JPH08173164A - Ｄｎａ調製法 - Google Patents
Ｄｎａ調製法Info
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- JPH08173164A JPH08173164A JP6320288A JP32028894A JPH08173164A JP H08173164 A JPH08173164 A JP H08173164A JP 6320288 A JP6320288 A JP 6320288A JP 32028894 A JP32028894 A JP 32028894A JP H08173164 A JPH08173164 A JP H08173164A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＤＮＡ解析に必要な試料調整をクローニング
プロセスを用いずに選別ＰＣＲ増幅により行う手法を提
供する。 【構成】 ＤＮＡ末端にオリゴマーを結合し、このオリ
ゴマー部にハイブリダイズし、３’末端に選別配列を持
つプライマーでＰＣＲ増幅して特定の断片だけを選別増
幅する。 【効果】 クローニングなど手間のかかるプロセスが不
要となり、試料調整の全自動化が可能となる。
プロセスを用いずに選別ＰＣＲ増幅により行う手法を提
供する。 【構成】 ＤＮＡ末端にオリゴマーを結合し、このオリ
ゴマー部にハイブリダイズし、３’末端に選別配列を持
つプライマーでＰＣＲ増幅して特定の断片だけを選別増
幅する。 【効果】 クローニングなど手間のかかるプロセスが不
要となり、試料調整の全自動化が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ解析、特に長いＤ
ＮＡの効率よい解析法および解析システムに関するもの
である。
ＮＡの効率よい解析法および解析システムに関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】従来、長いＤＮＡの解析ではクローニン
グを用いる方法が用いられていた。すなわち、長いＤＮ
Ａを断片化し、これらの断片群をプラスミドなどのベク
ター中に組み込んだ後に大腸菌に感染させ、これを寒天
培地で培養する。目的ＤＮＡを組み込まれたプラスミド
を有する大腸菌だけが生き残るような培地で培養する
と、寒天上にコロニーが出現する。これは単一の大腸菌
であり、従って同一のＤＮＡ断片を有するプラスミドを
含んだ大腸菌が増殖したものであり、これらのうち単一
コロニーから大腸菌を取り培養することにより、ＤＮＡ
断片を精製し、かつ、コピー数を増やして得ることがで
きる。
グを用いる方法が用いられていた。すなわち、長いＤＮ
Ａを断片化し、これらの断片群をプラスミドなどのベク
ター中に組み込んだ後に大腸菌に感染させ、これを寒天
培地で培養する。目的ＤＮＡを組み込まれたプラスミド
を有する大腸菌だけが生き残るような培地で培養する
と、寒天上にコロニーが出現する。これは単一の大腸菌
であり、従って同一のＤＮＡ断片を有するプラスミドを
含んだ大腸菌が増殖したものであり、これらのうち単一
コロニーから大腸菌を取り培養することにより、ＤＮＡ
断片を精製し、かつ、コピー数を増やして得ることがで
きる。
【０００３】このようなクローニングと培養プロセスを
経て得たＤＮＡを用い塩基配列決定などを行なってい
た。しかしながら、このような従来法では解析しようと
するＤＮＡを多量調製するためにはそのＤＮＡのクロー
ニングおよび大腸菌の培養を行なうプロセスを必要と
し、複雑で人手を要するうえ、自動化に不向きであり、
ヒトゲノムなどの大容量のＤＮＡ解析に用いるには問題
が多かった。
経て得たＤＮＡを用い塩基配列決定などを行なってい
た。しかしながら、このような従来法では解析しようと
するＤＮＡを多量調製するためにはそのＤＮＡのクロー
ニングおよび大腸菌の培養を行なうプロセスを必要と
し、複雑で人手を要するうえ、自動化に不向きであり、
ヒトゲノムなどの大容量のＤＮＡ解析に用いるには問題
が多かった。
【０００４】また、制限酵素を用いて長いＤＮＡの短小
断片を作り個々の断片の配列を決定してつなげて行く方
法もあるが、制限酵素切断で得られる断片サイズは不揃
いで一度に解析できないサイズの物も多い。更に断片同
志をつなげてゆく手間がかかる難点があり、前記方法同
様に自動化に不向きであり大容量のＤＮＡ解析には適さ
ない方法である。
断片を作り個々の断片の配列を決定してつなげて行く方
法もあるが、制限酵素切断で得られる断片サイズは不揃
いで一度に解析できないサイズの物も多い。更に断片同
志をつなげてゆく手間がかかる難点があり、前記方法同
様に自動化に不向きであり大容量のＤＮＡ解析には適さ
ない方法である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、その
３’末端に１〜４塩基からなる選別配列を含むプライマ
ーを用いて解析しようとするＤＮＡを選択的に増幅する
ことにより、ＤＮＡのクローニングおよび大腸菌の培養
を行なうことなく、ＤＮＡ試料を調製することに成功
し、本発明を完成した。そして、この方法はＤＮＡのク
ローニング及び大腸菌の培養プロセスを必要としないも
のであるから、自動化に適したＤＮＡ試料調製法であ
る。
３’末端に１〜４塩基からなる選別配列を含むプライマ
ーを用いて解析しようとするＤＮＡを選択的に増幅する
ことにより、ＤＮＡのクローニングおよび大腸菌の培養
を行なうことなく、ＤＮＡ試料を調製することに成功
し、本発明を完成した。そして、この方法はＤＮＡのク
ローニング及び大腸菌の培養プロセスを必要としないも
のであるから、自動化に適したＤＮＡ試料調製法であ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、二本鎖ＤＮＡ
を断片化処理し、複数種のＤＮＡ断片を生成するプロセ
スと、切断部にライゲーション反応で既知配列を持つオ
リゴマーを前記ＤＮＡ断片に結合するプロセスと、前記
既知配列のオリゴマーに対し相補的なオリゴヌクレオチ
ド配列を含みかつその３’末端に１〜４塩基からなる選
別配列を持つプライマーを用いて前記ＤＮＡ断片の相補
鎖合成をすることによりＤＮＡ断片のコピー数を増幅す
るプロセスとを含むことを特徴とするＤＮＡ調製法であ
る。
を断片化処理し、複数種のＤＮＡ断片を生成するプロセ
スと、切断部にライゲーション反応で既知配列を持つオ
リゴマーを前記ＤＮＡ断片に結合するプロセスと、前記
既知配列のオリゴマーに対し相補的なオリゴヌクレオチ
ド配列を含みかつその３’末端に１〜４塩基からなる選
別配列を持つプライマーを用いて前記ＤＮＡ断片の相補
鎖合成をすることによりＤＮＡ断片のコピー数を増幅す
るプロセスとを含むことを特徴とするＤＮＡ調製法であ
る。
【０００７】上記二本鎖ＤＮＡの断片化処理としては、
制限酵素処理、エクソヌクレアーゼおよびS1ヌクレアー
ゼ処理、レーザーを用いた物理的切断処理、超音波を用
いた物理的切断処理などが挙げられる。また、この二本
