JPH08333256A - ロタマーゼ酵素活性の阻害剤 - Google Patents

ロタマーゼ酵素活性の阻害剤

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JPH08333256A JP8132866A JP13286696A JPH08333256A JP H08333256 A JPH08333256 A JP H08333256A JP 8132866 A JP8132866 A JP 8132866A JP 13286696 A JP13286696 A JP 13286696A JP H08333256 A JPH08333256 A JP H08333256A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有
するピペコリン酸誘導体化合物を、イムノフィリンタン
パク質の阻害剤、特に神経成長または再生を刺激または
促進するペプチジル−プロリルイソメラーゼまたはロタ
マーゼ活性の阻害剤として使用する方法の提供。 【解決手段】ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親和性
を有するピペコリン酸誘導体の有効量を動物に投与し、
損傷した末梢神経の成長を刺激するか、またはニューロ
ン再生を促進することからなり、前記ＦＫＢＰ型イムノ
フィリンはロタマーゼ活性を示し、そして前記ピペコリ
ン酸誘導体は前記イムノフィリンのロタマーゼ活性を阻
害する、動物における神経学的障害（アルツハイマー
病，パーキンソン病，筋萎縮側索硬化等）を治療する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イムノフィリンタ
ンパク質と関連する酵素活性の阻害剤、特に、ペプチジ
ル−プロリルイソメラーゼまたはロタマーゼ酵素活性の
阻害剤としてＦＫＢＰ型のイムノフィリンに対する親和
性を有する神経栄養性(neurotrophic ) ピペコリン酸誘
導体化合物を使用する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】イムノフィリンという用語は主要な免疫
抑制剤、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６およ
びラパマイシンに対する受容体として機能する多くのタ
ンパク質を意味する。イムノフィリンの公知群はシクロ
フィリン、およびＦＫ５０６結合タンパク質、例えばＦ
ＫＢＰである。シクロスポリンＡはシクロフィリンに結
合し、ＦＫ５０６およびラパマイシンはＦＫＢＰに結合
する。これらのイムノフィリン−薬剤複合体は種々の細
胞間信号変換系、特に免疫系および神経系と相互作用す
る。
【０００３】イムノフィリンはペプチジル−プロリルイ
ソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）またはロタマーゼ酵素活性
を有することが知られている。ロタマーゼ活性はイムノ
フィリンタンパク質のシスおよびトランス異性体の相互
変換の触媒作用の役目を果たすものであると決められて
いる。
【０００４】イムノフィリンは免疫組織において最初に
発見され、そして研究された。イムノフィリンのロタマ
ーゼ活性の阻害はＴ細胞の増殖の阻害を導き、それによ
り免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６お
よびラパマイシンにより示される免疫抑制作用を引き起
こすことが当業者により当初推定された。さらに研究さ
れ、ロタマーゼ活性の阻害は、本質的に、そしてそれ自
体では、免疫抑制剤活性に対して十分ではないことが示
されている（Schreiber 等, Science, 1990, vol. 250,
pp. 556-559）。また、免疫抑制は免疫抑制剤とイムノ
フィリンとの複合体の形成に由来する。イムノフィリン
−薬剤複合体は作用のそれらの様式として第３のタンパ
ク質の標的と相互作用することが示されている（Schrei
ber 等,Cell, 1991，vol. 66, pp. 807-815）。ＦＫＢ
Ｐ−ＦＫ５０６およびＦＫＢＰ−ＣｓＡの場合、薬剤−
イムノフィリン複合体はＴ細胞増殖を導く信号を伝達す
るＴ細胞受容体阻害性の酵素カルシニューリンに結合す
る。同様に、ラパマイシンとＦＫＢＰとの複合体はＲＡ
ＦＴ１／ＦＲＡＰタンパク質と相互作用し、そしてＩＬ
−２受容体からの信号伝達を阻害する。
【０００５】イムノフィリンは中枢神経系に高濃度で存
在することが見出されている。イムノフィリンは免疫系
に比べ中枢神経系に１０−５０倍豊富に存在する。神経
組織内でイムノフィリンは酸化窒素合成、神経伝達物質
放出およびニューロン突起伸長に影響を及ぼすようであ
る。
【０００６】酸化窒素は体内で種々の役割を果たしてい
る。脳において酸化窒素は神経伝達物質であると考えら
れている。それはアルギニンから、アルギニンのグアニ
ジノ基を酸化して酸化窒素とシトルリンを形成する酸化
窒素シンターゼにより形成される。グルタメート受容体
のＮ−メチル−ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）サブタ
イプの刺激は酸化窒素シンターゼを急速かつ顕著に活性
化し、そしてｃＧＭＰ形成を刺激する。アルギニン誘導
体、例えばニトロアルギニンでの酸化窒素シンターゼの
阻害はｃＧＭＰレベルにおけるグルタメート誘導増加を
ブロックする。酸化窒素シンターゼはカルシウム−カル
モジュリン要求酵素であり、そしてＮ−メチル−ｄ−ア
スパルテート受容体は、グルタメート刺激により開口さ
れてカルシウムが細胞中に急送され、そして酸化窒素シ
ンターゼを活性化するカルシウムチャンネルを有するの
で、Ｎ−メチル−ｄ−アスパルテート受容体活性化は酸
化窒素シンターゼ活性を刺激する。
【０００７】グルタメートは生理学的神経伝達物質であ
る。しかしながら、過剰に放出されると、グルタメート
はＮ−メチル−ｄ−アスパルテート受容体を介して神経
毒性を誘引する。大脳皮質ニューロン培養体のグルタメ
ートまたはＮ−メチル−ｄ−アスパルテートでの処理は
９０％までのニューロンを殺し、そしてこれらの作用は
Ｎ−メチル−ｄ−アスパルテート拮抗薬剤によりブロッ
クされる。このＮ−メチル−ｄ−アスパルテート神経毒
性は血管発作（拍動）を伴う神経障害の主因であると考
えられている。従って、大脳血管閉塞を伴うグルタメー
トの大量放出があり、そして数多くのＮ−メチル−ｄ−
アスパルテート拮抗剤は発作障害をブロックする。酸化
窒素シンターゼのリン酸化はその触媒活性を阻害する。
酸化窒素シンターゼリン酸化を高めることにより、ＦＫ
５０６は酸化窒素形成を機能的に阻害し得、そしてその
ためにグルタメート神経毒性をブロックする。実際、低
濃度のＦＫ５０６およびシクロスポリンＡは両方とも皮
質培養体においてＮ−メチル−ｄ−アスパルテート神経
毒性をブロックする。ラパマイシンはＦＫ５０６の治療
効果を逆にするので、ＦＫＢＰの仲介機能は明らかであ
る。免疫抑制剤として既に市販されているＦＫ５０６は
おそらく発作患者に臨床的に使用され得る。
【０００８】ＦＫ５０６はまた成長関連プロテイン−４
３（ＧＡＰ４３）のリン酸化を増大する。ＧＡＰ４３は
ニューロン突起伸長に包含され、そしてそのリン酸化は
この活性を高めるように思われる。従って、ＦＫ５０
６、ラパマイシンおよびシクロスポリンのニューロン突
起伸長における作用はＰＣ１２細胞を用いて試験され
た。ＰＣ１２細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）により刺激
される際に軸索を伸ばす神経様細胞の連続系である。
【０００９】驚くべきことに、ピコモル濃度の免疫抑制
剤、例えばＦＫ５０６およびラパマイシンがＰＣ１２細
胞および知覚神経、すなわち後根ガングリオン（神経
節）細胞（ＤＲＧ）における軸索の成長を刺激すること
が見出されている（Lyons 等,Proc. of Natl. Acad. Sc
i., 1994, vol. 91, pp. 3191-3195 ）。全身の動物実
験において、ＦＫ５０６は顔面神経損傷の後に神経再生
を刺激することが見出され、そして座骨神経機能障害を
有する動物における機能回復を結果的に導く。
【００１０】より詳しくは、ＦＫＢＰに対する高い親和
性を有する薬剤が強力なロタマーゼ阻害剤であり、そし
て優れた神経栄養作用を示すことが見出されている。Sn
yder等, 「イムノフィリンおよび神経系」，Nature Med
icine, Volume 1, No. 1, January 1995, 32-37 。これ
らの発見は種々の末梢ニューロパシー（神経障害）の処
置や中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン再成長の増加に
おける免疫抑制剤の使用を示唆する。神経変性障害、例
えばアルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮側
索硬化（ＡＬＳ）が該障害において影響を受けたニュー
ロンの特定の集合に特異的な神経栄養基質の損失または
減少した利用可能性に起因して生じ得ることが研究によ
り示されている。
【００１１】中枢神経系における特定のニューロン集合
体に影響を及ぼすいくつかの神経栄養因子は同定されて
いる。例えば、アルツハイマー病は神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）の減少または損失に起因することが推定されてい
る。このため、アルツハイマー病患者を外因性神経成長
因子またはその他の神経栄養タンパク質、例えば脳誘導
成長因子、グリア誘導神経因子、毛様体神経栄養因子お
よび変性性ニューロン集合体の残存を増加するためのニ
ューロトロピン−３で治療することが提案されている。
【００１２】種々の神経学的疾病状態におけるこれらの
タンパク質の臨床への適用は、神経系の標的への、大き
いタンパク質の移送および生体利用可能性の難しさによ
り妨げられている。一方、神経栄養活性を有する免疫抑
制剤は比較的小さく、そして優れた生体利用可能性およ
び特異性を示す。しかしながら、長期にわたり投与され
ると、免疫抑制剤は、腎毒性、例えば糸球体濾過の損傷
および不可逆的な間隙性線維症（Kopp等, 1991, J. Am.
