JPH0782017B2 - Siv群およびhiv‐2群のウィルスの検出および分化のための新規なタンパク質およびコード配列 - Google Patents
Siv群およびhiv‐2群のウィルスの検出および分化のための新規なタンパク質およびコード配列Info
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- JPH0782017B2 JPH0782017B2 JP1507338A JP50733889A JPH0782017B2 JP H0782017 B2 JPH0782017 B2 JP H0782017B2 JP 1507338 A JP1507338 A JP 1507338A JP 50733889 A JP50733889 A JP 50733889A JP H0782017 B2 JPH0782017 B2 JP H0782017B2
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- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、一般にタンパク質およびそれらコード配列の
単離および特徴付けの分野に関する。より詳しくは、SI
V群およびHIV−2群のウィルスについて特有の同定、特
徴付けおよびタンパク質の診断用途、ならびに該タンパ
ク質をコードしている遺伝子に関する。
単離および特徴付けの分野に関する。より詳しくは、SI
V群およびHIV−2群のウィルスについて特有の同定、特
徴付けおよびタンパク質の診断用途、ならびに該タンパ
ク質をコードしている遺伝子に関する。
発明の背景 シミアン(Simian)免疫不全症ウィルス(SIV)は、感
染しやすい霊長類においてヒト免疫不全症ウィルスタイ
プ1(HIV−1)およびタイプ2(HIV−2)によりひき
起こされるヒトエイズ(AIDS)と同様の症状をもった致
命的な病気をひき起こす。SIVウィルス株は、本来的に
は免疫不全症またはリンパ腫をもったアカゲザルより単
離され(SIV/mac)、そして続いて無症候マンガベイザ
ルより単離され(SIV/SMN、SIV/SMLV、SIV/Delta)また
リンパ腫をもったマカク ネメストリナ(Macaca nemes
trina)より単離されている(SIV/Mne)。SIVウィルス
株は、当初、SIV/macであることが示されて以来、アフ
リカミドリザルより得られると考えられていた(STLV−
III/agm)。SIVウィルス株はお互いに密接に関連してお
り(90%より大きい一致性)、そしてまたHIV−1と部
分的に関連するが(40%ヌクレオチド配列一致性)、HI
V−2とはより密接に関連している(全体として75%ヌ
クレオチド配列一致性)。
染しやすい霊長類においてヒト免疫不全症ウィルスタイ
プ1(HIV−1)およびタイプ2(HIV−2)によりひき
起こされるヒトエイズ(AIDS)と同様の症状をもった致
命的な病気をひき起こす。SIVウィルス株は、本来的に
は免疫不全症またはリンパ腫をもったアカゲザルより単
離され(SIV/mac)、そして続いて無症候マンガベイザ
ルより単離され(SIV/SMN、SIV/SMLV、SIV/Delta)また
リンパ腫をもったマカク ネメストリナ(Macaca nemes
trina)より単離されている(SIV/Mne)。SIVウィルス
株は、当初、SIV/macであることが示されて以来、アフ
リカミドリザルより得られると考えられていた(STLV−
III/agm)。SIVウィルス株はお互いに密接に関連してお
り(90%より大きい一致性)、そしてまたHIV−1と部
分的に関連するが(40%ヌクレオチド配列一致性)、HI
V−2とはより密接に関連している(全体として75%ヌ
クレオチド配列一致性)。
HIV−1、HIV−2およびSIVのゲノム組織は,大変近似
しており、各々gag、pol、env、Q、R、trs、tatおよ
びFと呼称される読み取り枠(ORF)を含む。しかしな
がら、HIV−2およびSIVは各々、HIV−1において見い
出されないところの、Xと呼称される読み取り枠を含む
[Chakrabarti,et,al,Nature 328,543(1987);Franchi
ni,et al,Nature 328,539(1987);そしてGuyader,et
al,Nature 326,662(1987)]。X読み取り枠(X−OR
F)はゲノムの中央域にpol読み取り枠(pol−ORF)とen
v読み取り枠(env−ORF)の間に位置する。しかし、X
−ORFの性質および特性、その翻訳生成物そしてそれら
の重要度は、これまで知られておらずまた記載されても
いなかった。
しており、各々gag、pol、env、Q、R、trs、tatおよ
びFと呼称される読み取り枠(ORF)を含む。しかしな
がら、HIV−2およびSIVは各々、HIV−1において見い
出されないところの、Xと呼称される読み取り枠を含む
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ni,et al,Nature 328,539(1987);そしてGuyader,et
al,Nature 326,662(1987)]。X読み取り枠(X−OR
F)はゲノムの中央域にpol読み取り枠(pol−ORF)とen
v読み取り枠(env−ORF)の間に位置する。しかし、X
−ORFの性質および特性、その翻訳生成物そしてそれら
の重要度は、これまで知られておらずまた記載されても
いなかった。
発明の要旨 したがって、本発明の一の目的は、本明細書においてp1
4またはシドタンパク質(sid−protein)と呼称する単
離された、実質的に純粋なタンパク質を提供することに
ある。
4またはシドタンパク質(sid−protein)と呼称する単
離された、実質的に純粋なタンパク質を提供することに
ある。
本発明の別の目的は、シドタンパク質の合成を指示する
コード配列を適当な表現ベクターで同定することにあ
る。
コード配列を適当な表現ベクターで同定することにあ
る。
本発明の他の目的は、HIV−2群およびSIV群のウィルス
を他の近似ウィルス、たとえばHIV−1群のウィルス株
と区別、検出するための診断キットを提供することにあ
る。
を他の近似ウィルス、たとえばHIV−1群のウィルス株
と区別、検出するための診断キットを提供することにあ
る。
本発明のさらに別の目的はHIV−2、SIVおよびHIV−1
