JPH08131157A - マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ並びにこれら酵素の生産能を有するプレシオモナス属新菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なマルトースホスホリラーゼ及びトレハ
ロースホスホリラーゼを高い生産性で生成し得る新規微
生物、前記新規な酵素、並びにこれら酵素の製造方法の
提供。 【解決手段】 マルトースホスホリラーゼ及びトレハロ
ースホスホリラーゼ生産能を有し、プレシオモナス（Pl
esiomonas ）属に属する微生物（生命研条寄第５１４４
号）。この微生物から得られた新規なマルトースホスホ
リラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼ。上記微生物
を培養する前記酵素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な微生物、新
規な酵素及び新規な酵素の製造方法に関する。更に詳し
くは、トレハロースを酵素的に生産する場合に必要なマ
ルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラ
ーゼの生産能を有するプレシオモナス(Plesiomonas) 属
に属する新規微生物、この微生物から得られる新規なマ
ルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラ
ーゼ、並びにこれら酵素の製造方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】トレ
ハロースは、医薬、化粧品、食品などに広い用途が期待
されている物質である。そこで、トレハロースを工業的
に生産する多くの試みがなされてきた。これらの技術は
大別して三つに分類する事ができる。その一つはトレハ
ロースを菌体内に蓄積する性質を有する微生物から該物
質を抽出精製する方法である〔ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサエテー(J.Am.Chem.Soc.)72巻，
2059頁、1950年、ドイツ特許第２６６５８４号、特開平
３−１３００８４号、特開平５−９１８９０号、特開平
５−１８４３５３号、特開平５−２９２９８６号〕。こ
の方法は、微生物の培養工程、微生物の分離工程、微生
物からのトレハロースの抽出工程、抽出したトレハロー
スの精製結晶化工程から構成されており、製造工程が非
常に煩雑である。しかも、トレハロースの生産性も他の
方法に比較して少ないばかりでなく、多量の微生物抽出
残査が廃棄物として発生する事から経済的に効率の良い
方法とは言えなかった。

【０００３】また、他の方法として、トレハロースを菌
体外（培地中）に生産する微生物が検索され、ブレビバ
クテリウム(Brevibacterium)属やコリネバクテリウム(C
orynebacterium) 属等の微生物を培養してトレハロース
を菌体外（培地中）に生産させる発酵法が開発されてい
る〔特開平５−２１１８８２号〕。しかしながら、本方
法においてもトレハロースの培地中への蓄積率は約３％
（ｗ／ｖ）程度と低収率であることから工業的規模でト
レハロースを大量生産するためには大容量の発酵槽とそ
れに見合う精製設備が必要であり経済的に問題がある。
しかも、本方法においても精製したトレハロースを得る
ためには除菌操作が必要とされるばかりでなく、培養時
に使用菌株が生産するトレハロース以外の夾雑物あるい
は培地成分等の除去に煩雑な工程を必要としている。

【０００４】一方、これら発酵法の種々の問題点を一挙
に解決する方法として酵素法が既に開発されている。こ
れには、微生物由来のマルトースホスホリラーゼ(Malto
se:orthophosphate β-D-glucosyltransferase) と藻類
由来のトレハロースホスホリラーゼ( α, α-Trehalos
e:orthophosphate β-D-glucosyltransferase) を燐酸
存在下でマルトースに作用させてトレハロースを生産す
る方法（特許第１５１３５１７号、Agri.Biol.Chem.,49
巻, 2113頁, 1985年) 、および細菌由来のシュークロー
ズホスホリラーゼ(Sucrose:orthophosphate α-D-gluco
syltransferase)と担子菌由来のトレハロースホスホリ
ラーゼ( α, α-Trehalosep:orthophosphateα-D-gluco
syltransferase) を燐酸存在下で蔗糖に作用させてトレ
ハロースを得る方法（平成６年度日本農芸化学会大会講
演要旨集、３Ｒａ１４）とが報告されている。

【０００５】これらの方法によればマルトースあるいは
蔗糖から６０〜７０％の高い収率でトレハロースが生成
する事が報告されている。また、本方法は使用する原料
が精製された高純度の糖質であることから、酵素反応に
より得られるトレハロースの精製も容易であり、他の方
法に比較して工業的に有利な方法と考えられている。し
かしながら、これらの方法においても使用される酵素、
特に、トレハロースホスホリラーゼの供給源はユーグレ
ナやマイタケなどのように藻類や担子菌であり、これら
から酵素を生産するためには経済的な問題ばかりでなく
技術的にも困難な点があった。しかも、得られるトレハ
ロースホスホリラーゼやこれに組み合わせて用いられる
シュークローズホスホリラーゼやマルトースホスホリラ
ーゼはそれぞれの酵素の至適ｐＨ領域が大きく異なるた
めに組み合わせて使用する際のｐＨ管理が非常に困難で
あるばかりでなく、温度に対する安定性も非常に低く、
トレハロースの生成反応は２５〜３７℃程度の低温下で
しか行えなかった。このことは解放型の反応槽を用いて
行われる酵素反応時に雑菌汚染が起こることを示唆して
おり、これによる副次的な反応を防止するために厳密な
衛生管理を必要とする等の欠点を有している。さらに
は、これら公知の酵素を組み合わせて用いる場合、これ
らの酵素の有する基質濃度依存性の為に高濃度の原料が
使用出来なかった。この為、この方法も経済的に効率の
良い方法とは言えなかった。

