昇および皮溝の均質性を現すＶＣ１値の減少が認めら
れ、肌状態が良い方向にあることが示された。
れのパネルにおいても、固定化トリプシン塗布部位はコ
ントロールの未処理焼成セリサイド塗布部位と比較し
て、画像解析により皮溝形状の凹凸を示すＫＳＤ値の上
昇および皮溝の均質性を現すＶＣ１値の減少が認めら
れ、肌状態が良い方向にあることが示された。
【００６４】
【表１】「レプリカテストの解析結果（固定化トリプシ
ンのスケールに対する影響）」
ンのスケールに対する影響）」
【００６５】このことから実施例１の不溶性担体固定化
トリプシンは肌改善効果を持つと考えられ、カゼインで
活性の認められた実施例２から５までの不溶性担体固定
化トリプシンについても同様に肌改善効果があると思わ
れる。
トリプシンは肌改善効果を持つと考えられ、カゼインで
活性の認められた実施例２から５までの不溶性担体固定
化トリプシンについても同様に肌改善効果があると思わ
れる。
【００６６】「酵素活性持続性の測定」不溶性担体固定
化トリプシンの酵素活性持続性を以下の方法で測定し
た。すなわち、試験管に一定量の活性を持つ酵素または
不溶性担体固定化トリプシンをとり、イオン交換水１．
０ｍｌに分散、または溶解し、０．１Ｍホウ酸ナトリウ
ム暖衡液（ｐＨ７．８）１．０ｍｌを添加した。これを
１サンプルとし、経時で測定する回数分のサンプルを調
製した。これらを３０℃の条件下に放置し、経時で取り
だしてカゼインを添加し、残存活性を測定した。
化トリプシンの酵素活性持続性を以下の方法で測定し
た。すなわち、試験管に一定量の活性を持つ酵素または
不溶性担体固定化トリプシンをとり、イオン交換水１．
０ｍｌに分散、または溶解し、０．１Ｍホウ酸ナトリウ
ム暖衡液（ｐＨ７．８）１．０ｍｌを添加した。これを
１サンプルとし、経時で測定する回数分のサンプルを調
製した。これらを３０℃の条件下に放置し、経時で取り
だしてカゼインを添加し、残存活性を測定した。
【００６７】実施例１の不溶性担体固定化トリプシン
と、固定化されていない通常の試薬のトリプシンを室温
に放置し、経時で残存酵素活性を測定した結果（図３参
照）、固定化されていないトリプシンは３か月の間に徐
々に活性が低下していくが、実施例１の不溶性担体固定
化トリプシンは高い活性を維持し、活性安定性を示し
た。
と、固定化されていない通常の試薬のトリプシンを室温
に放置し、経時で残存酵素活性を測定した結果（図３参
照）、固定化されていないトリプシンは３か月の間に徐
々に活性が低下していくが、実施例１の不溶性担体固定
化トリプシンは高い活性を維持し、活性安定性を示し
た。
【００６８】実施例１の不溶性担体固定化トリプシン
と、固定化されていない通常の試薬のトリプシンを水に
分散、３０℃に１週間放置し、やはり経時で残存酵素活
性を測定した結果（図３参照）、イオン交換水中で、ト
リプシンは急激に活性低下し、１週間でまったく活性を
示さなくなったが、実施例１の不溶性担体固定化トリプ
シンは高い活性安定性を示した。以上より、不溶性担体
固定化トリプシンは固定化されていないトリプシンより
も活性安定性が向上しており、例えば、化粧料などに配
合した場合においても、化粧料使用時までその活性を維
持することが可能となる。
と、固定化されていない通常の試薬のトリプシンを水に
分散、３０℃に１週間放置し、やはり経時で残存酵素活
性を測定した結果（図３参照）、イオン交換水中で、ト
リプシンは急激に活性低下し、１週間でまったく活性を
示さなくなったが、実施例１の不溶性担体固定化トリプ
シンは高い活性安定性を示した。以上より、不溶性担体
固定化トリプシンは固定化されていないトリプシンより
も活性安定性が向上しており、例えば、化粧料などに配
合した場合においても、化粧料使用時までその活性を維
持することが可能となる。
【００６９】次に、実施例１で製造した不溶性担体固定
化セリンプロテアーゼを用いて、本発明の好ましい化粧
料の実施例について説明する。
化セリンプロテアーゼを用いて、本発明の好ましい化粧
料の実施例について説明する。
【００７０】「実施例６：クリーム」以下の処方及び製
法により本発明の化粧料であるクリームを製造した。 （処方） 油分： セチルアルコール ５．０％ ステアリン酸 ３．０ ワセリン ５．０ スクワラン ９．５ グリセロールトリ２−エチルヘキサン酸エステル ７．０ 保湿剤：ジプロピレングリコール ５．０ グリセリン ５．０ 界面活性剤：プロピレングリコールモノステアリン酸エステル ３．０ ＰＯＥ（２０）セチルアルコールエーテル ３．０ アルカリ：トリエタノールアミン １．０ 防腐剤： 適 量 酸化防止剤： 適 量 香料： 適 量 実施例１の不溶性担体固定化トリプシン： ０．５ 精製水： ５３．０ （製法） 精製水に保湿剤、アルカリを加え７０℃に調
整した。油分を加熱溶解後、界面活性剤、防腐剤、酸化
防止剤、香料を加え７０℃に調整した。これを先の水相
に添加し予備乳化を行った。次いで、実施例１で製造し
た不溶性担体固定化トリプシンを徐々に添加しながらホ