感染同士を分化させる方法を提供することにある。
感染同士を分化させる方法を提供することにある。
本発明の他の目的および利点は、以下の発明の詳細な説
明より明らかとされる。
明より明らかとされる。
とりわけ、本発明は、HIV−2群、SIV群およびHIV−1
群のウィルスを区別するか、または、SIVウィルスもし
くはHIV−2ウィルスのいずれかの存在を検出する方法
における抗−シドタンパク質p−14の使用において、該
方法は、 ウィルス感染された試料を抗−シドタンパク質p−14と
反応させること、 および、 抗原−抗体複合体の生成を慣用の免疫学的方法により測
定することよりなり、 前記試料における前記複合体の存在はSIVウィルスまた
はHIV−2ウィルスの存在を示すが、HIV−1ウィルスの
存在を示さない、抗−シドタンパク質p−14の使用法を
提供するものである。
群のウィルスを区別するか、または、SIVウィルスもし
くはHIV−2ウィルスのいずれかの存在を検出する方法
における抗−シドタンパク質p−14の使用において、該
方法は、 ウィルス感染された試料を抗−シドタンパク質p−14と
反応させること、 および、 抗原−抗体複合体の生成を慣用の免疫学的方法により測
定することよりなり、 前記試料における前記複合体の存在はSIVウィルスまた
はHIV−2ウィルスの存在を示すが、HIV−1ウィルスの
存在を示さない、抗−シドタンパク質p−14の使用法を
提供するものである。
また、本発明は、SIV感染またはHIV−2感染を検出する
方法におけるシドタンパク質p−14の使用において、該
方法は、 SIV感染またはHIV−2感染有りと疑われる被験者から血
液または血清試料を得ること、 前記試料をシドタンパク質p−14と反応させること、お
よび、 抗原−抗体複合体が前記試料中に生成されているか否か
を測定することよりなり、前記複合体の生成はSIV感染
またはHIV−2感染のみの発現を示すが、HIV−1感染を
示さない、シドタンパク質p−14の使用法を提供するも
のである。
方法におけるシドタンパク質p−14の使用において、該
方法は、 SIV感染またはHIV−2感染有りと疑われる被験者から血
液または血清試料を得ること、 前記試料をシドタンパク質p−14と反応させること、お
よび、 抗原−抗体複合体が前記試料中に生成されているか否か
を測定することよりなり、前記複合体の生成はSIV感染
またはHIV−2感染のみの発現を示すが、HIV−1感染を
示さない、シドタンパク質p−14の使用法を提供するも
のである。
図面の簡単な説明 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および多くの付帯
する利点は、添付した図面との関係を考慮するとき、以
下の詳細な説明の記載よりより良く理解されるであろ
う。
する利点は、添付した図面との関係を考慮するとき、以
下の詳細な説明の記載よりより良く理解されるであろ
う。
第1図は、SIV/Mne、SIV/macおよびHIV−2におけるX
−ORFのタンパク質生産物ならびにSIV/Mneより得られた
精製タンパク質(p14)を示すSDSゲル電気泳動を表わ
す。1図中aは、SIV/Mneのクーマシー染色ゲル(レー
ン1)および精製タンパク質(p14)(レーン2)を示
す。ウィルスgaaタンパク質(p28、p16、p8およびp6)
がレーン1において同定される。1図中bは、HIV−1
(レーン1)、HIV−2(レーン2)、SIV/Mne(レーン
3)およびSIV/mac(レーン4)のクーマシー染色ゲル
を示す。1図中cは、ウサギ抗血清を用いて精製SIV/Mn
e p14と分離されたウィルスタンパク質(panel−bと等
価であるSDSゲル)の免疫斑点分析(immunoblotanalysi
s)の結果を示す。SDSゲル電気泳動の後、タンパク質は
ニトロセルロースに転換されそして抗血清により1ない
し500倍希釈で探り出される。抗原−抗体複合体は、Hen
derson,et al,Virol 61,1116(1987)に記載されている
ように125I−標識化ヌクレアーゼタンパク質A(staphy
lococcal protein A)との反応の後のラジオオートグラ
フィーにより検出された。およそ50μgの全タンパク質
を各ウィルスレーン(パネルbおよびc)に適用した。
−ORFのタンパク質生産物ならびにSIV/Mneより得られた
精製タンパク質(p14)を示すSDSゲル電気泳動を表わ
す。1図中aは、SIV/Mneのクーマシー染色ゲル(レー
ン1)および精製タンパク質(p14)(レーン2)を示
す。ウィルスgaaタンパク質(p28、p16、p8およびp6)
がレーン1において同定される。1図中bは、HIV−1
(レーン1)、HIV−2(レーン2)、SIV/Mne(レーン
3)およびSIV/mac(レーン4)のクーマシー染色ゲル
を示す。1図中cは、ウサギ抗血清を用いて精製SIV/Mn
e p14と分離されたウィルスタンパク質(panel−bと等
価であるSDSゲル)の免疫斑点分析(immunoblotanalysi
s)の結果を示す。SDSゲル電気泳動の後、タンパク質は
ニトロセルロースに転換されそして抗血清により1ない
し500倍希釈で探り出される。抗原−抗体複合体は、Hen
derson,et al,Virol 61,1116(1987)に記載されている
ように125I−標識化ヌクレアーゼタンパク質A(staphy
lococcal protein A)との反応の後のラジオオートグラ
フィーにより検出された。およそ50μgの全タンパク質
を各ウィルスレーン(パネルbおよびc)に適用した。
第2図は、p14からのトリプシンペプチドのアミノ酸配
列およびHIV−2 X−ORFにより予測されたタンパク質の
一直線表現を示す。第2a図:トリプシンペプチドの精
製:精製p14(第1図、レーン1)(200μg)を0.1M t
ris−Hcl(pH7.4)0.5ml中に溶解しそしてトリプシン
(Cooper Biomedical)20μgを加えた。消化を8時間
の間続けそしてトリフルオロ酢酸(TFA)をpH2.0になる
まで添加することにより停止させた。ペプチドをRP−HP
LCにより、u−Bondapak C18(3.9x300mmカラム)上で
0.1ml/分にて、pH2.0(0.05% TFA)でアセトニトリル
の線形グラジエント(−−−)により分離し、そして20