【０００６】以上のことから、製造および精製が容易
で、高い熱安定性を有し、基質濃度依存性が無い新たな
マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリ
ラーゼを見出すことができれば、容易に且つ大量に入手
できるマルトースを原料として高収率でしかも容易に且
つ効率よくトレハロースを製造することができる。

【０００７】そこで、本発明の第一の目的は、上記の各
種条件を満足する新規な酵素、マルトースホスホリラー
ゼおよびトレハロースホスホリラーゼを高い生産効率で
生成し得る新規微生物を提供することにある。本発明の
第二の目的は、製造および精製が容易で、高い熱安定性
を有し、基質濃度依存性が無い新たなマルトースホスホ
リラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを提供する
ことにある。さらに本発明の第三の目的は、上記微生物
を用いて、上記２種類の酵素を簡単且つ高い収率で得る
製造方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的に
使用するためのマルトースホスホリラーゼおよびトレハ
ロースホスホリラーゼが具備すべきこれらの諸性質を有
する酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべくして広
く天然界を検索した。その結果、プレシオモナス属に属
する微生物が上記要件を備えた両酵素を著量生産するこ
とを見い出し、本発明を完成せしめたものである。

【０００９】即ち、本発明は、マルトースホスホリラー
ゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有し、プ
レシオモナス(Plesiomonas) 属に属する微生物、生命研
条寄第５１４４号に関する。

【００１０】さらに本発明は、以下に示す理化学的性質
を有するマルトースホスホリラーゼに関する。 （イ）作用：マルトース中のα−１，４−グルコピラノ
シド結合を燐酸存在下で可逆的に加燐酸分解し、グルコ
ースおよびβ−Ｄ−グルコース１−燐酸を生成する。 （ロ）基質特異性（分解反応）：マルトースに作用し、
他の二糖類に作用しない。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解反応の至適ｐ
Ｈは７．０〜７．５であり、合成反応の至適ｐＨは６．
０である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．
５〜７．０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性：ｐＨ６．０、１５分間の加
熱条件下では４５℃まで安定である。 （ホ）作用適温の範囲：５０℃近傍に分解反応の至適作
用温度を有し、合成反応の作用適温は５０〜５５℃であ
る。 （ヘ）失活条件：５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐ
Ｈ５．０および８．０で完全に失活する。また、ｐＨ
６．０、１５分間の処理では５５℃で完全に失活する。 （ト）阻害：銅、水銀、カドミウム、亜鉛、Ｎ−ブロモ
サクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエイト、
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムで阻害される。 （チ）アイソエレクトロフォーカシング法による等電
点：３．８ （リ）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子
量：約９２，０００（ゲル濾過法による分子量は約２０
０，０００であり、２ケのサブユニットから構成されて
いる）。

【００１１】さらに本発明は、以下に示す理化学的性質
を有するトレハロースホスホリラーゼに関する。 （イ）作用：トレハロース中のα−１，１−グルコピラ
ノシド結合を燐酸存在下で可逆的に加燐酸分解し、グル
コースおよびβ−Ｄ−グルコース１−燐酸を生成する。 （ロ）基質特異性（分解反応）：トレハロースに作用
し、他の二糖類に作用しない。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解および合成反
応の至適ｐＨは７．０である。５０℃、１０分間の加熱
条件下ではｐＨ６．０〜９．０の範囲内である。 （ニ）温度に対する安定性：ｐＨ７．０、１５分間の加
熱条件下では５０℃まで安定である。 （ホ）作用適温の範囲：分解反応及び、合成反応の作用
適温は５０〜５５℃である。 （ヘ）失活条件：５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐ
Ｈ５．０および９．５で完全に失活する。また、ｐＨ
７．０、１５分間の処理では５５℃で完全に失活する。 （ト）阻害：銅、水銀、カドミウム、亜鉛、Ｎ−ブロモ
サクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエイトで
阻害される。 （チ）アイソエレクトロフォーカシング法による等電
点：４．５ （リ）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子
量：約８８，０００（ゲル濾過法による分子量は約２０
０，０００であり、２ケのサブユニットから構成されて
いる）。

