JPH08173198A - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
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- JPH08173198A JPH08173198A JP6340360A JP34036094A JPH08173198A JP H08173198 A JPH08173198 A JP H08173198A JP 6340360 A JP6340360 A JP 6340360A JP 34036094 A JP34036094 A JP 34036094A JP H08173198 A JPH08173198 A JP H08173198A
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Abstract
Aの塩基配列を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)法において、予め血液成分を凝固させることを特徴
とする核酸合成法。 【効果】本発明により、核酸の分離精製の過程を経ず
に、血液を主成分とする試料から直接目的のDNAを増
幅することが可能となる。従って、本発明により、簡
便、迅速、かつコンタミネーションの危険の少ない核酸
合成法を提供することができる。
Description
メラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いる核酸合成法に関
する。
来、肝炎の原因ウイルスであるHBV、HCV又はAI
DSの原因ウイルスであるHIV等のウイルス、敗血症
を起こす細菌又は遺伝病等の遺伝子検査には、血液中に
存在するウイルス、細菌又は末梢血白血球のDNAまた
は逆転写酵素によりRNAより合成したcDNAをポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)法により増幅させて検出す
る方法が用いられている。しかし、血液、血清又は血漿
試料を直接PCR反応溶液中に添加しても、試料中に含
まれる夾雑物によりPCRが強く抑制され、目的とする
核酸の検出が困難となる。従って、核酸合成前に、試料
中のウイルス、細菌又は細胞からDNA又はRNAの分
離精製が必須となる(Blin,N and D.W.Stafford,Nuclei
c Acids Res.,3,2303-2306,1976 )。
酸を分離精製するには、フェノール−クロロホルム、イ
オン交換樹脂、ガラスビーズ、蛋白凝集剤等種種の材料
を用いて行われ、一定の時間を必要とする。しかし、遺
伝子検査は迅速を要する場合が多く、また、PCR法は
極めて高感度であるため、コンタミネーションの機会を
可能な限り減らすことが必要であることから、試料の前
処理はなるべく行わず、試料中の核酸を直接増幅させる
方法の開発が必要とされている。従って、本発明の目的
は、血液を多く含む試料中の核酸を、複雑な前処理なし
にPCR法により増幅させる方法を提供することにあ
る。
況に鑑み、PCR法に対する血清の影響を鋭意検討した
ところ、PCR反応溶液にヒト血清を10%の濃度で添
加し、標的DNAを加えてPCRを行ったところ、PC
R反応溶液が白濁化し、PCRが阻害された。このこと
から、本発明者らは、反応溶液の白濁化は、蛋白の凝集
であり、PCRが阻害される原因の一つは、反応中の蛋
白の凝集によるものであると考え、種々検討を加えたと
ころ、血清試料についてPCRを行う前に、予め、血液
成分を凝固させることにより、PCRが血清の影響を受
けることなく進行する事実を発見した。本発明は、かか
る発見に基づき更に検討を進めて完成するに至ったもの
である。
る試料中に存する、目的DNAの塩基配列を増幅させる
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法において、予め血液
成分を凝固させることを特徴とする核酸合成法、に関す
る。
発明に用いられる血液を主成分とする試料としては、P
CRによる増幅の目的となる肝炎やエイズ等の原因ウイ
ルス、細菌、細胞等を含む試料であれば、特に限定され
るものではない。
ては、熱処理による方法が代表的なものである。熱処理
の方法としては、ヒートブロックを用いる方法、温浴を
用いる方法、電子レンジを用いる方法等のいずれでもよ
く、その他の熱処理方法でもよい。本発明における熱処
理の温度は、通常65〜100℃、好ましくは75〜1
00℃である。熱処理の時間は、熱処理の温度により変
わるが、試料の温度が処理温度に達してから通常1秒間
〜60分間、好ましくは1秒間〜10分間である。
は、PCR法による増幅の目的となる肝炎やエイズ等の
原因ウイルス、細菌、細胞等を含む血清そのもの又は蒸
留水で1〜3倍以内に希釈された試料が用いられる。