Soc. Nephrol. 1:162）；神経学的欠損、例えば不随意
の震えまたは非特異的大脳アンギナ、例として非局在の
頭痛（De Greon等, 1987, N. Engl. J. Med. 317:86
1）；および血管系の高血圧やそれに起因する合併症（K
ahan 等, 1989, N. Engl. J. Med. 321:1725 ）等を含
む多くの非常に危険な副作用を示す。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、軸索の成長
を増加し、そして種々の神経病理学的状態においてニュ
ーロン成長および再生を促進し、その場合、ニューロン
修復は物理的損傷や疾病状態、例えば糖尿病による末梢
神経損傷、中枢神経系（脊髄および脳）への物理的損
傷、発作を伴う脳損傷を包含して促進され得るための、
そしてパーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮
側索硬化を包含する神経変性に関連する神経学的障害の
治療のための、非常に有効である小分子ＦＫＢＰロタマ
ーゼ阻害剤を含有する、非免疫抑制性ならびに免疫抑制
性ピペコリン酸誘導体化合物を提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明はＦＫＢＲ型のイ
ムノフィリンに対する親和性を有する神経栄養性ピペコ
リン酸誘導体化合物をイムノフィリンタンパク質と関係
がある酵素活性の阻害剤、特にペプチジル−プロリルイ
ソメラーゼまたはロタマーゼ酵素活性の阻害剤として使
用する方法に関するものである。
【００１５】本発明の好ましい態様は、ＦＫＢＰ型イム
ノフィリンに対する親和性を有するピペコリン酸誘導体
の有効量を動物に投与し、損傷した末梢神経の成長を刺
激するか、またはニューロン再生を促進することからな
り、前記ＦＫＢＰ型イムノフィリンはロタマーゼ活性を
示し、そして前記ピペコリン酸誘導体は前記イムノフィ
リンのロタマーゼ活性を阻害する、動物における神経学
的障害を治療する方法である。
【００１６】本発明のもう一つの好ましい態様は、ＦＫ
ＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有するピペコリ
ン酸誘導体の有効量を神経栄養成長因子、脳誘導成長因
子、グリア誘導成長因子、毛様体神経栄養因子およびニ
ューロトロピン−３からなる群から選択される神経栄養
因子の有効量と組み合わせて動物に投与し、損傷した末
梢神経の成長を刺激するか、またはニューロン再生を促
進することからなり、前記ＦＫＢＰ型イムノフィリンは
ロタマーゼ活性を示し、そして前記ピペコリン酸誘導体
は前記イムノフィリンのロタマーゼ活性を阻害する、動
物における神経学的障害を治療する方法である。
【００１７】本発明のもう一つの好ましい態様は、ＦＫ
ＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有するピペコリ
ン酸誘導体化合物の有効量を損傷した末梢神経に投与
し、損傷した末梢神経の成長を刺激または促進すること
からなり、前記ＦＫＢＰ型イムノフィリンはロタマーゼ
活性を示し、そして前記ピペコリン酸誘導体は前記イム
ノフィリンのロタマーゼ活性を阻害する、損傷した末梢
神経の成長を刺激する方法である。
【００１８】本発明のもう一つの好ましい態様は、ＦＫ
ＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有するピペコリ
ン酸誘導体化合物の有効量を損傷した末梢神経に投与
し、損傷した末梢神経の成長を刺激することからなり、
前記ＦＫＢＰ型イムノフィリンはロタマーゼ活性を示
し、そして前記ピペコリン酸誘導体は前記イムノフィリ
ンのロタマーゼ活性を阻害する、損傷した末梢神経の成
長を刺激する方法である。
【００１９】本発明のもう一つの好ましい態様は、ＦＫ
ＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有するピペコリ
ン酸誘導体化合物の有効量を動物に投与し、ニューロン
再生を促進することからなり、前記ＦＫＢＰ型イムノフ
ィリンはロタマーゼ活性を示し、そして前記ピペコリン
酸誘導体は前記イムノフィリンのロタマーゼ活性を阻害
する、動物におけるニューロン再生および成長を促進す
る方法である。
【００２０】本発明の別の好ましい態様は、ＦＫＢＰ型
イムノフィリンに対する親和性を有するピペコリン酸誘
導体の有効量を動物に投与し、神経変性を防止すること
からなり、前記ＦＫＢＰ型イムノフィリンはロタマーゼ
活性を示し、そして前記ピペコリン酸誘導体は前記イム
ノフィリンのロタマーゼ活性を阻害する、動物における
神経変性を防止する方法である。
【００２１】本発明の新規な神経栄養性ピペコリン酸誘
導体化合物はＦＫ５０６結合性タンパク質、例えばＦＫ
ＢＰ−１２に対する親和性を有する。本発明の神経栄養
化合物がＦＫＢＰに結合されると、それらはプロリル−
ペプチジルシス−トランスイソメラーゼ活性または前記
結合タンパク質のロタマーゼ活性を阻害し、そして予期
されなかったことに軸索(neurite) の成長を刺激するこ
とが見出された。
【００２２】本発明の化合物は無機または有機酸および
塩基から誘導される塩の形態で使用され得る。そのよう
な酸塩には以下のものが包含される：酢酸塩、アジピン
酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、
ベンゼンスルホン酸塩、ビスルフェート酪酸塩、クエン
酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シク
ロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル
硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプ
タン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミススルフェートヘプ
タン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化水素塩、臭化水素塩、ヨ
ウ化水素塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸
塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレ
ンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエー
ト（パルミチン酸塩）、ペクチン酸塩、プロピオン酸
塩、コハク酸塩、タルタル酸塩、チオシアン酸塩、トシ
レートおよびウンデカン酸塩。塩基塩はアンモニウム
塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウムおよびカリウム
塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩およびマ
グネシウム塩、有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシ
ルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、およびアミ
ノ酸例えばアルギニン、リジン等との塩を包含する。ま
た、塩基性窒素含有基はそのような試薬、例えば低級ア
ルキルハロゲン化物例えば塩化、臭化およびヨウ化メチ
ル、エチル、プロピルおよびブチル；ジアルキルスルフ
ェート、例としてジメチル、ジエチル、ジブチルおよび
ジアミルスルフェート、長鎖ハロゲン化物、例えば塩
化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルお
よびステアリル、アルアルキルハロゲン化物例として臭
化ベンジルおよびフェンエチル等で四級化されていても
よい。水もしくは油溶性または分散性生成物がそれによ
り得られる。
【００２３】本発明の神経栄養化合物は患者に周期的に
投与され、神経学的障害に治療を施すか、またはニュー
ロン再生および成長を刺激することが望ましいその他の
理由、例えば神経変性に関連する種々の末梢神経病的お
よび神経学的障害に治療を施すことができる。本発明の
化合物は種々の哺乳類の神経学的障害の治療のために、
ヒト以外の哺乳動物に投与されてもよい。
【００２４】本発明の新規化合物はロタマーゼ活性の強
力な阻害剤であり、そして非常に高度の神経栄養活性を
有する。この活性は損傷したニューロンの刺激、ニュー
ロン再生の促進、神経変性の防止、およびニューロン変
性や末梢神経病と関連することが知られている様々な神
経学的障害の治療に有用である。治療され得る神経学的
障害には以下のものが包含されるが、それらに限定され
るものではない：三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、
重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮側索硬化、進
行性筋萎縮、進行性球状遺伝性筋萎縮、ヘルニア様破壊
または脱出インバータブラエ(invertabrae) 椎間板症候
群、頸部脊椎症、叢障害(plexus disorders)、胸部出口
破損症候群、末梢ニューロパシー例えば鉛、ダプソン、
マダニ、ポルフィリア(porphyria) またはギャン−バレ
ー症候群により引き起こされる疾病、アルツハイマー病
およびパーキンソン病。
【００２５】上記の目的のために、本発明の化合物は経
口で、非経口で、吸入スプレーにより、局部的に、直腸
に、経鼻で、経頬で、経膣で、または慣用の非毒性の薬
学的に許容され得る担体、助剤およびビヒクルを含有す
る投与配合剤中の移入レザバーを介して投与され得る。
本明細書において使用されるような非経口という用語は
皮下、静脈内、筋肉内、腹膜腔内、脊髄内、心室内（脳
室内）、胸骨内および頭蓋内注射または注入（輸液）法
を包含する。
【００２６】中枢神経系標的として治療を有効にするた
めに、イムノフィリン−薬剤複合体は末端で投与された
場合に血液脳関門を容易に通過すべきである。血液脳関
門を通過できない本発明の化合物は心室内（脳室内）経
路により有効に投与され得る。
【００２７】薬剤組成物は、例えば滅菌注入水性または
油性懸濁液として、滅菌注入製剤の形態であってよい。
この懸濁液は適当な分散剤または水和剤および懸濁剤を
用いて当業界では公知の技術に従って製剤化され得る。
滅菌注入製剤はまた、非毒性で非経口（注射）に適合し
得る希釈剤または溶剤中の滅菌注入液または懸濁液、例
えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使
用され得る適用可能なビヒクルおよび溶剤は水、リンガ
ー液および等張塩化ナトリウム液である。さらに、滅菌
固定油が溶剤または懸濁媒体として通常使用される。こ
の目的のために、合成モノ−またはジグリセリド等のあ
らゆる非刺激性の固定油が使用され得る。脂肪酸、例え
ばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注入可能
なオリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシ
エチル化体の製造における用途を見出す。これらの油溶
液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分
散剤を含有し得る。
【００２８】化合物はカプセルまたは錠剤の形態で、例
えば水性懸濁液または水溶液として経口投与され得る。
経口用の錠剤の場合、慣用の担体はラクトースおよびコ
ーンスターチを包含する。滑剤、例えばステアリン酸マ
グネシウムもまた典型的に添加される。カプセル形態で
の経口投与のために、有用な希釈剤はラクトースおよび
乾燥コーンスターチを包含する。水性懸濁液が経口用途
に要求される場合、活性成分は乳化剤および懸濁剤と組
合せられる。所望するならば、ある種の甘味料および／
または香味料および／または着色料が添加され得る。
【００２９】本発明の化合物はまた、薬剤の直腸投与の
ために坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、
室温で固体であるが、直腸温度で液体であり、そのため