【００１２】加えて本発明は、前記プレシオモナス(Ple
siomonas) 属に属する本発明の微生物を培養し、前記本
発明のマルトースホスホリラーゼおよび前記本発明のト
レハロースホスホリラーゼの少なくとも１つを生成・蓄
積させ、これを採取することを特徴とするマルトースホ
スホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの製造
方法に関する。以下本発明について説明する。

【００１３】本発明の新規菌株は、本発明者等により静
岡県富士市田子の浦海岸の汚泥中から新たに単離された
ものである。この菌株は、バージェーズ・マニュアル・
オブ・デターミネイティブ・バクテオロジー(Bergey's
Mannual of Determinative Bacteriolgy) 、第８版、第
１巻に従って同定すると、単離した菌株の菌学的諸性質
を以下の表１に示しているように、プレシオモナス(Ple
seiomonas)属に属し、P.shigelloidesの類縁菌と同定さ
れた。しかしながら、ＶＰテストおよびウレアーゼテス
トが陽性であること、並びに、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトースを資
化出来ること、並びに、ｐＨ９のアルカリ性条件下でも
生育出来る点において記載内容と相違しており、しか
も、トレハロースホスホリラーゼとマルトースホスホリ
ラーゼの両酵素を菌体内および培地中（菌体外）に生成
・蓄積する点で既知菌株とは大幅に異なる。なお、上記
菌株プレシオモナスＳＨ−３５は工業技術院生命工学工
業技術研究所に条寄第５１４４号(FERM BP-5144)として
寄託している。

【００１４】

【表１】

【００１５】本発明の新菌株は次のようにしてスクリー
ニングした。まず、採取海岸汚泥を整理食塩水に懸濁
し、該懸濁液１滴を以下の組成の寒天培地に塗沫した。
使用した寒天平板培地は寒天２％（ｗ／ｖ）、トレハロ
ースまたはマルトース１％、ポリペプトン０．５％、酵
母エキス０．５％、燐酸二カリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム・七水塩０．０２％を含有する。かくして、寒
天平板を３７℃にて好気的に培養し、平板上に現れた各
コロニーを得、各々のコロニーを寒天を除いた上記組成
の液体培地中で３７℃にて２４〜７２時間、１８０ｒ．
ｐ．ｍ．で振盪培養した。次いで、各培養液を１２，０
００×ｇにて１０分間、４℃で遠心分離し菌体と上澄液
とに分離した。かくして得られた菌体は少量の０．１Ｍ
燐酸緩衝液（７．０）に菌体を懸濁させ、以下に述べる
方法で活性を測定した。その結果、上記のような菌学的
諸特性を有する菌株を分離できた。

【００１６】本発明の新規な微生物は、新規なマルトー
スホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを
生産する菌である。次に、これらの酵素の製造方法につ
いて説明する。本発明の微生物(FERM BP-5144)を適当な
培地に接種し、培養する。培養は、該菌体の生育温度の
観点から、２５〜４２℃の温度範囲とし、８〜７０時間
好気的に培養することが適当である。本発明の微生物を
培養することにより、本発明のトレハロースホスホリラ
ーゼおよび／またはマルトースホスホリラーゼが生成す
る。生成する酵素の大部分は菌体内に蓄積され、一部分
は菌体外（培地中）に蓄積される。そこで、菌体内ある
いは菌体外（培地中）に生成蓄積されたマルトースホス
ホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼ
を採取する。また、上記培養は、バッチ式、連続式のい
ずれによっても実施することができる。

【００１７】上記培養に用いる培地について説明する。
炭素源としては、トレハロースやマルトースおよびこれ
らを含有する糖質を用いることができる。窒素源には各
種有機および無機の窒素化合物を用い、さらに培地は各
種の無機塩をさらに含むことができる。炭素源としてト
レハロースもしくは該物質を含有する糖質を用いると、
本発明の微生物はトレハロースホスホリラーゼを優先的
に生産する。また、マルトースもしくは該物質を含有す
る糖質を炭素源として用いると、本発明の微生物はマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼを同時に生産する。但し、この場合、トレハロースホ
スホリラーゼの生産量は、炭素源としてトレハロースを
用いた場合に比べれば、少なくなる傾向がある。さら
に、炭素源としてトレハロースとマルトースの両者又は
これらの物質を含有する糖質を用いると、トレハロース
ホスホリラーゼとマルトースホスホリラーゼとを同時に
生産させることができ、トレハロースとマルトースの量
を制御することで、トレハロースホスホリラーゼとマル
トースホスホリラーゼの生成割合をコントロールするこ
ともできる。

【００１８】また、窒素源にはコーンスチープリカー、
大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、そし
て硫安、硝安、燐安、尿素等の無機窒素源などの一般に
微生物の培養に用いられている安価な化合物が使用可能
である。なお、尿素や有機窒素源は炭素源にもなること
はいうまでもない。

