JPH0815429B2 - ＤＮＡポリメラーゼβ遺伝子、該遺伝子を有する組換え体プラスミド及び該プラスミドにより形質転換された形質転換体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、DNAの合成に必要な酵素であり、生化学、
分子生物学、遺伝学、癌研究等の諸分野での基礎研究に
おいてのみならず、遺伝子工学における実用面あるいは
工業的な観点から非常に有用なDNAポリメラーゼ、特
に、動物が産生する特定構造のDNAポリメラーゼβの遺
伝子組換えによる生産に有用な技術に関する。すなわ
ち、本発明は、DNAポリメラーゼβをコードするDNA配
列、該配列を用いた組換え体プラスミド、該換え体プラ
スミドを用いて形質転換した宿主細胞、に関する。

〔従来の技術〕

DNAポリメラーゼ（デオキシヌクレオシド３リン酸:DN
Aデオキシヌクレオチディルトランスフェラーゼ、EC 2.
7.7.7）は、細胞の遺伝物質であるDNAが合成される際に
必要とされる酵素であり、上記のように生化学、分子生
物学、遺伝学、癌研究等の諸分野での基礎研究のみなら
ず、遺伝子工学における実用面あるいは工業的な観点か
ら非常に有用な酵素であり、生命科学の発展に大きな役
割を果している。

すなわち、例えば近年急速に開発された遺伝子工学技
法は、生物の持つ任意の遺伝子の単離（クローニング）
と、その遺伝子によって支配されている蛋白質を、例え
ば大腸菌や動物細胞等の適当な宿主菌に生産させること
を可能にしたが、この分野においても、DNAポリメラー
ゼはDNA合成用の試薬として頻用されており、その需要
はさらに拡大しつつある。

このDNAポリメラーゼとしては、従来より細菌由来のD
NAポリメラーゼＩ及びその部分分解物であるクレノウフ
ラグメント（klenow fragment）、いわゆるクレノウ酵
素が用いられてきており、特にクレノウ酵素の使用頻度
がより多いのが現状である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところで、前記の大腸菌由来のDNAポリメラーゼＩ
は、DNAポリメラーゼ活性とともに、DNA分解酵素活性、
すなわち５′→３′エキソヌクレアーゼ活性及び３′→
５′エキソヌクレアーゼ活性を有しており、また、クレ
ノウ酵素も３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有して
いるため、これらを用いたDNA合成においては、合成DNA
の一部分解が避けられないという問題点があった。

一方、ラットやヒトなど、動物の細胞のDNAポリメラ
ーゼ（動物細胞を含む真核細胞には、複数のDNAポリメ
ラーゼがあり、これらは、ポリメラーゼα、β、γと称
されている）には、エキソヌクレアーゼ活性がないこと
が知られているが、その量は、例えば全蛋白質の１万〜
10万分の１と極微量であり、細胞からの抽出精製による
方法では、DNAポリメラーゼを大量に得ることは困難で
あり、工業的にも実用的でない。

そこで、本発明者らは、上記のような問題点に鑑み動
物細胞由来のDNAポリメラーゼについて種々の検討を加
えた結果、DNAポリメラーゼは、ヒト、哺乳類、鳥類、
両性類、魚類等の種々の動物の細胞で生産されており、
これらの動物細胞のDNAポリメラーゼをコードする遺伝
子をクローニングして、組換えDNAを形成し、これを適
当な宿主細胞中に導入して発現させることによって、動
物細胞由来のDNAポリメラーゼを大量に生産できるとの
結論に至り、鋭意検討を進め本発明を完成した。

すなわち本発明の目的は、生化学、分子生物学、遺伝
学、癌研究等の諸分野での基礎研究においてのみなら
ず、遺伝子工学における実用面あるいは工業的な観点か
ら非常に有用な、ヌクレアーゼ活性のない動物細胞由来
のDNAポリメラーゼβの遺伝子組換えによる生産に有用
なDNAポリメラーゼβ遺伝子を提供することにある。

本発明の他の目的は、動物細胞由来のDNAポリメラー
ゼβを高収率で生産するの有用なDNAポリメラーゼβ遺
伝子発現用組換えプラスミド及び該プラスミドで宿主を
形質転換して得られた形質転換体提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の目的を達成するために、まず、
前述の３種のDNAポリメラーゼのうちDNAポリメラーゼβ
が、40kDa（キロダルトン）の一本鎖からなり、最も単
純な構造を有し、またラット及びヒト由来のDNAポリメ
ラーゼβにはヌクレアーゼ活性がないことに着目し、そ
れらの構造及び機能について種々検討を加えた。

このうち、ラット由来のDNAポリメラーゼβ（以後場
合によりDNAポリメラーゼβをpol−βと略称する）の遺
伝子のクローン化についてはZmudzka,B.Z.及び本発明者
の一人である松影らによってcDNAの形でクローン化され
たものがある（Zmudzka,B.Z.,et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,Vol.83,pp.5106,July 1986）。このクローン化さ
れたラットpol−β遺伝子は、1197塩基対よりなり、そ
のうちの954塩基対からなる暗号読み枠が318アミノ酸残
基からなる蛋白質を規定するものであった。

本発明者らは、上述した種々の検討のなかで、このク
ローン化ラットpol−β遺伝子についても着目し、その
構造について鋭意検討したところ、ラット及びニワトリ
から直接分離精製したpol−βのアミノ酸配列と、この
クローン化pol−β遺伝子によってコードされる318アミ
ノ酸残基からなる蛋白質のアミノ酸配列はほぼ一致して
いるものの、このクローン化ラットpol−β遺伝子を適
当なベクターに挿入して形成した組換え体プラスミドを
大腸菌に導入して、該遺伝子の発現を試みたところ、得
られた蛋白質にはラットpol−β活性がないことが判明
した。

そこで、更に本発明者らは、この酵素活性の欠如の問
題について、更に詳細な検討を加え、すなわち、常法に
従って、ラットpol−β遺伝子を、ラットの染色体から
分離し、そのDNA配列を検索したところ、上述のクロー
ン化ラットpol−β遺伝子によって支配されるアミノ酸
配列では、DNAポリメラーゼのポリペプチド構造として
は不完全であり、すなわちＮ−末端側の17アミノ酸残基
が足りず、その原因がクローン化したDNA配列に９塩基
に相当する欠損部分が生じている（第４図の塩基配列の
最初の９塩基）との知見を得た。

一方、ヒトpol−βのクローニングに関しては、senGu
pta,D.N.et al,Biochem.Biophys.Res.Commum.,136,341
〜347,1986に開示されているが、本発明者らによる同様
の検討によれば、ここで得られているcDNAもまた不完全
なものであることが判明した。

そこで、本発明者らは、上記欠損部分や不完全部分を
補う手法を確立して、pol−β活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNA配列の合成に成功し、また該配列を
用いた遺伝子工学的手法によってアミノ酸残基数335か
らなるラットやヒトDNAポリメラーゼβを高収率で得ら
れる方法を確立するに至り本発明を完成した。

本発明の動物細胞由来のDNAポリメラーゼβをコード
するDNA配列は、DNAポリメラーゼβを産生する各種動物
細胞のDNAポリメラーゼβ遺伝子に含まれるDNAポリメラ
ーゼβをコードするDNA配列をクローン化することによ
って得ることができる。

この動物細胞としては、サケ、マス、カエル、ニワト
リ、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サル、ヒト等を上げることができる。