直腸内で融解して薬剤を放出するであろう適当な非刺激
性の賦形剤と薬剤とを混合することにより製造され得
る。そのような物質はココアバター、密蝋およびポリエ
チレングリコールを包含する。
【００３０】本発明の化合物はまた、特に治療が行われ
る病気が眼、皮膚またはより下部の腸管の神経学的障害
等の局部適用により容易に接近し得る領域または器官を
包含する場合には、局部に投与されてもよい。適当な局
部製剤は上記領域の各々のために容易に調製される。
【００３１】眼への使用のために、上記化合物は等張ｐ
Ｈ調整滅菌生理食塩水中の微小化懸濁液として、または
好ましくは防腐薬例えば塩化ベンジルアルコニウムを含
み、もしくは含まずに等張ｐＨ調整滅菌生理食塩水中の
溶液として製剤化され得る。また、眼への使用のため
に、上記化合物は軟膏例えばワセリン中に製剤化されて
もよい。
【００３２】皮膚への局部的適用のために、上記化合物
は該化合物を懸濁または溶解されてその中に含有する適
当な軟膏、例えば以下の１種またはそれ以上の混合物中
に製剤化され得る：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリ
ン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオ
キシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水。また、
上記化合物は例えば以下の１種またはそれ以上の混合
物：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベー
ト６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコ
ール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール
および水中に懸濁または溶解されて活性化合物を含有す
る適当なローションまたはクリームに製剤化されてもよ
い。
【００３３】より下部の腸管に対する局部適用は直腸坐
剤製剤（上記参照）または適当な浣腸製剤で行われ得
る。
【００３４】上記有効化合物約０．１ｍｇないし約１０
０００ｍｇのオーダーでの投与レベルが上記状態の処置
に有用であり、約０．１ｍｇないし約１０００ｍｇのレ
ベルが好ましい。単一投与形態を製造するために担体物
質と組合せられ得る有効成分の量は処置される主体およ
び投与の特定の様式に応じて変化するであろう。
【００３５】しかしながら、特定の患者に対する特定の
投与レベルは使用される特定化合物の活性、年齢、体
重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄の
頻度、薬剤の併用、処置される特定の疾病の程度および
投与の形態等の種々の因子に依存するであろう。
【００３６】上記化合物はその他の神経栄養薬剤、例え
ば神経栄養成長因子（ＮＧＦ）、グリア誘導神経因子、
脳誘導神経因子、毛様体神経栄養因子およびニューロト
ロピン−３と共に投与され得る。その他の神経栄養薬剤
の投与レベルは上記の因子および薬剤併用の神経栄養作
用に依存するであろう。
【００３７】
【発明の実施の形態】
方法および操作 座骨神経挫傷 本実施例は通常の末梢神経における高レベルのＦＫＢＰ
を示し、そしてこれらが神経挫傷に続いて増加すること
を示す。ＦＫＢＰがＧＡＰ−４３の作用におけるニュー
ロン突起伸長に生理学的に関連しているならば、末梢神
経においてＦＫＢＰの実質的レベルを予測し得る。従っ
て、我々はラット座骨神経、ならびに２日齢の幼ラット
から単離された成長円錐体における〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０
６結合性を測定し、そして大脳皮質および種々の末梢組
織の値と比較した。
【００３８】〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６オートラジオグラフ
ィーは、解凍および風乾後、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２
ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５％エタノールおよび
０．０２％ツイーン２０（ｐＨ７．４）からなる緩衝液
中で１時間予備培養した未固定切片上で記載されるよう
に行われた。切片を次に１ｎＭ〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６
（８６．５Ｃｉ／ミリモル；デュポン−ＮＥＮ，マサチ
ューセッツ州ボストン）に予備培養緩衝液中室温で１時
間曝露した。非特異的結合は１μＭ ＦＫ−５０６の添
加により決定された。保温の後、スライドを氷冷予備培
養緩衝液中で４×５分間洗浄し、そして風乾した。放射
標識切片を次にトリチウム感受性フィルムまたはコダッ
クＮＴＢ−２エマルジョンを被覆したカバースリップに
並列した。
【００３９】
【表１】 座骨神経および成長円錐体への〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６の結合性 （Ａ）座骨神経における〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６の結合性 ──────────────────────────────── 組織 Ｂｍａｘ （ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質） ──────────────────────────────── 成熟ラット 座骨神経 ２２．１ 大脳皮質 ３８．０ 胸腺 ９．５ 脾臓 ８．０ 新生ラット 前脳 ２５．５ 成長円錐体 １０．２ ──────────────────────────────── （Ｂ）座骨神経挫傷後の〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６の結合性 ──────────────────────────────── タンパク質 Ｂｍａｘ Ｂｍａｘ ｆｍｏｌ／５ｍｍ切片 ｐｍｏｌ／ｍｇ ──────────────────────────────── 未処理 ３１．８± ２．１ ２１．２±１．４ 挫傷７日目 １３６．５±１５．７* ４０．１±２．０* 〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６の結合性は方法の項に記載したよ
うに評価された。表１（Ａ）において実験は３回反復さ
れ、１０％未満の変動だった。表１（Ｂ）において、値
は平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）て表される。* Ｐ＜
０．０５個々の平均値に対するスチューデントｔ試験。
【００４０】試験された全ての組織の中で、座骨神経結
合レベルが最高であり、大脳皮質のものより幾分高く、
そしてリンパ球と結合したＦＫＢＰを含有する胸腺およ
び脾臓におけるレベルより約１０倍高い。表１（Ａ）参
照。神経再生におけるＦＫＢＰの役割に対する証拠は、
我々が成熟ラットの座骨神経を挫傷させ、そして神経挫
傷部から５ｍｍ離れた基部において７日後に〔 3Ｈ〕Ｆ
Ｋ−５０６の結合性を測定した実験に由来する。
【００４１】スプラーグ−ダウレイ(Sprague-Dawley)ラ
ット（１７５−２００ｇ）をロムプン（１２ｍｋ／ｋ
ｇ）ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻痺させ
た。無菌法を用いて、顔面神経を宝石商摂子でもって茎
乳突孔からその出口に向け遠位に２ｍｍの箇所で２×３
０秒間圧搾した（この操作を本明細書で、挫傷とも記載
する）。同様の操作が大腿部中央のレベルにある座骨神
経を圧搾するために使用された。
【００４２】挫傷部の基部側における全体の結合性が４
組、対照の値と比較された。全タンパク質は基部側断片
において実質的に増加しており、タンパク質ｍｇあたり
の〔3Ｈ〕ＦＫ−５０６結合性は基部断片において２倍
程度である。
【００４３】顔面神経挫傷 この例は顔面神経損傷がＦＫＢＰおよびＧＡＰ−４３の
同時発現を増加することを示す。顔面神経挫傷に続い
て、ＧＡＰ−４３のｍＲＮＡレベルは顔面神経核におい
て増加する。in situ ハイブリダイゼーションを用い
て、我々は顔面神経挫傷に続いてＦＫＢＰ、ＧＡＰ−４
３およびカルシニューリンのｍＲＮＡレベルを測定し
た。
【００４４】ラットは１５０−２００ｍｌ氷冷リン酸緩
衝液（ＰＢＳ）（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で心臓を通す
ように灌流された。組織を除去し、そしてすぐにイソペ
ンタン（−８０℃）中に凍結させた。低温切片（厚さ１
８μｍ）を切断し、そしてゼラチン被覆スライド上に載
せて解凍した。
【００４５】in situ ハイブリダイゼーションは
〔35Ｓ〕ｄＡＴＰで末端標識されたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いて上記のように行われた。
ＦＫＢＰに対し、Maki等，(1990) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 87, 5440-5443 およびStandaert, R. F.等，(1
990) Nature 346, 671-674（これらの文献は参照により
本明細書に編入される）に開示されたクローン化ｃＤＮ
Ａの以下の領域：７０−１１４，２１４−２５８，４４
１−４８５に相補的な３種のオリゴヌクレオチドが使用
された。ＧＡＰ−４３に対し、Rosenthal, A. 等，(198
7) EMBO J. 6, 3641-3646 （該文献は参照により本明細
書に編入される）に開示されたクローン化ｃＤＮＡのヌ
クレオチド９６１−１００８，１０８１−１１２８，１
２０１−１２４８に相補的な３種のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが使用された。カルシニューリンＡαに対
し、Ito 等，(1989) Biochem. Biophys. Res. Commun.
163, 1492-1497（該文献は参照により本明細書に編入さ
れる）に開示されたヌクレオチド１３６３−１４１０お
よび１７１１−１７５８に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが、そしてカルシニューリンＡβに対し、
Kuno, T.等，(1989) Biochem. Biophys. Res. Commun.
165, 1352-1358（該文献は参照により本明細書に編入さ
れる）に開示されたヌクレオチド１３３９−１３８６お
よび１５６９−１６１６が使用された。切片を解凍し、
そして乾燥させ、次にＰＢＳ中の４％の新たに解重合し
たパラホルムアルデヒド中に５分間固定した。ＰＢＳ中
で２回すすいだ後、切片を０．１Ｍトリエタノールアミ
ン、０．５％ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中の０．２５％無
水酢酸でアセチル化し、次に規格アルコール中で水分除
去を行い、クロロホルム中で５分間脱脂し、９５％エタ
ノールに再び水和させ、そして風乾した。ハイブリダイ
ゼーションは５０％脱イオン化ホルムアルデヒド、１０
％硫酸デキストラン、４×ＳＳＣ、１×デンハルツ溶
液、２０ｍＭリン酸緩衝液、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子
ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ酵母トランスファーＲＮＡ、
１０ｍＭジチオトレイトール、２．０％ベータメルカプ
トエタノール（ＢＭＤ）、１．０ｍＭ ＥＤＴＡおよび
標識プローブ（２００００００ｄｐｍ／切片）を含有す
る緩衝液中３７℃で一晩行われた。ハイブリダイゼーシ
ョンに続き、切片を１×ＳＳＣ、１．０％ＢＭＥ中室温
で１５分間すすぎ、次に５５℃で１０分間２回風乾し、
そしてフィルム上に置くか、またはコダックＮＴＢ−２
エマルジョン中に浸漬した。
【００４６】ＦＫＢＰおよびＧＡＰ−４３発現の顕著な
増加が観察され、カルシニューリン発現に変化は見られ