モミキサーにて攪拌した後、脱気、冷却を行い、本発明
のクリームを得た。
法により本発明の化粧料であるクリームを製造した。 （処方） 油分： セチルアルコール ５．０％ ステアリン酸 ３．０ ワセリン ５．０ スクワラン ９．５ グリセロールトリ２−エチルヘキサン酸エステル ７．０ 保湿剤：ジプロピレングリコール ５．０ グリセリン ５．０ 界面活性剤：プロピレングリコールモノステアリン酸エステル ３．０ ＰＯＥ（２０）セチルアルコールエーテル ３．０ アルカリ：トリエタノールアミン １．０ 防腐剤： 適 量 酸化防止剤： 適 量 香料： 適 量 実施例１の不溶性担体固定化トリプシン： ０．５ 精製水： ５３．０ （製法） 精製水に保湿剤、アルカリを加え７０℃に調
整した。油分を加熱溶解後、界面活性剤、防腐剤、酸化
防止剤、香料を加え７０℃に調整した。これを先の水相
に添加し予備乳化を行った。次いで、実施例１で製造し
た不溶性担体固定化トリプシンを徐々に添加しながらホ
モミキサーにて攪拌した後、脱気、冷却を行い、本発明
のクリームを得た。
【００７１】「実施例７：リキッドファンデーション」
以下の処方及び製法により本発明の化粧料であるリキッ
ドファンデーションを製造した。 （処方） 粉体：実施例１の不溶性担体固定化トリプシン ３．０％ 二酸化チタン ５．０ ベンガラ ０．５ 黄酸化鉄 １．４ 黒酸化鉄 ０．１ 水相：ベントナイト ０．５ モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ０．９ トリエタノールアミン １．０ プロピレングリコール １０．０ 精製水 ５６．４ 油相：ステアリン酸 ２．２ イソヘキサデシルアルコール ７．０ モノステアリン酸グリセリン ２．０ 液状ラノリン ２．０ 流動パラフィン ８．０ 防腐剤： 適 量 香料： 適 量 （製法） 水系の増粘剤であるベントナイトに分散した
プロピレングリコールを精製水に加え、７０℃でホモミ
キサー処理した後、残りの水相成分を添加し、十分に攪
拌した。これに十分混合粉砕された粉体部を攪拌しなが
ら添加し、７０℃でホモミキサー処理した。つぎに、７
０〜８０℃に加熱溶解された液相を徐々に添加し７０℃
でホモミキサー処理した。これを攪拌しながら冷却し、
４５℃で香料を加え、室温まで冷却した。最後に脱気
し、得られた本発明の化粧料であるリキッドファンデー
ションを容器に充填した。
以下の処方及び製法により本発明の化粧料であるリキッ
ドファンデーションを製造した。 （処方） 粉体：実施例１の不溶性担体固定化トリプシン ３．０％ 二酸化チタン ５．０ ベンガラ ０．５ 黄酸化鉄 １．４ 黒酸化鉄 ０．１ 水相：ベントナイト ０．５ モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン ０．９ トリエタノールアミン １．０ プロピレングリコール １０．０ 精製水 ５６．４ 油相：ステアリン酸 ２．２ イソヘキサデシルアルコール ７．０ モノステアリン酸グリセリン ２．０ 液状ラノリン ２．０ 流動パラフィン ８．０ 防腐剤： 適 量 香料： 適 量 （製法） 水系の増粘剤であるベントナイトに分散した
プロピレングリコールを精製水に加え、７０℃でホモミ
キサー処理した後、残りの水相成分を添加し、十分に攪
拌した。これに十分混合粉砕された粉体部を攪拌しなが
ら添加し、７０℃でホモミキサー処理した。つぎに、７
０〜８０℃に加熱溶解された液相を徐々に添加し７０℃
でホモミキサー処理した。これを攪拌しながら冷却し、
４５℃で香料を加え、室温まで冷却した。最後に脱気
し、得られた本発明の化粧料であるリキッドファンデー
ションを容器に充填した。
【００７２】「実施例８：カーマインローション」以下
の処方及び製法により本発明の化粧料であるカーマイン
ローションを製造した。 （処方） 保湿剤：ソルビット ４．０％ ジプロピレングリコール ５．０ ＰＥＧ１５００ ５．０ 界面活性剤：ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５ 増粘剤：メチルセルロース ０．２ クインスシード ０．１ 実施例１の不溶性担体固定化トリプシン： １．０ エタノール： １０．０ 香料： 適 量 色剤： 適 量 防腐剤： 適 量 キレート剤： 適 量 褪色防止剤： 適 量 緩衝剤： 適 量 精製水： ７４．２ （製法） 精製水の一部を取りキレート剤を溶解し、こ
れに高分子増粘剤のメチルセルロース及びクインスシー
ド、並びに実施例１の不溶性担体固定化トリプシンを混
合、攪拌し懸濁液を作った。精製水の残部に保湿剤、緩
衝剤、褪色防止剤などを加えて室温下にて溶解しこれに
前述の懸濁液を加えた。これに、エタノールに防腐剤、
界面活性剤、香料を加えたアルコール溶液を添加混合し
て本発明の化粧料であるカーマインローションを得た。
の処方及び製法により本発明の化粧料であるカーマイン