鎖ＤＮＡの断片化処理には、その断片化処理の過程で形
成される一本鎖のループ状のＤＮＡ鎖をS1ヌクレアーゼ
で分解除去し、二本鎖ＤＮＡの欠落部をＤＮＡポリメラ
ーゼ及びリガーゼを用いて修復するプロセスを含む処理
法も含まれる。
制限酵素処理、エクソヌクレアーゼおよびS1ヌクレアー
ゼ処理、レーザーを用いた物理的切断処理、超音波を用
いた物理的切断処理などが挙げられる。また、この二本
鎖ＤＮＡの断片化処理には、その断片化処理の過程で形
成される一本鎖のループ状のＤＮＡ鎖をS1ヌクレアーゼ
で分解除去し、二本鎖ＤＮＡの欠落部をＤＮＡポリメラ
ーゼ及びリガーゼを用いて修復するプロセスを含む処理
法も含まれる。
【０００８】さらに、本発明は、二本鎖ＤＮＡを断片化
処理し、複数種のＤＮＡ断片を生成するプロセスと、切
断部にライゲーション反応で既知配列を持つオリゴマー
を前記ＤＮＡ断片の一端に、そして別種の既知配列を持
つオリゴマーを前記ＤＮＡ断片の他端に結合するプロセ
スと、前記既知配列のオリゴマーに対し相補的なオリゴ
ヌクレオチド配列を含むプライマー及び前記別種の既知
配列のオリゴマーに対し相補的なオリゴヌクレオチド配
列を含みかつその５’末端及び３’末端にそれぞれ蛍光
標識及び１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマー
を用いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成をすることにより
ＤＮＡ断片のコピー数を増幅するプロセスとを含むこと
を特徴とするＤＮＡ調製法である。
処理し、複数種のＤＮＡ断片を生成するプロセスと、切
断部にライゲーション反応で既知配列を持つオリゴマー
を前記ＤＮＡ断片の一端に、そして別種の既知配列を持
つオリゴマーを前記ＤＮＡ断片の他端に結合するプロセ
スと、前記既知配列のオリゴマーに対し相補的なオリゴ
ヌクレオチド配列を含むプライマー及び前記別種の既知
配列のオリゴマーに対し相補的なオリゴヌクレオチド配
列を含みかつその５’末端及び３’末端にそれぞれ蛍光
標識及び１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマー
を用いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成をすることにより
ＤＮＡ断片のコピー数を増幅するプロセスとを含むこと
を特徴とするＤＮＡ調製法である。
【０００９】さらに、本発明は、少なくとも二本鎖ＤＮ
Ａを断片化処理し、切断部に既知配列を持ったオリゴマ
ーを結合するプロセスと、前記結合したオリゴマーに対
し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含みかつその３’
末端に１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマーを
少なくとも１種用いて前記ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する
プロセスと、ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、
分取するプロセスとを含むことを特徴とするＤＮＡ調製
法である。
Ａを断片化処理し、切断部に既知配列を持ったオリゴマ
ーを結合するプロセスと、前記結合したオリゴマーに対
し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含みかつその３’
末端に１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマーを
少なくとも１種用いて前記ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する
プロセスと、ゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、
分取するプロセスとを含むことを特徴とするＤＮＡ調製
法である。
【００１０】さらに、本発明は、複数の２本鎖ＤＮＡを
含むＤＮＡ断片群に既知配列を持ったオリゴマーを結合
させ、その３’末端に１〜４塩基からなる選別配列を持
ち且つ前記結合したオリゴマーに相補的なオリゴヌクレ
オチド配列を含むプライマーを用いて少なくとも１回以
上相補鎖合成して、ＤＮＡ断片のＤＮＡコピーを増幅す
るプロセスを含むことを特徴とするＤＮＡ調製法であ
る。
含むＤＮＡ断片群に既知配列を持ったオリゴマーを結合
させ、その３’末端に１〜４塩基からなる選別配列を持
ち且つ前記結合したオリゴマーに相補的なオリゴヌクレ
オチド配列を含むプライマーを用いて少なくとも１回以
上相補鎖合成して、ＤＮＡ断片のＤＮＡコピーを増幅す
るプロセスを含むことを特徴とするＤＮＡ調製法であ
る。
【００１１】本発明では二本鎖ＤＮＡを制限酵素処理、
エクソヌクレアーゼおよびS1ヌクレアーゼ処理、レーザ
ーを用いた物理的切断処理、超音波を用いた物理的切断
処理等で断片化し、この未知のＤＮＡ断片の末端に既知
ＤＮＡ断片を結合させ、ＰＣＲ（Polymerase Chain Rea
ction）等で増幅可能な形とする。すなわち、種々の長
さのＤＮＡ断片をゲル電気泳動を用いて、その長さ毎に
大まかに分離し分取する。あるいはＤＮＡ断片をエクソ
ヌクレアーゼなどにより末端消化し短い断片とする反応
を反応時間等を調節して行ない、長さの異なる断片群を
得る。次いで末端に既知配列のオリゴマーをリガーゼを
用いて結合させる。この場合、各断片群内のＤＮＡ断片
の長さはほぼ一定であるが、厳密には種々の長さのもの
が含まれる。
エクソヌクレアーゼおよびS1ヌクレアーゼ処理、レーザ
ーを用いた物理的切断処理、超音波を用いた物理的切断
処理等で断片化し、この未知のＤＮＡ断片の末端に既知
ＤＮＡ断片を結合させ、ＰＣＲ（Polymerase Chain Rea
ction）等で増幅可能な形とする。すなわち、種々の長
さのＤＮＡ断片をゲル電気泳動を用いて、その長さ毎に
大まかに分離し分取する。あるいはＤＮＡ断片をエクソ
ヌクレアーゼなどにより末端消化し短い断片とする反応
を反応時間等を調節して行ない、長さの異なる断片群を
得る。次いで末端に既知配列のオリゴマーをリガーゼを
用いて結合させる。この場合、各断片群内のＤＮＡ断片
の長さはほぼ一定であるが、厳密には種々の長さのもの
が含まれる。
【００１２】上記制限酵素としては、Sau3A, TaqI, Pst
I, MaeI, HindIII, ECoRI 等が用いられる。エクソヌク
レアーゼ、S1ヌクレアーゼ、リガーゼはいずれも市販の
製品が用いられる。次いで末端が特定のＤＮＡ配列を持
つ未知のＤＮＡ断片を、上記既知配列のオリゴマーに対
し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含みかつその３’
末端に１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマーを
用いてＤＮＡ相補鎖合成反応を繰り返し用いて増幅し、
のコピー数を増やす。ここで、選別配列の塩基数が例え
ば１塩基の場合は４種類、２塩基の場合は１６種類、３
塩基の場合は６４種類のＤＮＡ断片を選択増幅すること
ができる。これにより末端が特定の配列のＤＮＡを精製
し、調製することができる。
I, MaeI, HindIII, ECoRI 等が用いられる。エクソヌク
レアーゼ、S1ヌクレアーゼ、リガーゼはいずれも市販の
製品が用いられる。次いで末端が特定のＤＮＡ配列を持
つ未知のＤＮＡ断片を、上記既知配列のオリゴマーに対
し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含みかつその３’
末端に１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマーを
用いてＤＮＡ相補鎖合成反応を繰り返し用いて増幅し、
のコピー数を増やす。ここで、選別配列の塩基数が例え
ば１塩基の場合は４種類、２塩基の場合は１６種類、３
塩基の場合は６４種類のＤＮＡ断片を選択増幅すること
ができる。これにより末端が特定の配列のＤＮＡを精製
し、調製することができる。
【００１３】上記未知のＤＮＡ断片の末端に結合させる
既知配列のオリゴマーの長さは１０〜５０塩基、好まし
くは１８〜３０塩基である。この塩基長が１０塩基より
短いとプライマーが安定にハイブリダイズせずＰＣＲ増
幅効率が下がる。５０塩基より長いと合成に手間がかか
る。
既知配列のオリゴマーの長さは１０〜５０塩基、好まし
くは１８〜３０塩基である。この塩基長が１０塩基より
短いとプライマーが安定にハイブリダイズせずＰＣＲ増
幅効率が下がる。５０塩基より長いと合成に手間がかか
る。
【００１４】
【作用】ＤＮＡ断片をゲル電気泳動分離して分取すると
末端消化により得たＤＮＡ断片群中に含まれるＤＮＡの
長さはほぼそろっており、全くランダムな長さのＤＮＡ
が含まれる場合に比べるとかなりの程度選別された長さ
のＤＮＡ断片だけが分取される。更にこれら断片種の中
で末端１〜４塩基のうち特定塩基配列を持つ断片だけが
相補鎖合成反応で増幅されるので、この結果末端塩基配
列を選別することによりＤＮＡ断片を精製することがで
きる。更に相補鎖合成反応を繰り返し用いることでその
コピー数を増やすことができる。
末端消化により得たＤＮＡ断片群中に含まれるＤＮＡの
長さはほぼそろっており、全くランダムな長さのＤＮＡ
が含まれる場合に比べるとかなりの程度選別された長さ
のＤＮＡ断片だけが分取される。更にこれら断片種の中
で末端１〜４塩基のうち特定塩基配列を持つ断片だけが
相補鎖合成反応で増幅されるので、この結果末端塩基配
列を選別することによりＤＮＡ断片を精製することがで
きる。更に相補鎖合成反応を繰り返し用いることでその
コピー数を増やすことができる。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 〔実施例１〕第１の例は末端消化により得たＤＮＡ断片
を用いる例である。長いＤＮＡを解析するときには第１
図に示したように片方の末端３が一定で他方の末端４が
種々の位置で切断されたＤＮＡ断片群５を用いて６のよ
うに順次配列をよんで行く方法が有効である。ＤＮＡの
末端を消化する方法の１つにエキソヌクレアーゼ（Exon
uclease）（アマシャム社製）とS1ヌクレアーゼ（nucle
ase ）（アマシャム社製）を組み合わせて末端塩基を順
次分解してゆく方法がある。ベクターに組みこまれた長
いＤＮＡ（１０ｋｂ程度）を例に考える。ベクターには
プラスミド、M13mp18（アマシャム社製）のようなM13系
ファージの２本鎖ＤＮＡなどを用いる。２本鎖状態のM1
3mp18を用いた例を図２に示した。制限酵素Bam HIサイ
ト２１に塩基配列を決定しようとするＤＮＡ２０をクロ
ーニングする。このベクターはBam HIサイト２１とプラ
イマーアニーリング部位２４の間にXbaI２２およびPstI
２３の切断部位を持つ。両酵素で切断すると図２に示し
た長いＤＮＡ断片２５が得られる。これにエキソヌクレ
アーゼIII（アマシャム社製）を数分間作用させる。エ
キソヌクレアーゼIIIは５’突出末端および平滑端を持
つ２本鎖ＤＮＡを３’末端から順次分解する。反応時間
を変化させて生成物を得ることにより図２の２本鎖部分
３０が種々長さの挿入ＤＮＡ群２６を分取することがで
きる。次いでムンクビーン ヌクレアーゼ（アマシャム
社製）およびクレノウフラグメント（ＤＮＡポリメラー
ゼ）（アマシャム社製）を作用させ、一本鎖部分を除去
して平滑端を持つＤＮＡ群２７を得る。平滑端を持ち既
知配列のオリゴマー３２をライゲーションにより結合さ
せる。オリゴマー３２が逆向きに結合することを防止す
るため非結合端は平滑端とせず、また分取時のモニター
用に非結合端の５’末端に蛍光体３１を入れておく。ラ
イゲーション反応は６時間〜１２時間行なう。次に制限
酵素Bam HIで切断し、切断部に既知配列のオリゴマー４
１をライゲーションで結合する。Bam HIサイトに結合す
るオリゴマー４１の配列は平滑端に結合したオリゴマー
３２の配列と異なるものにしておく。このＤＮＡ断片の
Bam HIサイト側は一定の部位で切断されオリゴマーが結
合しているが平滑端側はデリーションによるため厳密に
一定の位置で切断されたものにオリゴマーがついたもの
でなく、１つの群には種々長さのＤＮＡ断片の混合した
ものが含まれる。ＤＮＡシーケンス反応はオリゴマー３
２側から行なうので、このままでは種々配列が混合した
信号が得られ、うまく配列決定できない。そこで混合物
の中から特定の長さのＤＮＡ断片だけを選びだして塩基
配列決定する必要がある。従来はこれらフラグメントを
再度クローニング（サブクローニング）し、コロニー培
養後特定のコロニーを得て再度培養することによりＤＮ
Ａ断片の精製とコピー数の増幅をしていた。ここでは従
来のサブクローニングに代えて、選択ＰＣＲにより特定
のＤＮＡだけを増幅した。ＤＮＡ断片のオリゴマー３２
に続く部分は断片種毎に異なる配列をしている。一方、
ＤＮＡ相補鎖合成を行なうとき、プライマーの３’末端
側２塩基が完全にハイブリダイズしているときには相補
鎖合成が起こるが、完全でない場合には相補鎖合成はお
きないか、非常にすくない。そこで結合させたオリゴマ
ー３２に続く２塩基が断片種毎に異なるであろうこと
（断片種が多いときは２塩基の配列が同じ異種断片があ
りえる）を利用して、特定のＤＮＡ鎖だけを選びだし、
増幅した。用いた増幅用プライマーと両端にライゲーシ
ョンでオリゴマーを導入したフラグメント２ヶの関係を
図３に示した。オリゴマー４１にハイブリダイスするプ
ライマ５１とオリゴマー３２に結合しその５’末端に蛍
光標識を持つオリゴマー６１とこれに続く配列ＴＧ６２
部分を持ったプライマー５２を用いた。なお、この配列
ＴＧはＤＮＡ断片種をその５’末端の塩基配列の種類に
より選択するための選択配列である。したがって、選択