なかった。顔面神経挫傷後２４時間以内では、ＦＫＢＰ
発現は１−２週間明らかなピークレベルで増加し、ｍＲ
ＮＡ濃度は３週間で実質的に消失する。より高倍率下で
の実験は、ＦＫＢＰｍＲＮＡに対する銀粒子の増加した
レベルがニューロン細胞体に限られていることを示す
（図２）。切断した顔面核のノーザンブロット分析は、
ＦＫＢＰ特異的ｍＲＮＡの増加したレベルを確認する。
ＧＡＰ−４３ｍＲＮＡはＦＫＢＰのものと近似する時間
経過を辿る。一方、カルシニューリン発現における変化
は試験したあらゆる時点で検出されない。
【００４７】切断顔面核からの全細胞ＲＮＡが単離され
た。１０または２０μｇの全ＲＮＡの試料が１％アガロ
ース、２．０％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動され、
そしてナイロン膜に１０ｎＭ ＮａＯＨ中で移し取られ
た。ランダムプライムにより１×１０9 ｃｐｍ／ｕｇの
比活性まで〔35Ｓ〕ｄＣＴＰで標識されたＦＫＢＰに対
するｃＤＮＡプローブを、５０％ホルムアミド、２×Ｓ
ＳＰＥ、７％ＳＤＳ、０．５％Ｂｌｏｔｔｏおよび１０
０ｕｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中４２℃で
一晩バイブリッド形成させた。ブロットを室温で２０分
間洗浄し、そして０．１５×ＳＳＣ、０．１５％ＳＤＳ
中６５℃で２×１５分間洗浄し、次いで４８０９６時間
フィルムに曝露した。
【００４８】非損傷側に、対照領域に比べ銀粒のわずか
な増加が観察される。これは反対側のニューロンもまた
軸索切断に応答するという発見と一致する。顔面神経挫
傷に続いて、ラットは顔面神経麻痺を示したが、これは
神経再生の完了と一致する３週間で機能回復するひげ動
作の欠失により明らかである。我々のラットの中に我々
はまた、３週間で機能の回復を伴う神経挫傷の後のひげ
動作の欠失を観察した。従って、ＧＡＰ−４３およびＦ
ＫＢＰの高められた発現の時間経過は神経再生の過程と
相互に関連する
【００４９】座骨神経再生 この例は座骨神経再生と関連するＦＫＢＰおよびＧＡＰ
−４３における変化を示す。座骨神経損傷に続いて、Ｇ
ＡＰ−４３ｍＲＮＡレベルは脊髄運動ニューロンおよび
後根ガングリオンニューロン細胞の両方において高めら
れる。座骨神経挫傷に供したラットにおいて、我々はＬ
−４，５（図３）および後根ガングリオンニューロン細
胞にＧＡＰ−４３発現（図４）の報告された増加と一致
する運動ニューロンにおけるＦＫＢＰに対するｍＲＮＡ
レベルでの顕著な増加を観察した。高倍率で、我々はニ
ューロン細胞体に局在化したＦＫＭＢｍＲＮＡ銀粒を観
察した（図３）。我々はＦＫＢＰに選択的に結合する条
件下で〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６結合性のオートラジオグラ
フィーによるＦＫＢＰタンパク質レベルを追跡した。高
められたＦＫＢＰは後根ガングリオンにおいて一次知覚
ニューロンにおいて検出され、一方、座骨神経挫傷に続
いて運動ニューロン細胞に増加はないことが明らかであ
る。
【００５０】増加ＦＫＢＰ発現の再生選択性との関連は
リシンでの実験によりさらに支持される。末梢神経に注
入された場合、リシンは関連神経再生なしに破壊される
細胞体中に戻される。我々はリシン（ＲＣＡ６０，シグ
マ，ミズーリ州セントルイス）０．５ｕｇを、Streitお
よびKreutzbnerg の方法に従って０．５ｕｌＰＢＳおよ
び０．１％ファストグリーン中、その他の実験において
圧搾が行われたのと顔面神経の同じ部位に注射した(Str
eit 等, (1988) J. Comp. Neurol. 268, 248-263) 。
【００５１】我々はリシン処理後２、４および７日目に
ＦＫＢＰｍＲＮＡに対するin situハイブリダイゼーシ
ョン局在化試験を行った（図５）。ＦＫＢＰｍＲＮＡに
おける増加がリシン処理後に観察されない。リシン処理
の後にも神経挫傷の後にもグリオーシスが起こる。リシ
ン処理に続いてＦＫＢＰｍＲＮＡの増加がないのは、顔
面核におけるＦＫＢＰｍＲＮＡの選択的ニューロン局在
化と一致する。
【００５２】座骨神経におけるＦＫＢＰ移送 この例はＦＫＢＰが座骨神経において急速に移送される
されることを示す。ＦＫＢＰｍＲＮＡの増加にもかかわ
らず、座骨神経挫傷に続いて運動ニューロンにおいてＦ
ＫＢＰタンパク質が増加しないことは、該タンパク質が
細胞体から出て神経突起中に急速に移送されることを示
唆する。このことは、ＦＫＢＰｍＲＮＡが低レベルのＦ
ＫＢＰタンパク質を含有する小脳のグラニュール細胞に
集中し、ＦＫＢＰタンパク質レベルがグラニュール細胞
から生じる平行繊維と結合した小脳の分子層に高度に集
中しているという初期の観察と適合する。ＦＫＢＰの可
能な移送を試験するために、我々は座骨神経を圧搾し、
そして７日後、圧搾部の１０および２０ｍｍの基部側の
位置を結紮した。結紮６時間後、我々は〔 3Ｈ〕ＦＫ−
５０６結合性を結紮部位の３ｍｍ領域において追跡した
（図６）。
【００５３】軸索移送試験のために、古典的結紮法がTe
tzlaff等の方法に続いて使用された。座骨神経挫傷１週
間後、２種の集合結紮部（５１０縫合）が最初の圧搾部
位から１０ｍｍの位置にある最も遠位の結紮から約１０
ｍｍ離れた神経上に置かれた。６時間後、神経５−３ｍ
ｍ部分が基部側、遠位側、および図５に示される集合結
紮部の間の領域から集められた。神経部分が、５０ｍＭ
トリスＨＣｌ，ｐＨ７．４ １０容量中にホモジネート
することにより〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６結合性アッセイの
ために調製された。ホモジネートを１５０００×ｇ４℃
で２０分間遠心分離し、そして上清を集め、クマーシー
ブルー染料結合性アッセイ（パース）を用いて全タンパ
ク質濃度を評価した。〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６結合性は、
５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．４，２ｍｇ／ｍｌウシ
血清アルブミン，２５０ｐＭ〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６およ
び種々の濃度の非標識ＦＫ−５０６からなるアッセイ緩
衝液最終容量０．４ｍｌ中に全可溶性タンパク質２ｕｇ
を含有する一部に対し、記載されるように（４）行われ
た。２５℃で６０分間保温した後、０．３５ｍｌをＬＨ
−２０セファデックス（ファルマシアＬＫＢ）の０．８
ｍｌカラム上に載せ、そしてアッセイ緩衝液０．４ｍｌ
で洗浄した。溶離液は集められ、そしてシンチレーショ
ンカウンターで計測した。
【００５４】結果は図５に示される。〔 3Ｈ〕ＦＫ−５
０６結合性レベルは挫傷部から結紮まで２０ｃｍの基部
側において最高であり、その他の部位においてほぼ４倍
のレベルであった。部位Ａ−Ｄにおける〔 3Ｈ〕ＦＫ−
５０６結合性レベルに基づいて、我々はＦＫＢＰに対す
る前方への移送の速度を計算した。日あたり２４０ｍｍ
の速度はニューロンタンパク質に対して最速移送速度を
示すＧＡＰ−４３に対する移送速度と実質的に同じであ
る。
【００５５】神経挫傷に続きＦＫＢＰの蓄積を可視化す
るために、我々は座骨神経の圧搾の部位をマークするた
めに緩い結紮を行い、そしてＦＫＢＰｍＲＮＡに対する
in situ ハイブリダイゼーションおよび〔 3Ｈ〕ＦＫ−
５０６結合性に対するオートラジオグラフィーを行った
（図７）。ほとんどのＦＫＢＰｍＲＮＡおよび〔 3Ｈ〕
ＦＫ−５０６結合性は挫傷部に近い基部側に蓄積する。
これらのレベルは対照の非挫傷座骨神経におけるよりも
かなり高い。高倍率でのin situ ハイブリダイゼーショ
ンおよびオートラジオグラフィー調製物の試験はニュー
ロン繊維に結合した銀粒子を表す。同定を我々が正確に
決定し得ない細胞に局在した銀粒子もあるが、それらは
シュワン細胞、マクロファージまたは繊維芽細胞である
かもしれない。
【００５６】ＰＣ１２細胞中のＦＫＢＰ この例はＰＣ１２細胞がＦＫＢＰを含有し、そしてＦＫ
ＢＰレベルが神経成長因子により高められることを示
す。我々は、基礎麻酔条件下〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６の細
胞への結合性を追跡し、そして神経成長因子（ＮＧＦ）
で処理することによりＦＫＢＰの存在に対してＰＣ１２
細胞を試験した。
【００５７】ＰＣ１２細胞中のＦＫＢＰレベルは
〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６結合性曲線のスカッチャード分析
から得られた。培養体が培養ウエルから掻き取られ、そ
して５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，１００μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフル
オリドの１０容量中にホモジネートし、そして４℃、４
００００×ｇで２０分間遠心分離した。タンパク質は標
準としてウシ血清アルブミンを用いるクーマシーブルー
染料結合アッセイにより決定された。２５０ｐＭ
〔 3Ｈ〕ジヒドロＦＫ−５０６（８６．５Ｃｉ／ミリモ
ル，デュポン／ＮＥＮ）の結合性が５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ，ｐＨ７．４，２ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび種々の濃度
の非標識ＦＫ−５０６を含有するアッセイ緩衝液最終容
量０．４ｍｌ中に可溶性タンパク質５μｇを含有する試
料に対して評価された。２５℃で６０分間保温した後、
０．３５ｍｌをアッセイ緩衝液で予め平衡化したＬＨ−
２０セファデックス（ファルマシアＬＫＢ）の０．８ｍ
ｌカラム上に載せた。カラムをさらにアッセイ緩衝液
０．４ｍｌで洗浄し、溶離液を集め、フォーミュラ９６
３（デュポン／ＮＥＮ）と混合し、そしてベックマンシ
ンチレーションカウンターで計測した。結合した全体の
〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６から１μＭの非標識ＦＫ−５０６
の存在下で得られる結合性を差し引くことにより特異的
結合性が決定された。
【００５８】結果は図８に示されている。〔 3Ｈ〕ＦＫ
−５０６は未処理ＰＣ１２細胞ホモジネートに飽和状に
結合する。典型的な試験において、約１０００ｃｐｍが
結合し、１μＭ ＦＫ５０６の存在下での非特異的結合
性が約１５０ｃｐｍである。〔 3Ｈ〕ＦＫ−５０６結合
性の５０％阻害は結合部位が真正のＦＫＢＰに相当する
ことを示す１−２ｎＭ ＦＫ５０６で生じる。〔 3Ｈ〕
ＦＫ−５０６結合性はＮＧＦ処理に続いて顕著に増加す
る。顕著な増加は１０−１５時間で現れる。結合性は２
０時間で３倍になり、そして中程度の増加が１００時間
目に現れる。
【００５９】ＰＣ１２細胞中の増加した軸索伸長 この例はＦＫ−５０６およびラパマイシンがＰＣ１２細
胞中で軸索伸長を増加することを示す。ＰＣ１２細胞は
１０％熱不活性化ウマ血清および５％熱不活性化ウシ胎
児血清を補足したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）中３７℃で５％ＣＯ2 に維持された。ＮＧＦにお
ける分化のために、ラット脚コラーゲンを５μｇ／ｃｍ
2 で被覆した３５ｍｍ培養ウエル中に１×１０5 で細胞
を置き、そして２％ウマ胎児血清、ＮＧＦおよび／また
はＦＫ５０６もしくはラパマイシンを補足したＤＭＥＭ
に培地を代える前に付着させた。軸索成長の定量のため
に、ランダム写真が作成され（ウエルあたり３−４）、
そして突起形成ニューロンが５μｍより大きい突起に対
して計測された。実験条件は写真撮影者および細胞計測
者により知らされなかった。４回の別々の試験が示され
た各々のデータ点に対して二重に行われた。軸索が同定
され、そして写真あたり約１００細胞から計測した。従
って、１２００−１６００細胞からの軸索がデータ点あ
たり計測された。
【００６０】観察されるように、ＮＧＦは１ｎｇ／ｍｌ
で最高刺激の１／２、そして約５０−１００ｎｇ／ｍｌ
で最高増加を示して、軸索成長を強力に刺激する（図
９，１０）。ＦＫ５０６（１００ｎＭ）はＮＧＦへの感
