JPH0779688B2 - 可変の基質特異性を有するコレステリンエステラーゼの製造方法、コレステリンエテラーゼおよびコレステリンの測定方法および試薬 - Google Patents
可変の基質特異性を有するコレステリンエステラーゼの製造方法、コレステリンエテラーゼおよびコレステリンの測定方法および試薬Info
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- JPH0779688B2 JPH0779688B2 JP3509900A JP50990091A JPH0779688B2 JP H0779688 B2 JPH0779688 B2 JP H0779688B2 JP 3509900 A JP3509900 A JP 3509900A JP 50990091 A JP50990091 A JP 50990091A JP H0779688 B2 JPH0779688 B2 JP H0779688B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、可変の基質特異性を有するコレステリンエス
テラーゼの製造方法、こうして得られるコレステリンエ
ステラーゼならびにコレステリンの酵素的測定方法およ
び試薬に関する。
テラーゼの製造方法、こうして得られるコレステリンエ
ステラーゼならびにコレステリンの酵素的測定方法およ
び試薬に関する。
血清中のコレステリンの測定は、動脈硬化症の診断法に
おける重要なパラメーターである。血清中に存在するコ
レステリンは、非常に異種の化合物で存在し、その際コ
レステリンの約70〜80％は異なる長さの脂肪酸でエステ
ル化されている。従って、コレステリン血中濃度の正確
な測定は、存在するコレステリンエステラーゼがどの程
度完全に遊離コレステリンに分解されるかに依存する。
臨床および医療の実地においては、コレステリンエステ
ラーゼを用いるコレステリンエステルの酵素的分解が最
も簡単に適用できる方法であることが立証された。しか
しこの測定法の欠点は、種々のコレステリンエステルを
異なる特異性を有する特定のコレステリンエステラーゼ
によって分解することである。従って本発明は、変化し
た基質特異性および改良された活性を有するコレステリ
ンエステラーゼを提供することを目標とする。
おける重要なパラメーターである。血清中に存在するコ
レステリンは、非常に異種の化合物で存在し、その際コ
レステリンの約70〜80％は異なる長さの脂肪酸でエステ
ル化されている。従って、コレステリン血中濃度の正確
な測定は、存在するコレステリンエステラーゼがどの程
度完全に遊離コレステリンに分解されるかに依存する。
臨床および医療の実地においては、コレステリンエステ
ラーゼを用いるコレステリンエステルの酵素的分解が最
も簡単に適用できる方法であることが立証された。しか
しこの測定法の欠点は、種々のコレステリンエステルを
異なる特異性を有する特定のコレステリンエステラーゼ
によって分解することである。従って本発明は、変化し
た基質特異性および改良された活性を有するコレステリ
ンエステラーゼを提供することを目標とする。
本発明による課題は、活性中心が配列−Gly−His−Ser
−Ｘ−Gly−（ここでＸはアミノ酸を表わす）を有す
る、SEQ.ID.No.1による配列を有しかつプラスミドDSM59
02、DSM5903またはDSM6541から入手しうるコレステリン
エステラーゼ遺伝子をベクター中でクローン化し、微生
物をこのベクターで形質転換し、コレステリンエステラ
ーゼ遺伝子を発現することにより、変化した基質特異性
を有するコレステリンエステラーゼの製造するため、突
然変異誘発によって活性中心の部位Ｘのアミノ酸HiSを
他のアミノ酸GLuと交換することを特徴とする方法によ
って解決される。
−Ｘ−Gly−（ここでＸはアミノ酸を表わす）を有す
る、SEQ.ID.No.1による配列を有しかつプラスミドDSM59
02、DSM5903またはDSM6541から入手しうるコレステリン
エステラーゼ遺伝子をベクター中でクローン化し、微生
物をこのベクターで形質転換し、コレステリンエステラ
ーゼ遺伝子を発現することにより、変化した基質特異性
を有するコレステリンエステラーゼの製造するため、突
然変異誘発によって活性中心の部位Ｘのアミノ酸HiSを
他のアミノ酸GLuと交換することを特徴とする方法によ
って解決される。