6nmにおける紫外線吸収(___)により検出した。他の分
析のために採られたペプチドを含むもののピークは、文
字“a"ないし“1"により示す。
列およびHIV−2 X−ORFにより予測されたタンパク質の
一直線表現を示す。第2a図:トリプシンペプチドの精
製:精製p14(第1図、レーン1)(200μg)を0.1M t
ris−Hcl(pH7.4)0.5ml中に溶解しそしてトリプシン
(Cooper Biomedical)20μgを加えた。消化を8時間
の間続けそしてトリフルオロ酢酸(TFA)をpH2.0になる
まで添加することにより停止させた。ペプチドをRP−HP
LCにより、u−Bondapak C18(3.9x300mmカラム)上で
0.1ml/分にて、pH2.0(0.05% TFA)でアセトニトリル
の線形グラジエント(−−−)により分離し、そして20
6nmにおける紫外線吸収(___)により検出した。他の分
析のために採られたペプチドを含むもののピークは、文
字“a"ないし“1"により示す。
第2b図:SIV/Mne p14のトリプシンペプチドを、HIV−2
のX−ORFにより予測されたアミノ酸配列により一直線
に表わす。p14から誘導されたトリプシンペプチド(第2
a図におけるように)について、アミノ酸含有量(Pico
Tag system,Waters Inc.Milford,MA)そしてアミノ酸配
列(気相シーケンサ、120A型を備えた470A型分析機、Ap
plied Biosystems,Foster City,CA.)を分析しそして結
果をHIV−2のヌクレオチド配列中のX−ORFにより予測
されたアミノ酸配列と比較した[Guyader,etal,Nature
326,661(1987)]。ペプチドを括弧および破線[−
−]により示した。右向きの矢印の先端(−−→)はア
ミノ酸配列分析により同定された最後の残基を示す。左
向きの矢印(←−−)はカルボキシペプチターゼ−pに
よるp14の消化により測定された残基を示す。括弧中お
よびコマンに分けた残基は、精製ペプチドのアミノ酸含
有量により確認された残基を表わす。先頭寄りの文字
(a、b、c等)の場合は第2a図で精製されたペプチド
を表わす。星印(*)はアミノ酸配列が異なるところを
表わす。p14のN末端基上での未知の阻止基はxにより
示した。そして、 第3図は精製p14がポリエテノアデニル酸と結合するこ
とを示す。p28、p2、p8、p6およびp14を含む精製SIV/Mn
eタンパク質を一重鎖核酸結合活性についてKarpel,et a
l,[J.Biol.Chem.262,4961(1987)]により記載されて
いるような2.19μM ポリエテノアデニンを用いた蛍光
増大分析法により試験した。試験されたウィルスタンパ
ク質のうちp14およびp8のみ、ポリエテノアデニンの溶
液を加えたとき蛍光の有意の増大を生じた。
のX−ORFにより予測されたアミノ酸配列により一直線
に表わす。p14から誘導されたトリプシンペプチド(第2
a図におけるように)について、アミノ酸含有量(Pico
Tag system,Waters Inc.Milford,MA)そしてアミノ酸配
列(気相シーケンサ、120A型を備えた470A型分析機、Ap
plied Biosystems,Foster City,CA.)を分析しそして結
果をHIV−2のヌクレオチド配列中のX−ORFにより予測
されたアミノ酸配列と比較した[Guyader,etal,Nature
326,661(1987)]。ペプチドを括弧および破線[−
−]により示した。右向きの矢印の先端(−−→)はア
ミノ酸配列分析により同定された最後の残基を示す。左
向きの矢印(←−−)はカルボキシペプチターゼ−pに
よるp14の消化により測定された残基を示す。括弧中お
よびコマンに分けた残基は、精製ペプチドのアミノ酸含
有量により確認された残基を表わす。先頭寄りの文字
(a、b、c等)の場合は第2a図で精製されたペプチド
を表わす。星印(*)はアミノ酸配列が異なるところを
表わす。p14のN末端基上での未知の阻止基はxにより
示した。そして、 第3図は精製p14がポリエテノアデニル酸と結合するこ
とを示す。p28、p2、p8、p6およびp14を含む精製SIV/Mn
eタンパク質を一重鎖核酸結合活性についてKarpel,et a
l,[J.Biol.Chem.262,4961(1987)]により記載されて
いるような2.19μM ポリエテノアデニンを用いた蛍光
増大分析法により試験した。試験されたウィルスタンパ
ク質のうちp14およびp8のみ、ポリエテノアデニンの溶
液を加えたとき蛍光の有意の増大を生じた。
発明の詳細な説明 本発明の上記および他の種々の目的および利点は、全体
に又は部分的に、シドタンパク質に対する抗体の特異な
結合親和性を有するタンパク質であって、該タンパク質
はHIV−1群のウィルスに対して抗体とともに交差反応
活性をもたないところの、単離された、実質的に純粋な
タンパク質により達成された。
に又は部分的に、シドタンパク質に対する抗体の特異な
結合親和性を有するタンパク質であって、該タンパク質
はHIV−1群のウィルスに対して抗体とともに交差反応
活性をもたないところの、単離された、実質的に純粋な
タンパク質により達成された。
別途定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術的
および科学的用語は、本発明が属するところの分野にお
ける当業者により普通に理解されるのと同一の意味を有
する。本明細書に記載されたのと類似または等価のいか
なる方法および材料も本発明の実施または試験的行為に
使用することができるけれども、より好ましい方法およ
び材料をここに記載する。以下で言及する全ての刊行物
は参照に組み入れてなる。別途言及しない限り、本明細
書で用いた技術は該分野の当業者にとってよく知られた
標準方法論である。
および科学的用語は、本発明が属するところの分野にお
ける当業者により普通に理解されるのと同一の意味を有
する。本明細書に記載されたのと類似または等価のいか
なる方法および材料も本発明の実施または試験的行為に
使用することができるけれども、より好ましい方法およ
び材料をここに記載する。以下で言及する全ての刊行物
は参照に組み入れてなる。別途言及しない限り、本明細
書で用いた技術は該分野の当業者にとってよく知られた
標準方法論である。
本明細書で使用する語句“実質的に純粋な”は、当該分
野の当業者によく知られた標準精製技術により得ること