受性を高めることによりＮＧＦの効果を著しく増加させ
る。従って、ＦＫ５０６は最高の成長を引き出すのに必
要とされるＮＧＦ濃度を２０−５０倍減らす。ＦＫ５０
６の不在下での最高成長の１／２が５ｎｇ／ｍｌＮＧＦ
で生じ、そしてＦＫ５０６の存在下では０．１ｎｇ／ｍ
ｌＮＧＦで生じる。ＮＧＦの最高濃度（１０−１００ｎ
ｇ／ｍｌ）では、ＦＫ５０６は追加の軸索成長を生じな
い。
【００６１】ＦＫ５０６はその神経栄養効果において極
めて強力である。最高以下の濃度のＮＧＦ（１ｎｇ／ｍ
ｌ）の存在下、１ｎＭのＦＫ５０６が５０ｎｇ／ｍｌＮ
ＧＦで観察されたのと同じ最大成長を生じる（図１
１）。ＦＫ５０６の最大効果の１／２が約１００ｐＭで
得られる。ＮＧＦの不在下、ＦＫ５０６は軸索成長を引
き出さない（図１０）。
【００６２】ラパマイシンは、カルシニューリンを介し
て作用すると考えられず、その他のリン酸化カスケード
に影響を与え得る強力な免疫抑制剤である。ＦＫＢＰで
ＦＫ５０６拮抗剤としておそらく作用することにより、
ＦＫＢＰおよびカルシニューリンを介して生じるＦＫ５
０６の作用をラパマイシンは強力にブロックする。ラパ
マイシン（１μＭ）はＦＫ５０６の神経栄養作用をブロ
ックしない。実際、ラパマイシンはそれ自身神経栄養性
であり、１ｎＭで高い軸索成長を付与する。ラハマイシ
ンおよびＦＫ５０６は異なる機構を介して作用するよう
に考えられる。従って、ラパマイシンは突起の数ならび
にそれらの長さを増し、ＦＫ５０６は主に軸索の長さを
増す。さらに、ＦＫ５０６およびラパマイシンの効果は
付加的であるように考えられる。
【００６３】後根ガングリオン この例は、ＦＫ５０６が感覚ガングリオンに対して神経
栄養性であることを示す。我々は１６日目の胚状態のラ
ットからの後根ガングリオンの一次培養体へのＦＫ５０
６の作用を試験した。
【００６４】Ｅ１６段階の胚を妊娠スプラーグ−ダウレ
イラットから取りだし、そして後根ガングリオンを摘出
する。全体のガングリオン外植片をコラーゲン被覆３５
ｍｍ皿（ファルコン）中、Ｎ２培地（ダルベッコ変性イ
ーグル培地とハムＦ１２培地との１：１混合物，プロゲ
ステロン，セレニウム，インシュリン，プトレスシン，
グルコース，およびペニシリン−ストレプトマイシンを
補足）を用いて１５％ＣＯ2 環境中３７℃で培養した。
感覚ガングリオンは種々の濃度のＮＧＦおよび／または
ＦＫ５０６またはラパマイシンまたは抗ＮＧＦ抗体で処
理された。ガングリオンはオリンパスＩＭＴ−２倒立顕
微鏡を用いて相コントラストの下、２−３日毎に観察さ
れ、そして軸索長さの測定が行われた。各ガングリオン
の軸索領域は４つの象限に分割され、そして各象限にお
ける最大軸索の長さがアイピースマイクロメーターを用
いてミクロン単位で計測された。これらの測定の平均を
ガングリオンに対する軸索長さとして採用した。
【００６５】〔 3Ｈ〕ＦＫ５０６オートラジオグラフィ
ーに対し、後根ガングリオン培養体をコラーゲン５μｇ
／ｃｍ2 で被覆したチャンバースライド上で増殖させ
た。培養体を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）中の氷冷した４％の新たに解重合したパラホル
ムアルデヒドでスライド上に１時間固定し、次いでリン
酸緩衝液で２回洗浄した。固定された培養体はスライド
を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブ
ミン、および０．０２％ツイーン２０（ｐＨ７．４）か
らなる緩衝液中で予備培養することにより〔 3Ｈ〕ＦＫ
−５０６で標識された。次いで、１ｎＭ〔 3Ｈ〕ＦＫ５
０６を含有する同一アッセイ緩衝液中で培養した。非特
異的結合は１μＭ非標識ＦＫ５０６を添加することによ
り決定された。スライドを次に乾燥前に４×５分すす
ぎ、そして次にトリチウム感受性フィルムに並列した。
【００６６】〔 3Ｈ〕ＦＫ５０６結合部位のオートラジ
オグラフィーは、これらのガングリオンにおいてＦＫＢ
Ｐ結合銀粒子の実質的なレベルを示す（図１２）。１μ
Ｍ非標識ＦＫ５０６では、オートラジオグラフの粒子は
結合の特異性を示していなかった。以前に報告されたよ
うに、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）はガングリオン突起
の数および長さを著しく増やす（図１３）。ＦＫ５０６
（１μＭ）は単独で同様の神経栄養効果を生じるが、１
ｎＭという低濃度のＦＫ５０６が成長におけるかなりの
増加を生じる。ＦＫ５０６拮抗剤として作用するラパマ
イシン（１μＭ）はＦＫ５０６（１μＭ）の効果をブロ
ックし、従ってＦＫ５０６の作用はＦＫＢＰの特徴的な
薬剤特異性を示す。
【００６７】添加されるＮＧＦの不在下で、ＦＫ５０６
はＰＣ１２細胞における軸索成長を刺激しないことか
ら、感覚ガングリオンにおいてＦＫ５０６は単独で神経
栄養性である。ガングリオンにおけるシュワン細胞はＮ
ＧＦを製造し得、そしてシュワン細胞によるＮＧＦの製
造はタンパク質リン酸化反応により制御される。ＦＫ５
０６単独の作用が内因性ＮＧＦの効力を包含するのかを
確認するために、我々はＮＧＦに対する抗体の影響を調
べた（図１３）。抗ＮＧＦはＦＫ５０６（１μＭ）の神
経栄養効果を著しく減じた。我々が添加したＮＧＦの存
在下または不在下で抗ＮＧＦに曝露した細胞中で毒性の
形態学的証拠を観察しなかったように、抗ＮＧＦは毒性
作用を示さない。
【００６８】ＦＫ５０６は軸索成長の刺激に極めて効力
がある。１ｐＭという低濃度のＦＫ５０６が検出し得る
増加を生じる。０．１ないし１０ｎＭ ＦＫ５０６で徐
々に増加する成長が生じ（データは示していない）、最
大の成長は１μＭのＦＫ５０６を必要とする。
【００６９】軸索成長の時間経過はＮＧＦおよびＦＫ５
０６の全ての濃度で同様である。いくらかの成長が１日
目に現れ、成長は約５−６日でプラトーに達し始めてい
る。
【００７０】ＦＫ５０６の効果は低濃度のラパマイシ
ン、ＦＫＢＰでのＦＫ５０６公知拮抗剤により逆にされ
るので、ＦＫ５０６神経栄養効果は感覚ガングリオンに
おけるＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合性タンパク質）を包含
する。ラパマイシンＰＣ１２細胞においてＦＫ５０６効
果をブロックしないことは、ラパマイシンの別々の刺激
効果をおそらく反映している。ＰＣ１２細胞における軸
索成長のラパマイシン刺激に対する機構は直ちに明らか
とはならない。その免疫抑制作用はＦＫ５０６のものと
は異なる機構を包含すると考えられる。ラパマイシンは
Ｓ６リボソームサブユニットをリン酸化するＳ６キナー
ゼを阻害し得る。ラパマイシンはまたホスファチジルイ
ノシトール−３−キナーゼを阻害する。
【００７１】プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）仲介リン
酸化はニューロン再生の間の突起成長に関連している。
その他の証拠はニューロン突起伸長におけるＰＫＣの阻
害効果を示唆する。
【００７２】ＧＡＰ−４３は軸索に高度に集中した主な
カルシニューリン基質であり、そしてそのリン酸化はＦ
ＫＢＰにより制御される。低レベルのＧＡＰ−４３を有
するＰＣ１２細胞系が通常の軸索成長を示すので、ＧＡ
Ｐ−４３は軸索伸長に直接包含され得ない。しかしなが
ら、リン酸化ＧＡＰ−４３のレベルは軸索がそれらの標
的に近づく際に増加されるので、ＧＡＰ−４３およびそ
のリン酸化は標的化軸索に包含され得る。ＧＡＰ−４３
のリン酸化はまた、軸索伸長を制御するＣａ2+の移動に
影響を及ぼし得る。リン酸化ＧＡＰ−４３はホスファチ
ジルイノシトールビスホスフェート形成を阻害し、イノ
シトール１，４，５−トリホスフェートおよび会合した
Ｃａ2+放出のレベルを消失させる。さらに、ＧＡＰ−４
３のリン酸化はＣａ2+を結合するのに利用し得る生成遊
離カルモジュリンを有するカルモジュリンに対する親和
性を低下する。
【００７３】イムノフィリンは、軸索成長を制御するＣ
ａ2+に影響を与えるカルシニューリン以外の部位に作用
し得る。ＦＫＢＰはＣａ2+放出チャンネルであるリアノ
ジン受容体に結合する。骨格筋の筋小胞体において、Ｆ
Ｋ５０６はリアノジン受容体からＦＫＢＰを解離して、
Ｃａ2+誘導Ｃａ2+放出機構を促進する。さらに、ＦＫ５
０６はＦＫＢＰ２５ステロイド受容体およびその他の未
同定標的、例えばＦＫＢＰ１３に関連するものを包含す
るその他の部位に作用する。従って、その他の有効な機
構は軸索伸長においていくつかの役割を果たし得る。
【００７４】イムノフィリンの非免疫抑制性および免疫
抑制性リガンドはＰＣ１２細胞において軸索成長を刺激
する 本試験において、我々はＰＣ１２細胞および無傷ニワト
リ感覚ガングリオンにおいて軸索伸長の際のイムノフィ
リンのリガンド数の影響を詳細に調べた。我々は、非免
疫抑制性および免疫抑制性リガンドがＰＣ１２細胞およ
び感覚ガングリオンの両方での軸索成長の増加において
極めて有効であることを報告する。
【００７５】我々の初期の研究において、我々は神経成
長因子（ＮＧＦ）の効力を約１０倍に高めることにより
免疫抑制剤がＰＣ１２細胞における軸索成長を刺激する
ことを見出した(Lyons等, 1994) 。添加されるＮＧＦの
不在下で、神経栄養効果は観察されない。本試験におい
て、我々は免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパマイシンの
０．１−１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの存在下でのＰＣ１
２軸索成長への効果を評価した。
【００７６】添加されるＮＧＦの不在下で、いずれの薬
剤も軸索成長を刺激しない。０．１ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ
単独では、５０ｎｇ／ｍｌで明白である最大効果の約１
５％のみの軸索伸長におけるわずかな増加を生じる（図
１４）。ラパマイシンはその他の薬剤に比べより大きい
範囲まで、０．１−０．５ｎｇ／ｍｌＮＧＦで３−４倍
の刺激でもって軸索成長を刺激する。ラパマイシンによ
り誘導される増加の範囲はより高濃度のＮＧＦで減少
し、そして５−５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦでは統計学的に有
意ではない。ＦＫ５０６はまた、より低いＮＧＦ濃度で
最も明らかな効果を有し、かつ０．５ｎｇ／ｍｌＮＧＦ
で明らかな軸索成長の最大２．５倍増加を有し、神経栄
養性である。
【００７７】構造においてシクロスポリンＡ、ＦＫ５０
６およびラパマイシンに関連する免疫抑制薬剤の３種の
主要な構造群がある。ＦＫ５０６およびシクロスポリン
Ａは別々のイムノフィリンタンパク質に結合するけれど
も、それらは両方カルシニューリンを阻害することによ
り免疫抑制剤として作用する。ラパマイシンは非常に高
い親和性でＦＫＢＰ−１２に結合するが、薬剤−イムノ
フィリン複合体はカルシニューリンに結合しない。ま
た、免疫抑制作用は最近同定され、そしてクローン化さ
れたタンパク質で、ＲＡＦＴ−１（ラパマイシンおよび
ＦＫ５０６標的）と表記されるもの、およびＦＲＡＰと
表記されるもの(Sabatini およびSynder,1994; Brown
等, 1994; Chen等, 1994) に結合するラパマイシン−Ｆ
ＫＢＰ−１２複合体に起因する。ラパマイシンはＦＫＢ
Ｐ−１２に強力に結合するが、カルシニューリンを阻害
しないので、それはＦＫ５０６に対する拮抗剤として作
用し得る。ラパマイシンの非免疫抑制性誘導体が存在す
る。これらの１種であるＷＡＹ−１２４４６６、ラパマ
イシンのトリエン誘導体はＦＫＢＰ−１２に対して高い
親和性で結合し、そしてロタマーゼ活性を阻害するが、
免疫抑制作用を欠いている。シクロスポリンＡは大環状
ウンデカペプチドである。アラニンの６位にメチル基を
単に付加すると、カルシニューリンを阻害せず、免疫抑
制作用を欠く薬剤を生じるが、それはシクロスポリンＡ
と同じ範囲までシクロフィリンのロタマーゼ活性を阻害
する（Ｍｅ ＣｓＡ ｒｅｆ）。
【００７８】免疫抑制活性が神経栄養作用に必要とされ
るか否かを確認するために、我々はＦＫ５０６、ラパマ
イシンおよびシクロスポリンＡの神経栄養作用を非免疫
抑制剤ＷＡＹ−１２４４６６と比較し、ＰＣ１２細胞上
で広範囲の濃度を評価する（図１５，１６）。全ての試