本発明は、活性中心として（つまり酵素活性の原因にな
っている範囲として）アミノ酸配列−Gly−His−Ser−
Ｘ−Gly−（ここではＸはアミノ酸HiSを表わす）を有す
るコレステリンエステラーゼに関する。異なるアミノ酸
基Ｘを有するこの種のコレステリンエステラーゼは自体
公知である（たとえば第１表参照）。しかし、これらの
コレステリンエステラーゼは異なる生物体から由来し、
従ってそれのコードを提供する遺伝子のヌクレオチド配
列も異なる。本発明によれば、簡単かつ迅速に、活性中
心のアミノ酸Ｘの突然変異誘発によって、唯１つのコレ
ステリンエステラーゼから、アミノ酸Ｘのみが相違す
る、１組の種々のコレステリンエステラーゼを得る方法
が提供される。しかし、コレステリンエステラーゼ遺伝
子中のヌクレオチド配列の変化によって、所望である限
り、同時に活性中心外のペプチドフレームの付加的変化
を行なうこともできる。
っている範囲として）アミノ酸配列−Gly−His−Ser−
Ｘ−Gly−（ここではＸはアミノ酸HiSを表わす）を有す
るコレステリンエステラーゼに関する。異なるアミノ酸
基Ｘを有するこの種のコレステリンエステラーゼは自体
公知である（たとえば第１表参照）。しかし、これらの
コレステリンエステラーゼは異なる生物体から由来し、
従ってそれのコードを提供する遺伝子のヌクレオチド配
列も異なる。本発明によれば、簡単かつ迅速に、活性中
心のアミノ酸Ｘの突然変異誘発によって、唯１つのコレ
ステリンエステラーゼから、アミノ酸Ｘのみが相違す
る、１組の種々のコレステリンエステラーゼを得る方法
が提供される。しかし、コレステリンエステラーゼ遺伝
子中のヌクレオチド配列の変化によって、所望である限
り、同時に活性中心外のペプチドフレームの付加的変化
を行なうこともできる。
驚異的なことに、活性中心がアミノ酸配列−Gly−His−
Ser−Ｘ−Gly−を有するコレステリンエステラーゼの基
質特異性は、活性中心の部位Ｘのアミノ酸Hisを他のア
ミノ酸GLuと交換することによって変えられることが見
出された。これは有利には、活性中心のアミノ酸Ｘに対
するコードを指定するコドンの突然変異によって達成さ
れる。とくに、突然変異誘発は、意図的に、しかもオリ
ゴヌクレオチドを使用して実施される。その際、コレス
テリンエステラーゼ遺伝子から、活性中心のコードを有
するオリゴヌクレオチドを切り出し、その代りに部位Ｘ
に他のアミノ酸をコードする新しいオリゴヌクレオチド
を遺伝子中へ組み入れる。
Ser−Ｘ−Gly−を有するコレステリンエステラーゼの基
質特異性は、活性中心の部位Ｘのアミノ酸Hisを他のア
ミノ酸GLuと交換することによって変えられることが見
出された。これは有利には、活性中心のアミノ酸Ｘに対
するコードを指定するコドンの突然変異によって達成さ
れる。とくに、突然変異誘発は、意図的に、しかもオリ
ゴヌクレオチドを使用して実施される。その際、コレス
テリンエステラーゼ遺伝子から、活性中心のコードを有
するオリゴヌクレオチドを切り出し、その代りに部位Ｘ
に他のアミノ酸をコードする新しいオリゴヌクレオチド
を遺伝子中へ組み入れる。
新しいオリゴヌクレオチドは、とくに化学的に合成され
る。その際合成は有利には固相で実施される。かかる固
相法は、ウィナッカー（E.−L.Winnacker）の“Gene un
d Klone"（VCH Verlagsgesellschaft We−inheim（198
5））第44頁以降に要約されている。有利には、新しい
オリゴヌクレオチドはアミダイト法（Amiditverfahre
n）により、殊にホルホルアミダイト法（Phosphoramidi
t−Verfahren）に従って製造される。
る。その際合成は有利には固相で実施される。かかる固
相法は、ウィナッカー（E.−L.Winnacker）の“Gene un
d Klone"（VCH Verlagsgesellschaft We−inheim（198
5））第44頁以降に要約されている。有利には、新しい
オリゴヌクレオチドはアミダイト法（Amiditverfahre
n）により、殊にホルホルアミダイト法（Phosphoramidi
t−Verfahren）に従って製造される。
化学的合成の代りに、新しいオリゴヌクレオチドを他の
リパーゼ／コレステリンエステラーゼの遺伝子ないしは
遺伝子構成要素から得ることも有利であることが立証さ