配列が２塩基の場合は配列ＴＧの他に１５種の選別配列
があり、これら１５種の５’末端の塩基配列を有するＤ
ＮＡ断片種を選択的に増幅することができる。プライマ
ー５１はすべての断片に共通してハイブリダイズする。
一方、プライマー５２が完全にハイブリダイズし、相補
鎖合成が効率良く起こるのは末端が共通配列に続いてＡ
Ｃの配列を持ったものである。ＰＣＲ増幅によりその長
さの異なる複数の断片種のうちの特定種だけを増幅する
ことができた。これを図４により説明する。１つのフラ
クションの中には種々の長さのＤＮＡ断片がありそのコ
ピー数の分布は図４の上図の７１のようである。この混
合ＤＮＡ断片について、例えばその末端配列がＴＧのプ
ライマーで増幅すると前記混合ＤＮＡ断のうち末端配列
がＡＣのＤＮＡ断片のみが選択的に増幅され、図４の上
図の７２のようになる。したがって、混合ＤＮＡ断のう
ちから特定の一本のＤＮＡ断片を抜き出すことができ
る。
る。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 〔実施例１〕第１の例は末端消化により得たＤＮＡ断片
を用いる例である。長いＤＮＡを解析するときには第１
図に示したように片方の末端３が一定で他方の末端４が
種々の位置で切断されたＤＮＡ断片群５を用いて６のよ
うに順次配列をよんで行く方法が有効である。ＤＮＡの
末端を消化する方法の１つにエキソヌクレアーゼ（Exon
uclease）（アマシャム社製）とS1ヌクレアーゼ（nucle
ase ）（アマシャム社製）を組み合わせて末端塩基を順
次分解してゆく方法がある。ベクターに組みこまれた長
いＤＮＡ（１０ｋｂ程度）を例に考える。ベクターには
プラスミド、M13mp18（アマシャム社製）のようなM13系
ファージの２本鎖ＤＮＡなどを用いる。２本鎖状態のM1
3mp18を用いた例を図２に示した。制限酵素Bam HIサイ
ト２１に塩基配列を決定しようとするＤＮＡ２０をクロ
ーニングする。このベクターはBam HIサイト２１とプラ
イマーアニーリング部位２４の間にXbaI２２およびPstI
２３の切断部位を持つ。両酵素で切断すると図２に示し
た長いＤＮＡ断片２５が得られる。これにエキソヌクレ
アーゼIII（アマシャム社製）を数分間作用させる。エ
キソヌクレアーゼIIIは５’突出末端および平滑端を持
つ２本鎖ＤＮＡを３’末端から順次分解する。反応時間
を変化させて生成物を得ることにより図２の２本鎖部分
３０が種々長さの挿入ＤＮＡ群２６を分取することがで
きる。次いでムンクビーン ヌクレアーゼ（アマシャム
社製）およびクレノウフラグメント（ＤＮＡポリメラー
ゼ）（アマシャム社製）を作用させ、一本鎖部分を除去
して平滑端を持つＤＮＡ群２７を得る。平滑端を持ち既
知配列のオリゴマー３２をライゲーションにより結合さ
せる。オリゴマー３２が逆向きに結合することを防止す
るため非結合端は平滑端とせず、また分取時のモニター
用に非結合端の５’末端に蛍光体３１を入れておく。ラ
イゲーション反応は６時間〜１２時間行なう。次に制限
酵素Bam HIで切断し、切断部に既知配列のオリゴマー４
１をライゲーションで結合する。Bam HIサイトに結合す
るオリゴマー４１の配列は平滑端に結合したオリゴマー
３２の配列と異なるものにしておく。このＤＮＡ断片の
Bam HIサイト側は一定の部位で切断されオリゴマーが結
合しているが平滑端側はデリーションによるため厳密に
一定の位置で切断されたものにオリゴマーがついたもの
でなく、１つの群には種々長さのＤＮＡ断片の混合した
ものが含まれる。ＤＮＡシーケンス反応はオリゴマー３
２側から行なうので、このままでは種々配列が混合した
信号が得られ、うまく配列決定できない。そこで混合物
の中から特定の長さのＤＮＡ断片だけを選びだして塩基
配列決定する必要がある。従来はこれらフラグメントを
再度クローニング（サブクローニング）し、コロニー培
養後特定のコロニーを得て再度培養することによりＤＮ
Ａ断片の精製とコピー数の増幅をしていた。ここでは従
来のサブクローニングに代えて、選択ＰＣＲにより特定
のＤＮＡだけを増幅した。ＤＮＡ断片のオリゴマー３２
に続く部分は断片種毎に異なる配列をしている。一方、
ＤＮＡ相補鎖合成を行なうとき、プライマーの３’末端
側２塩基が完全にハイブリダイズしているときには相補
鎖合成が起こるが、完全でない場合には相補鎖合成はお
きないか、非常にすくない。そこで結合させたオリゴマ
ー３２に続く２塩基が断片種毎に異なるであろうこと
（断片種が多いときは２塩基の配列が同じ異種断片があ
りえる）を利用して、特定のＤＮＡ鎖だけを選びだし、
増幅した。用いた増幅用プライマーと両端にライゲーシ
ョンでオリゴマーを導入したフラグメント２ヶの関係を
図３に示した。オリゴマー４１にハイブリダイスするプ
ライマ５１とオリゴマー３２に結合しその５’末端に蛍
光標識を持つオリゴマー６１とこれに続く配列ＴＧ６２
部分を持ったプライマー５２を用いた。なお、この配列
ＴＧはＤＮＡ断片種をその５’末端の塩基配列の種類に
より選択するための選択配列である。したがって、選択
配列が２塩基の場合は配列ＴＧの他に１５種の選別配列
があり、これら１５種の５’末端の塩基配列を有するＤ
ＮＡ断片種を選択的に増幅することができる。プライマ
ー５１はすべての断片に共通してハイブリダイズする。
一方、プライマー５２が完全にハイブリダイズし、相補
鎖合成が効率良く起こるのは末端が共通配列に続いてＡ
Ｃの配列を持ったものである。ＰＣＲ増幅によりその長
さの異なる複数の断片種のうちの特定種だけを増幅する
ことができた。これを図４により説明する。１つのフラ
クションの中には種々の長さのＤＮＡ断片がありそのコ
ピー数の分布は図４の上図の７１のようである。この混
合ＤＮＡ断片について、例えばその末端配列がＴＧのプ
ライマーで増幅すると前記混合ＤＮＡ断のうち末端配列
がＡＣのＤＮＡ断片のみが選択的に増幅され、図４の上
図の７２のようになる。したがって、混合ＤＮＡ断のう
ちから特定の一本のＤＮＡ断片を抜き出すことができ
る。
【００１６】以上、酵素による末端消化産物（デリーシ
ョン産物）中の特定断片だけを増幅し、得る方法を示し
たが、末端消化の反応時間を変化させることにより、大
まかに長さのそろった種々断片長のＤＮＡ群を得ること
ができる。これらＤＮＡ断片群を前記の方法で処理する
ことにより、各グループ内の特定断片種だけを増幅して
グループ毎に長さをそろえることが出来、これらを順次
解析することにより長いＤＮＡのシーケンシングを行な
うことができる。
ョン産物）中の特定断片だけを増幅し、得る方法を示し
たが、末端消化の反応時間を変化させることにより、大
まかに長さのそろった種々断片長のＤＮＡ群を得ること
ができる。これらＤＮＡ断片群を前記の方法で処理する
ことにより、各グループ内の特定断片種だけを増幅して
グループ毎に長さをそろえることが出来、これらを順次
解析することにより長いＤＮＡのシーケンシングを行な
うことができる。