含量は、通常25mg/ml以上、、好ましくは40m
g/ml以上である。
明の方法で処理することにより、以下の実施例に示すよ
うに、PCRは支障なく行うことができる。熱処理が不
十分であり蛋白の凝固が不十分であれば、PCR中に白
濁が生じ、核酸の合成は進行し難い。従って、本発明の
方法を用いることにより、血液を含む試料からの核酸合
成を簡易かつ迅速に行うことができる。
nce 230, 1350-1354(1985))に従って行うことができ
る。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域(本
発明の場合は、試料中に存在するDNA)を検出する場
合、その領域の両端の一方は+鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意し、それを熱変性により1本鎖状態
にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
のプライマーとして機能させ、生成した2本鎖核酸を再
び1本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この
一連の操作を繰り返すことで2つのプライマーに挟まれ
た領域は検出できるまでにコピー数が増大する。
写酵素反応やリガーゼチェインリアクション(Ligarse
chain reaction) 等にも利用可能であると思われる。
明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定
されるものではない。
μl(100ag/μl〜10fg/μl)および1〜
5倍希釈となるように適当量の蒸留水を加えた後、ミネ
ラルオイル50μlを添加し、95℃にて5分間の熱処
理を行ったものを試料として用いた。熱処理試料に、P
CR反応溶液を添加し、溶液量を100μlとしてPC
Rを行った。
ience 239, 295-297,1988)が用いたHIV−1env遺
伝子領域内に位置するSK68(配列番号:1)とSK
69(配列番号:2)とを用いた。なお、SK68とS
K69の塩基配列は次の通りであり、2種類のプライマ
ーに挟まれる領域には142塩基対(プライマーを含
む)が存在する。 SK68:AGCAGCAGGAAGCACTATGG SK69:CCAGACTGTGAGTTGCAACAG PCR反応溶液は、各プライマーを1μM、4種のデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)を200μ
M含む反応液(10mMのトリス塩酸(pH8.3)、
50mMのKCl、1.5mMのMgCl2 、0.01
%(w/v)のゼラチン、0.025U/μlの耐熱性
DNAポリメラーゼ(AmpliTaq,PerkinElmer Cetus 社
製)を用いた。PCRは、94℃にて1分間の熱変性、
55℃にて1分間のアニーリング、72℃にて1分間の
DNA鎖伸長反応を1サイクルとして40サイクルの反
応を行い、最後に72℃にて7分間のDNA鎖伸長反応
を行うことにより、2種類のプライマーに挟まれた領域
のDNA部分の増幅を行った。
て、3%アガロースを含むTAE(40mMのトリス−
酢酸、1mMのEDTA(pH8.0))液中で電気泳
動を行い、臭化エチジウムによるDNAの染色と検出を
行った。その結果を図1に示す。図は、電気泳動による
DNAの検出結果であり、矢印は、特異的なPCR産物
の泳動位置を、Mはマーカー(HincIIて切断した
125ngのφX174のDNA)を示す。
た試料の熱処理により、血清蛋白の凝固が認められた
が、3倍希釈もしくは5倍希釈した試料の熱処理では、
血清蛋白の凝固が不完全であった。熱処理後、PCRを
行ったところ、熱処理により血清蛋白の凝固が認められ
た希釈なしもしくは2倍希釈の試料を用いた場合、PC
R中に反応溶液の白濁が認められず、試料中に10コピ
ーのHIV−1のDNAが存在すれば、HIV−1en
v遺伝子に特異的なPCR産物が検出された。一方、熱
処理により、血清蛋白の凝固が不完全な3倍希釈もしく
は5倍希釈の試料を用いた場合、PCR中に反応溶液の
白濁化が認められ、試料中に1000コピーのHIV−
1のDNAが存在しても、特異的なPCR産物は認めら
れなかった。
(0.05〜5000PFU(plaque forming unit)/
μl)を加え、ミネラルオイル50μlを添加し、95
℃にて5分間の熱処理を行ったものを試料として用い
た。熱処理試料に、PCR反応溶液を添加し、溶液量を
100μlとしてPCRを行った。
領域内に位置するP1(配列番号:3)およびP2(配
列番号:4)を用いた。なお、P1およびP2の塩基配
列は次のとおりであり、2種類のプライマーに挟まれる
領域には500bpの塩基配列(プライマーを含む)が