ができる程度の純粋さを意味する。
野の当業者によく知られた標準精製技術により得ること
ができる程度の純粋さを意味する。
タンパク質の単離および特徴付け SIV/Mneウィルスを成長させるために、SIV/Mneにより感
染させたHut−78細胞の単細胞クローン(クローンELL
S)をウィルスの増殖のために培養しそして次いで標準
ショ糖密度勾配遠心により精製した。その後ウィルスタ
ンパク質を、均質製剤が得られるまで行なう逆相高圧液
体クロマトグラフィーを含む、当業者によく知られた標
準手順により分別し、単離しそして精製した。その後タ
ンパク質を、例えば、Henderson,et al,J.Virol 52:492
(1987)により記載されたNH2及びCOOHアミノ酸配列分
析により特徴付けした。
染させたHut−78細胞の単細胞クローン(クローンELL
S)をウィルスの増殖のために培養しそして次いで標準
ショ糖密度勾配遠心により精製した。その後ウィルスタ
ンパク質を、均質製剤が得られるまで行なう逆相高圧液
体クロマトグラフィーを含む、当業者によく知られた標
準手順により分別し、単離しそして精製した。その後タ
ンパク質を、例えば、Henderson,et al,J.Virol 52:492
(1987)により記載されたNH2及びCOOHアミノ酸配列分
析により特徴付けした。
タンパク質の均質製剤は、SDS−PAGE分析により示すよ
うに(第1図a、レーン2)、誘導されたNH2末端残基
(NH2−terminus)を持つことを暗示するエドマン分解
(気相シーケンサ)に対して不活性である。アミノ酸配
列を得るために、タンパク質をトリプシンで消化しそし
て而して得られた精製ペプチドフラグメント(第2a図、
“a"ないし“1")を、アミノ酸組成および配列を決定す
るための分析に受けさせた[第2b図]。決定されたアミ
ノ酸組成および配列をSIV/mac及びHIV−2の翻訳された
プロウィルスDNA配列と比較しそして各ウィルスのX−O
RF中に位置する予測された配列と大変同質であることを
見出した。SIV/Men p14ペプチド[第2b図]は、位置2
より始めそして位置112まで、予測残基69ないし70およ
び85ないし88に相当するペプチドが単離されなかったこ
とを除いて、HIV−2のX−ORFにより予測された残基と
一致する。精製ペプチドの分析により決定されたSIV/Mn
e p14の105アミノ酸残基のうち、90はHIV−2 X−ORF中
の予測残基と一致し(86%一致性)そして103はSIV/mac
X−ORF中の予測残基と一致することを見出した(98%
一致性)。SIV/Mne p14のアミノ酸配列はSIV/mac X−OR
Fより予測された配列と、SIV/Mneタンパク質が位置3で
アスパラギン酸を含まずそして位置67でトレオニンが置
換されたバリンを有することで相違する。加えて、成熟
p14タンパク質は、イニシエーターメチオニンの除去と
新たに形成されたNH2末端基への阻止基の付加の結果に
よる修飾を行なった。修飾基の性質は、測定されるまで
残存する。SIV/Mne p14のCOOH末端残基は、カルボキシ
ペプチダーゼ−pによる消化による残基の遊離速度によ
り決定した[2分、Ala(0.30),Leu(0.22)、20分、A
la(0.40),Leu(0.47)]。これらの結果は、−Leu−A
la−OHのCOOHアミノ酸配列と一致しかつHIV−2およびS
IV/macの両X−ORFの最後の二つのコドン(遺伝暗号)
より演えきされた配列と合致する。
うに(第1図a、レーン2)、誘導されたNH2末端残基
(NH2−terminus)を持つことを暗示するエドマン分解
(気相シーケンサ)に対して不活性である。アミノ酸配
列を得るために、タンパク質をトリプシンで消化しそし
て而して得られた精製ペプチドフラグメント(第2a図、
“a"ないし“1")を、アミノ酸組成および配列を決定す
るための分析に受けさせた[第2b図]。決定されたアミ
ノ酸組成および配列をSIV/mac及びHIV−2の翻訳された
プロウィルスDNA配列と比較しそして各ウィルスのX−O
RF中に位置する予測された配列と大変同質であることを
見出した。SIV/Men p14ペプチド[第2b図]は、位置2
より始めそして位置112まで、予測残基69ないし70およ
び85ないし88に相当するペプチドが単離されなかったこ
とを除いて、HIV−2のX−ORFにより予測された残基と
一致する。精製ペプチドの分析により決定されたSIV/Mn
e p14の105アミノ酸残基のうち、90はHIV−2 X−ORF中
の予測残基と一致し(86%一致性)そして103はSIV/mac
X−ORF中の予測残基と一致することを見出した(98%
一致性)。SIV/Mne p14のアミノ酸配列はSIV/mac X−OR
Fより予測された配列と、SIV/Mneタンパク質が位置3で
アスパラギン酸を含まずそして位置67でトレオニンが置
換されたバリンを有することで相違する。加えて、成熟
p14タンパク質は、イニシエーターメチオニンの除去と
新たに形成されたNH2末端基への阻止基の付加の結果に
よる修飾を行なった。修飾基の性質は、測定されるまで
残存する。SIV/Mne p14のCOOH末端残基は、カルボキシ
ペプチダーゼ−pによる消化による残基の遊離速度によ
り決定した[2分、Ala(0.30),Leu(0.22)、20分、A
la(0.40),Leu(0.47)]。これらの結果は、−Leu−A
la−OHのCOOHアミノ酸配列と一致しかつHIV−2およびS
IV/macの両X−ORFの最後の二つのコドン(遺伝暗号)
より演えきされた配列と合致する。
SIV/macのX−ORFより予測されたタンパク質とSIV/Men
p14とのアミノ酸配列一致性の程度(98%一致性)は、g
ag遺伝子より誘導されたタンパク質について見出された
一致性(92%一致性)より大きく、そしてまた3′−LT
Rを含む1.6KbプロウィルスDNAフラグメントについて二
つのウィルス間に見出された一致性の程度(93%一致
性)より大きい。これらの結果は、X−ORFタンパク質
は、SIV株間で大変保持されることを示す。
p14とのアミノ酸配列一致性の程度(98%一致性)は、g
ag遺伝子より誘導されたタンパク質について見出された
一致性(92%一致性)より大きく、そしてまた3′−LT
Rを含む1.6KbプロウィルスDNAフラグメントについて二
つのウィルス間に見出された一致性の程度(93%一致