【００１９】本発明の方法において使用するのに適した
培地としては、例えば、トレハロースホスホリラーゼを
優先的に生産したい場合には、トレハロース１〜２％
（ｗ／ｖ）、酵母エキス２％、燐酸アンモニウム０．１
５％、尿素０．１５％、食塩１％、燐酸二カリウム０．
１％、硫酸マグネシウム・七水塩０．０２％および炭酸
カルシウム０．２％を含むｐＨ７．０〜７．５の液体培
地を用いることが適当である。また、マルトースホスホ
リラーゼとトレハロースホスホリラーゼを同時に生産し
たい場合には、マルトース１〜２％（ｗ／ｖ）、ポリペ
プトンＳ（日本製薬製）２〜３％、燐酸アンモニウム
０．１５％、尿素０．１５％、食塩１％、燐酸二カリウ
ム０．１％、硫酸マグネシウム・七水塩０．０２％およ
び炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地を用いること
が適当である。

【００２０】尚、前記のように、マルトースを炭素源と
して用いるとマルトースホスホリラーゼばかりでなく、
トレハロースホスホリラーゼもある程度の量生産され
る。従って、トレハロース生産用の粗酵素（マルトース
ホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼとの混合
物）を得るには、マルトースを炭素源として用いことが
便利かつ経済的である。

【００２１】培養菌体内又は培養上清中に蓄積した各酵
素は、常法により単離することができる。まず、菌体内
の酵素は、菌体ごと粗酵素として用いることができる。
さらに、菌体から酵素を抽出することで粗酵素を回収す
ることもできる。また、菌体外の培養上清中にも酵素は
含まれており、菌体を分離した残りの培養液を粗酵素含
有液として利用することもできる。さらに、これらの粗
酵素は、エタノール、アセトン、イソプロパノール等に
よる溶媒沈澱法、硫安分画法、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の通常の方法を
用いて、精製することができる。さらに、マルトースホ
スホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼとの分離
は、両者の等電点が異なることから、陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより行うことができる。

【００２２】このようにして得られる本発明の酵素は、
後述の実施例において詳細に説明するように、前記の理
化学的性質を有するマルトースホスホリラーゼ及びトレ
ハロースホスホリラーゼである。これらの酵素の活性測
定は、本発明のプレシオモナスＳＨ−３５株がマルトー
スやトレハロースを加水分解するα−グルコシダーゼ
（マルターゼ）、グルコアミラーゼ、トレハラーゼ等を
生産しないので、加燐酸分解反応の測定にはそれぞれマ
ルトースあるいはトレハロースを基質とし、燐酸塩存在
下で酵素反応させて生成するグルコースをグルコースオ
キシダーゼ法で測定する簡便法が適用可能である。ま
た、合成反応はβ−Ｄ−グルコース１燐酸とグルコース
の混合液を基質とし、酵素反応により生成する無機燐酸
を常法により測定することで可能である。

【００２３】酵素活性測定法（１）分解反応： ５０ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ７）に溶
解させた２０ｍＭのマルトースもしくはトレハロース溶
液０．５ｍｌに酵素液０．０１ｍｌを添加し、５０℃で
１５分間反応させた後、沸騰水浴中で３分間加熱して酵
素反応を止める。次いで、流水中で冷却した後、生成し
たグルコースをグルコースオキシダーゼ法（和光純薬工
業（株）製、グルコースＣ−IIテスト・ワコー）で測定
する。ここで１単位の酵素活性は同条件下で１分間に１
μｍｏｌｅ（マイクロモル）のグルコースを生成する酵
素量とする。（２）合成反応： ７０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた２７ｍＭのβ−Ｄ−グル
コース１燐酸Ｎａ塩と同濃度のグルコースとの混合溶液
０．１５ｍｌに０．０５ｍｌの酵素液を添加し、５０℃
で１５分間反応させた後、沸騰水浴中で２分間加熱して
酵素活性を止める。ついで、生成した無機燐酸を和光純
薬工業（株）製ピーテストワコーを用いて測定する。こ
こで１単位の酵素活性は同上条件下で１分間に１マイク
ロモル（μｍｏｌｅ）の無機燐酸を生成する酵素量とす
る。

【００２４】本発明の新規な酵素であるマルトースホス
ホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼは、それぞ
れ粗酵素又は精製酵素として利用することができる。さ
らに、両酵素の活性を有する菌体および該菌体を適当な
担体に包括、吸着あるいは化学的に結合させた固定化菌
体などを、例えばトレハロースの製造に使用することも
可能である。さらには、本発明の酵素は、各酵素を公知
の方法で固定化させた固定化酵素として使用することも
できる。