れた。その際通常、遺伝子を既に所望のエステル結合に
対し基質特異性を有するようなリパーゼ／コレステリン
エステラーゼから選択するように行なわれる。かかる遺
伝子から、活性中心をコードするヌクレオチド配列が切
り出され、変えるべきコレステリンエステラーゼ遺伝子
中へ新しい活性中心として挿入される。
リパーゼ／コレステリンエステラーゼの遺伝子ないしは
遺伝子構成要素から得ることも有利であることが立証さ
れた。その際通常、遺伝子を既に所望のエステル結合に
対し基質特異性を有するようなリパーゼ／コレステリン
エステラーゼから選択するように行なわれる。かかる遺
伝子から、活性中心をコードするヌクレオチド配列が切
り出され、変えるべきコレステリンエステラーゼ遺伝子
中へ新しい活性中心として挿入される。
とくに本発明方法においては、SEQ ID NO:1によるアミ
ノ酸配列に一致するコレステリンエステラーゼ遺伝子が
使用される。
ノ酸配列に一致するコレステリンエステラーゼ遺伝子が
使用される。
本発明方法においては、コレステリンエステラーゼ遺伝
子の形質転換および発現のために、それ自体活性のコレ
ステリンエステラーゼを発現しない微生物を使用するの
が有利であることも立証された。とくに、かかる微生物
としてプソイドモナスまたはE.コリの菌株、特に望まし
くはプソイドモナス・スペック（Ps-eudomonas apec）D
SM5902が使用される。コレステリンエステラーゼを発現
しない微生物は、コレステリンエステラーゼ産生菌株を
突然変異誘発により変えて、もはや活性のコレステリン
エステラーゼを発現しないようにすることによってつく
ることができる。
子の形質転換および発現のために、それ自体活性のコレ
ステリンエステラーゼを発現しない微生物を使用するの
が有利であることも立証された。とくに、かかる微生物
としてプソイドモナスまたはE.コリの菌株、特に望まし
くはプソイドモナス・スペック（Ps-eudomonas apec）D
SM5902が使用される。コレステリンエステラーゼを発現
しない微生物は、コレステリンエステラーゼ産生菌株を
突然変異誘発により変えて、もはや活性のコレステリン
エステラーゼを発現しないようにすることによってつく
ることができる。
次に、この菌株を、変化した基質特異性を有するコレス
テリンエステラーゼの遺伝子を有するベクター（たとえ
ばプラスミド）を用いて形質転換する。
テリンエステラーゼの遺伝子を有するベクター（たとえ
ばプラスミド）を用いて形質転換する。
しかし、本発明方法を、コレステリンエステラーゼを発
現するような微生物の菌株を用いて実施することも可能
である。かかる菌株は、もとの菌株に比して増加した発
現を有する。このために、本発明方法をにおいては有利
に出発菌株としてE.コリまたはプソイドモナスの菌株を
使用する。
現するような微生物の菌株を用いて実施することも可能
である。かかる菌株は、もとの菌株に比して増加した発
現を有する。このために、本発明方法をにおいては有利
に出発菌株としてE.コリまたはプソイドモナスの菌株を
使用する。
コレステリンエステラーゼ遺伝子のベクターとしては、
本発明はよればとくにpBR322、pUC18またはpBT306.1
（ヨーロッパ公開特許EP−A187138号）が使用される。
本発明はよればとくにpBR322、pUC18またはpBT306.1
（ヨーロッパ公開特許EP−A187138号）が使用される。
本発明方法においては、可変アミノ酸Ｘのコドンとして
有利にはそれぞれ、相応する微生物ないしはベクター中
にも存在するコドンが使用される。しかし、Ｘに対する
コドンとして、Hisに対してCAT、Metに対してATG、Phe
に対してTTC、Glnに対してCAG、Leuに対してTTG、Ileに
対してATC、Valに対してGTC、Serに対してTCT、Proに対
してCCC、Thrに対してACT、Alaに対してGCT、Tyrに対し
てTAT、Hisに対してCAC、Asnに対してAAC、Lysに対して
AAG、Aspに対してGAC、Gluに対してGAG、Cysに対してTG
T、Argに対してCGTおよびGlyに対してGGAを使用するの
がとくに有利であることが立証された。
有利にはそれぞれ、相応する微生物ないしはベクター中
にも存在するコドンが使用される。しかし、Ｘに対する
コドンとして、Hisに対してCAT、Metに対してATG、Phe