性)より大きい。これらの結果は、X−ORFタンパク質
は、SIV株間で大変保持されることを示す。
ウィルス製剤中に存在するp14のモル量を算出しそして
この量を他の知られたウィルスタンパク質のモル量と関
係付けるべく、p18、p16、p14およびp8バンドを第1図
aに示されたゲル(レーン1)より切り出し、そしてそ
れらのタンパク質含有量をアミノ酸分析により、Hender
son,et al,J.Virol 52:492(1987)により記載されてい
るようにして測定した。結果は、各タンパク質の知られ
たアミノ酸含有量と合致しそしてゲルがタンパク質を次
のモル比で含有することを示した:1.0:1.2:1.1:0.8(p1
8:p16:p8:p14)。伝染性分子クローンより得られたウィ
ルスを含むいくつかのSIV/Mne製剤を、SDS PAGE後のバ
ンドの肉眼観察により調べそして第1図a(レーン1)
に示されたのと同様のp14とp16の比を含むことを見出し
た。
この量を他の知られたウィルスタンパク質のモル量と関
係付けるべく、p18、p16、p14およびp8バンドを第1図
aに示されたゲル(レーン1)より切り出し、そしてそ
れらのタンパク質含有量をアミノ酸分析により、Hender
son,et al,J.Virol 52:492(1987)により記載されてい
るようにして測定した。結果は、各タンパク質の知られ
たアミノ酸含有量と合致しそしてゲルがタンパク質を次
のモル比で含有することを示した:1.0:1.2:1.1:0.8(p1
8:p16:p8:p14)。伝染性分子クローンより得られたウィ
ルスを含むいくつかのSIV/Mne製剤を、SDS PAGE後のバ
ンドの肉眼観察により調べそして第1図a(レーン1)
に示されたのと同様のp14とp16の比を含むことを見出し
た。
精製SIV/Mne p14についての多クローン性ウサギ抗血清
をSIV/Mne中のp14を検出しそして免疫斑点分析{第1図
c]によりHIV−1、HIV−2およびSIV/macにおける交
差反応性タンパク質について探ってみた。該血清は、SI
V/Mne(レーン3)およびSIV/mac(レーン4)中に14kD
バンドそしてHIV−2(レーン2)中に16kDバンド検出
されたが、HIV−1(レーン1)中のタンパク質とは有
意に反応することが見られなかった。SIV/macにおいて
検出された抗原は、SDS−PAGEにおいてSIV/Mne p14と同
じ移動度を有する。この証拠は、p14はSIV/mac X−ORF
遺伝子の翻訳生成物であるという結論に導く。HIV−2
において検出された抗原(p16)はSDS−PAGEにおいてSI
V/MneおよびSIV/macの両p14よりより遅い移動度を有す
る[第1図c]。しかし、他の霊長類からのSIV単離物
は、HIV−2において検出されたタンパク質により近似
する移動度をもった交差反応性タンパク質を有すると現
われている(データ示さず。)。いかなる論理にも束縛
されることなく、観察されたSDS−PAGE移動殿相違は、
たぶん、実際の分子量の差異よりもむしろ、タンパク質
のアミノ酸組成の相違によるものであると確信する。結
局、データは、HIV−2およびSIV/macのX−ORF翻訳生
成物が生成ウイルス中に見出されそしてHIV−1は同様
の交差反応性タンパク質を含んでいないという結論を支
持する。
をSIV/Mne中のp14を検出しそして免疫斑点分析{第1図
c]によりHIV−1、HIV−2およびSIV/macにおける交
差反応性タンパク質について探ってみた。該血清は、SI
V/Mne(レーン3)およびSIV/mac(レーン4)中に14kD
バンドそしてHIV−2(レーン2)中に16kDバンド検出
されたが、HIV−1(レーン1)中のタンパク質とは有
意に反応することが見られなかった。SIV/macにおいて
検出された抗原は、SDS−PAGEにおいてSIV/Mne p14と同
じ移動度を有する。この証拠は、p14はSIV/mac X−ORF
遺伝子の翻訳生成物であるという結論に導く。HIV−2
において検出された抗原(p16)はSDS−PAGEにおいてSI
V/MneおよびSIV/macの両p14よりより遅い移動度を有す
る[第1図c]。しかし、他の霊長類からのSIV単離物
は、HIV−2において検出されたタンパク質により近似
する移動度をもった交差反応性タンパク質を有すると現
われている(データ示さず。)。いかなる論理にも束縛
されることなく、観察されたSDS−PAGE移動殿相違は、
たぶん、実際の分子量の差異よりもむしろ、タンパク質
のアミノ酸組成の相違によるものであると確信する。結
局、データは、HIV−2およびSIV/macのX−ORF翻訳生
成物が生成ウイルス中に見出されそしてHIV−1は同様
の交差反応性タンパク質を含んでいないという結論を支
持する。
各ウィルス製剤中のウィルスタンパク質の量を目に見え
るようにし算出するために、免疫斑点分析に使用された
のと同じSDS−PAGEゲルをクーマシーブリリアントブル
ーにより染色した[第1図b]。14kDおよび16kDにてク
ーマシー染色されたバンド(p14およびp16−gag)はSIV
/Mne(レーン3)およびSIV/mac(レーン4)において
ただちに明らかであった。;しかし、HIV−2(レーン
2)においては、14kDバンドが欠落しておりそして顕著
な16kDバンドが存在する。HIV−2レーンにおける16kD
バンドは、p16 gag(データ示さず。)およびX−ORFタ
ンパク質の双方を含む。主要なgagタンパク質(HIV−1
p24およびp17、HIV−2 p26およびSIV p28およびp16)の
染色示強量は、各レーンに適用されたウィルスの量の相
対指示薬として取扱うことができる。免疫斑点分析にお
けるバンドの示強量[第1図c]とクーマシー染色バン
ドの示強量[第1図b]との比較は、SIV/macおよびHIV
−2はそれらのX−ORFからの翻訳生成物をSIV/Mneにお
けるp14について観察されたのと同等量含むことができ
ることを示唆するものである。
るようにし算出するために、免疫斑点分析に使用された
のと同じSDS−PAGEゲルをクーマシーブリリアントブル
ーにより染色した[第1図b]。14kDおよび16kDにてク
ーマシー染色されたバンド(p14およびp16−gag)はSIV
/Mne(レーン3)およびSIV/mac(レーン4)において
ただちに明らかであった。;しかし、HIV−2(レーン