【００１７】〔実施例２〕上記の特定ＤＮＡ断片を増幅
する方法で得たＤＮＡ断片群中に複数の長さのＤＮＡ断
片が依然として含まれるときには次の方法で精製するこ
とができる。第５図にその概要を示した。デリーション
で生じた種々長さのＤＮＡ断片１００が１つのグループ
(a)内には存在する。(b)のように前記ＤＮＡ断片の両末
端に既知オリゴマー４１、および３２を結合させる。次
いで、これをＰＣＲ増幅する。このときオリゴマー３２
側にハイブリダイズするプライマー５２は共通配列６１
とその３’末端側に塩基選別用の２塩基６２、（ここで
はＴＧとした）を持つため、種々断片のうちＴＧ部分が
完全に一致する断片だけがＰＣＲで増幅される。この結
果(c)のように３種の断片が生じた。プライマーを除去
後これらを混合して熱変性し、再アニールすると、(d)
のように同じ長さのＤＮＡペアーに加えて長さの異なる
ペアーが生じる。これらＤＮＡの末端部は共通なので途
中にループ１０１ができることになる。この一本鎖部分
をS1ヌクレアーゼで消化すると１０２のように二本鎖の
一部に切れ目のある型となる。切れ目部分が１塩基以上
抜けていると後のリガーゼ修復反応が進まない。そこで
１０３のようにＤＮＡポリメラーゼを作用させ相補鎖合
成し、続いてＤＮＡリガーゼで２本鎖を修復するが、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼで２本鎖を修復す
ると短いＤＮＡ鎖の比率が高い状態となる。これを数回
繰り返すことで複数種のＤＮＡ鎖を１０４のように短い
ものに一本化していくことができる。このようにデリー
ションで得た１つの断片群の長さをそろえていくことが
できる。このS1ヌクレアーゼを用いるプロセスをオリゴ
マーをライゲーションする前の(a)の段階で用いてもよ
い。
する方法で得たＤＮＡ断片群中に複数の長さのＤＮＡ断
片が依然として含まれるときには次の方法で精製するこ
とができる。第５図にその概要を示した。デリーション
で生じた種々長さのＤＮＡ断片１００が１つのグループ
(a)内には存在する。(b)のように前記ＤＮＡ断片の両末
端に既知オリゴマー４１、および３２を結合させる。次
いで、これをＰＣＲ増幅する。このときオリゴマー３２
側にハイブリダイズするプライマー５２は共通配列６１
とその３’末端側に塩基選別用の２塩基６２、（ここで
はＴＧとした）を持つため、種々断片のうちＴＧ部分が
完全に一致する断片だけがＰＣＲで増幅される。この結
果(c)のように３種の断片が生じた。プライマーを除去
後これらを混合して熱変性し、再アニールすると、(d)
のように同じ長さのＤＮＡペアーに加えて長さの異なる
ペアーが生じる。これらＤＮＡの末端部は共通なので途
中にループ１０１ができることになる。この一本鎖部分
をS1ヌクレアーゼで消化すると１０２のように二本鎖の
一部に切れ目のある型となる。切れ目部分が１塩基以上
抜けていると後のリガーゼ修復反応が進まない。そこで
１０３のようにＤＮＡポリメラーゼを作用させ相補鎖合
成し、続いてＤＮＡリガーゼで２本鎖を修復するが、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼで２本鎖を修復す
ると短いＤＮＡ鎖の比率が高い状態となる。これを数回
繰り返すことで複数種のＤＮＡ鎖を１０４のように短い
ものに一本化していくことができる。このようにデリー
ションで得た１つの断片群の長さをそろえていくことが
できる。このS1ヌクレアーゼを用いるプロセスをオリゴ
マーをライゲーションする前の(a)の段階で用いてもよ
い。
【００１８】〔実施例３〕上記実施例２はＤＮＡをデリ
ケーションにより短小化したが、超音波による切断、レ
ーザによる切断、あるいは化学的切断をしたものについ
ても同様に扱える。たとえば超音波による切断を用いた
例を図６に示す。超音波を用いる切断では切断は１２０
のように無作為におこる。そこで得られる断片はＤＮＡ
の種々な部分からランダムに得られる。解析効率を上げ
るには特定部位を起点にして種々長さのＤＮＡ断片を得
るのが都合がよい。そこで対象とするＤＮＡの両側に蛍
光標識１１１とビオチン１１２のついたオリゴマー１１
０をライゲーションで結合させる。オリゴマーの蛍光標
識の入った側はライゲーションできないよう処理してお
く。このように標識を導入したＤＮＡを断片化し、切断
部を平滑化してオリゴマー１２１を再度ライゲーション
で結合させる。生成した断片をゲル電気泳動を用いてサ
イズ分画する。ストレプトアビジン１３１を保持した磁
気ビーズ１３０を用いてビオチンが結合しているＤＮＡ
断片だけを抜き取り、オリゴマー１１０とオリゴマー１
２１に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。こ
のとき、図５と同様にオリゴマー１２１にハイブリダイ
ズするプライマーは相補配列に加えて３’側に塩基選別
用の配列、例えばＴＧを持つものを使用する。これによ
り似た長さのＤＮＡ断片群の中から特定の物だけを選ん
で増幅する。この結果サイズ分画した各グループについ
てそれぞれ１〜３本のＤＮＡ断片を得ることが出来た。
複数本のＤＮＡ断片が含まれるグループについては前述
したようにS1ヌクレアーゼを用いて１本に調製した。
ケーションにより短小化したが、超音波による切断、レ
ーザによる切断、あるいは化学的切断をしたものについ
ても同様に扱える。たとえば超音波による切断を用いた
例を図６に示す。超音波を用いる切断では切断は１２０
のように無作為におこる。そこで得られる断片はＤＮＡ
の種々な部分からランダムに得られる。解析効率を上げ
るには特定部位を起点にして種々長さのＤＮＡ断片を得
るのが都合がよい。そこで対象とするＤＮＡの両側に蛍
光標識１１１とビオチン１１２のついたオリゴマー１１
０をライゲーションで結合させる。オリゴマーの蛍光標
識の入った側はライゲーションできないよう処理してお
く。このように標識を導入したＤＮＡを断片化し、切断
部を平滑化してオリゴマー１２１を再度ライゲーション
で結合させる。生成した断片をゲル電気泳動を用いてサ
イズ分画する。ストレプトアビジン１３１を保持した磁
気ビーズ１３０を用いてビオチンが結合しているＤＮＡ
断片だけを抜き取り、オリゴマー１１０とオリゴマー１
２１に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。こ
のとき、図５と同様にオリゴマー１２１にハイブリダイ
ズするプライマーは相補配列に加えて３’側に塩基選別
用の配列、例えばＴＧを持つものを使用する。これによ
り似た長さのＤＮＡ断片群の中から特定の物だけを選ん
で増幅する。この結果サイズ分画した各グループについ
てそれぞれ１〜３本のＤＮＡ断片を得ることが出来た。
複数本のＤＮＡ断片が含まれるグループについては前述
したようにS1ヌクレアーゼを用いて１本に調製した。
【００１９】以上の試料調製により、ＤＮＡの末端から
ほぼ一定の長さ間隔を持つ一群のＤＮＡ断片を得ること
ができる。そこで、これらを順に塩基配列決定すること