なかでも、ヌクレアーゼ活性を有していないDNAポリ
メラーゼβを得るには、先に述べたようにラット及びヒ
ト等の細胞が好適である。

なお、所望のDNAポリメラーゼβをコードするDNA配列
をクローン化する方法としては、例えば、後述の実施例
１に示されたような本発明者らによって確立された方法
が有用である。

すなわち、従来のDNAポリメラーゼβ遺伝子のクロー
ン化によって得られていたDNA配列（二本鎖）には、上
述のように欠損部分や不完全部分が存在する。そこで、
まず、補充すべき部分と相補性を有する塩基配列の両側
に、該補充部分が、それが補充されるべきDNA配列（被
補充DNA配列）に補充された際の該補充部分の両側のDNA
配列に相補性を有する塩基配列をそれぞれ結合させた一
本鎖のDNA断片を合成しておく。次に、被補充二本鎖DNA
配列を一本鎖とし、先に用意した補充部分保有の一本鎖
DNA断片と反応させる。

すると、補充部分保有のDNA断片は、その両側に、被
補充DNA配列の上述したような補充部分の両側の塩基配
列と相補性を有する塩基配列を有しているので、それら
の部分から被補充DNAと結合する（該結合部分は二本鎖
となる）。

そこで、前記DNA断片の結合部分間に、部位特異的突
然変異を起させる。すると、被補充一本鎖DNA配列のこ
れら結合部分間に、補充すべき部分に相補性のある塩基
配列を含む合成ヌクレオチドが形成され、それによって
補充すべき所定の相補的な塩基配列を有し、二本鎖から
なるDNA配列を得ることができる。

このような、一本鎖DNAの状態の被補充DNA配列に部位
特異的突然変異を起して、必要部分を補充する方法は、
上記のような欠損部分や不完全部分が存在するDNA配列
のみならず所定のDNA配列と相同部分を有するDNA配列等
に不足部分を補って、所望のDNA配列を得るのに好適で
あり、例えば、所望とするDNA配列を完全な形でクロー
ン化できなくても、該方法によりその不完全な部分を補
充することができる。上記のこれらの手法をミスマッチ
プライマー法と称する。

なお、後述の実施例１は、ラットからのラットpol−
βをコードするDNA配列のクローン化を示したものであ
るが、この方法は、DNAポリメラーゼを産生する他の上
述の各種動物細胞からのDNA配列のクローン化にも適用
できる。

このようにしてクローン化したDNAポリメラーゼβを
コードするDNA配列は、本発明者らによって新たに構築
されたものであり、これにより、DNAポリメラーゼβ生
産用の組換え体DNAを形成することが可能となり、DNAポ
リメラーゼβの大量生産が可能となった。

次に、本発明のDNAポリメラーゼβをコードするDNA配
列を用いたDNAポリメラーゼβの生産方法について説明
する。

このDNAポリメラーゼβの生産方法に用いることので
きる宿主細胞としては、例えば、大腸菌、放線菌、枯草
菌等の細菌や酵母などの微生物、サケ、マス、ニワト
リ、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、サ
ル、ヒト等の細胞などを挙げることができる。

本発明のDNAポリメラーゼβをコードするDNA配列を組
込むベクターとしては、用いる宿主細胞内で複製可能で
あり、DNAポリメラーゼβの宿主細胞での発現を可能と
するものであれば、どのようなものでの利用できる。そ
のようなベクターとしては、例えばlacオペロン・プロ
モーターを有するベクター、tacプロモーターを有するp
KK 322ベクター、tprオペロン・プロモーターを有する
ベクター等が挙げられる。

更に該ベクターは、必要に応じて上述のようなプロモ
ーターに加えて、アンピシリン、テトラサイクリン、カ
ナマイシン等に対する耐性を支配するマーカーを含んで
いても良い。

また、該ベクターとしてpUC118（宝酒造社製）等のフ
ァージを加えることにより一本鎖になる性質を有するプ
ラスミドを用いた場合、ただちに部位特異的突然変異部
分を含む合成オリゴヌクレオチドプライマーと結合でき
るので、ミスマッチプライマー法により目的とする置
換、挿入、削除等の操作の入った塩基配列の二重鎖DNA
が得られ、これを適当な宿主に導入して、新たな生理活
性を有するタンパク質を発現させることが可能となる。
なお、pTZ18R、pTZ19R（ファルマシア社製）等の上記の
ような一本鎖となる性質を有する他のベクターもこれら
目的に利用し得る。

このような構造のベクターに、常法に従い適当な制限
酵素切断部位を利用して、必要に応じてリンカー等を用
い本発明のDNAポリメラーゼβをコードするDNA配列を組
込むことによって、DNAポリメラーゼβ生産用の組換え
体DNAを形成することができる。

なお後述の実施例１で得られた組換え体DNAは、それ
自身がDNAポリメラーゼβ生産用として特に好適なもの
であり、本発明者らによって新たに構築されたものであ
る。

本発明のDNAポリメラーゼβをコードするDNA配列を含
む組換え体DNAを、宿主細胞にトランスフェクションす
るには、例えば、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム
法、プロトプラスト融合法等の方法が利用できる。

このようにして組み換え体DNAを宿主細胞にトランス
フェクションして、それを形質転換し、該形質転換され
た宿主細胞を培養することによってDNAポリメラーゼβ
を生産することができる。

例えば、以後の実施例２で示されているように本発明
の方法により、菌体中の全蛋白質量の19.3％に達するDN
Aポリメラーゼβの生産が実現された。

なお、上記の方法において宿主細胞に生産させたDNA
ポリメラーゼβは、以下に詳述する方法によって、精製
することができる。

ちなみに、本発明者らは、これまでの各種のDNAポリ
メラーゼの構造と機能についての研究を行なってきた
が、動物細胞中ではDNAポリメラーゼが極微量にしか存
在せず、その分離精製は非常に困難であった。しかしな
がら、本発明者らは、10段階程度の操作を組合せて単一
なDNAポリメラーゼの取得に成功した。

具体的には、本発明者らは、DNAポリメラーゼが塩基
性のタンパクであること及び夾雑のDNA等核酸類を除去
することを考慮して、まずDEAEセルロースのような陰イ
オン交換担体でDNAポリメラーゼを含む菌体抽出液等の
混合物を処理することが必要であるとの結論に至った。

次に、この陰イオン交換担体を素通りした分画をリン
酸セルロース酸性担体に吸着させ、溶出液の塩濃度の差
異によってDNAポリメラーゼを分離精製することを行な
った。

そして最後に、DNAカラムによるアフィニティークロ
マトグラフにより、更に、DNAポリメラーゼを精製し
た。

なお、この分離精製方法は、上記の主要過程に加え
て、ゲルロ過を含め種々の操作が加えられ、動物細胞由
来の超微量のDNAポリメラーゼは分離精製された。

これに対し、本発明においては、細菌等において動物
DNAポリメラーゼβが大量に生産されるので、DNAポリメ
ラーゼβを含む粗生産物が大量に得られ、本発明者らは
前記の主要な３つの過程の操作以外の種々の操作を省略
し、すなわち特に有効なこれら操作のみを組合せて、そ
の操作過程を大幅に単純化した新たな精製方法を確立し
た。

第１の主要過程で用いる陰イオン交換担体としては、
DEAEセルロース、TEAEセルロース、DEAEセファデック
ス、QAEセファデックス、セファセル、Dowex−１などが
挙げられる。