に対してTTC、Glnに対してCAG、Leuに対してTTG、Ileに
対してATC、Valに対してGTC、Serに対してTCT、Proに対
してCCC、Thrに対してACT、Alaに対してGCT、Tyrに対し
てTAT、Hisに対してCAC、Asnに対してAAC、Lysに対して
AAG、Aspに対してGAC、Gluに対してGAG、Cysに対してTG
T、Argに対してCGTおよびGlyに対してGGAを使用するの
がとくに有利であることが立証された。
とくに、突然変異によって導入されるアミノ酸は、突然
変異誘発によって導入されるアミノ酸GLuである。
変異誘発によって導入されるアミノ酸GLuである。
本発明はまた、従来未知で、本発明方法で得られる新規
コレステリンエステラーゼに関する。しかし本発明はと
くに、本発明方法によって得られ、考慮される各エステ
ル結合を分離するかかるコレステリンエステラーゼの混
合物に関する。これは本発明によれば、活性中心のＸに
対する、考慮される全部で20のアミノ酸を含有するコレ
ステリンエステラーゼをつくることによって達成され
る。この種の本発明によるコレステリンエステラーゼの
混合物、とくに全部で20の種々のコレステリンエステラ
ーゼの混合物を用いると、簡単に身体内に出現する種々
のコレステリンエステルを簡単かつ完全に分解すること
が可能である。
コレステリンエステラーゼに関する。しかし本発明はと
くに、本発明方法によって得られ、考慮される各エステ
ル結合を分離するかかるコレステリンエステラーゼの混
合物に関する。これは本発明によれば、活性中心のＸに
対する、考慮される全部で20のアミノ酸を含有するコレ
ステリンエステラーゼをつくることによって達成され
る。この種の本発明によるコレステリンエステラーゼの
混合物、とくに全部で20の種々のコレステリンエステラ
ーゼの混合物を用いると、簡単に身体内に出現する種々
のコレステリンエステルを簡単かつ完全に分解すること
が可能である。
従って、本発明は、体液中のコレステリンの測定のため
にこのようにして得られるコレステリンエステラーゼの
使用ならびにこれらのコレステリンエステラーゼまたは
その混合物を含有する試薬にも関する。
にこのようにして得られるコレステリンエステラーゼの
使用ならびにこれらのコレステリンエステラーゼまたは
その混合物を含有する試薬にも関する。
菌株プソイドモナススペックDSM5902および寄託番号DSM
5903を有するプラスミドpBTmg1CEは、1990年４月24日に
ドイツチエ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメ
ン（Duetsche Sam-mlung von Mikroorganismen.Mascher
oder Weg1b、Ｄ−3300Braunschweig）に寄託された。寄
託番号DSM6541を有するE.コリ菌株HB2154は、1991年５
月29日にドイツチエ・ザムルング・フォン・ミクロオル
ガニスメンに寄託された。
5903を有するプラスミドpBTmg1CEは、1990年４月24日に
ドイツチエ・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメ
ン（Duetsche Sam-mlung von Mikroorganismen.Mascher
oder Weg1b、Ｄ−3300Braunschweig）に寄託された。寄
託番号DSM6541を有するE.コリ菌株HB2154は、1991年５
月29日にドイツチエ・ザムルング・フォン・ミクロオル
ガニスメンに寄託された。
本発明を、次の実施例により配列プロトコールと結合し
て詳説する。SEQ ID NO:1は、プソイドモナススペック
のコレステリンエステラーゼのアミノ酸配列を示す。
て詳説する。SEQ ID NO:1は、プソイドモナススペック
のコレステリンエステラーゼのアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:2および３は、一緒になって成熟コレステリ
ンエステラーゼのアミノ酸１〜30をコードするEcoRI/Sa
lI−フラグメントを生じる２つの相補的オリゴヌクレオ
チドを示す。
ンエステラーゼのアミノ酸１〜30をコードするEcoRI/Sa
lI−フラグメントを生じる２つの相補的オリゴヌクレオ
チドを示す。
SEQ ID NO:4および５は、クローン化されたコレステリ