によりむだなくＤＮＡの配列決定を行なうことができ
る。長さ毎に各群に属するＤＮＡ断片の長さの差は３０
０塩基長程度に調製するのがよい。これはＤＮＡシーケ
ンサーで容易に配列を読める長さが４００塩基長程度の
ためである。より長いＤＮＡ断片の配列が決定できる長
いゲル（８００〜１０００塩基配列決定が可能）を用い
る場合にはＤＮＡ断片はは６００〜８００塩基長の差を
持って調製すればよい。
ほぼ一定の長さ間隔を持つ一群のＤＮＡ断片を得ること
ができる。そこで、これらを順に塩基配列決定すること
によりむだなくＤＮＡの配列決定を行なうことができ
る。長さ毎に各群に属するＤＮＡ断片の長さの差は３０
０塩基長程度に調製するのがよい。これはＤＮＡシーケ
ンサーで容易に配列を読める長さが４００塩基長程度の
ためである。より長いＤＮＡ断片の配列が決定できる長
いゲル（８００〜１０００塩基配列決定が可能）を用い
る場合にはＤＮＡ断片はは６００〜８００塩基長の差を
持って調製すればよい。
【００２０】
【発明の効果】従来、長いＤＮＡの塩基配列決定では、
ショットガン法等によるため、平均すると同じ配列を４
〜１０回繰り返し読み取ることを行なっていた。又、ク
ローニング、大腸菌の培養といったやっかいなプロセス
を用いるために自動化に不向きであった。一方、制限酵
素を用いて短小断片を作り個々の断片の配列を決定して
つなげて行く方法もあるが、制限酵素切断で得られる断
片サイズは不揃いで一度に解析できないサイズの物も多
い。更に断片同志をつなげてゆく手間がかかる難点があ
る。
ショットガン法等によるため、平均すると同じ配列を４
〜１０回繰り返し読み取ることを行なっていた。又、ク
ローニング、大腸菌の培養といったやっかいなプロセス
を用いるために自動化に不向きであった。一方、制限酵
素を用いて短小断片を作り個々の断片の配列を決定して
つなげて行く方法もあるが、制限酵素切断で得られる断
片サイズは不揃いで一度に解析できないサイズの物も多
い。更に断片同志をつなげてゆく手間がかかる難点があ
る。
【００２１】これに対して本発明によれば、ほぼ一定の
長さのＤＮＡ断片を含む断片群から単一の長さのＤＮＡ
断片のコピー数を増幅して、長さがほぼ一定の割合で変
化する整列したＤＮＡ断片群を得ることができる。これ
らは片側の末端は同じ部位で始まり、反対側の終端側末
端位置が一定長さ毎に変化するものであり、一番長いＤ
ＮＡ鎖から終端側を順次シーケンシングする。そして、
より短いＤＮＡ断片の終端近傍の配列と重複するまで配
列を読み取ることにより、読み取り配列情報を乗り継
ぎ、全配列を効率良く決定できる。
長さのＤＮＡ断片を含む断片群から単一の長さのＤＮＡ
断片のコピー数を増幅して、長さがほぼ一定の割合で変
化する整列したＤＮＡ断片群を得ることができる。これ
らは片側の末端は同じ部位で始まり、反対側の終端側末
端位置が一定長さ毎に変化するものであり、一番長いＤ
ＮＡ鎖から終端側を順次シーケンシングする。そして、
より短いＤＮＡ断片の終端近傍の配列と重複するまで配
列を読み取ることにより、読み取り配列情報を乗り継
ぎ、全配列を効率良く決定できる。
【００２２】各ＤＮＡ断片は長さ毎に整理してあるの
で、読み取りが重複する部分の配列は５０塩基長以下で
よく、全体の１０〜２０％程度である。ＤＮＡ２本鎖の
両鎖を読んだとして総重複度は高々２．５であり、従来
の１／４〜１／２である。一方、この方法ではクローニ
ングを用いる従来法に良く見られる小さなＤＮＡ断片が
脱落して、各断片がつながらず、全体配列が決定できな
いという難点はない。更にクローニングプロセスがない
ため、自動化が容易になる利点がある。
で、読み取りが重複する部分の配列は５０塩基長以下で
よく、全体の１０〜２０％程度である。ＤＮＡ２本鎖の
両鎖を読んだとして総重複度は高々２．５であり、従来
の１／４〜１／２である。一方、この方法ではクローニ
ングを用いる従来法に良く見られる小さなＤＮＡ断片が
脱落して、各断片がつながらず、全体配列が決定できな
いという難点はない。更にクローニングプロセスがない
ため、自動化が容易になる利点がある。
【図１】長いのＤＮＡ配列決定法の概念の一例を示す
図。
図。
【図２】本発明における酵素を用いる例の概念図。
【図３】本発明に用いるプライマーとＤＮＡフラグメン
トに導入したオリゴマーの関係を示す図。
トに導入したオリゴマーの関係を示す図。
【図４】長さのよくにたＤＮＡ断片群から一定の長さの
ＤＮＡフラグメントを得る方法の概念図。
ＤＮＡフラグメントを得る方法の概念図。
【図５】本発明における物理的切断法を用いる例の概念
図。
図。
【図６】本発明における超音波切断法を用いる例の概念
図。
図。
１…試料ＤＮＡ、２…切断個所、３…一方のＤＮＡ端、
４…他方のＤＮＡ端、５…切断されたＤＮＡ群、６…配
列決定部位、２０…試料ＤＮＡ、２１…Bam HIサイト、
２２…Xba I サイト、２３…Pst I サイト、２４…プラ
イマアニーリング群、２５…長いＤＮＡ断片、２６…Ex
onuclease III分解を受けたＤＮＡフラグメント、２７
…末端が平滑化したＤＮＡフラグメント群、２８…両端
に既知オリゴマーを導入したＤＮＡフラグメント群、２
９…両端にことなる既知配列オリゴマーを導入したＤＮ
Ａフラグメント群、３０…２本鎖部分、３１…蛍光体、
３２…既知配列オリゴマー、４１…他の既知配列オリゴ
マー、５１…Bam HIサイト側のオリゴマーに結合するプ
ライマー、５２…オリゴマー３２側に結合するプライマ
ー、６１…共通配列部分、６２…共通配列に続く２塩基
部分、７１…ＰＣＲ前のＤＮＡフラグメント群の電気泳
動パターン、７２…ＰＣＲ後のＤＮＡフラグメントパタ
ーン、１００…デリーションで生じた種々の長さのＤＮ
Ａフラグメント群、１０１…ＤＮＡフラグメント群の変
性、再アニールで生じた非相補的部分、１０２…S1ヌク
レアーゼで分解して生じたギャップ部分、１０３…ギャ
ップ部分の相補鎖伸長部分、１０４…長さの揃った２本
鎖、１１０…ライゲーションでＤＮＡに導入したオリゴ
マー、１１１…蛍光体、１１２…ビオチン、１２０…超
音波切断部位、１２１…他のオリゴマー、１３０…磁気
ビーズ、１３１…ストレプトアビジン、１３５…分離さ
れたよくにた長さのＤＮＡフラグメント
４…他方のＤＮＡ端、５…切断されたＤＮＡ群、６…配
列決定部位、２０…試料ＤＮＡ、２１…Bam HIサイト、
２２…Xba I サイト、２３…Pst I サイト、２４…プラ
イマアニーリング群、２５…長いＤＮＡ断片、２６…Ex
onuclease III分解を受けたＤＮＡフラグメント、２７
…末端が平滑化したＤＮＡフラグメント群、２８…両端
に既知オリゴマーを導入したＤＮＡフラグメント群、２
９…両端にことなる既知配列オリゴマーを導入したＤＮ
Ａフラグメント群、３０…２本鎖部分、３１…蛍光体、
３２…既知配列オリゴマー、４１…他の既知配列オリゴ
マー、５１…Bam HIサイト側のオリゴマーに結合するプ
ライマー、５２…オリゴマー３２側に結合するプライマ