また第２の主要な過程で用いる酸性担体（陽イオン交
換体）としては、リン酸セルロース、CMセルロース、SE
セルロース、CMセファデックス、ハイドロキシアパタイ
ト、Dowex−50などが挙げられる。

更に、第３の主要過程で用いるアフィニティークロマ
トグラフとしては、DNAセルロースあるいはブルーアガ
ロースなどを用いることができる。

これら主要の過程の他に本発明の分離精製方法には、
硫安分画法や有機溶媒法も利用し得る。また、第３の主
要過程後に例えばセファデックスG150などを用いたゲル
ろ過法及びDNAセルロースなどを用いたアフィニティー
クロマトグラフィーによる精製過程を更に組合せても良
い。

次に、本発明の分離精製方法の代表例を示す。

まず、DNAポリメラーゼβを生産させた宿主細胞を、T
ME（50mM Tris−HCl、pH7.6、10mM MgCl₂、1mM EDTA）
で洗浄した後、大量にストックする場合、これを−80℃
で保存する。

次に、細胞をその５倍量の抽出用液体［50mM Tris−H
Cl、pH7.6、0.1mM EDTA、1mMジチオレイトール（DT
T）、10％グリセリン、0.5MKCl、1mMフェニルメチルス
ルフォニルフロライド（PMSF）］に懸濁し、この溶液に
超音波を１分間かけ、細胞を破壊し、更に遠心分離（12
000g、20分間）で処理し沈殿物を除去し、細胞の粗抽出
液を得る。

なお、この粗抽出液の調製には、リゾチーム及び／ま
たは中性の界面活性剤を用いる方法も好適であり、その
他各種の方法を利用しても良い。

次に、粗抽出液に、PC溶液（50mM Tris−HCl、pH7.
6、0.1mM EDTA、1mM DTT、10％グリセリン）を加えて1.
5倍程度に希釈する。この希釈は、以後のDEAEセルロー
スカラムによる処理が良好に行なえる程度とすれば良
い。

希釈した粗抽出液のKCl濃度を0.4Mに調整してから、
これをDEAEセルロース（ファルマシア社製）を詰たカラ
ムに通し、希釈粗抽出液中に含まれる核酸成分を、DEAE
セルロースに吸着させて、該希釈粗抽出液から除去す
る。

カラムに未吸着であった画分（DNAポリメラーゼを含
む）に、上記組成のPC溶液を加えて２〜３に希釈し、更
にKCl濃度を0.2Mに調整する。

次に、リン酸セルロース（シグマ社製）を詰たカラム
を0.2M KClを含むPC溶液で処理してリン酸セルロースを
平衡化した後、上記のようにして得た調製溶液を、これ
に通し、更に0.2M KClを含むPC溶液でカラムを十分に洗
浄する。

この操作で、本発明のDNAポリメラーゼβをコードす
るDNA配列由来のDNAポリメラーゼβの大部分はカラムに
吸着する。なお、この段階で、宿主細胞に由来するDNA
ポリメラーゼはカラムに未吸着となるため、溶出してし
まい、所望のDNAポリメラーゼβと分離することができ
る。

カラム内に吸着した蛋白質は、0.2〜0.7M KClの直線
濃度勾配を用いて溶出させることができ、約0.4M KCl付
近でDNAポリメラーゼβ活性の単一ピークを得ることが
できる。そこで、このDNAポリメラーゼβ活性の高い画
分を集め、これを上記組成のPC溶液で希釈し、更にその
KCl濃度を0.15Mに、またグリセリン濃度を20％に調整す
る。

次に、この調製溶液を、リットマン（Litman,R.N.,J.
Biol.Chem.,243,6222〜6233,1969）の方法に従って変性
仔牛胸腺DNA（ワシントン社製）を用いて作成したDNAセ
ルロースカラムに通す。更に、カラムを、前述のPC溶液
で十分に洗浄した後、0.6〜0.7M KCl−PC溶液（20容量
％グリセリン）を用い、吸着したDNAポリメラーゼβを
カラムから溶出させる。このとき、DNAポリメラーゼβ
活性と蛋白質の一致した単一ピークを得ることができ、
この単一ピークのある画分を回収し、DNAポリメラーゼ
βの精製品を得ることができる。この精製品を安定に保
存するためには、グリセリンを50％となるように加えて
−20℃に保つのが良い。

なお、得られた精製品は必要に応じて更に以下のよう
なゲルろ過法およびアフィニティークロマトグラフィー
を組合せた過程で処理しても良い。

例えば、セファデックスG 150を詰めたカラムを作成
し、これを0.15M KCl−PC溶液で平衡化した後、上記の
第３の主要過程後に得られた精製品をカラムにのせ、こ
れを0.15M KCl−PC溶液で溶出させ、溶出液を分取し、
各画分のDNAポリメラーゼβ活性を測定する。次に、高
いDNAポリメラーゼβ活性を示す画分を集めこれをDNAセ
ルロースカラムにかける。更に0.15M KCl−PC溶液で充
分洗浄した後、カラムに吸着した成分を15mlの0.15−0.
7M KCl直線濃度勾配（PC溶液中）を用いて溶出させ、高
いDNAポリメラーゼβ活性を示す画分を集めこれを精製
品とする。なお、DNAポリメラーゼβを約0.4M KCl濃度
で溶出することができる。

このようにして得られる精製品は、均一なDNAポリメ
ラーゼβを含み、天然のものと同様の酵素活性を有し、
かつその比活性は天然のものと同様に十分高いものであ
る。

〔実施例〕

以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではなく、種々の
態様を取り得る。

実施例１ （第１図に示した工程に従ったラットpol−β発現用プ
ラスミドの作製） （１）ラットpol−β構造遺伝子の前半部分の調製 ［第１図に（ａ）で示した工程］ まず、A.Matsukageらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,Vol.83,pp.5106,July 1986）に従って得たラットpol
−βのＮ−末端側半分をコードするDNA配列（開始コド
ンから９塩基、すなわち３アミノ酸残基に相当する欠損
部分を有する）を含むcDNAを有するプラスミドpUC9−10
Fの10μｇを制限酵素EcoRIで切断した。

なお、本実施例で用いた制限酵素、T₄ライゲース及び
T₄カイネースはいずれも日本ジーン社製のものであり、
これらを用いた反応は特に指示されていない場合はすべ
て常法に従って行なった。

また、該プラスミドにおける上記のラットpol−βの
Ｎ−末端側半分をコードするDNA配列における欠損部分
は、先に述べたような過程を経て本発明者らによって特
定されたものである。

次に、反応が終了したところで、反応液を0.6％低ゲ
ル化温度アガロースゲル（BRL社製、LMPアガロース）電
気泳動にかけて440bpのフラグメントを分離した後、こ
の440bpのフラグメント含むゲル部分を切出し、これを
プラスチックチューブ内に移して65℃に加熱して融解さ
せたところで、チューブ内にその容積の1/3程度のTE緩
衝液（10mM Tris−HCl、pH8.0、1mM EDTA）飽和フェノ
ールを加えてよく振り、更に12,000rpm、５分の遠心分
離で処理して水相を得た。この得られた水相から３回の
エーテル処理によって残留のフェノールを取り除き、更
にエタノール沈澱によってDNAを回収した。

これとは別に、pUC 118ベクター（宝酒造社製）の３
μｇを制限酵素EcoRIで完全に切断し、アルカリフォス
ファターゼ（ベリンガーマンハイム社製）で処理してお
いた。