2)においては、14kDバンドが欠落しておりそして顕著
な16kDバンドが存在する。HIV−2レーンにおける16kD
バンドは、p16 gag(データ示さず。)およびX−ORFタ
ンパク質の双方を含む。主要なgagタンパク質(HIV−1
p24およびp17、HIV−2 p26およびSIV p28およびp16)の
染色示強量は、各レーンに適用されたウィルスの量の相
対指示薬として取扱うことができる。免疫斑点分析にお
けるバンドの示強量[第1図c]とクーマシー染色バン
ドの示強量[第1図b]との比較は、SIV/macおよびHIV
−2はそれらのX−ORFからの翻訳生成物をSIV/Mneにお
けるp14について観察されたのと同等量含むことができ
ることを示唆するものである。
ここに明示されたp14の確定された構造および遺伝的起
源は、X−ORFがSIV/Mneにおける遺伝子として機能する
ことを示す。遺伝子および遺伝生産物(p14)は最初SIV
/Mneにおいて認められそしてシミアン免疫不全症ウィル
スおよび密接に関連したウィルスに対して特異であると
思われるので、この遺伝子はここにおいてシド遺伝子
(sid gene)と呼称する。
源は、X−ORFがSIV/Mneにおける遺伝子として機能する
ことを示す。遺伝子および遺伝生産物(p14)は最初SIV
/Mneにおいて認められそしてシミアン免疫不全症ウィル
スおよび密接に関連したウィルスに対して特異であると
思われるので、この遺伝子はここにおいてシド遺伝子
(sid gene)と呼称する。
SIVおよびHIV−2シドタンパク質のアミノ酸配列は、維
持されたシステイン残基を位置73、87および89におい
て、そしてヒスチジン残基を位置82において含む[第2b
図]。同様のシステイン−ヒスチジン モチーフは核算
においてレトロウィルスの特性[Henderson,et al,J.Bi
ol,Chem.256,8400(1981)]を他のタンパク質[J.Ber
g.Science,232,485(1986)]と結合する役割を果たす
ものであると信じられている。精製p14を核酸結合活性
についてポリエテノアデニンを一重鎖ヌクレオチドテン
プレートとして使用して蛍光増大方法により試験した
[Karpel,et al,JBiol.Chem.262,4961(1987)]。第3
図はp14をポリエテノアデニンの溶液に加えることによ
り得られた滴定曲線を示す。また、第3図においては、
SIV/Men p8 gagヌクレオキャプシド タンパク質および
p28 gagについて得られた結果が含まれている。データ
は、p14およびp8が該テンプレートに結合することを示
しそしてこれらタンパク質が一重鎖RNAに結合できるこ
とを示唆する。滴定曲線の形は各々のタンパク質につい
て異なるところの協力結合の程度および性質に依存す
る。p14の一重鎖核酸に結合する能力は、精製ウィルス
中のその高い濃度を部分的ながら説明するものとなる。
しかしながら、p14が一重鎖核酸に結合することができ
るという事実は、それがインビボ(in vivo)で特異的R
NA結合タンパク質として機能することを暗示する。
持されたシステイン残基を位置73、87および89におい
て、そしてヒスチジン残基を位置82において含む[第2b
図]。同様のシステイン−ヒスチジン モチーフは核算
においてレトロウィルスの特性[Henderson,et al,J.Bi
ol,Chem.256,8400(1981)]を他のタンパク質[J.Ber
g.Science,232,485(1986)]と結合する役割を果たす
ものであると信じられている。精製p14を核酸結合活性
についてポリエテノアデニンを一重鎖ヌクレオチドテン
プレートとして使用して蛍光増大方法により試験した
[Karpel,et al,JBiol.Chem.262,4961(1987)]。第3
図はp14をポリエテノアデニンの溶液に加えることによ
り得られた滴定曲線を示す。また、第3図においては、
SIV/Men p8 gagヌクレオキャプシド タンパク質および
p28 gagについて得られた結果が含まれている。データ
は、p14およびp8が該テンプレートに結合することを示
しそしてこれらタンパク質が一重鎖RNAに結合できるこ
とを示唆する。滴定曲線の形は各々のタンパク質につい
て異なるところの協力結合の程度および性質に依存す
る。p14の一重鎖核酸に結合する能力は、精製ウィルス
中のその高い濃度を部分的ながら説明するものとなる。
しかしながら、p14が一重鎖核酸に結合することができ
るという事実は、それがインビボ(in vivo)で特異的R
NA結合タンパク質として機能することを暗示する。
シドタンパク質はHIV−2およびSIV群のウィルスに対し
独特であるので、このタンパク質を利用した診断手順は
HIV−1、HIV−2およびSIVウィルス株間を明白に区別
するように展開される。診断キットは、シドタンパク質
および抗p14抗体を別個に含有する容器から構成され、
後者は、全体にまたは部分的に、シドタンパク質と相同
の抗原成分を有するところのウィルスのみと反応する。
独特であるので、このタンパク質を利用した診断手順は
HIV−1、HIV−2およびSIVウィルス株間を明白に区別
するように展開される。診断キットは、シドタンパク質
および抗p14抗体を別個に含有する容器から構成され、
後者は、全体にまたは部分的に、シドタンパク質と相同
の抗原成分を有するところのウィルスのみと反応する。
HIV−1ウィルス株はシド抗体と交差反応する抗原成分
を有しないので、生物学的試料と診断キットの成分との
陽性の抗原−抗体反応は“シド”相同を有するウィルス
の存在を示す。
を有しないので、生物学的試料と診断キットの成分との
陽性の抗原−抗体反応は“シド”相同を有するウィルス
の存在を示す。
本発明の有用性 A.SIV/HIV−2感染の診断法 1.ウィルスからのタンパク質をもった抗体の検出 a.上述のごとく図示したように、シドタンパク質はSIV/
HIV−2群の全てのウィルス株よりクロマトグラフィー
例えばRP−HPLCまたは充分な分解能を供えた他のいかな
る適当なタンパク質精製法により精製することができ
る。精製タンパク質はその後、ELISAまたは同様の技術
を用いて患者の血液(sera)中の特異抗体を検出するの
に使用される。この方法の感度はマイクログラム桁以下
でありそしてナノグラム量は一回の試験について充分で
あろう。最近の市販の診断キットは、HIV−1感染とHIV