ンエステラーゼを欠失突然変異誘発を介してGBP−シグ
ナルペプチドに融合するために使用されるオリゴヌクレ
オチドを示す。
ンエステラーゼを欠失突然変異誘発を介してGBP−シグ
ナルペプチドに融合するために使用されるオリゴヌクレ
オチドを示す。
例１ コレステリンエステラーゼ（CE）をコードするプソイド
モナススペック遺伝子のクローン化 プソイドモナス・スペック（DSM5903）の微生物からDNA
を単離し、適当な制限酵素を用いて消化し、E.コリに対
し適合する、pBR322のようなベクター中へクローン化し
た。
モナススペック遺伝子のクローン化 プソイドモナス・スペック（DSM5903）の微生物からDNA
を単離し、適当な制限酵素を用いて消化し、E.コリに対
し適合する、pBR322のようなベクター中へクローン化し
た。
CE含有プラスミドの同定は、プソイドモナススペックコ
レステリンエステラーゼのペプチド配列から誘導された
オリゴヌクレオチドを経て行なわれた。CEタンパク質の
アミノ酸終端部から誘導されたオリゴヌクレオチド試料
を使用して、プソイドモナススペックDNAの2.1kbの大き
さのPstI−フラグメントを単離し、pBR322中へサブクロ
ーン化した。DNA配列決定により、このフラグメントは
コレステリンエステラーゼのＮ−終端部のみをコードす
ることが判明した。試料としてPstIのフラグメントを用
いて、CE−コードDNAのＣ終端部を約1.1kbの大きさのSa
1Iフラグメントと同定し、同様にpBR322中へサブクロー
ン化した。
レステリンエステラーゼのペプチド配列から誘導された
オリゴヌクレオチドを経て行なわれた。CEタンパク質の
アミノ酸終端部から誘導されたオリゴヌクレオチド試料
を使用して、プソイドモナススペックDNAの2.1kbの大き
さのPstI−フラグメントを単離し、pBR322中へサブクロ
ーン化した。DNA配列決定により、このフラグメントは
コレステリンエステラーゼのＮ−終端部のみをコードす
ることが判明した。試料としてPstIのフラグメントを用
いて、CE−コードDNAのＣ終端部を約1.1kbの大きさのSa
1Iフラグメントと同定し、同様にpBR322中へサブクロー
ン化した。
DNAから誘導された、オーバーラップPstI−およびSalI
フラグメントのアミノ酸配列は、316個のアミノ酸の開
いた読み枠を生じた。成熟タンパク質の分子量は30770D
である。
フラグメントのアミノ酸配列は、316個のアミノ酸の開
いた読み枠を生じた。成熟タンパク質の分子量は30770D
である。
コレステリンエステラーゼは、周縁質ないしは外膜中に
局在せる酵素である。24個のアミノ酸のシグナルペプチ
ドは分泌に責任がある。プソイドモナススペックから単
離された、精製された酵素の種々の調製品の配列決定に
よって見出されたタンパク質配列は均一でない。成熟コ
レステリンエステラーゼの位置＋１にアミノ酸Pheまた
はTrpが存在し（SEQ.ID.NO:1参照）、これによりアミノ
酸24と25の間ないしはアミノ酸25と26の間にシグナルペ
プチド切断部位が生じる。従って、E.コリ中に表現する
際、Ｎ末端は可変であってもよいことを考慮すべきであ
る。E.コリ中に認められるシグナルペプチド切断部位が
使用される（von Heijne,“Eur.J.Biochem."、第133巻
（1983年）、第17頁〜第21頁;von Heijne,,“J.Mol.Bio
l."、第184巻（1985年）、第99頁〜第105頁）。ベクタ
ーM13mgl Ecokが、かかるシグナルペプチド切断部位を
有する（WO88/09373参照）。このベクターは、プロモー
ターならびに翻訳開始部およびガラクトース結合タンパ
ク質（GBP）のシグナルペプチドを含有する、S.チフイ
ムリウム（S.typhimurium）のmgl−オペロン（Brenner
−LugerおよびBoos,“Mol.Gen.Genet."、第214巻（1988
年）、第579頁〜第587頁）からの約700bpの大きさのEco
RI/Bam HIDNAフラグメントを含有する。このシグナルペ
プチドの切断部位は、E.コリにおいてしばしば使用され
る（von Heijne,“Eur.J.Biochem."、第133巻（1983
年）、第17頁〜第21頁）。
局在せる酵素である。24個のアミノ酸のシグナルペプチ
ドは分泌に責任がある。プソイドモナススペックから単