験は０．５ｎｇ／ｍｌＮＧＦの存在下に行われた。前に
観察されたように、ＦＫ５０６は非常に強力に軸索伸長
を刺激し、最大刺激の１／２が０．５ｎＭで、そして最
大効果が５−１００ｎＭである。
【００７９】ラパマイシンは調べられた最も有効な薬剤
であり、そして最大レベルの軸索伸長を生じる。反復さ
れた実験において、最大伸長の５０％が約０．２−０．
４ｎＭで現れ、最大効果が約１０−１００ｎＭで現れ
る。ラパマイシンでの最大軸索伸長は５０ｎｇ／ｍｌＮ
ＧＦの最大効果に匹敵する。ＷＡＹ１２４４６６はまた
神経栄養性であるが、ラパマイシンに比べより低い最大
効果を生じる。ＷＡＹ−１２４４６６での１／２最大刺
激は約１０ｎＭで生じ、そして最大効果が１００−１０
００ｎＭで生じる。従って、ラパマイシンはＷＡＹ−１
２４４６６より約１００倍強力であり、ＦＫＢＰ−１２
への結合において４０倍高い効力に類似する（表２）。
【００８０】シクロスポリンＡは軸索成長の刺激におい
てＦＫ５０６またはラパマイシンに比べ実質的により低
い効力であり、ロタマーゼ活性の阻害において実質的に
より低い効力に相当する。シクロスポリンＡでの軸索成
長の５０％最大刺激は５０ｎＭで明白であり、１００ｎ
Ｍで最大効果であり、そしてより高濃度のシクロスポリ
ンＡでは軸索成長が減少する。シクロスポリンＡでの最
大刺激は５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦの効果の約６０％であ
る。
【００８１】突起伸長の一般的なパターンは種々のイム
ノフィリンリガンドおよびＮＧＦと類似している。最大
効果の５０％を誘導する濃度，ＮＧＦ（１−５ｎｇ／ｍ
ｌ）では、細胞の４０−５０％が少なくとも細胞体と同
じ程度まで伸長し、１５％がより突起を細胞体の長さの
３−５倍まで伸ばす。パターンは試験された種々の薬剤
とかなり類似している。ラパマイシンおよびＷＡＹ１２
４４６６はＦＫ５０６に比べ細胞あたり、より多い数の
突起を生じる傾向がある。シクロスポリンＡは数または
突起に関し中間である傾向にある。
【００８２】イムノフィリンの非免疫抑制性および免疫
抑制性リガンドによりニワトリ後根ガングリオンに誘導
された神経伸長 我々の以前の研究において、我々はラット後根ガングリ
オンの外植片において免疫抑制薬剤の神経栄養効果を観
察し、１ピコモルという低い濃度のＦＫ５０６で観察さ
れた神経成長において顕著に増加することを見出した(L
yons等, 1994)。ラットガングリオンにおいて、神経栄
養効果はＮＧＦの不在下でさえもＦＫ５０６でもって観
察された。本試験において、我々は神経成長の研究に使
用するのにより容易であるニワトリ後根ガングリオンの
外植片を用いた。添加されるＮＧＦの不在下、我々はイ
ムノフィリンリガンド薬剤の最小の効果を観察した。ニ
ワトリ細胞はＰＣ１２細胞に比べＮＧＦに対してより感
受性であり、その結果、我々は軸索最小成長を生じるた
め、そしてイムノフィリンリガンドの神経栄養作用を示
すために０．１ｎｇ／ｍｌＮＧＦを用いる（図１８，１
９）。
【００８３】後根ガングリオンは妊娠１０日目のニワト
リ胚から取り出された。全体のガングリオン外植片を、
２ｍＭグルタミンと１０％ウシ胎児血清を補足し、そし
て１０μＭシトシンβ−Ｄアラビノフラノシド（Ａｒａ
Ｃ）を含有するリーボビッツＬ１５＋グルコース培地を
有する薄層マトリゲルコート１２ウエルプレート上、３
７℃で５％ＣＯ2 含有環境において培養した。２４時間
後、ＤＲＧは種々の濃度の神経成長因子、イムノフィリ
ンリガンドまたはＮＧＦ＋薬剤で処理された。薬剤処理
４８時間後、ガングリオンは相コントラストまたはホフ
マンモジュレーションコントラストの下でツァイス・ア
キシオバート倒立顕微鏡を用いて可視化された。外植片
の顕微鏡写真が作成され、そして軸索成長が定量され
た。ＤＲＧ直径より長い軸索が陽性として、各実験条件
あたり計量された軸索の全数により計測された。４種の
ＤＲＧのうち３種がウエルあたり培養され、そして各処
理は二重に行われた。
【００８４】ガングリオンでの神経成長の刺激における
種々のイムノフィリンリガンドの相対効力はＰＣ１２細
胞におけるそれらの相対効力に類似している。従って、
ラパマイシンは１ｎＭのＥＣ50でもって最大効力の薬剤
であり、ＷＡＹ−１２４４６６に比べ１０倍強力であ
り、ＦＫ５０６は１−２ｎＭのＥＣ50を示す。
【００８５】突起の数、その長さおよび分岐の最大増加
はイムノフィリンリガンドおよびＮＧＦの最大に有効な
濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）で全く同様である。種々の薬
剤の徐々に増加する濃度でもって、突起のより多い数、
より広範囲の分岐および個々の突起のより長い長さを観
察する。
【００８６】我々は組換えＦＫＢＰ−１２への 3Ｈ−Ｆ
Ｋ５０６結合の阻害を試験することによりＦＫＢＰ−１
２への結合における薬剤の効力を評価した。ＦＫＢＰ−
１２に対する薬剤の親和性と軸索成長の刺激およびロタ
マーゼ活性阻害の効力との間に顕著な類似点がある。明
らかに、神経成長の刺激はカルシニューリン阻害に関係
しない。カルシニューリン阻害は免疫抑制活性と十分に
適合し、ＷＡＹ−１２４４６６は免疫抑制性ではなく、
そしてカルシニューリンを阻害しない。ラパマイシンは
強力な免疫抑制剤であるが、ラパマイシン−ＦＫＢＰ−
１２複合体はＲＡＦＴ−１に結合して免疫抑制性過程を
開始する(Sabatini およびSnyder, 1994; Snyderおよび
Sabatini, 1995) 。結果を表２にまとめて示す。
【００８７】
【表２】 カルシニューリンにはないロタマーゼのイムノフィリンリガンド神経栄養性類似 阻害 〔 3Ｈ〕−ＦＫ５０６ カルシニューリン薬剤 ＦＫＢＰ１２（ＩＣ50） 阻害 ＦＫ５０６ ０．６ｎＭ あり ラパマイシン ０．５ｎＭ なし ＷＡＹ−１２４４６６ １０．０ｎＭ なし シクロスポリンＡ なし あり （ＣｓＡ） （表２つづき） ロタマーゼ軸索成長薬剤 （Ｋｉ） （ＥＤ50） ＦＫ５０６ ０．４ｎＭ ０．５ｎＭ ラパマイシン ０．２ｎＭ ０．５ｎＭ ＷＡＹ−１２４４６６ １２．０ｎＭ １０ｎＭ シクロスポリンＡ ２０ｎＭ ５０ｎＭ （ＣｓＡ）
【００８８】我々はニワトリ後根ガングリオン外植片培
養体における軸索成長を促進するための非免疫抑制性イ
ムノフィリンリガンドの活性を比較した（表３）。これ
らの化合物の各々はカルシニューリンを阻害することが
できないが、イムノフィリンＦＫＢＰ−１２と相互作用
して表３に挙げた種々の阻害定数でもってロタマーゼ活
性を阻害する。ＤＲＧにおける軸索成長を促進するため
のこれらの化合物の能力はＦＫＢＰ−１２のロタマーゼ
活性を阻害する能力と高い相関関係にある。
【００８９】
【表３】 カルシニューリンにはないロタマーゼのイムノフィリンリガンド神経栄養性類似 阻害 〔 3Ｈ〕−ＦＫ５０６ カルシニューリン薬剤 ＦＫＢＰ１２（ＩＣ50） 阻害 実施例１２ ８μＭ なし 実施例１３ ４μＭ なし （表３つづき） ロタマーゼ軸索成長薬剤 （Ｋｉ） （ＥＤ50） 実施例１２ ２５０ｎＭ ３００ｎＭ 実施例１３ ２５ｎＭ ８０ｎＭ
【００９０】イムノフィリンへの結合、ロタマーゼ活性
の阻害および軸索成長の刺激における薬剤の効力の間の
非常に密接な相関関係は、ロタマーゼ活性の阻害が薬剤
の神経栄養作用に関連することを意味する。軸索成長の
刺激およびイムノフィリンへの結合における薬剤の顕著
に高い効力は、あらゆるその他の標的が神経栄養作用を
説明し得ることと非常に異なるものにしている。ロタマ
ーゼ以外のイムノフィリンの生物学的活性が薬剤の影響
を受けて神経栄養作用を仲介し得るものと予想される。
しかしながら、そのような活性は未だ報告されていな
い。
【００９１】薬剤の非常に高い効力とロタマーゼ阻害と
神経栄養作用との間の緊密な相関関係のために、我々は
ロタマーゼ阻害が神経栄養効果にほぼ包含されると結論
する。多くのタンパク質がコラーゲン(Steinmann等, 19
91) およびトランスフェリン(Lodish およびKing, 199
1) 等のイムノフィリンのロタマーゼ活性に対する基質
として報告されいている。天然の細胞間カルシウムチャ
ンネルであるリアノジン受容体およびＩＰ−３受容体の
最近高度に精製された調製物がＦＫＢＰ−１２との複合
体に存在することが報告されている。これらの複合体か
らＦＫＢＰ−１２の解離はカルシウムチャンネルに「漏
れ(leaky) 」を引き起こす(Cameron等, 1995) 。カルシ
ウム流（フラックス）は軸索伸長に関連し、その結果、
ＩＰ−３受容体およびリアノジン受容体は薬剤の神経栄
養作用に関連するであろう。薬剤はＩＰ−３受容体また
はリアノジン受容体としてＦＫＢＰ−１２と同じ部位に
結合するので、該薬剤はＦＫＢＰ−１２からのチャンネ
ル（流れ）を置き換えると推定せざるを得ない。シクロ
スポリンにおけるこれらのカルシウムチャンネル（流
れ）の間の相互関係は報告されておらず、その結果、こ
のモデルはシクロスポリンＡの神経栄養作用を説明しな
い。
【００９２】ここで研究された薬剤の神経栄養作用は極
端に低い濃度で証明されており、これは神経栄養タンパ
ク質、例えば脳誘導成長因子、ニューロトロピン−３お
よび神経栄養成長因子のものに匹敵し得る効力であるこ
とを示す。
【００９３】
【実施例】以下の実施例は本発明の好ましい態様の説明
であり、そしてそれにより本発明を制限するものではな
い。全てのポリマー分子量は平均分子量である。全ての
％は特記しない限り最終的伝達系または調製された配合
剤の重量％に基づいており、そして全量は１００重量％
に等しい。
【００９４】本発明の目的のために使用され得る例示さ
れるピペコリン酸誘導体化合物は以下のものを包含す
る。
【００９５】実施例１
【化１】 本実施例のピペコリン酸誘導体化合物はOcain 等, Bioc
hemical and Biophysical Research Communications, V
ol. 192, No. 3, 1993に開示されている。該化合物はWy
eth-AyerstでPhil Hughes 博士によって４−フェニル−
１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオンとラパマイ
シンとの反応により合成された。
【００９６】実施例２
【化２】 このピペコリン酸誘導体化合物はCharkraborty等, Chem
istry and Biology, March 1995, 2: 157-161 に開示さ
れている。
【００９７】実施例３−５
【化３】 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はIkeda 等, J. Am.
Chem. Soc. 1994, 116, 4143-4144に開示されており、
該文献は参照により本明細書に編入される。
【００９８】実施例６−９ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はWang等, Bioorgan
ic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 9,
pp. 1161-1166, 1994、特に化合物２ａ−２ｄに開示さ
れており、該文献は参照により本明細書に編入される。
【００９９】実施例１０
【化４】 本実施例のピペコリン酸誘導体，化合物１０はBirkensh
aw等, Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters, V
ol. 4, No. 21, pp. 2501-2506, 1994 に開示されてお
り、該文献は参照により本明細書に編入される。
【０１００】実施例１１−２１ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はHolt等, J. Am. C
hem. Soc. 1993, 115,9925-9938、特に化合物４−１４
に開示されており、該文献は参照により本明細書に編入
される。
【０１０１】実施例２２−３０ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はCaffery 等, Bioo
rganic and MedicinalChemistry Letters, Vol. 4, No.