ー、６１…共通配列部分、６２…共通配列に続く２塩基
部分、７１…ＰＣＲ前のＤＮＡフラグメント群の電気泳
動パターン、７２…ＰＣＲ後のＤＮＡフラグメントパタ
ーン、１００…デリーションで生じた種々の長さのＤＮ
Ａフラグメント群、１０１…ＤＮＡフラグメント群の変
性、再アニールで生じた非相補的部分、１０２…S1ヌク
レアーゼで分解して生じたギャップ部分、１０３…ギャ
ップ部分の相補鎖伸長部分、１０４…長さの揃った２本
鎖、１１０…ライゲーションでＤＮＡに導入したオリゴ
マー、１１１…蛍光体、１１２…ビオチン、１２０…超
音波切断部位、１２１…他のオリゴマー、１３０…磁気
ビーズ、１３１…ストレプトアビジン、１３５…分離さ
れたよくにた長さのＤＮＡフラグメント
Claims (9)
- 【請求項１】 二本鎖ＤＮＡを断片化処理し、複数種の
ＤＮＡ断片を生成するプロセスと、切断部にライゲーシ
ョン反応で既知配列を持つオリゴマーを前記ＤＮＡ断片
に結合するプロセスと、前記既知配列のオリゴマーに対
し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含みかつその３’
末端に１〜４塩基からなる選別配列を持つプライマーを
用いて前記ＤＮＡ断片の相補鎖合成をすることによりＤ
ＮＡ断片のコピー数を増幅するプロセスとを含むことを
特徴とするＤＮＡ調製法。 - 【請求項２】 二本鎖ＤＮＡの断片化処理が、制限酵素
処理によるものであることを特徴とする第１項記載のＤ
ＮＡ調製法。 - 【請求項３】 二本鎖ＤＮＡの断片化処理が、エクソヌ
クレアーゼおよびS1ヌクレアーゼ処理によるものである
ことを特徴とする第１項記載のＤＮＡ調製法。 - 【請求項４】 二本鎖ＤＮＡの断片化処理が、S1ヌクレ
アーゼを用いて一本鎖ＤＮＡ部分を分解し、ＤＮＡポリ
メラーゼ及びリガーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを修復する
プロセスを含むものであることを特徴とする第１項記載
のＤＮＡ調製法。 - 【請求項５】 二本鎖ＤＮＡの断片化処理が、レーザー
を用いた物理的切断によるものであることを特徴とする
第１項記載のＤＮＡ調製法。 - 【請求項６】 二本鎖ＤＮＡのＤＮＡの断片化処理が超
音波を用いた物理的切断であることを特徴とする第１項
記載のＤＮＡ調製法。 - 【請求項７】 二本鎖ＤＮＡを断片化処理し、複数種の
ＤＮＡ断片を生成するプロセスと、切断部にライゲーシ
ョン反応で既知配列を持つオリゴマーを前記ＤＮＡ断片
の一端に、そして別種の既知配列を持つオリゴマーを前
記ＤＮＡ断片の他端に結合するプロセスと、前記既知配
列のオリゴマーに対し相補的なオリゴヌクレオチド配列
を含むプライマー及び前記別種の既知配列のオリゴマー
に対し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含みかつその
５’末端及び３’末端にそれぞれ蛍光標識及び１〜４塩
基からなる選別配列を持つプライマーを用いて前記ＤＮ
Ａ断片の相補鎖合成をすることによりＤＮＡ断片のコピ
ー数を増幅するプロセスとを含むことを特徴とするＤＮ
Ａ調製法。 - 【請求項８】 少なくとも二本鎖ＤＮＡを断片化処理
し、切断部に既知配列を持ったオリゴマーを結合するプ
ロセスと、前記結合したオリゴマーに対し相補的なオリ
ゴヌクレオチド配列を含みかつその３’末端に１〜４塩
基からなる選別配列を持つプライマーを少なくとも１種
用いて前記ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するプロセスと、ゲ
ル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、分取するプロセ
スとを含むことを特徴とするＤＮＡ調製法。 - 【請求項９】 複数の２本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ断片群
に既知配列を持ったオリゴマーを結合させ、その３’末
端に１〜４塩基からなる選別配列を持ち且つ前記結合し
たオリゴマーに相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む
プライマーを用いて少なくとも１回以上相補鎖合成し
て、ＤＮＡ断片のＤＮＡコピーを増幅するプロセスを含
むことを特徴とするＤＮＡ調製法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6320288A JPH08173164A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | Ｄｎａ調製法 |
| EP95120038A EP0718409A3 (en) | 1994-12-22 | 1995-12-19 | DNA preparation method |
| CN 95121132 CN1131157A (zh) | 1994-12-22 | 1995-12-21 | Dna制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6320288A JPH08173164A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | Ｄｎａ調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173164A true JPH08173164A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=18119837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6320288A Pending JPH08173164A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | Ｄｎａ調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08173164A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7655791B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-02-02 | Rubicon Genomics, Inc. | DNA amplification and sequencing using DNA molecules generated by random fragmentation |
| US7718403B2 (en) | 2003-03-07 | 2010-05-18 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US7803550B2 (en) | 2005-08-02 | 2010-09-28 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods of producing nucleic acid molecules comprising stem loop oligonucleotides |