離された、精製された酵素の種々の調製品の配列決定に
よって見出されたタンパク質配列は均一でない。成熟コ
レステリンエステラーゼの位置＋１にアミノ酸Pheまた
はTrpが存在し（SEQ.ID.NO:1参照）、これによりアミノ
酸24と25の間ないしはアミノ酸25と26の間にシグナルペ
プチド切断部位が生じる。従って、E.コリ中に表現する
際、Ｎ末端は可変であってもよいことを考慮すべきであ
る。E.コリ中に認められるシグナルペプチド切断部位が
使用される（von Heijne,“Eur.J.Biochem."、第133巻
（1983年）、第17頁〜第21頁;von Heijne,,“J.Mol.Bio
l."、第184巻（1985年）、第99頁〜第105頁）。ベクタ
ーM13mgl Ecokが、かかるシグナルペプチド切断部位を
有する（WO88/09373参照）。このベクターは、プロモー
ターならびに翻訳開始部およびガラクトース結合タンパ
ク質（GBP）のシグナルペプチドを含有する、S.チフイ
ムリウム（S.typhimurium）のmgl−オペロン（Brenner
−LugerおよびBoos,“Mol.Gen.Genet."、第214巻（1988
年）、第579頁〜第587頁）からの約700bpの大きさのEco
RI/Bam HIDNAフラグメントを含有する。このシグナルペ
プチドの切断部位は、E.コリにおいてしばしば使用され
る（von Heijne,“Eur.J.Biochem."、第133巻（1983
年）、第17頁〜第21頁）。
コレステリンエステラーゼのＣ−末端の、1.1kbの大き
さのSalI−フラグメントを完成するために、２つの相補
性オリゴヌクレオチド（SEQ.ID.NO:2および３、位置＋
１のアミノ酸Pheから位置＋30のアミノ酸valまでに相
当、参照）をベクターpUC18中へ挿入し、これによりpUC
18*が生成した。次いで、SalIで線形化されたベクターp
UC18*中へ、pBR322にサブクローン化された1.1kbの大き
さの、コレステリンエステラーゼのSalIフラグメントを
クローン化した。その際、プラスミドpCH Elが生じる。
さのSalI−フラグメントを完成するために、２つの相補
性オリゴヌクレオチド（SEQ.ID.NO:2および３、位置＋
１のアミノ酸Pheから位置＋30のアミノ酸valまでに相
当、参照）をベクターpUC18中へ挿入し、これによりpUC
18*が生成した。次いで、SalIで線形化されたベクターp
UC18*中へ、pBR322にサブクローン化された1.1kbの大き
さの、コレステリンエステラーゼのSalIフラグメントを
クローン化した。その際、プラスミドpCH Elが生じる。
GBPシグナルペプチドに融合するために、pCHElにクロー
ン化されたコレステリンエステラーゼ遺伝子をベクター
M13mgl Ecok中へサブクローン化した。そのために、ベ
クターM13mgl EcokをKpnIで切断し突出している３′−
末端をT4ポリメラーゼで消化し、SalIでトリミングし
た。こうして修飾したベクター中へ、pCH E1からのコレ
ステリンエステラーゼの、約280bpの長さのＮ−末端Pvu
II/SalIフラグメントを挿入した。その際、ベクターM13
mglEcoK CEが生じた。GBPのシグナルペプチドへの成熟
コレステリンエステラーゼの融合は、M13mgl EcoK CEの
一本鎖DNAにおける失欠突然変異誘発を経て行なわれ
る。オリゴヌクレオチド（SEQ.ID.NO:4またはSEQ.ID.N
O:5）でのハイブリッド形成によって、試験管内で二本
鎖に補完され、E.コリHB2154（Carter等、“Nucl.Acids
Pes."第13巻（1985年）、第4431頁〜第4443頁）に形質
転換された部分的ヘテロ二本鎖DNAが生じる。シグナル
ペプチド配列と成熟コレステリンエステラーゼ配列の間
になお付加的配列（GBP、Ecokカセットおよび５′−未
翻訳コレステリンエステラーゼ配列）を含有するかかる
DNA分子を、E.コリHB2154（DSM6541）中のEcok選択によ
って除去した。得られるクローンM13mgl CEは、制限分
析およびDNA配列決定によて識別された。使用したオリ
ゴヌクレオチドによって、２つの異なるM13mgl CE誘導
体が生じた。これらをEcoRIおよびXhoIで切断し、相応