−2感染を容易に区別しうるものでない。対照的に、シ
ドタンパク質はHIV−2の明白な区別診断法を提供す
る。誤りの陽性は、精製タンパク質またはそのフラグメ
ントを使用した場合に、事実上除去される。誤りの陰性
は、ただ感染の大変速い段階において抗体の欠落により
現われる。しかし、一度酵素反応量の抗体が生産された
ならば、誤りの陰性はありそうでなくなる。
HIV−2群の全てのウィルス株よりクロマトグラフィー
例えばRP−HPLCまたは充分な分解能を供えた他のいかな
る適当なタンパク質精製法により精製することができ
る。精製タンパク質はその後、ELISAまたは同様の技術
を用いて患者の血液(sera)中の特異抗体を検出するの
に使用される。この方法の感度はマイクログラム桁以下
でありそしてナノグラム量は一回の試験について充分で
あろう。最近の市販の診断キットは、HIV−1感染とHIV
−2感染を容易に区別しうるものでない。対照的に、シ
ドタンパク質はHIV−2の明白な区別診断法を提供す
る。誤りの陽性は、精製タンパク質またはそのフラグメ
ントを使用した場合に、事実上除去される。誤りの陰性
は、ただ感染の大変速い段階において抗体の欠落により
現われる。しかし、一度酵素反応量の抗体が生産された
ならば、誤りの陰性はありそうでなくなる。
b.本発明は今や、感度の良い診断キットを可能とした。
シドタンパク質またはそのフラグメントを成分の一とし
て有するキットは、シドタンパク質と反応的な領域を有
する全てのウィルスを同定することができる。
シドタンパク質またはそのフラグメントを成分の一とし
て有するキットは、シドタンパク質と反応的な領域を有
する全てのウィルスを同定することができる。
2.組換えシドタンパク質 SIV/HIV−2群のウィルスのシド遺伝子は、きまりきっ
た型の実験室的技術によりクローンすることができる。
完全な遺伝子またはそのフラグメントは、原核または真
核の表現ベクターあるいは前述したところの診断試験の
ために使用された生産物のいずれかにおいて表現するこ
とができる。
た型の実験室的技術によりクローンすることができる。
完全な遺伝子またはそのフラグメントは、原核または真
核の表現ベクターあるいは前述したところの診断試験の
ために使用された生産物のいずれかにおいて表現するこ
とができる。
3.合成タンパク質 シドタンパク質またはシドタンパク質のフラグメントは
ペプチド合成の慣用技術により合成することができそし
て結果として生じた生産物を前述したように患者血液中
の抗体を検出するための診断試験に使用した。
ペプチド合成の慣用技術により合成することができそし
て結果として生じた生産物を前述したように患者血液中
の抗体を検出するための診断試験に使用した。
B.新規ウィルス単離物の文化のための試験 1.シドタンパク質に特異な単クローン性または多クロー
ン性抗体を利用できる全ての技術により製造することが
できる。該抗体は、ウィルス単離物中のシドタンパク質
の存在についての西欧斑点分析または他の適当な検出技
術を用いた、ヒトを含む全ての動物種からの単離物の同
定および型検出のために使用することができる。感染の
サイトの局在化は、免疫組織学的方法、免疫放射線学的
方法および他の方法により達成することができる。かか
る技術は当該分野の当業者にとって周知のものである。
結果は、新規ウィルスがSIV/HIV−2群の一員であるか
どうかそして感染はHIV−2またはSIVによるものかどう
かを容易に決定する。HIV−1群に属するウィルスは、
陽性反応を示さない。
ン性抗体を利用できる全ての技術により製造することが
できる。該抗体は、ウィルス単離物中のシドタンパク質
の存在についての西欧斑点分析または他の適当な検出技
術を用いた、ヒトを含む全ての動物種からの単離物の同
定および型検出のために使用することができる。感染の
サイトの局在化は、免疫組織学的方法、免疫放射線学的
方法および他の方法により達成することができる。かか
る技術は当該分野の当業者にとって周知のものである。
結果は、新規ウィルスがSIV/HIV−2群の一員であるか
どうかそして感染はHIV−2またはSIVによるものかどう
かを容易に決定する。HIV−1群に属するウィルスは、
陽性反応を示さない。
ここに記載された実施例および態様は例示の目的のため
のもののみにすぎず、かつその観点からの種々の変形ま
たは変化は当該分野の当業者にとって提案しうるもので
ありして本明細書の精神と範囲および請求の範囲の範囲
に含まれるべきものであると理解すべきである。
のもののみにすぎず、かつその観点からの種々の変形ま
たは変化は当該分野の当業者にとって提案しうるもので
ありして本明細書の精神と範囲および請求の範囲の範囲
に含まれるべきものであると理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/00 A 9282−4B C 9282−4B (72)発明者 ソウダー,ザセカンド,レイモンド,シ ー. アメリカ合衆国,メリーランド 21701, フレデリック,キャンフィールド テラス 226 (72)発明者 コープランド,テリー ディ. アメリカ合衆国,メリーランド 21701, フレデリック,ティーン バーナス ロー ド 4838 (72)発明者 オロッツラン,ステファン. アメリカ合衆国,メリーランド 20854, ポトマック,ダーヴィー ドライヴ 11411 (56)参考文献 特開 昭62−26300(JP,A) 特開 昭61−233700(JP,A) Nature,Vol.326(16Apr il1987)P.662−669 Nature,Vol.328(6Aug ust1987)P.543−547
Claims (3)
- 【請求項1】HIV−2群、SIV群およびHIV−1群のウィ
ルスを区別するか、または、SIVウィルスもしくはHIV−
2ウィルスのいずれかの存在を検出する方法における抗
−シドタンパク質p−14の使用において、該方法は、 ウィルス感染された試料を抗−シドタンパク質p−14と
反応させること、 および、 抗原−抗体複合体の生成を慣用の免疫学的方法により測
定することよりなり、 前記試料における前記複合体の存在はSIVウィルスまた
はHIV−2ウィルスの存在を示すが、HIV−1ウィルスの
存在を示さない、抗−シドタンパク質p−14の使用法。 - 【請求項2】SIV感染またはHIV−2感染を検出する方法
におけるシドタンパク質p−14の使用において、該方法