存在する。 P1:GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG P2:GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC PCR反応溶液の組成、PCRおよび電気泳動は、実施
例1と同様に行った。結果を図2に示す。図2は、電気
泳動によるDNA検出結果であり、矢印とマーカーは図
1と同様である。
合、10000PFUのλファージが存在しても、λフ
ァージ遺伝子に特異的なPCR産物は認められないが、
予め熱処理し、血清蛋白を凝固させた場合、1PFUの
λファージが存在すれば、特異的なPCR産物が認めら
れた。
(LT)産生大腸菌4μl(0.25〜2500cfu
/μl)を加え、さらにミネラルオイル25μlを添加
し、95℃にて5分間の熱処理を行ったものを試料とし
て用いた。熱処理試料にPCR反応溶液を添加し溶液量
を40μlとしてPCRを行った。
に位置するELT1、ELT2(島津製作所製)を用い
た。なお、2種類のプライマーに挟まれる領域には26
4bpの塩基配列(プライマーを含む)が存在する。P
CR反応溶液の組成、PCRおよび電気泳動は、実施例
1と同様に行った。結果を図3に示す。図は電気泳動に
よるDNA検出結果であり、矢印とマーカーは図1に同
じである。
合、1試料当り10000個のの大腸菌細胞が存在して
も、反応終了液中にはLT遺伝子に特異的なPCR産物
は認められないが、熱処理により血清蛋白を凝固させた
場合は1試料当り1個の細胞の大腸菌が存在すれば特異
的なPCR産物が認められた。
経ずに、血液を主成分とする試料から直接目的のDNA
を増幅することが可能となる。従って、本発明により、
簡便、迅速、かつコンタミネーションの危険の少ない核
酸合成法を提供することができる。
清を蒸留水で希釈して作成した試料を熱処理した後PC
Rを行った場合の電気泳動図である。
理後にPCRを行った場合の電気泳動図である。
大腸菌を添加したヒト血清を熱処理後にPCRを行った
場合の電気泳動図である。
コピー 2 添加したHIV−1 DNAのコピー数が100コ
ピー 3 添加したHIV−1 DNAのコピー数が10コピ
ー 4 HIV−1 DNA無添加 5 添加したλファージが10PFU 6 添加したλファージが1PFU 7 添加したλファージが0.1PFU 8 λファージを無添加 9 添加したλファージが10000PFU 10 添加した大腸菌が100CFU 11 添加した大腸菌が10CFU 12 添加した大腸菌が1CFU 13 添加した大腸菌が0.1CFU 14 大腸菌無添加 15 添加した大腸菌が10000CFU
Claims (1)
- 【請求項1】 血液を主成分とする試料中に存する、目
的DNAの塩基配列を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)法において、予め血液成分を凝固させること
を特徴とする核酸合成法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP34036094A JP3575633B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 核酸合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP34036094A JP3575633B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 核酸合成法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH08173198A true JPH08173198A (ja) | 1996-07-09 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP34036094A Expired - Fee Related JP3575633B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 核酸合成法 |
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Country | Link |
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WO2012144485A1 (ja) | 2011-04-20 | 2012-10-26 | オリンパス株式会社 | 生体試料中の核酸分子の検出方法 |
-
1994
- 1994-12-27 JP JP34036094A patent/JP3575633B2/ja not_active Expired - Fee Related
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