【００２５】

【実施例】以下本発明について実施例によりさらに説明
する。 実施例１菌体内及び菌体外マルトースホスホリラーゼの製造及び
精製 プレシオモナスＳＨ−３５株(FERM BP-5144)を、マルト
ース１％（ｗ／ｖ）、ポリペプトンＳ（日本製薬製）２
％、燐酸アンモニウム０．１５％、尿素０．１５％、食
塩１％、燐酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・
七水塩０．０２％および炭酸カルシウム０．２％を含む
ｐＨ７．０の液体培地に植菌した。次に、この液体培地
を３７℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液
を４℃で１２，０００×ｇにて１５分間遠心分離して菌
体と上清液とに分けた。得られた菌体は少量の２０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させた後、超音波菌体
破砕機で菌体を破壊した。ついで、該破砕菌体懸濁液に
硫安を加えて３０％飽和とし、４℃で一夜放置した。次
いで、遠心分離をして沈澱物を除いて得られる上清液に
さらに硫安を加えて７０％飽和とした。４℃で一夜放置
して生成する沈澱物を遠心分離で集め、２０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７）に溶解させた後、同上緩衝液で充分に透
析した。

【００２６】次いで、同上緩衝液で平衡化したDEAE−フ
ラクトゲル（メルク社製）カラムに通液し酵素を吸着さ
せた。吸着した酵素を同上緩衝液に含まれる０Ｍから
０．６Ｍの食塩の濃度勾配法で溶出させた後、ＵＦ膜
（アミコン社製、ＹＭ−３０）で濃縮した。濃縮酵素は
０．２Ｍ食塩を含む同上緩衝液で平衡化したセファクリ
ルＳ−３００（ファルマシア社製）カラムを用いてゲル
濾過クロマトグラフィーで精製した。得られた活性画分
を集め、１．５Ｍ硫安を含む同上緩衝液で充分に透析し
た後、１．５Ｍ硫安を含む同上緩衝液で平衡化したフェ
ニル・トヨパール（東ソー社製）カラムに通液し酵素を
吸着させた。吸着した酵素を同上緩衝液に含まれる１．
５Ｍから０Ｍの硫安の濃度勾配法で溶出させた後、得ら
れた活性画分を集め０．２Ｍ食塩を含む同上緩衝液で充
分に透析した。前述のＵＦ膜を用いて濃縮した後、０．
２Ｍ食塩を含む同上緩衝液で平衡化したスーパーデック
ス２００（ファルマシア社製）で再度ゲル濾過クロマト
グラフィーを行い、得られた活性画分を前述の方法で濃
縮してポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ法において均一な菌体
内マルトースホスホリラーゼ精製酵素（活性収率約２８
％）が得られた。また、菌体外酵素についても培養上清
を出発原料として、上記の方法と同様の方法で精製濃縮
して、活性収率約２５％でマルトースホスホリラーゼの
精製酵素を得た。

【００２７】実施例２菌体内および菌体外トレハロースホスホリラーゼの製造
及び精製 プレシオモナスＳＨ−３５株(FERM BP-5144)を、トレハ
ロース１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２％、燐酸アンモニ
ウム０．１５％、尿素０．１５％、食塩１％、燐酸二カ
リウム０．１％、硫酸マグネシウム・七水塩０．０２％
および炭酸カルシウム０．２％を含むｐＨ７．０の液体
培地に植菌した。この液体培地を実施例１と同様に培養
し、後処理して菌体破砕液と上清液を得た。得られた菌
体破砕液と上清液について、それぞれ実施例１と同様な
方法で精製した。ＰＡＧＥ法並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ法
において均一な菌体内トレハロースホスホリラーゼおよ
び菌体外トレハロースホスホリラーゼを、それぞれ活性
収率３５％および３２％で得た。

【００２８】実施例３プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマルトースホス
ホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの酵素化
学的諸性質 次に本発明のプレシオモナスＳＨ−３５株（FERM BP-51
44）が生産する新規マルトースホスホリラーゼおよびト
レハロースホスホリラーゼの一般的な酵素化学的特性に
関し、実施例１および２と同様な方法で精製して得た精
製酵素を用いて検討した結果を以下に示す。なお、予備
実験の結果、菌体内および菌体外の両酵素共にほぼ同様
な理化学的諸性質を示したので、ここでは菌体内酵素の
諸性質を示している。