ローションを製造した。 （処方） 保湿剤：ソルビット ４．０％ ジプロピレングリコール ５．０ ＰＥＧ１５００ ５．０ 界面活性剤：ＰＯＥ（２０）オレイルアルコールエーテル ０．５ 増粘剤：メチルセルロース ０．２ クインスシード ０．１ 実施例１の不溶性担体固定化トリプシン： １．０ エタノール： １０．０ 香料： 適 量 色剤： 適 量 防腐剤： 適 量 キレート剤： 適 量 褪色防止剤： 適 量 緩衝剤： 適 量 精製水： ７４．２ （製法） 精製水の一部を取りキレート剤を溶解し、こ
れに高分子増粘剤のメチルセルロース及びクインスシー
ド、並びに実施例１の不溶性担体固定化トリプシンを混
合、攪拌し懸濁液を作った。精製水の残部に保湿剤、緩
衝剤、褪色防止剤などを加えて室温下にて溶解しこれに
前述の懸濁液を加えた。これに、エタノールに防腐剤、
界面活性剤、香料を加えたアルコール溶液を添加混合し
て本発明の化粧料であるカーマインローションを得た。
【００７３】「肌改善効果の測定」以上の実施例６、
７、８で製造した化粧料、並びに実施例６のクリームか
ら不溶性担体固定化トリプシンのみを抜去しタルクで置
換したクリーム及び実施例６のクリームから保湿剤のみ
を抜去しスクワランで補充したクリームを用いて使用テ
ストを行い、肌改善効果を測定した。１つの化粧料のテ
ストに１０名のパネルを用いた。顔面の片側半分に化粧
料を塗布し他方は化粧料を使用せずにコントロールと
し、１週間使用後に左右の皮膚状態を測定した。評価は
皮膚表面のレプリカをとり、画像解析により皮溝形状の
凹凸（深さ）を示すＫＳＤ値を測定した。その結果を表
２に示す。スケールが改善されればＫＳＤ値は上昇する
が、不溶性担体固定化トリプシンを抜去したクリームは
塗布部でも未塗布部に比べ有意な改善が見られなかった
が、実施例６、７、８の不溶性担体固定化トリプシン配
合の化粧料では、塗布部が未塗布部に比べＫＳＤ値が上
昇し、肌状態の改善効果が見られた。また、実施例６の
クリームは、保湿剤のみを除去したクリームに比較し、
高い肌改善効果を示し、不溶性担体固定化トリプシンと
保湿剤の組合せに基づく、相乗的な肌改善効果が見られ
た。
７、８で製造した化粧料、並びに実施例６のクリームか
ら不溶性担体固定化トリプシンのみを抜去しタルクで置
換したクリーム及び実施例６のクリームから保湿剤のみ
を抜去しスクワランで補充したクリームを用いて使用テ
ストを行い、肌改善効果を測定した。１つの化粧料のテ
ストに１０名のパネルを用いた。顔面の片側半分に化粧
料を塗布し他方は化粧料を使用せずにコントロールと
し、１週間使用後に左右の皮膚状態を測定した。評価は
皮膚表面のレプリカをとり、画像解析により皮溝形状の
凹凸（深さ）を示すＫＳＤ値を測定した。その結果を表
２に示す。スケールが改善されればＫＳＤ値は上昇する
が、不溶性担体固定化トリプシンを抜去したクリームは
塗布部でも未塗布部に比べ有意な改善が見られなかった
が、実施例６、７、８の不溶性担体固定化トリプシン配
合の化粧料では、塗布部が未塗布部に比べＫＳＤ値が上
昇し、肌状態の改善効果が見られた。また、実施例６の
クリームは、保湿剤のみを除去したクリームに比較し、
高い肌改善効果を示し、不溶性担体固定化トリプシンと
保湿剤の組合せに基づく、相乗的な肌改善効果が見られ
た。
【００７４】
【表２】
【００７５】
【発明の効果】本発明によれば、細胞間接着蛋白質に作
用するセリンプロテアーゼを、不溶性担体に共有結合さ
せることにより、各種薬品、温度、ｐＨの広い範囲にわ
たり安定で、長期間にわたり高い酵素活性を保持するこ
とが可能な不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供
することができる。特に、疎水性表面を有する不溶性担
体に固定化されたトリプシンは、各種薬品、温度、ｐＨ
の広い範囲にわたり極めて安定で、長期間にわたり極め
て高い酵素活性を保持することが可能である。
用するセリンプロテアーゼを、不溶性担体に共有結合さ
せることにより、各種薬品、温度、ｐＨの広い範囲にわ
たり安定で、長期間にわたり高い酵素活性を保持するこ
とが可能な不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを提供
することができる。特に、疎水性表面を有する不溶性担
体に固定化されたトリプシンは、各種薬品、温度、ｐＨ
の広い範囲にわたり極めて安定で、長期間にわたり極め
て高い酵素活性を保持することが可能である。
【００７６】さらに、不溶性担体固定化セリンプロテア
ーゼを化粧料に配合することにより、製造又は貯蔵中の
酵素活性の失活を防止し、化粧料使用時にその効果を発
揮し得ると同時に、経皮吸収されず角質のみに作用する
ことによって、表皮を適正な状態に維持できる化粧料を
提供することができる。特に、不溶性担体固定化トリプ
シンと保湿剤と組合せて使用すると極めて高い肌改善効
果を発揮することが可能となる。
ーゼを化粧料に配合することにより、製造又は貯蔵中の
酵素活性の失活を防止し、化粧料使用時にその効果を発
揮し得ると同時に、経皮吸収されず角質のみに作用する
ことによって、表皮を適正な状態に維持できる化粧料を