する酵素で切断したベクターpCHEl中へ再クローン化し
た。その際、欠失突然変異誘発のためにオリゴヌクレオ
チドSEQ.ID.NO:4を使用した場合、成熟コレステリンエ
ステラーゼの完全な配列をGBPシグナルペプチド配列に
融合して含有するプラスミドが得られる。欠失突然変異
誘発のためにオリゴヌクレオチドSEQ.ID.NO:5を使用し
た場合には、成熟コレステリンエステラーゼ配列の位置
＋１にアミノ酸Trpを含有するプラスミドpBT mgl CE（D
SM5903）が得られる。
ン化されたコレステリンエステラーゼ遺伝子をベクター
M13mgl Ecok中へサブクローン化した。そのために、ベ
クターM13mgl EcokをKpnIで切断し突出している３′−
末端をT4ポリメラーゼで消化し、SalIでトリミングし
た。こうして修飾したベクター中へ、pCH E1からのコレ
ステリンエステラーゼの、約280bpの長さのＮ−末端Pvu
II/SalIフラグメントを挿入した。その際、ベクターM13
mglEcoK CEが生じた。GBPのシグナルペプチドへの成熟
コレステリンエステラーゼの融合は、M13mgl EcoK CEの
一本鎖DNAにおける失欠突然変異誘発を経て行なわれ
る。オリゴヌクレオチド（SEQ.ID.NO:4またはSEQ.ID.N
O:5）でのハイブリッド形成によって、試験管内で二本
鎖に補完され、E.コリHB2154（Carter等、“Nucl.Acids
Pes."第13巻（1985年）、第4431頁〜第4443頁）に形質
転換された部分的ヘテロ二本鎖DNAが生じる。シグナル
ペプチド配列と成熟コレステリンエステラーゼ配列の間
になお付加的配列（GBP、Ecokカセットおよび５′−未
翻訳コレステリンエステラーゼ配列）を含有するかかる
DNA分子を、E.コリHB2154（DSM6541）中のEcok選択によ
って除去した。得られるクローンM13mgl CEは、制限分
析およびDNA配列決定によて識別された。使用したオリ
ゴヌクレオチドによって、２つの異なるM13mgl CE誘導
体が生じた。これらをEcoRIおよびXhoIで切断し、相応
する酵素で切断したベクターpCHEl中へ再クローン化し
た。その際、欠失突然変異誘発のためにオリゴヌクレオ
チドSEQ.ID.NO:4を使用した場合、成熟コレステリンエ
ステラーゼの完全な配列をGBPシグナルペプチド配列に
融合して含有するプラスミドが得られる。欠失突然変異
誘発のためにオリゴヌクレオチドSEQ.ID.NO:5を使用し
た場合には、成熟コレステリンエステラーゼ配列の位置
＋１にアミノ酸Trpを含有するプラスミドpBT mgl CE（D
SM5903）が得られる。
例２ DNA平面上の活性中心の修飾による基質特異性の変化 コレステリンエステラーゼ／リパーゼの活性中心は、ア
ミノ酸配列−Gly−His−Ser−Ｘ−Glyによって定義され
た。シグナルペプチドを含めてこの配列は、プソイドモ
ナススペックリパーゼ／コレステリンエステラーゼの場
合、配列−Gly−His−Ser−His−Ser−Glyを有する109
〜113のアミノ酸が生じる。第１表には、リパーゼおよ
びコレステリンエステラーゼの選択の活性中心が示され
ている。
ミノ酸配列−Gly−His−Ser−Ｘ−Glyによって定義され
た。シグナルペプチドを含めてこの配列は、プソイドモ
ナススペックリパーゼ／コレステリンエステラーゼの場
合、配列−Gly−His−Ser−His−Ser−Glyを有する109
〜113のアミノ酸が生じる。第１表には、リパーゼおよ
びコレステリンエステラーゼの選択の活性中心が示され
ている。
コレステリンエステラーゼの特異性は、配列−Gly−His
−Ser−Ｘ−Gly中のアミノ酸Ｘの意図的交換によって変
えることができる。
−Ser−Ｘ−Gly中のアミノ酸Ｘの意図的交換によって変
えることができる。
109〜115のアミノ酸（シグナル配列を含む）をコードす
るCEコードDNAの配列は、次のとおりである： Gly His Ser His Gly Gly Pro ５′−GGC GAC AGC CAT GGC GGC CCG−３′ 相応する対向鎖は次のとおりである： ５′−CGG GCC GCC ATG GCT GTC GCC−３′ 次の19種のオリゴヌクレオチドが、指向された突然変異
誘発のために使用される： 突然変異誘発は、公知技術によりM13鋳型につき実施す