は、 SIV感染またはHIV−2感染有りと疑われる被験者から血
液または血清試料を得ること、 前記試料をシドタンパク質p−14と反応させること、お
よび、 抗原−抗体複合体が前記試料中に生成されているか否か
を測定することよりなり、前記複合体の生成は、SIV感
染またはHIV−2感染のみの発現を示すが、HIV−1感染
を示さない、シドタンパク質p−14の使用法。 - 【請求項3】単離された、実質的に純粋なシドタンパク
質および抗シド抗体(anti−sid−antibody)を別個に
含有する容器から構成される、ウィルス感染の種々の同
定のための診断キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20581888A | 1988-06-13 | 1988-06-13 | |
US205,818 | 1988-06-13 | ||
PCT/US1989/002536 WO1990000204A1 (en) | 1988-06-13 | 1989-06-12 | Novel protein and coding sequence for detection and differentiation of siv and hiv-2 group of viruses |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03504132A JPH03504132A (ja) | 1991-09-12 |
JPH0782017B2 true JPH0782017B2 (ja) | 1995-09-06 |
Family
ID=22763761
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1507338A Expired - Lifetime JPH0782017B2 (ja) | 1988-06-13 | 1989-06-12 | Siv群およびhiv‐2群のウィルスの検出および分化のための新規なタンパク質およびコード配列 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0452319A1 (ja) |
JP (1) | JPH0782017B2 (ja) |
AU (1) | AU617201B2 (ja) |
IL (1) | IL90553A0 (ja) |
WO (1) | WO1990000204A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT401732B (de) * | 1992-11-18 | 1996-11-25 | Wimmer Simon | Bindung für ein snowboard |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61233700A (ja) * | 1984-12-24 | 1986-10-17 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | 分子クロ−ンされたエイズ関連ポリペプチド |
JPS6226300A (ja) * | 1984-10-10 | 1987-02-04 | セントコ−・インコ−ポレ−テツド | Htlv−3dnaのクロ−ニングおよび発現 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
ATE154808T1 (de) * | 1987-01-16 | 1997-07-15 | Pasteur Institut | Peptide mit den immunologischen eigenschaften von hiv-2 |
WO1991000045A1 (en) * | 1989-07-03 | 1991-01-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce | Reagents for detecting siv and hiv-2 |
-
1989
- 1989-06-07 IL IL90553A patent/IL90553A0/xx unknown
- 1989-06-12 AU AU38644/89A patent/AU617201B2/en not_active Ceased
- 1989-06-12 JP JP1507338A patent/JPH0782017B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-12 WO PCT/US1989/002536 patent/WO1990000204A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-06-12 EP EP89908003A patent/EP0452319A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6226300A (ja) * | 1984-10-10 | 1987-02-04 | セントコ−・インコ−ポレ−テツド | Htlv−3dnaのクロ−ニングおよび発現 |
JPS61233700A (ja) * | 1984-12-24 | 1986-10-17 | ジエネンテク,インコ−ポレイテツド | 分子クロ−ンされたエイズ関連ポリペプチド |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Nature,Vol.326(16April1987)P.662−669 |
Nature,Vol.328(6August1987)P.543−547 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU3864489A (en) | 1990-01-23 |
EP0452319A1 (en) | 1991-10-23 |
IL90553A0 (en) | 1990-01-18 |
JPH03504132A (ja) | 1991-09-12 |
AU617201B2 (en) | 1991-11-21 |
WO1990000204A1 (en) | 1990-01-11 |
EP0452319A4 (en) | 1991-09-02 |
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