| US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US8409804B2 (en) | 2005-08-02 | 2013-04-02 | Rubicon Genomics, Inc. | Isolation of CpG islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method |
| US8440404B2 (en) | 2004-03-08 | 2013-05-14 | Rubicon Genomics | Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
-
1994
- 1994-12-22 JP JP6320288A patent/JPH08173164A/ja active Pending
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9410193B2 (en) | 2001-11-13 | 2016-08-09 | Rubicon Genomics, Inc. | DNA amplification and sequencing using DNA molecules generated by random fragmentation |
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| US7655791B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-02-02 | Rubicon Genomics, Inc. | DNA amplification and sequencing using DNA molecules generated by random fragmentation |
| US8815504B2 (en) | 2001-11-13 | 2014-08-26 | Rubicon Genomics, Inc. | DNA amplification and sequencing using DNA molecules generated by random fragmentation |
| US7718403B2 (en) | 2003-03-07 | 2010-05-18 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US11661628B2 (en) | 2003-03-07 | 2023-05-30 | Takara Bio Usa, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| EP2374900A1 (en) | 2003-03-07 | 2011-10-12 | Rubicon Genomics, Inc. | Polynucleotides for the amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process |
| US11492663B2 (en) | 2003-03-07 | 2022-11-08 | Takara Bio Usa, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US10837049B2 (en) | 2003-03-07 | 2020-11-17 | Takara Bio Usa, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
| US8440404B2 (en) | 2004-03-08 | 2013-05-14 | Rubicon Genomics | Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
| US9708652B2 (en) | 2004-03-08 | 2017-07-18 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
| US8778610B2 (en) | 2005-08-02 | 2014-07-15 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods for preparing amplifiable DNA molecules |
| US9598727B2 (en) | 2005-08-02 | 2017-03-21 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods for processing and amplifying nucleic acids |
| US8728737B2 (en) | 2005-08-02 | 2014-05-20 | Rubicon Genomics, Inc. | Attaching a stem-loop oligonucleotide to a double stranded DNA molecule |
| US10196686B2 (en) | 2005-08-02 | 2019-02-05 | Takara Bio Usa, Inc. | Kits including stem-loop oligonucleotides for use in preparing nucleic acid molecules |
| US10208337B2 (en) | 2005-08-02 | 2019-02-19 | Takara Bio Usa, Inc. | Compositions including a double stranded nucleic acid molecule and a stem-loop oligonucleotide |
| US8409804B2 (en) | 2005-08-02 | 2013-04-02 | Rubicon Genomics, Inc. | Isolation of CpG islands by thermal segregation and enzymatic selection-amplification method |
| US8399199B2 (en) | 2005-08-02 | 2013-03-19 | Rubicon Genomics | Use of stem-loop oligonucleotides in the preparation of nucleic acid molecules |
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