次に、EcoRIで切断した線状pUC 118の１μｇと先に回
収した440bpのDNAフラグメントとを、T₄ライゲース（50
0単位）の存在下で室温で２時間反応させた。

反応終了後、反応物の一部をカルシウム法によって大
腸菌MV1304株（宝酒造社製）に導入し、これを以下の組
成のＬ−brothで培養した後、形質転換株をアンピシリ
ン（50μg/ml）プレート［Ｌ−brothに1.5％の寒天（バ
クトアガー、ディフコ社製）を加え、これにアンピシリ
ン（明治製菓製）を加えて調製したもの］で選別した。

Ｌ−broth組成； バクトトリプトン（ディフコ社製） 10g イーストエキストラクト（ディフコ社製） 5g NaCl 5g ブドウ糖 1g 水 １ アンピシリン耐性を示したコロニーから12のコロニー
を選別し、これらを個々に1.5mlの上記組成のＬ−broth
で振とう培養し、培養細胞からミニライセートを調製
し、それを制限酵素Hind III及びXh₀ Iとで切断したも
のと、Hind III及びBgl IIで切断したのの両方を作成
し、これらを個々に１％アガロース電気泳動にかけて、
形質転換株中に含まれるプラスミドの構成を検討した。

その結果から、第２図に示すようにプラスミドpUC9−
10F由来のラットpol−β遺伝子の一部を含むDNAフラグ
メント（440bp）が、β−ガラクトシダーゼ（β−gal）
遺伝子と同方向に挿入されているプラスミドを含む３つ
のコロニー（＃７、＃８、＃９）を選別した。

（２）一本鎖DNAの調製 上記（１）項で選別した３つのコロニー＃７、＃８、
＃９を個々に、以下の組成の2XYT培地にアンピシリンを
50μg/mlの割合で加えた培地で振とう培養し、それぞれ
の培養において、0D₆₀₀＝0.1程度の菌体濃度が得られた
ところで、それぞれの培養液に１×10⁹p.f.uのヘルパー
ファージM13K07（宝酒造社製）を加え、更に１晩振とう
培養を続けた。

2XYT培地組成； バクトトリプトン（ディフコ社製） 32g イーストエキストラクト（ディフコ社製） 20g NaCl 10g 水 １ 培養終了後、各培養液から遠心分離（12,000rpm、10
分間）によって菌体を除き、得られた各上清にNaCl 0.3
g及びポリエチレングリコール6000（商品名、和光純薬
社製）0.2gを加え、４℃で２時間放置し、ファージ粒子
を凝集させた。

次に、各上清中で凝集したファージ粒子を遠心分離
（12,000rpm、10分間）によって集め、それぞれ300μ
のTE緩衝液に懸濁した後、この懸濁液の各々に200μ
のフェノール：クロロフォルム混液（1:1）を加え、よ
く振って脱タンパク処理を行ない、更にエーテル処理を
３回行ない、懸濁液中から残留フェノールを除き、最後
にエタノール沈殿処理により、精製物を得た。なお、こ
の精製物の収量は、各懸濁液で4.5μｇであった。

この精製物をアガロースゲル電気泳動にかけたとこ
ろ、前記第（１）項で得たプラスミドpUC9−10F由来の
ラットpol−β遺伝子の一部を含むDNAフラグメント（44
0bp）が、β−ガラクトシダーゼ（β−gal）遺伝子と同
方向に挿入されているプラスミドの片方の鎖からなる一
本鎖DNAであることが確認された。

（３）オリゴデオキシヌクレオチドを用いた突然変異誘
発［第１図に（ｂ）で示した工程］ 上記（２）項で得た一本鎖DNAは前記（１）項で得た4
40bpのDNAフラグメントのラットpol−βのＮ−末端側半
分をコードするDNA配列の開始コドンから９塩基、すな
わち３アミノ酸残基に相当する欠損部分をそのまま有し
ている。

そこで、この欠損部分を以下のようにして補填した。

まず、第３図（ｃ）に示すような上記の欠損部分に相
当するDNA配列と、かつその両側に位置するβ−gal遺伝
子の開始コドンより上流の部分と相補性を示すDNA配列
と、ラットpol−β遺伝子の上記欠損部分（開始コドン
を含む９塩基からなる）より下流の部分と相補性を示す
DNA配列とからなるオリゴデオキシヌクレオチド（30塩
基）を、日本ゼオンgenetを用いて合成した。

次に、このオリゴデオキシヌクレオチドの５′側をリ
ン酸化した。このリン酸化は、35ngのオリゴデオキシヌ
クレオチドとT₄カイネース（ベーリンガーマンハイム社
製）16単位とを50mM tris−HCl、pH7.9、6mM MgCl₂、1
0mM β−メルカプトエタノール、0.5mM ATPを含む水溶
液中（10μ）で反応させ（37℃、30分間）、100℃、3
0秒の熱処理によってT₄カイネースを失活させて反応を
終了させることによって行なった。

反応終了後、反応液の２μ（リン酸化オリゴデオキ
シヌクレオチド7ng含む）と、前記（２）項で得たコロ
ニー＃８由来の一本鎖DNAの0.9μｇを含む上述組成のTE
緩衝液２μとを混合し、更にこれにアニール用緩衝液
を加えて全体を10μとし、これをキャピラリーに封入
した。なお、アニール用緩衝液の組成（最終濃度）は、
30mM Tris−HCl、pH7.9、6mM MgCl₂、120mM NaCl、10m
M β−メルカプトエタノールであった。

次に、キャピラリーに封入した反応液をまず100℃、
１分間の条件で加熱処理し、次に、温度を60℃に低下さ
せてから、３時間かけて28℃まで除冷した。

更に、キャピラリーを開封し、反応液を取出し、これ
に10mM dATP、dGTP、dCTP、TTPを含む水溶液（吉富製薬
製）の0.8μ、10mM ATPを含む水溶液（シグマ社製）
の0.8μ、４単位のクレノウ酵素（ベーリンガーマン
ハイム社製）及び5000単位のT₄ライゲースを加え、28℃
で２時間これらを反応させた。

反応は、反応液にフェノール−クロロホルム混液（1:
1）を加えることによって終了させた。

反応終了後、反応液のエーテル処理を３回行ない、そ
の一部を大腸菌HB101（UCLA分子生物学研究所Dr.Dan S
Rayより入手）に塩化カルシウム法によって導入した。

なお、以上の操作を前記（２）項で得たコロニー＃８
由来の一本鎖DNAの代りにコロニー＃９由来の一本鎖DNA
を用いて同様にして用いて行ない、最終的に得られた反
応液を大腸菌HB101に塩化カルシウム法によって導入し
た。

（４）組み換え体の検出 前記（３）項で反応液を導入した２種の大腸菌HB101
を、個々に前記Ｌ−broth培地で培養し、更に、前記項
で用いたアンピシリンプレートでアンピシリン耐性を示
すコロニーを選別した。

次に選別した各コロニーのうち。所望とするラットpo
l−βのＮ−末端側半分をコードするDNA配列を含むプラ
スミドを有するものを、以下に示すコロニーハイブリダ
イゼーション法によって選別した。

すなわち、まずフィルター（ミリポア社製、HAタイ
プ、0.45μｍ、直径82mm）をアンピシリンプレート上に
置き、プレート上のコロニーから菌体をフィルター上に
移し取り、各コロニーからの菌体が吸着した面を上にし
つつ、以下に示す溶液をしみ込ませたろ紙上に所定時間
置いた。