提供することができる。特に、不溶性担体固定化トリプ
シンと保湿剤と組合せて使用すると極めて高い肌改善効
果を発揮することが可能となる。
【図１】不溶性担体固定化トリプシンの酵素活性を比較
したグラフである。
したグラフである。
【図２】不溶性担体固定化トリプシンと固定化されてい
ないトリプシンを室温に放置した場合の経時での残存酵
素活性を示す図である。
ないトリプシンを室温に放置した場合の経時での残存酵
素活性を示す図である。
【図３】不溶性担体固定化トリプシンと固定化されてい
ないトリプシンを水に分散して３０℃に１週間放置した
場合の経時での残存酵素活性を示す図である。
ないトリプシンを水に分散して３０℃に１週間放置した
場合の経時での残存酵素活性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 裕美子 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 佐藤 純子 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第二リサーチセンター内 (72)発明者 野村 淳子 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 山口 道広 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内
Claims (9)
- 【請求項１】 不溶性担体に共有結合によりセリンプロ
テアーゼを固定化してなる不溶性担体固定化セリンプロ
テアーゼ。 - 【請求項２】 前記不溶性担体が疎水性表面を有するも
のである請求項１記載の不溶性担体固定化セリンプロテ
アーゼ。 - 【請求項３】 前記不溶性担体がポリメチルシロキサン
で被覆されたものである請求項１記載の不溶性担体固定
化セリンプロテアーゼ。 - 【請求項４】 前記不溶性担体を、セリンプロテアーゼ
と共有結合可能な官能基を有する化合物で被覆し、セリ
ンプロテアーゼを該官能基と共有結合して固定化してな
る請求項１記載の不溶性担体固定化セリンプロテアー
ゼ。 - 【請求項５】 Ｓｉ-Ｈ部分を少なくとも１個をもつシ
リコーンポリマーで不溶性担体を被覆し、さらに該Ｓｉ
-Ｈ部分と反応可能な化合物を、不溶性担体に被覆した
シルコーンポリマーのＳｉ-Ｈ部分に付加させることに
よって、付加した前記化合物から誘導されるアミノ基、
カルボキシル基、スルホ基、水酸基、ポリアルキレンエ
ーテル基又はエポキシ基から選ばれた少なくとも１種以
上の官能基と直接又はスペーサー化合物を介して共有結
合によりセリンプロテアーゼを固定化してなる請求項１
記載の不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ。 - 【請求項６】 テトラメチルシクロテトラシロキサンを
不溶性担体表面で重合させて、ポリメチルシロキサンで
被覆された不溶性担体を製造し、次に、アリルグリシジ
ルエーテルを該不溶性担体に反応させて担体表面にエポ
キシ基を導入し、次いで該エポキシ基にアルキルアミン
を反応させて担体表面にアミノ基を導入し、該アミノ基
と共有結合によりセリンプロテアーゼを固定化してなる
不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ。 - 【請求項７】 前記セリンプロテアーゼがトリプシン又
はキモトリプシンである請求項１ないし６のいずれか１
項に記載の不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ。 - 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれか１項に記載
の不溶性担体固定化セリンプロテアーゼを配合すること
を特徴とする化粧料。 - 【請求項９】 請求項１ないし７のいずれか１項に記載
の不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及び保湿剤を配
合することを特徴とする化粧料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19789494A JPH0838175A (ja) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | 不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及びこれを配合した化粧料 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19789494A JPH0838175A (ja) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | 不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及びこれを配合した化粧料 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0838175A true JPH0838175A (ja) | 1996-02-13 |