【００２９】（イ）作用 １０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた１％
（ｗ／ｖ）のマルトース及びトレハロース溶液にマルト
ースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ
を基質１ｇに対してそれぞれ５単位（分解反応）添加
し、５０℃で５時間反応させた後、沸騰水浴中で３分間
加熱して酵素を失活させて得られる糖化液中の糖を高速
液体クロマトグラフ法で測定した結果、グルコース及び
グルコース１燐酸がそれぞれ検出された。また、１０ｍ
Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解させた１％（ｗ／ｖ）のグルコースおよびβ−Ｄ−グ
ルコース１燐酸Ｎａ塩もしくはα−Ｄ−グルコース１燐
酸Ｎａ塩の混合溶液を基質とし、マルトースホスホリラ
ーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを基質１ｇに対
してそれぞれ５単位添加し５０℃で５時間反応させた
後、前述のように処理して糖組成を測定した結果、グル
コースとβ−Ｄ−グルコース１燐酸からはマルトースお
よびトレハロースがそれぞれ検出されたが、グルコース
とα−Ｄ−グルコース１燐酸からの二糖類の合成反応は
検出されなかった。

【００３０】生成糖の分析は以下の方法で行った。即
ち、加熱失活させて得られる糖化液中の不溶物を０．４
５μｍのメンブレンフィルターで濾別して得られる濾液
を供試糖液とし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ、ＯＤＳ−ＡＱ（Ａ
Ｑ−３０４、ＹＭＣ社製）カラムを用いる高速液体クロ
マトグラフィー法で測定した。なお、移動相には水を用
い、カラム温度を３０℃とし検出には示差屈折計を用い
た。（ロ）基質特異性（分解反応） 先に述べた活性測定法（分解反応）に示した基質（マル
トースもしくはトレハロース）に代えて各種糖類を基質
とした場合の活性を相対活性として表した。結果を表２
に示す。

【００３１】

【表２】

【００３２】（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 精製酵素を用いて分解および合成反応の最適ｐＨを測定
した。その結果、図１のＡに示したように、マルトース
ホスホリラーゼの分解反応（白丸で示す）の最適ｐＨは
７．０〜７．５であり、合成反応（黒丸で示す）は６．
０が最適であった。また、図１のＢに示すように、トレ
ハロースホスホリラーゼは分解反応（白丸）及び合成反
応（黒丸）共に７．０が最適であった。なお、ｐＨ分解
反応の場合は２０ｍＭの燐酸緩衝液を、合成反応の場合
には、ＭＥＳ（ｐＨ５．５〜６．５）、ＭＯＰＳ（ｐＨ
値６．５〜７．０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０〜８．
０）、トリスー塩酸（ｐＨ７．５〜９．０）の各緩衝液
を用いて調整した。また、精製した両酵素を各緩衝液中
で１０分間、５０℃で処理し、それらの残存酵素活性を
分解反応で測定した結果、図２に示したように、マルト
ースホスホリラーゼ（白丸）はｐＨ５．５〜６．５の範
囲で、また、トレハロースホスホリラーゼ（黒丸）はｐ
Ｈ６．０〜９．０まで安定であった。なお、ｐＨは酢酸
（ｐＨ５．０〜５．５）、燐酸（ｐＨ６．０〜８．
０）、炭酸（ｐＨ８．９）の各緩衝液を用いて調整し
た。

【００３３】（ニ）作用適温 両酵素の分解反応および合成反応の作用適温を測定した
結果、図３に示したように、マルトースホスホリラーゼ
（Ａ、白丸：分解反応、黒丸：合成反応）、トレハロー
スホスホリラーゼ（Ｂ、白丸：分解反応、黒丸：合成反
応）共に分解反応は５０℃、合成反応は５０〜５５℃の
範囲であった。（ホ）温度による失活の条件 マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリ
ラーゼのそれぞれの安定ｐＨであるｐＨ６．０および
７．０の条件下で１５分間処理し、残存する失活を無処
理と比較して常法により測定した。その結果、図４に示
したように、マルトースホスホリラーゼ（白丸）は５５
℃で、また、トレハロースホスホリラーゼ（黒丸）は６
０℃で完全に失活した。（ヘ）阻害剤 両酵素の合成反応における活性を各種阻害剤存在下で測
定し、無添加時の活性を１００％とする相対活性で表し
た結果を表３に示す。

【００３４】

【表３】

【００３５】（ト）等電点 アイソゲル(FMC BioProducto社製) を用いるアイソエレ
クトロフォーカシング法により、両酵素の等電点を測定
した結果、図５に示したようにマルトースホスホリラー
ゼは３．８、トレハロースホスホリラーゼは４．５であ
った。（チ）分子量 両精製酵素の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法並びにセファ
クリルＳ−２００を用いるゲル濾過法により測定した。
その結果、図６に示したように、ゲル濾過法では両酵素
の分子量は約２００，０００であったが、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ法ではマルトースホスホリラーゼが約９２，０００
そしてトレハロースホスホリラーゼが約８８，０００で
あったことから、これらの酵素はそれぞれ２ケのサブユ
ニットから構成されていることが予想された。上記の理
化学的諸性質を既知のマルトースホスホリラーゼおよび
トレハロースホスホリラーゼと比較して表４および表５
にまとめた。