１） 0.5N NaOHで７分間 ２） 0.5M Trs−HCl、pH7.4で２分間 ３） 0.5M Trs−HCl、pH7.4で更に２分間 ４） 1.5M NaClを含む0.5M Trs−HCl、pH7.4で５分間 次に、４）の溶液50mlをフィルターに通し、更に50ml
のクロロホルムをフィルターに通した後、フィルターを
乾燥させ、更に80℃、1.5時間、真空中でのベイキング
を行ない、DNAを固定した。

DNAを固定したフィルターは、×10 Denhardt液（×1
Denhardt液:0.02％ポリビニルピロリドン、0.02％Ficol
l 400、0.02％牛血清アルブミン）、100μg/mlの変性サ
ケ精子DNA、×4 SSC（×1 SSC:0.15M塩化ナトリウム、
0.015Mクエン酸三ナトリウム、塩酸でpH7.4に調整）、
0.5％Triton X−100に浸し、65℃、２時間のプレハイブ
リダイゼーションを行なった後、液を抜取り、更に、（
³²P−γ）ATP 10μCiで標識した前記（３）項で用いた
オリゴデオキシヌクレオチドと同様の塩基配列を有する
プローブとしての合成オリゴデオキシヌクレオチド30ng
を含む×4 SSC、×10 Denhardt液、0.5％Triton X−100
（総量2ml）に浸し、58℃、10時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。

反応終了後、フィルターに60mlの50℃、×1 SSC、５
分間の洗浄処理を３回行なった後、乾燥させ、Ｘ線フィ
ルム（富士デンタルパノラマ NIFタイプ）に露出した。

その結果、＃８由来の反応液を導入したコロニーでア
ンピシリン耐性を示したもののうち、約15％が、また＃
９由来の反応液を導入したコロニーでアンピシリン耐性
を示したもののうち、約30％がプローブに強く結合する
DNAを有していることが判明した。

ここでポジティブな反応を示したDNAの起源となった
コロニーは、なお変異型（前記欠損部分が補われたも
の）とともに非変異型（前記欠損部分が補われていない
もの）が残存している可能性があるので、ポジティブな
反応を示したDNAの起源となったコロニーに変異型があ
るのを確かめた上、該コロニーからプラスミドを分離し
て、それにより再度大腸菌を導入し、変異型のみを持つ
株を選択する必要がある。

そこで、＃８由来の反応液を導入したコロニーでアン
ピシリン耐性を示し、かつポジティブな反応を示したも
のから９個、＃９由来の反応液を導入したコロニーでア
ンピシリン耐性を示し、かつポジティブな反応を示した
ものから４個のコロニーを選択し、それぞれを1.5mlの
前述のＬ−brothで14時間、振とう培養し、それぞれか
らミニライセートを常法により調製し、それぞれEcoRI
で切断し、１％アガロース電気泳動にかけた。

なお、これに際しては、第１図に（ｂ）で表した過程
前後のプラスミドの構成に示されているようにEcoRI切
断部位（RI）が２ヶ所あるが、変異型ではそれが１ヶ所
に減っているので、これらを容易に検出できる。

変異型を比較的多く含む＃８由来の反応液を導入した
コロニー（＃８−２、＃８−７）及び＃９由来の反応液
を導入したコロニー（＃９−12）を選別し、それらから
常法に従って得た各ミニライセートを次に、JM 109に個
々に導入して、それらを培養し、その中から形質転換株
をアンピシリンプレート上で選択した。

得られた形質転換株＃８−７−７及び＃９−12−16を
300mlの前述のＬ−brothで大量に培養し、得られた菌体
からDNAを精製した（＃８−７−７から120μｇ、＃９−
12−16から60μｇ）。

この精製DNAを、制限酵素処理して、その制限酵素地
図を作り解析したところ、pUC118のlac遺伝子のプロモ
ーターとオペレーター、シャイン・ダルガーノ（SD）配
列（リボゾーム結合部位）の下流に、外来遺伝子である
ラットpol−β遺伝子の前半部分（開始コドンから構造
遺伝子のほぼ中央のEcoRI切断部位までを含む）をlac遺
伝子の最初の遺伝子（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）の
開始コドンに合せて挿入したプラスミドが含まれている
ことが確認された。

（５）pUC−10フラグメントの導入 ［第１図（ｃ）で示した工程］ 前記（４）項で得た＃８−７−７及び＃９−12−16か
ら得た精製DNAの各々１μｇを制限酵素EcoRIで切断し、
更にフォスファターゼ処理を行なった。

次に、前記（１）項に引用した本発明者の一人である
松影及びZmudzkaらの文献に記載の方法によりpUC9−10S
を調製し、これから前記（１）項で述べたと同様の手順
で、pUC9−10SのEcoRI切断フラグメント（770bp）の0.2
μｇを得た。

ここで、先にフォスファターゼ処理した精製DNAと、
上記フラグメント（770bp）を、前記（１）項と同様の
手順で、T₄ラレイゲースにより連結した。

得られた反応物のそれぞれを、大腸菌JM 109株（宝酒
造社製）に導入し、これを培養してから、アンピシリン
プレート上で形質転換株を選択した。

アンピシリン耐性を示したコロニーからそれぞれ12個
ずつ計24個を採取し、それぞれを前述のＬ−broth（1.5
ml）で培養し、常法に従って各培養菌体からミニライセ
ートを調製した。得られた各ミニライセートをEcoRIで
切断し、前記（１）項と同様の方法によってpUC9−10S
のEcoI切断フラグメント（770bp）の有無を調べた。

その結果をもとに、フラグメント（770bp）を有する
コロニーを、＃８−７−７由来のDNAを用いて調製され
た反応物で形質転換されたコロニーから６個、＃９−12
−16由来のDNAを用いて調製された反応物で形質転換さ
れたコロニーから６個取り出し、それぞれを更に上記と
同様にして培養した後、各培養菌体からミニライセート
を調製して、前記（１）項と同様の方法でフラグメント
（770bp）の挿入方向を検討した。

その結果、＃８−７−７由来のDNAを用いて調製され
た反応物で形質転換されたコロニーのうちの４個（＃８
−７−７−２、＃８−７−７−５〜−７）に、また＃９
−12−16由来のDNAを用いて調製された反応物で形質転
換されたコロニーのうちの１つ（＃９−12−16−23）に
所望の挿入方向でフラグメント（770bp）が挿入された
組換え体（第１図）が存在することが確認された。

（６）大腸菌を宿主としたラットpol−βの発現 前記（５）項で得た所望の組み換え体を含む株＃８−
７−７−２、＃８−７−７−５〜−７及び＃９−12−16
−23のそれぞれを1.5mlのアンピシリン（50μ/ml）を含
む前述の2XYT培地で培養し、OD₆₀₀＝0.2程度の菌体濃度
が得られたところで、各培養液0.1MIPTG（イソプロピル
β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド、シグマ社製）を15
μ加え、更に１晩振とう培養を続けた。

得られた各培養液（菌体を含む）の200μに、50％T
CA（トリクロロ酢酸）の22μを加えてから、これを1
5,000rpm、３分間の遠心分離処理し、上清を除去して、
更に沈殿物に約0.5mlのアセトンを加え、遠心分離（15,
000rpm、３分間）にかけ、上清を除去して沈殿物中の残
留TCAを取り除いた。