21, pp. 2507-2510, 1994 に開示されており、該文献
は参照により本明細書に編入される。
【０１０２】実施例３１
【化５】 本実施例のピペコリン酸誘導体，化合物３１はTeague
等, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vo
l. 3, No. 10, pp. 1947-1950, 1993 に開示されてお
り、該文献は参照により本明細書に編入される。
【０１０３】実施例３２−３４ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はYamashita 等, Bi
oorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4,
No. 2, pp. 325-328, 1994、特に化合物１１、１２およ
び１９に開示されており、該文献は参照により本明細書
に編入される。
【０１０４】実施例３５−５５ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はHolt等, Bioorgan
ic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 2,
pp. 315-320, 1994、特に化合物３−２１および２３−
２４に開示されており、該文献は参照により本明細書に
編入される。
【０１０５】実施例５６−６８ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はHolt等, Bioorgan
ic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 3, No. 1
0, pp. 1977-1980, 1993 、特に化合物３−１５に開示
されており、該文献は参照により本明細書に編入され
る。
【０１０６】実施例６９−８３ 本発明の実施例化合物はHauske等, J. Med. Chem. 199
2, 35, 4284-4296 、特に化合物６、９−１０、２１−
２４、２６、２８、３１−３２および５２−５５に開示
されており、該文献は参照により本明細書に編入され
る。
【０１０７】実施例８４
【化６】 本実施例のピペコリン酸誘導体はTeague等, Bioorganic
and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No. 13,
pp. 1581-1584, 1994 に開示されており、該文献は参照
により本明細書に編入される。
【０１０８】実施例８５−８８ 実施例のピペコリン酸誘導体化合物はStocks等, Bioorg
anic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, No.
12, pp. 1457-1460, 1994 、特に化合物２、１５−１７
に開示されており、該文献は参照により本明細書に編入
される。
【０１０９】スキーム１
【化７】
【０１１０】スキーム２
【化８】
【０１１１】スキーム３
【化９】
【０１１２】スキーム４
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【０１１３】スキーム５
【化１３】
【０１１４】スキーム６
【化１４】
【化１５】
【０１１５】スキーム７
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【０１１６】スキーム８
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【０１１７】スキーム９
【化２３】
【０１１８】本発明は上記のように、同じものが多くの
方法で変更され得ることが明らかである。そのような変
更は本発明の精神および範囲から逸脱しないものとみな
され、そしてそのような全ての変更が本発明の特許請求
の範囲内に包含されるものと意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】神経挫傷後の顔面核におけるＦＫＢＰ−１２お
よびＧＡＰ−４３の発現を示す生物の形態を表す写真。
ＦＫＢＰ−１２（左側）およびＧＡＰ−４３（右側）に
対する顔面核におけるｍＲＮＡの発現の時間経過を比較
するin situ ハイブリダイゼーション。右側顔面核は挫
傷と同じ側であり、そして左側は未操作の対照である
（図１Ｂ）。未処理対照へのＦＫＢＰ−１２（左側）に
対する、および顔面神経挫傷後７日目のカルシニューリ
ンＡα，βに対する（右側）in situ ハイブリダイゼー
ション。実験は少なくとも３回反復され、同じ結果が得
られた。
【図２】神経挫傷に続く顔面運動ニューロンに対するＦ
ＫＢＰ−１２の局在性を示す生物の形態を表す写真。挫
傷後７日目の顔面核の運動ニューロン（図２Ａ）におけ
る、および対照顔面核の運動ニューロン（図２Ｂ）にお
けるＦＫＢＰ−１２に対するin situ ハイブリダイゼー
ションの明視野顕微鏡写真。
【図３】座骨神経挫傷後の腰部脊髄運動ニューロンにお
けるＦＫＢＰ−１２ｍＲＮＡの上昇制御を示す生物の形
態を表す写真。右側座骨神経の挫傷後７日目のＦＫＢＰ
−１２に対するin situ ハイブリダイゼーション。上の
図（図３Ａ）は下側腰部脊髄の前角（矢印で示す）にお
ける運動ニューロンの応答を示す。対応する運動ニュー
ロンプールの明視野顕微鏡写真は下の図に示されてい
る：（図３Ｂ）神経挫傷とは反対側である左側，（図３
Ｃ）神経挫傷と同じ側である右側。この実験は３回反復
され、同じ結果が得られた。
【図４】座骨神経挫傷後１および６週目の後根ガングリ
オンにおけるＦＫＢＰおよびＦＫＢＰ−１２ｍＲＮＡの
誘導を示す生物の形態を表す写真。ＦＫＢＰin situ ハ
イブリダイゼーションに対して処理された座骨神経挫傷
と同じ側のＬ４後根ガングリオンを介する切片の暗視野
顕微鏡写真は左側の図であり、そして〔 3Ｈ〕ＦＫ５０
６オートラジオグラフィーに対するものは右側の図であ
る。これらの結果は各々の時間に対して３回反復され
た。
【図５】右側顔面神経のリシン損傷を示す生物の形態を
表す写真。ニッスル染色（下側の図，図５Ａ）は顔面神
経へのリシン注入後７日目のグリア増殖を伴う右側顔面
核における運動ニューロンの広範囲に及ぶ変性を示す。
顔面神経／核のリシン損傷後７日目のＦＫＢＰｍＲＮＡ
に対するin situ ハイブリダイゼーションは上側の図
（図５Ｂ）に示されている。この実験は３回反復され、
同じ結果が得られた。
【図６】挫傷後７日目の座骨神経の断片における
〔 3Ｈ〕ＦＫ５０６結合性を示す図面。図面は採取した
神経の３ｍｍ断片を示す：くびれ部は方法に記載したよ
うに６時間の採取時間、７日目に適用した結紮位置を示
す。遠位の結紮部は最初の挫傷部位から１０ｍｍ離れて
いる。ＦＫＢＰの前方への移動は１２４ｍｍ／日であ
る。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３）である。
【図７】座骨神経におけるＦＫＢＰの移動を示す生物の
形態を表す写真。ＦＫＢＰ−１２in situ ハイブリダイ
ゼーションに対して（図７Ａ，図７Ｂ）、および
〔 3Ｈ〕ＦＫ５０６オートラジオグラフィーに対して
（図７Ｃ，７Ｄ）に対して処理された、対照（未処理）
座骨神経および７日目座骨神経挫傷部位を介する切片の
暗視野顕微鏡写真。矢印は神経挫傷の観測を示す。この
実験は３回反復され、同じ結果が得られた。
【図８】ＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不在
下で維持されたＰＣ細胞における〔 3Ｈ〕ＦＫ５０６結
合のレベルを示すグラフ。各々の時間に対してｎ＝３。
バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図９】ＰＣ１２細胞における軸索伸長の免疫抑制が介
在した増加を示す生物の形態を表す写真。ＮＧＦの存在
下、ＦＫ５０６またはラパマイシンを添加または添加せ
ずに、４８時間増殖した培養体のホフマンコントラスト
顕微鏡写真（６４）。図９Ａ：１．０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ
中で増殖したＰＣ−１２細胞。図９Ｂ：５０ｎｇ／ｍｌ
ＮＧＦ。図９Ｃ：１．０ｎｇ／ｍｌＮＧＦおよび１００
ｎＭ ＦＫ５０６。図９Ｄ：１．０ｎｇ／ｍｌＮＧＦお
よび１００ｎＭラパマイシン。倍率２００倍。
【図１０】ＰＣ−１２細胞中での軸索増殖へのＦＫ５０
６の影響を示すグラフ。培養体は１００ｎＭ ＦＫ５０
６の存在下または不在下に種々の濃度のＮＧＦと処理さ
れ、そして軸索伸長は４８時間目に測定された。増殖は
方法の項に記載したように、５μｍより大きい軸索成長
を有する細胞を数えることにより定量化した。ｎ＝４の
別々の実験が各時間に対して行われ、そして誤差バーは
ＳＥＭを表す。
【図１１】ＰＣ−１２細胞中での軸索増殖のＦＫ５０６
有効性に対する濃度応答関係を示すグラフ。細胞は１ｎ
ｇ／ｍｌＮＧＦおよび種々の濃度のＦＫ５０６でもって
４８時間処理された。軸索増殖応答は図１０および方法
の項に記載されるように計測された。ｎ＝４の別々の実
験が各データ点に対して行われた。* ｐ＜０．００１ス
チューデントｔ試験。
【図１２】後根ガングリオン外植片培養体上の〔 3Ｈ〕
ＦＫ５０６オートラジオグラフィーを示す生物の形態を
表す写真。１００ｎｇ／ＮＧＦでの培養２６日後、広範
囲の突起は豊富なＦＫＢＰ結合銀粒を示す。オートラジ
オグラフィーの粒は１μｍの非標識ＦＫ５０６で消失さ
れる。
【図１３】異なる基質で増殖させた後根ガングリオンの
相コントラスト顕微鏡写真である生物の形態を表す写
真。図１３Ａ：ＮＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ，図１３Ｂ：Ｆ
Ｋ５０６ １μＭ，図１３Ｃ：ＦＫ５０６ １μＭおよ
び抗ＮＧＦ抗体，図１３Ｄ：成長因子の添加なし，図１
３Ｅ：ＦＫ５０６ １ｐＭ，図１３Ｆ：ＦＫ５０６ １
μＭおよびラパマイシン１μＭ。スケールバーは２０５
μｍである。ＮＧＦは豊富な軸索増殖を生じ（図１３
Ａ）、また１μＭ ＦＫ５０６も同様である（図１３
Ｂ）。ＦＫ５０６の効果は１ｐＭまで濃度を減少させる
ことにより実質的に低下される（図１３Ｅ）。しかしな
がら、１ｐＭ ＦＫ５０６での軸索増殖はその不在下
（図１３Ｄ）に比べ多い。ＦＫ５０６効果はまた、培養
体における非ニューロン細胞により生じるＮＧＦの効果
を消失させるための抗ＮＧＦ抗体を添加することにより
消失される。ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）（図１３Ａ）
または１μＭ ＦＫ５０６（図１３Ｂ）に応答して大き
い神経繊維束を生じる豊富な軸索は白く見え、一方、小
さい神経繊維束または個別の軸索は黒く見える。非ニュ
ーロン細胞、シュワン細胞およびいくつかの繊維芽細胞
は１μＭ ＦＫ５０６（図１３Ｂ）に比べ１ｐＭ ｆｋ
５０６（図１３Ｅ）または抗ＮＧＦ抗体（図１３Ｃ）の
場合、はっきりしている。培養体中に非ニューロン細胞
により産生されるＮＧＦは成長因子が添加されない培養
体中に見られる限定された軸索増殖を生じる（図１３
Ｄ）。白く見える多数の屈折非ニューロン細胞は少数の
軸索を暗くする傾向がある（図１３Ｄ）。ラパマイシン
はＦＫ５０６の存在下で軸索増殖を完全に阻害する（図
１３Ｆ）。顕微鏡写真は各実験条件からの１２−３０の
ガングリオンの代表例である。全ての実験群間の相違は
高度の再現性があった。
【図１４】ＰＣ−１２細胞におけるＮＧＦ仲介軸索伸長
へのＦＫ５０６およびラパマイシンの影響を示すグラ
フ。ＰＣ１２細胞（継代６０）は種々の濃度のＮＧＦ単
独または１００ｎＭ ＦＫ５０６、１００ｎＭラパマイ
シンまたは１００ｎＭ Ｗａｙ１２４４６６の存在下で
処理された。軸索増殖は９６時間後に陽性を示す細胞の
直径より大きい突起部を有する細胞でもって計測した。
ｎ＝３の別々の実験が各時間に対して行われ、そして誤
差バーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図１５】ピコモル濃度の（Ａ）ＦＫ５０６および
（Ｂ）ラパマイシンとＷＡＹ−１２４４６６はＰＣ１２
細胞中でＮＧＦ（０．５ｎｇ／ｍｌ）により誘導された
軸索伸長を強化することを示すグラフ。より少ない継代
のＰＣ１２細胞は種々の濃度のＦＫ５０６（□）、ラパ
マイシン（●）またはＷＡＹ−１２４４６６（○）の存
在下に０．５ｎｇ／ｍｌＮＧＦと共に４日間処理され
た。軸索伸長は図１４において上記したように定量され
た。０．５ｎｇ／ｍｌＮＧＦ（Ｌと表記）および５０ｎ
ｇ／ｍｌＮＧＦ（Ｈと表記）の存在下での軸索産生のレ
ベルが比較のために示されている。
【図１６】イムノフィリンリガンド＋０．５ｎｇ／ｍｌ
ＮＧＦ自身または５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦで処理されたＰ
Ｃ１２細胞の顕微鏡写真である生物の形態を表す写真。
【図１７】イムノフィリンリガンド＋０．５ｎｇ／ｍｌ
ＮＧＦ自身または５０ｎｇ／ｍｌＮＧＦで処理されたＰ
Ｃ１２細胞の顕微鏡写真である生物の形態を表す写真。
【図１８】イムノフィリンリガンドはニワトリ感覚ガン
グリオンにおいて最大軸索伸長を生じるために必要なＮ
ＧＦの量を減少することを示す生物の形態を表す写真。
全体の後根ガングリオン外植片は９−１０日齢のニワト
リ胚から単離され、そしてＬ１５培地と高グルコース
を、１０μＭ Ａｒａ Ｃ ペニシリンおよびストレプ
トマイシンを補足した１０％ウシ胎児血清と共に含有す
るマトリゲル被覆１２ウエル皿中に５％ＣＯ2 雰囲気下
３７℃で培養された。感覚ガングリオンは１ｎｇ／ｍｌ
ＮＧＦ、１ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ＋１００ｎＭ ＦＫ５
０６または１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦと４８時間処理さ
れ、そしてニューロン突起が計測され、そして写真撮影
された。
【図１９】ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびＷＡＹ−１
２４４６６が感覚ガングリオンにおいてＮＧＦ依存軸索
産生を強化することを示すグラフ。ニワトリＤＲＧの外