【００３６】

【表４】

【００３７】

【表５】

【００３８】実施例４菌体内および菌体外トレハロースホスホリラーゼの製造
方法 トレハロース１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス(Difco社製)
２％、燐酸アンモニウム０．１５％、尿素０．１５％、
食塩１％、燐酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム
・七水塩０．０２％および炭酸カルシウム０．２％を含
むｐＨ７．５の液体培地２０リットルに予め同上培地で
一夜培養して得たプレシオモナスＳＨ−３５株種菌（FE
RM BP-5144）１リットルを無菌的に添加し、３７℃、３
００ｒｐｍ、通気量１ｖ．ｖ．ｍの条件下で２４時間通
気攪拌培養をした。本培養液のトレハロースホスホリラ
ーゼ活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当たり１．５単
位であった。また同様にマルトースホスホリラーゼ活性
も測定したが、活性は微量であった。次いで、１２，０
００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、約１６０ｇの菌
体（湿潤時）および１９．５リットルの上清液を得、ロ
ミコン(Romicon) 社製ＵＦ膜（ＹＭ−３０）で濃縮し、
約１リットル（約６，４００単位）の菌体外濃縮粗酵素
が得られた。上清液中の酵素活性を測定した結果、全活
性（約３０×１０³ 単位）の約２５％（７．５×１０³
単位）の活性があった。また、菌体部分については１０
ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ７）で充分洗浄し、５００ｍｌ
の同上緩衝液に懸濁させた後、超音波菌体破砕機で菌体
を破砕し、常法によりトレハロースホスホリラーゼ活性
を測定した結果、全活性の約７５％（２２．５×１０³
単位）が菌体内に含まれていた。

【００３９】実施例５ （マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ含有菌体および菌体外酵素の製造）実施例１で
用いた培地成分中のトレハロースをマルトースに、酵母
エキスをポリペプトンＦＣ（日本製薬（株）製）５％
（ｗ／ｖ）にそれぞれ代え、他は同様な方法でＳＨ−３
５株（FERM BP-5144）を培養した。本培養液のマルトー
スホスホリラーゼ活性並びにトレハロースホスホリラー
ゼ活性を測定した結果、培養液１ｍｌ当たり０．５単位
のマルトースホスホリラーゼ活性と０．４５単位のトレ
ハロースホスホリラーゼが含まれていた。次いで、同様
に遠心分離して約１５０ｇの菌体（湿潤時）および１
９．６リットルの上清液を得た。ついで、菌体および上
清中のマルトースホスホリラーゼ活性を測定した結果、
マルトースホスホリラーゼの全活性の約７８％（約１
０，０００単位）が菌体内に、そして約２２％が菌体外
（培養上清）に含まれていた。また、トレハロースホス
ホリラーゼの全活性の約８２％（約９，０００単位）が
菌体内に、そして約１８％が菌体外（培養上清）に含ま
れていた。培養上清は実施例１と同様な方法で濃縮し、
約１リットルの濃縮酵素が得られ、該濃縮酵素中には約
１，７００単位のマルトースホスホリラーゼと１，４３
０単位のトレハロースホスホリラーゼが含まれていた。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、トレハロースを酵素的
に製造する際に必要なマルトースホスホリラーゼおよび
トレハロースホスホリラーゼを菌体内及び菌体外（培地
中）に生産し得る新規な微生物が提供される。本発明の
微生物は細菌であるので、従来トレハロースホスホリラ
ーゼの給源として知られていた緑藻や担子菌に比較し酵
素の取得方法が容易であるばかりでなく、培養時間も大
幅に短縮し得ることから経済的である。さらに、本発明
の微生物は、一種の細菌がトレハロースの酵素的生産に
必要な二種の酵素を同時に生産し得るという利点も有す
る。また、本発明の２つの酵素は、トレハロースを酵素
的に生産する際に要求される諸要件をいずれも満足する
ので、得られるトレハロースの有効利用を著しく容易に
し、経済的にも大幅な改善を保証し得るものである。即
ち、本発明のマルトースホスホリラーゼおよびトレハロ
ースホスホリラーゼは高い温度安定性を有し、高温での
酵素反応が可能であるので反応中の雑菌汚染から免れ
る。さらには、両方の酵素がほぼ同一の最適ｐＨ範囲を
有しているので反応中の煩雑なｐＨ管理が不要であると
いう利点も有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼの反応至適曲線〔シンボル：分解反応（○）、合成反
応（●）〕。

【図２】 プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼのｐＨ安定性〔シンボル：マルトースホスホリラーゼ
（○）、トレハロースホスホリラーゼ（●）〕。