得られた各沈殿物の30μを、0.0625M Tris−HCl 5
％ β−メルカプトエタノール、２％SDS、10％グリセ
ロール、0.1％ブロモフェノールブルーからなる溶液に
溶かし、その半分をSDSゲル電気泳動による解析に用い
た。

その結果、これらの形質転換株から40KDaの蛋白質の
生産が確認された。

なお、前記（５）項で得られたフラグメント（770b
p）が逆方向に挿入されたプラスミドを含むコロニーを
上記と同様の操作によって培養し、その培養液を処理し
て蛋白質の解析を行なったところ、SDSゲル電気泳動で
は、宿主由来の極薄いバンドしか認められなかった。

更に、40KDa蛋白質の生産の経時的変化を調べてみた
ところ、IPTGの添加による誘導後、約６時間でほぼ最高
の生産が行なわれることが確認された。

また、IPTGの添加の有無による細胞増殖速度について
検討したところ、これらにはほとんど差はなく、生産さ
れた40KDa蛋白質が細胞に無害であることが確認され
た。

このようにして得た40KDa蛋白質を生産する形質転換
株のうちからその生産量の多い２つの株（＃８−７−７
−５、＃８−７−７−６）を選択し、それらを個々に培
養して、各培養菌体から常法によりプラスミドを調製し
た。これらのプラスミドのDNA配列について、マキサム
・ギルバート法によって解析した結果、pUC118lac遺伝
子のプロモーターとオペレーター、シャイン・ダルガー
ノ配列（リボゾーム結合部位）の下流で、β−ガラクト
シターゼ遺伝子）の開始コドンが存在していた位置か
ら、ラットpol−βをコードする第4A図〜第4C図に示す
ような塩基配列の構造遺伝子［1008bp（終止コドン１つ
を含む）からなり、335個のアミノ酸残基からなる配列
を有するラットpol−βをコードする］がその開始コド
ンから挿入されたプラスミドを有していることが判明し
た。

これらのプラスミドをそれぞれpUC118pol−β−５及
びpUC118pol−β−６と命名した。

実施例２ （組換え体pUC118pol−β−５を用いたラットpol−βの
生産とその精製） （１）組み換え体pUC118pol−β−５を導入した形質転
換株の培養 実施例１の（６）項で得た形質転換株＃８−７−７−
５（JMpβ５）を50μg/mlのアンピシリンを含む実施例
１で用いた2XYT培地１中で、37℃の条件で振とう培養
した。

600nmの吸光分析で吸光度が0.5程度であるような菌体
濃度が得られたところで、培養液を２分し、一方にIPTG
を0.5mMの濃度となるように加え、更にこれらを７時間
培養した。

培養終了後菌体を遠心分離によって集菌した。得られ
た菌体量はともに約3g/1培養液であった。

このようにして得た菌体を個々に１％SDS、５％２−
メルカプトエタノールを含むSDSゲル電気泳動用サンプ
ル液に懸濁し、100℃、２分間加熱処理して、完全に可
溶化した後、これをSDS−ポリアクリルアミド電気泳動
にかけた。

その結果、IPTGの添加、無添加の両方において、40KD
aのポリペプチドが大量に検出され、またIPTGを添加し
た方がその量が多かった。このIPTG添加培養で得られた
菌体の全蛋白質量に対する40KDaのポリペプチドの割合
を調べたところ、全蛋白質の19.3％に達した。なお、場
合によっては菌体が成長飽和（定常）状態に達した場
合、IPTGを加えなくても最大この19.3％近くのpol−β
の生産が行なわれた。

この40KDaのポリペプチドのサイズは、ラットやニワ
トリ等のpol−βと一致していた。

なお、参考のため、実施例１の（１）項に引用したZm
udzkaらの方法によって得た、pol−β構造遺伝子に前述
の欠損部分を有するプラスミドを大腸菌JM109に導入
し、形質転換株JM pβ２−１を得、それを上記と同様に
して培養し、得られた菌体の蛋白質を分析した。

その結果、上記JMpβ５の培養で認められたような40K
Daのポリペプチドは見い出されなかった。

これとは別に、大腸菌JM109を上記と同様にして培養
し、得られた菌体の蛋白質を分析した。

その結果、この培養においても上記JMpβ５の培養で
認められたような40KDaのポリペプチド見い出されなか
った。

（２）菌体抽出液の調製と、該抽出液中のpol−β活性
の測定 上記（１）で得た菌体のそれぞれを個々に以下のよう
にして処理した。

まず、菌体を、TME（10mM MgCl₂、1mM EDTA、を含む5
0mM Tris−HCl緩衝液、pH7.6）で洗浄した後、−80℃で
保存した。

次に、菌体の５倍量の抽出用液体［50mM Tris−HCl、
pH7.6、0.1mM EDTA、1mMジチオスレイトール（DTT）、1
0％グリセリン、0.5M KCl、1mM フェニルメチルスルフ
ォニルフロライド（PMSF）］に懸濁し、この溶液に超音
波を１分間かけ、細胞を破壊し、更に遠心分離（12000
g、20分間）で処理し沈殿物を除去し、細胞の粗抽出液
を得た。

次に、得られた２種の粗抽出液のpol−β活性を、本
発明者である山口らの方法（J.Biol.Chem.255、9942〜9
948、1980年）により測定した。なお、ここでの１単位
の活性は、１時間に1nmolのdNTPを重合させる酵素量と
して定義した。

その結果を表１に示す。なお、参考のため前記（１）
で培養したJMp β１−２と大腸菌JM109を用いて上記と
同様にして粗抽出液を調製して、そのpol−βの活性を
測定した（表１）。

この結果、IPTGで誘導したJMpβ５で特に高い活性が
得られ、それはJM109の約20倍に達した。

なお、JM109の活性の大部分は、DNAポリメラーゼＩと
考えられる。

JMpβ５の比活性を40KDaポリペプチド当りに換算する
と、６×10⁵単位/mg蛋白質となった。

（３）粗抽出液からのpol−βの精製とその性質の検定 前記（２）項で得た２種の粗抽出液をそれぞれ個々に
用いて以下の処理を行なった。

まず、粗抽出液に、PC溶液（0.1mM EDTA、1mM DTT、1
0％グリセリンを含む50mM Tris−HCl緩衝液、pH7.6）を
加えて1.5倍程度に希釈した。

希釈した粗抽出液のKCl濃度を0.4Mに、調整してか
ら、これをDEAEセルロース（ファルマシア社製）を詰た
カラムに通し、希釈粗抽出液中に含まれる核酸成分を、
DEAセルロースに吸着させて、該希釈粗抽出液から除去
した。

カラムに未吸着であった画分（ラットpol−β）に、
上記組成のPC溶液を加えて２〜３倍に希釈し、更にKCl
濃度を0.2Mに調整した。

次に、リン酸セルロース（シグマ社製）を詰たカラム
を0.2M KClを含むPC溶液で処理してリン酸セルロース
を平衡化した後、上記のようにして得た調整溶液を、こ
れに通し、更に0.2M KClを含むPC溶液でカラムを十分
に洗浄した。

この操作で、本発明のラットpol−β DNAポリメラー
ゼの大部分はカラムに吸着した。なお、この段階で、宿
主細胞に由来するDNAポリメラーゼＩ等はカラムに未吸
着となるため、溶出してしまい、これらと所望のラット
pol−βと分離することができる。