植片は図１８において上記したように培養された。ＦＫ
５０６、ラパマイシンおよびＷＡＹ−１２４４６６（各
々１００ｎＭプラスまたはマイナス０．１ｎｇ／ｍｌＮ
ＧＦ）がＤＲＧ外植片培養体に添加された。４８時間目
に、軸索増殖が定量され、そして培養体が写真撮影され
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｄ 211/60 9271−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 491/04 491/04 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 596061409 ジョン ホプキンス ユニバーシティ ス クール オブ メディシン Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ アメリカ合衆国 メリーランド 21205 バルチモア スイート 72−100 イース ト モニュメント 2024 (72)発明者 ジョセフ ピー．スタイナー アメリカ合衆国 メリーランド 21074 ハンプステッド シュガー メープル ス トリート 988 (72)発明者 ソロモン シンダー アメリカ合衆国 メリーランド 21205− 2185 バルチモア ウルフ ストリート 725 (72)発明者 グレゴリー エス．ハミルトン アメリカ合衆国 メリーランド 21228 ケイトンズビル フレデリック ロード 6501

Claims (56)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親和
    性を有するピペコリン酸誘導体の有効量を動物に投与
    し、損傷した末梢神経の成長を刺激するか、またはニュ
    ーロン再生を促進することからなり、前記ＦＫＢＰ型イ
    ムノフィリンはロタマーゼ活性を示し、そして前記ピペ
    コリン酸誘導体は前記イムノフィリンのロタマーゼ活性
    を阻害する、動物における神経学的障害を治療する方
    法。
  2. 【請求項２】 神経学的障害が物理的損傷または疾病状
    態による末梢ニューロパシー、脳への物理的損傷、脊髄
    への物理的損傷、脳損傷と関連する発作、および神経変
    性に関連する神経学的障害からなる群から選択される請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 神経学的障害がアルツハイマー病、パー
    キンソン病、および筋萎縮側索硬化からなる群から選択
    される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 ピペコリン酸誘導体化合物が免疫抑制性
    または非免疫抑制性である請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 ピペコリン酸誘導体がＷａｙ−１２４６
    ６６である請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 ピペコリン酸誘導体がラパマイシンであ
    る請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 ピペコリン酸誘導体がＦＫ５０６である
    請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 ピペコリン酸誘導体がＲａｐ−Ｐａであ
    る請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 ピペコリン酸誘導体がＳＬＢ−５０６で
    ある請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ピペコリン酸誘導体が化合物３−８４
    および８６−８８からなる群から選択される請求項１記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】 ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親
    和性を有するピペコリン酸誘導体の有効量を神経栄養成
    長因子、脳誘導成長因子、グリア誘導成長因子、毛様体
    神経栄養因子およびニューロトロピン−３からなる群か
    ら選択される神経栄養因子の有効量と組み合わせて動物
    に投与し、損傷した末梢神経の成長を刺激するか、また
    はニューロン再生を促進することからなり、前記ＦＫＢ
    Ｐ型イムノフィリンはロタマーゼ活性を示し、そして前
    記ピペコリン酸誘導体は前記イムノフィリンのロタマー
    ゼ活性を阻害する、動物における神経学的障害を治療す
    る方法。
  12. 【請求項１２】 神経学的障害が物理的損傷または疾病
    状態による末梢ニューロパシー、脳への物理的損傷、脊
    髄への物理的損傷、脳損傷と関連する発作、および神経
    変性に関連する神経学的障害からなる群から選択される
    請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 神経学的障害がアルツハイマー病、パ
    ーキンソン病、および筋萎縮側索硬化からなる群から選
    択される請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ピペコリン酸誘導体化合物が免疫抑制
    性または非免疫抑制性である請求項１１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ピペコリン酸誘導体がＷａｙ−１２４
    ６６６である請求項１１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ピペコリン酸誘導体がラパマイシンで
    ある請求項１１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ピペコリン酸誘導体がＦＫ５０６であ
    る請求項１１記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ピペコリン酸誘導体がＲａｐ−Ｐａで
    ある請求項１１記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ピペコリン酸誘導体がＳＬＢ−５０６
    である請求項１１記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ピペコリン酸誘導体が化合物３−８４
    および８６−８８からなる群から選択される請求項１１
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親
    和性を有するピペコリン酸誘導体化合物の有効量を損傷
    した末梢神経に投与し、損傷した末梢神経の成長を刺激
    または促進することからなり、前記ＦＫＢＰ型イムノフ
    ィリンはロタマーゼ活性を示し、そして前記ピペコリン
    酸誘導体は前記イムノフィリンのロタマーゼ活性を阻害
    する、損傷した末梢神経の成長を刺激する方法。
  22. 【請求項２２】 神経栄養成長因子、脳誘導成長因子、
    グリア誘導成長因子、毛様体神経栄養因子およびニュー
    ロトロピン−３からなる群から選択される神経栄養因子
    を投与し損傷した末梢神経の成長を刺激または促進する
    ことをさらに含む請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ピペコリン酸誘導体が免疫抑制性また
    は非免疫抑制性である請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ピペコリン酸誘導体がＷａｙ−１２４
    ６６６である請求項２１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ピペコリン酸誘導体がラパマイシンで
    ある請求項２１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ピペコリン酸誘導体がＦＫ５０６であ
    る請求項２１記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ピペコリン酸誘導体がＲａｐ−Ｐａで
    ある請求項２１記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ピペコリン酸誘導体がＳＬＢ−５０６
    である請求項２１記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ピペコリン酸誘導体が化合物３−８４
    および８６−８８からなる群から選択される請求項２１
    記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親
    和性を有するピペコリン酸誘導体化合物の有効量を損傷
    した末梢神経に投与し、損傷した末梢神経の成長を刺激
    することからなり、前記ＦＫＢＰ型イムノフィリンはロ
    タマーゼ活性を示し、そして前記ピペコリン酸誘導体は
    前記イムノフィリンのロタマーゼ活性を阻害する、損傷
    した末梢神経の成長を刺激する方法。
  31. 【請求項３１】 神経栄養成長因子、脳誘導成長因子、
    グリア誘導成長因子、毛様体神経栄養因子およびニュー
    ロトロピン−３からなる群から選択される神経栄養因子
    の有効量を投与し損傷した末梢神経の成長を刺激するこ
    とをさらに含む請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ピペコリン酸誘導体化合物が免疫抑制
    性または非免疫抑制性である請求項３０記載の方法。
  33. 【請求項３３】 ピペコリン酸誘導体がＷａｙ−１２４
    ６６６である請求項３０記載の方法。
  34. 【請求項３４】 ピペコリン酸誘導体がラパマイシンで
    ある請求項３０記載の方法。
  35. 【請求項３５】 ピペコリン酸誘導体がＦＫ５０６であ
    る請求項３０記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ピペコリン酸誘導体がＲａｐ−Ｐａで
    ある請求項３０記載の方法。
  37. 【請求項３７】 ピペコリン酸誘導体がＳＬＢ−５０６
    である請求項３０記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ピペコリン酸誘導体が化合物３−８４
    および８６−８８からなる群から選択される請求項３０
    記載の方法。
  39. 【請求項３９】 ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親
    和性を有するピペコリン酸誘導体化合物の有効量を動物
    に投与し、ニューロン再生を促進することからなり、前
    記ＦＫＢＰ型イムノフィリンはロタマーゼ活性を示し、
    そして前記ピペコリン酸誘導体は前記イムノフィリンの
    ロタマーゼ活性を阻害する、動物におけるニューロン再
    生および成長を促進する方法。
  40. 【請求項４０】 神経栄養成長因子、脳誘導成長因子、
    グリア誘導成長因子およびニューロトロピン−３からな
    る群から選択される神経栄養因子の有効量を投与しニュ
    ーロン再生を促進することをさらに含む請求項３９記載
    の方法。
  41. 【請求項４１】 ピペコリン酸誘導体化合物が免疫抑制
    性または非免疫抑制性である請求項３９記載の方法。
  42. 【請求項４２】 ピペコリン酸誘導体がＷａｙ−１２４
    ６６６である請求項３９記載の方法。
  43. 【請求項４３】 ピペコリン酸誘導体がラパマイシンで
    ある請求項３９記載の方法。
  44. 【請求項４４】 ピペコリン酸誘導体がＦＫ５０６であ
    る請求項３９記載の方法。
  45. 【請求項４５】 ピペコリン酸誘導体がＲａｐ−Ｐａで
    ある請求項３９記載の方法。
  46. 【請求項４６】 ピペコリン酸誘導体がＳＬＢ−５０６
    である請求項３９記載の方法。
  47. 【請求項４７】 ピペコリン酸誘導体が化合物３−８４
    および８６−８８からなる群から選択される請求項３９
    記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親
    和性を有するピペコリン酸誘導体の有効量を動物に投与
    し、神経変性を防止することからなり、前記ＦＫＢＰ型
    イムノフィリンはロタマーゼ活性を示し、そして前記ピ
    ペコリン酸誘導体は前記イムノフィリンのロタマーゼ活
    性を阻害する、動物における神経変性を防止する方法。
  49. 【請求項４９】 神経栄養成長因子、脳誘導成長因子、
    グリア誘導成長因子、毛様体神経栄養因子およびニュー
    ロトロピン−３からなる群から選択される神経栄養因子
    の有効量を投与し神経変性を防止することをさらに含む
    請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 ピペコリン酸誘導体化合物が免疫抑制
    性または非免疫抑制性である請求項４８記載の方法。
  51. 【請求項５１】 ピペコリン酸誘導体がＷａｙ−１２４
    ６６６である請求項４８記載の方法。
  52. 【請求項５２】 ピペコリン酸誘導体がラパマイシンで
    ある請求項４８記載の方法。
  53. 【請求項５３】 ピペコリン酸誘導体がＦＫ５０６であ
    る請求項４８記載の方法。
  54. 【請求項５４】 ピペコリン酸誘導体がＲａｐ−Ｐａで
    ある請求項４８記載の方法。
  55. 【請求項５５】 ピペコリン酸誘導体がＳＬＢ−５０６
    である請求項４８記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ピペコリン酸誘導体が化合物３−８４
    および８６−８８からなる群から選択される請求項４８
    記載の方法。
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