Family
ID=16382065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19789494A Pending JPH0838175A (ja) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | 不溶性担体固定化セリンプロテアーゼ及びこれを配合した化粧料 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0838175A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0940544A (ja) * | 1995-07-25 | 1997-02-10 | L'oreal Sa | 酵素を含有する安定組成物 |
| JP2002284665A (ja) * | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Nippon Hypox Lab Inc | 化粧料 |
| GB2396297A (en) * | 2002-12-18 | 2004-06-23 | Coletica | A cosmetic or dermopharmaceutical composition comprising an enzyme which is insoluble in an aqueous medium, as well as its uses |
-
1994
- 1994-07-29 JP JP19789494A patent/JPH0838175A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0940544A (ja) * | 1995-07-25 | 1997-02-10 | L'oreal Sa | 酵素を含有する安定組成物 |
| JP2002284665A (ja) * | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Nippon Hypox Lab Inc | 化粧料 |
| GB2396297A (en) * | 2002-12-18 | 2004-06-23 | Coletica | A cosmetic or dermopharmaceutical composition comprising an enzyme which is insoluble in an aqueous medium, as well as its uses |
| GB2396297B (en) * | 2002-12-18 | 2005-08-31 | Coletica | A cosmetic or dermopharmaceutical composition comprising an enzyme which is insoluble in an aqueous medium, as well as its uses. |
| DE10312259B4 (de) * | 2002-12-18 | 2007-11-08 | Engelhard Lyon | Kosmetische oder dermopharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Enzym, das in einem wässrigen Medium unlöslich ist, sowie deren Verwendung |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20031209 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040107 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20040225 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
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| A521 | Written amendment |
Effective date: 20040225 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
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|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
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