カラム内に吸着した蛋白質は、0.2〜0.7MKClの直線濃
度勾配を用いて溶出させることができ、約0.4M KCl付
近でラットpol−β活性の単一ピークを得た。そこで、
このラットpol−β活性の高い画分を集め、これを上記
組成のPC溶液で希釈し、更にそのKCl濃度を0.15Mに、ま
たグリセリン濃度を20％に調整した。

次に、この調整溶液を、変性仔牛胸腺DNA（ワシント
ン社製）を用い、前述のリットマンの方法に従って作成
したDNAセルロースカラムに通した。カラムを、PC溶液
で十分に洗浄した後、0.6MKCl−PC溶液（20％グリセリ
ン）を用い、吸着したラットpol−βをカラムから溶出
させた。このとき、ラットpol−β活性と蛋白質の一致
した単一ピークを得ることができ、この単一ピークのあ
る画分を吸収して、DNAポリメラーゼの精製品を得るこ
とができた。

以上の精製操作を各段階における含有蛋白質を10％ゲ
ルとLaemmli,U.K.,Nature,227,680〜685,1970、トリス
緩衝液）の溶媒系を用いたSDSポリアクリルアミド電気
泳動で追跡したところ、粗抽出液段階では40KDaに相当
するバンドを含む主要な６個の濃いバンドが、DEAEセル
ロース処理段階では40KDaに相当するバンドを含む主要
な６個の濃いバンドが、リン酸セルロースでの処理段階
では40KDaに相当する濃い単一のバンドが、DNAセルロー
スでの処理段階では40KDaに相当する濃い単一のバンド
がそれぞれ得られた。なお、この結果は２種の粗抽出液
の両方の場合について同じであった。

また、最終的に得られた各精製品は、ポリアクリルア
ミド電気泳動で単一のバンド（40KDa）を示し、そのpol
−β比活性を前記（２）項に記載の方法によって測定し
たところ、7.5×10⁵単位/mgであった。

一方、セファデックスG 150を詰めたカラム（1.5×50
cm）を作成し、これを0.15M KCl−PC溶液で平衡化した
後、先のDNAセルロースカラムによる処理後に得られた
精製品（0.7M KCl−PC溶液で溶出させた画分）をカラム
にのせ、これを0.15M KCl−PC溶液で溶出させ、溶出液
を分取し、各画分のpol−β活性を測定した。次に、高
いpol−β活性を示す画分を集めこれを更にDNAセルロー
スカラム（0.6×5cm）にかけ、0.15M KCl−PC溶液で充
分洗浄した後、カラムに吸着した成分を15mlの0.15−0.
7M KCl直線濃度勾配（PC溶液中）を用いて溶出させ、高
いpol−β活性を示す画分を集めこれを精製品とした。
なお、pol−βは約0.4M KCl濃度で溶出された。このよ
うにして得られた精製品におけるpol−βの純度は98〜9
9％と非常に高いものであった。

なお、ラット細胞から直接抽出精製したpol−βと上
記精製品のポリアクリルアミド電気泳動の結果を比較し
たところ、ともに40KDaのサイズを有し、これらに差は
認められなかった。

次に、イムノウエスタン法によって、精製品を分析し
た。

まず、先に述べた精製品のSDSポリアクリルアミド電
気泳動で得られた、40KDaのバンドに含まれる淡白質
を、ブロッティング装置（Bio−rad社製）を用い、ニト
ロセルロース膜上に移した。次に、25mM Tris/192mMグ
リシン、pH8.3、20％メタノールからなるブロッティン
グ溶液中で、2,000V、15時間のブロッティングを行なっ
た。

更に、膜を20％牛胎児血清を含むTBS（50mM Tris−HC
l、pH8.3、150mM NaCl）でブロックした後、500倍に希
釈した。

ここで、抗ニワトリpol−βウサギ抗体を、室温で２
時間反応させ、更に２次抗体である、ペルオキシダーゼ
結合抗ウサギIgG抗体（ヤギ）と反応させた（室温、２
時間）。

最後に、膜を洗浄した後、0.05％ 4−クロルナフトー
ル、0.015％のH₂O₂、16.5％のメタノールを含むTBSにつ
け、発色反応により抗原ポリペプチドを同定した。

その結果、精製品から得られたポリペプチドは、抗ニ
ワトリpol−βウサギ抗体と交叉した。

以上の結果から、得られた精製品は、ラットpol−β
活性を有するものであることが確認された。また、更
に、この精製品の酵素活性は天然のものと同様であり、
その比活性も天然のものと同様十分に高いものであるこ
とが確認された。

次に、得られた精製品のヌクレアーゼ活性を以下の方
法に従って測定した。

まず、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性測定のた
め、プラスミドpM1−１（本発明者らが自製したもの）
を制限酵素Hind III、Scl Iで切断し、アガロース電気
泳動で2347bpの断片を得て、その３′−末端を³²P−dCT
Pとクレノウ酵素を用いて標識した。

次に10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl₂、20mM NaC
l、7mM 2−メルカプトエタノール、100μg/mlゼラチ
ン、10⁵cpmの標識DNA及び60〜75単位の精製品からなる
反応液を50μ調製し、37℃で反応を進行させた。

反応の進行とともに経時的にサンプリング（10μ）
して、0.5％アルガロースゲル電気泳動とオートラジオ
グラムとで分析し、標識DNA断片からの³²Pの減少により
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を測定した。

その結果、精製品においては３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性は認められなかった。

なお同様の測定をクレノウ酵素を用いて行なったとこ
ろ活性が認められた。

更に、精製品のエンドヌクレアーゼ活性をプラスミド
pUS19 DNAの閉環状DNA（Ｉ型）がDNA鎖切断により開環
状（II型）に変換するかどうかによって測定した。

すなわち、標識DNA断片の代りに２μｇのpUC19（宝酒
造社製）DNA［80〜90％が（Ｉ型）］を用い、また酵素
量を80〜120単位とする以外は、上記エキソヌクレアー
ゼ活性の測定における反応液と同様の組成の反応液を調
製し、これを37℃に保温して反応を進行させ、経時的に
サンプリングして、0.6％アガロースゲル電気泳動にか
け、エチジウムブロマイドで染色し、Ｉ型の減少及びII
型の増加があるかどうかを追跡した。

その結果、本実施例で得られ精製品においてはエンド
ヌクレアーゼ活性は認められなかった。同様の測定をク
レノウ酵素についても行なったところ同様に活性は認め
られなかった。

〔発明の効果〕

本発明によって、DNA合成酵素活性が高く、ヌクレア
ーゼ活性のない動物細胞由来のDNAポリメラーゼβをコ
ードするDNA配列がクローン化され、更にそれを適当な
ベクターとともにプラスミド中に組換え、大腸菌等の宿
主細胞内に導入して発現させることによって、例えば20
％という高い収率での該DNAポリメラーゼβの生産が可
能となった。

また、本発明によって、宿主細胞に生産させたDNAポ
リメラーゼβを、宿主細胞の培養系から純粋な形で収率
良く分離精製することが可能となり、純粋なDNAポリメ
ラーゼβの大量生産が可能となった。