【図３】 プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼの作用適温〔シンボル：分解反応（○）、合成反応
（●）〕。

【図４】 プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼの温度安定性〔シンボル：マルトースホスホリラーゼ
（○）、トレハロースホスホリラーゼ（●）〕。

【図５】 プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼの等電点。

【図６】 プレシオモナスＳＨ−３５株の生産するマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼの分子量

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マルトースホスホリラーゼおよびトレハ
   ロースホスホリラーゼ生産能を有し、プレシオモナス(P
   lesiomonas) 属に属する微生物、生命研条寄第５１４４
   号。
2. 【請求項２】 以下に示す理化学的性質を有するマルト
   ースホスホリラーゼ。 （イ）作用：マルトース中のα−１，４−グルコピラノ
   シド結合を燐酸存在下で可逆的に加燐酸分解し、グルコ
   ースおよびβ−Ｄ−グルコース１−燐酸を生成する。 （ロ）基質特異性（分解反応）：マルトースに作用し、
   他の二糖類に作用しない。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解反応の至適ｐ
   Ｈは７．０〜７．５であり、合成反応の至適ｐＨは６．
   ０である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．
   ５〜７．０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性：ｐＨ６．０、１５分間の加
   熱条件下では４５℃まで安定である。 （ホ）作用適温の範囲：５０℃近傍に分解反応の至適作
   用温度を有し、合成反応の作用適温は５０〜５５℃であ
   る。 （ヘ）失活条件：５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐ
   Ｈ５．０および８．０で完全に失活する。また、ｐＨ
   ６．０、１５分間の処理では５５℃で完全に失活する。 （ト）阻害：銅、水銀、カドミウム、亜鉛、Ｎ−ブロモ
   サクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエイト、
   ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムで阻害される。 （チ）アイソエレクトロフォーカシング法による等電
   点：３．８ （リ）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子
   量：約９２，０００（ゲル濾過法による分子量は約２０
   ０，０００であり、２ケのサブユニットから構成されて
   いる）。
3. 【請求項３】 以下に示す理化学的性質を有するトレハ
   ロースホスホリラーゼ。 （イ）作用：トレハロース中のα−１，１−グルコピラ
   ノシド結合を燐酸存在下で可逆的に加燐酸分解し、グル
   コースおよびβ−Ｄ−グルコース１−燐酸を生成する。 （ロ）基質特異性（分解反応）：トレハロースに作用
   し、他の二糖類に作用しない。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解および合成反
   応の至適ｐＨは７．０である。５０℃、１０分間の加熱
   条件下ではｐＨ６．０〜９．０の範囲内である。 （ニ）温度に対する安定性：ｐＨ７．０、１５分間の加
   熱条件下では５０℃まで安定である。 （ホ）作用適温の範囲：分解反応及び合成反応の作用適
   温は５０〜５５℃である。 （ヘ）失活条件：５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐ
   Ｈ５．０および９．５で完全に失活する。また、ｐＨ
   ７．０、１５分間の処理では５５℃で完全に失活する。 （ト）阻害：銅、水銀、カドミウム、亜鉛、Ｎ−ブロモ
   サクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエイトで
   阻害される。 （チ）アイソエレクトロフォーカシング法による等電
   点：４．５ （リ）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子
   量：約８８，０００（ゲル濾過法による分子量は約２０
   ０，０００であり、２ケのサブユニットから構成されて
   いる）。
4. 【請求項４】 請求項１記載の微生物を培養し、請求項
   ２記載のマルトースホスホリラーゼおよび請求項３記載
   のトレハロースホスホリラーゼの少なくとも１つを生成
   ・蓄積させ、これを採取することを特徴とするマルトー
   スホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの
   製造方法。
5. 【請求項５】 上記培養を炭素源としてマルトースの存
   在下で行い、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロ
   ースホスホリラーゼを生成・蓄積させる請求項４記載の
   製造方法。
6. 【請求項６】 上記培養を炭素源としてトレハロースの
   存在下で行い、トレハロースホスホリラーゼを優先的に
   生成・蓄積させる請求項４記載の製造方法。
7. 【請求項７】 培養後の培養液から菌体を分離し、分離
   した菌体をそのままマルトースホスホリラーゼおよび／
   またはトレハロースホスホリラーゼの粗酵素とする請求
   項４記載の製造方法。
8. 【請求項８】 培養後の培養液から菌体を分離し、分離
   した菌体からマルトースホスホリラーゼおよび／または
   トレハロースホスホリラーゼの粗酵素を抽出する請求項
   ４記載の製造方法。
9. 【請求項９】 培養後の培養液から菌体を分離し、得ら
   れた培養上清液をマルトースホスホリラーゼおよび／ま
   たはトレハロースホスホリラーゼの粗酵素含有液とする
   請求項４記載の製造方法。