なかでも、動物細胞由来のDNAポリメラーゼβの例と
して、本発明者らはニワトリ、ラット、ヒトなどに由来
するものを検討し、ラットのアミノ酸配列は、ヒトのそ
れと95％の相同性を有していることから、まずラットDN
Aポリメラーゼβ遺伝子のクローン化と工学的手法によ
るその発現を企て、そしてそれに成功した。しかも、そ
こで得られたラットDNAポリメラーゼβは、均一であ
り、その酵素活性は十分に高いものであった。この結果
は、更に、本発明によればラット以外のニワトリ、ヒト
などのDNAポリメラーゼの工学的手法による宿主細胞中
での発現と、該DNAポリメラーゼの純粋な形での大量生
産が可能となることを裏付けている。

一方、従来より繁用されている大腸菌由来のDNAポリ
メラーゼＩやクレノウ酵素がヌクレアーゼ活性を持つの
に対して、本発明により得られたDNAポリメラーゼβに
はヌクレアーゼ活性がない。従って、本発明により得ら
れたDNAポリメラーゼを用いたDNA合成では、３′末端を
完成することができるので、ヌクレアーゼ活性を必要と
しない、あるいはヌクレアーゼ活性を所望しないDNA合
成に直接使用でき、かつ純粋な形で大量生産可能である
ので、DNAポリメラーゼβに対する拡大しつつある需要
に十分対応できるものである。

また、本発明により得られたDNAポリメラーゼβは、
例えば、 ａ）DNAシークエンシングなどの組換え用としての、ま
た ｂ）DNA上の任意の場所に突然変異を起させる、いわゆ
る部位特異的突然変異誘発の際に、二重鎖を形成させる
反応用としての 酵素剤の成分として有用であるなど、多目的なタンパク
工学用に広く使用可能である。

更に、本発明のDANポリメラーゼβをコードするDNA配
列の組込んだDNAポリメラーゼβ発現用の組換え体に、
一体鎖DNAとすることが可能なベクターを用いた場合、
ただちに部位特異的突然変異部分を含む合成オリゴヌク
レオチドプライマーと結合できるので、ミスマッチプラ
イマー法により目的とする置換、挿入、削除等の操作の
入った塩基配列の二重鎖DNAが得られ、これを適当な宿
主に導入して、新たな生理活性を有するタンパク質を更
に発現させることが可能となる。

また、本発明によってDNAポリメラーゼβが大量に生
産され、例えばエームステストとは異なるinvitroでの
変異原性試験に用いる試薬として有効に利用できる。

なお、変異原物質による鋳型DNAに対する相補DNAの合
成の際の読み誤りを、大腸菌−バクテリオファージの系
でファージの突然変異として検出するこの試験法は、エ
ームステストと異なり、変異のメカニズムをも明らかと
することができる上、感度が遥かに高いという利点があ
る。そこで、本発明は、このような有用な試験の普及に
今後貢献できるものである。

更に、本発明によって、動物疾患の診断薬若しくは治
療剤等の用途における需要に対応するDNAポリメラーゼ
βの大量生産が可能となった。

他方、現在皮膚でのうっ血にDNA分解酵素であるDNAア
ーゼＩが効果があり、実際にその治療に用いられている
ことなどから、逆に種々の疾患の発現機序にDNA合成酵
素であるDNAポリメラーゼが関与していたり、また例え
ば遺伝病等の種々の疾患の治療にDNAポリメラーゼが有
効であることが今後発見されてくる可能性があり、それ
らの疾患の診断や治療の際には、ヒトDNAポリメラーゼ
が量的に生産確保されることが必須であり、本発明によ
ってそのような需要に十分対応できる技術が提供され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のDNAポリメラーゼβ発現用プラスミ
ドの構築過程を示した図、第２図は本発明の実施例１の
（１）項で得たプラスミドにおけるラットDNAポリメラ
ーゼβ遺伝子の一部からなるDNAフラグメントの挿入方
向を示した模式図、第３図は本発明における部位特異的
突然変異誘発過程を示した図、第4A図〜第4C図は本発明
の実施例１で得たラットDNAポリメラーゼβをコードす
るDNA配列における塩基配列及びそれによってコードさ
れるアミノ酸配列を示す図である。なおこれらの第4A図
〜第4C図は連続したもので１つの配列を示している。 また、これらの図中、P.はプロモーター、O.はオペレー
ター、SDはシャイン・ダルガーノ配列、MCSはマルチク
ローニングサイト（ポリリンカー部位）、Ｆは電気泳動
における移動速度の速い部分、Ｓはそれが遅い部分をそ
れぞれ示す。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下に示すアミノ酸配列をコードするDNA
   ポリメラーゼβ遺伝子。
2. 【請求項２】以下に示す塩基配列を有する特許請求の範
   囲第１項に記載のDNAポリメラーゼβ遺伝子。
3. 【請求項３】宿主中での複製を可能とする部分とプロモ
   ーターを含むベクターと、以下に示すアミノ酸配列をコ
   ードするDNAポリメラーゼβ遺伝子を有し、前記DNAポリ
   メラーゼβ遺伝子の発現が前記プロモーターにより制御
   される位置関係でこれらを結合させたことを特徴とする
   組換え体プラスミド。
4. 【請求項４】前記DNAポリメラーゼβ遺伝子が以下に示
   す塩基配列からなる特許請求の範囲第３項に記載の組換
   え体プラスミド。
5. 【請求項５】前記ベクターが、動物細胞中で機能するも
   のである特許請求の範囲第３項または第４項に記載の組
   換え体プラスミド。
6. 【請求項６】前記ベクターが、微生物中で機能するもの
   である特許請求の範囲第３項または第４項に記載の組換
   え体プラスミド。
7. 【請求項７】前記ベクターが、ファージを加えることに
   より１本鎖になる性質を有する特許請求の範囲第３項ま
   たは第４項に記載の組換え体プラスミド。
8. 【請求項８】前記ベクターが大腸菌で機能するものであ
   る特許請求の範囲第６項に記載の組換え体プラスミド。
9. 【請求項９】前記ベクターがプラスミドpUC118由来のDN
   Aフラグメントであり、前記プロモーターがラクトース
   オペロンのプロモーターである特許請求の範囲第８項に
   記載の組換え体プラスミド。
10. 【請求項１０】宿主を、組換え体プラスミドで形質転換
    して得られる形質転換体であって、前記組換え体プラス
    ミドが、前記宿主中での複製を可能とする部分とプロモ
    ーターを含むベクターと、以下に示すアミノ酸配列をコ
    ードするDNAポリメラーゼβ遺伝子を有し、前記DNAポリ
    メラーゼβ遺伝子の発現が前記プロモーターにより制御
    される位置関係でこれらを結合させたものであることを
    特徴とする形質転換体。
11. 【請求項１１】前記DNAポリメラーゼβ遺伝子が以下に
    示す塩基配列からなる特許請求の範囲第10項に記載の形
    質転換体。
12. 【請求項１２】前記宿主が、動物細胞である特許請求の
    範囲第10項または第11項に記載の形質転換体。
13. 【請求項１３】前記宿主が、微生物である特許請求の範
    囲第10項または第11項に記載の形質転換体。
14. 【請求項１４】前記ベクターが、ファージを加えること
    により１本鎖になる性質を有する特許請求の範囲第10項
    または第11項に記載の形質転換体。
15. 【請求項１５】前記宿主が大腸菌である特許請求の範囲
    第13項に記載の形質転換体。
16. 【請求項１６】前記ベクターがプラスミドpUC118由来の
    DNAフラグメントであり、前記プロモーターがラクトー
    スオペロンのプロモーターである特許請求の範囲第15項
    に記載の形質転換体。