る（Amersham Nr.1523“試験管内突然変異誘発に向けら
れたオリゴヌクレオチド”）。
るCEコードDNAの配列は、次のとおりである： Gly His Ser His Gly Gly Pro ５′−GGC GAC AGC CAT GGC GGC CCG−３′ 相応する対向鎖は次のとおりである： ５′−CGG GCC GCC ATG GCT GTC GCC−３′ 次の19種のオリゴヌクレオチドが、指向された突然変異
誘発のために使用される： 突然変異誘発は、公知技術によりM13鋳型につき実施す
る（Amersham Nr.1523“試験管内突然変異誘発に向けら
れたオリゴヌクレオチド”）。
そのために、pBTmgl CEからのCEコードDNAの約970bpの
長さのSalIフラグメントを、SalIで切断したファージDN
A M13mp19の二本鎖形に結合する。一本鎖DNAの調製後、
相応するオリゴヌクレオチドを一本鎖DNAにハイブリッ
ド形成させ、クレノウポリメラーゼ、リガーゼおよび４
つのヌクレオチドトリホスフェートGTP、CTP、TTP、ATP
を使用して、オリゴヌクレオチドの５′→３′方向への
延長を実施する。二本鎖DNAがE.コリTGl（Amershamキッ
トNr.1523またはベーリンガー・マイハイムGmbHの突然
変異誘発キット、キット番号1269049から）に形質転換
する。個々のプラークをつつき、それに含まれているM1
3ファージを一本鎖DNA調製のために使用する。公知技術
によりDNA配列決定を実施し、こうして所望の突然変異
のための正確な交換を調べる。二本鎖DNAの調製後、約9
70bpの長さの突然変異したSalIフラグメントを単離す
る。次に、このフラグメントをSalIで切断したプラスミ
ドpBTmgl CEのベクターフラグメント中へ再クローン化
する。
長さのSalIフラグメントを、SalIで切断したファージDN
A M13mp19の二本鎖形に結合する。一本鎖DNAの調製後、
相応するオリゴヌクレオチドを一本鎖DNAにハイブリッ
ド形成させ、クレノウポリメラーゼ、リガーゼおよび４
つのヌクレオチドトリホスフェートGTP、CTP、TTP、ATP
を使用して、オリゴヌクレオチドの５′→３′方向への
延長を実施する。二本鎖DNAがE.コリTGl（Amershamキッ
トNr.1523またはベーリンガー・マイハイムGmbHの突然
変異誘発キット、キット番号1269049から）に形質転換
する。個々のプラークをつつき、それに含まれているM1
3ファージを一本鎖DNA調製のために使用する。公知技術
によりDNA配列決定を実施し、こうして所望の突然変異
のための正確な交換を調べる。二本鎖DNAの調製後、約9
70bpの長さの突然変異したSalIフラグメントを単離す
る。次に、このフラグメントをSalIで切断したプラスミ
ドpBTmgl CEのベクターフラグメント中へ再クローン化
する。
例３ プソイドモナスからのリパーゼ／コレステリンエステラ
ーゼの表現 プラスミドpBTmgl CEをNaeIで切断する。この切断部位
に、SacIリンカーｄ（CGTCGACG）を結合する。DNAの調
製後、SacIで切断されることによりSacIリンカーの有効
な結合を調べ、Eco RIおよびSacIでの切断後、約1800bp
の長さのフラグメントを単離する。ベクターpBT306.1
（ヨーロッパ特許EP−A187138号により製造）を、Eco R
IおよびSacIで切断する。このベクター中へ、約1800bp
の長さのフラグメントを結合する。こうして生じるプラ
スミドは標識pBT306CEHis（Wt）を有する。
ーゼの表現 プラスミドpBTmgl CEをNaeIで切断する。この切断部位
に、SacIリンカーｄ（CGTCGACG）を結合する。DNAの調
製後、SacIで切断されることによりSacIリンカーの有効
な結合を調べ、Eco RIおよびSacIでの切断後、約1800bp
の長さのフラグメントを単離する。ベクターpBT306.1
（ヨーロッパ特許EP−A187138号により製造）を、Eco R
IおよびSacIで切断する。このベクター中へ、約1800bp
の長さのフラグメントを結合する。こうして生じるプラ
スミドは標識pBT306CEHis（Wt）を有する。
このプラスミドを生体内伝達（Gene第16巻（1981年）第
237頁〜第247頁）によってプソイドモナス突然変異体DS
M5902に伝達する。この菌株は、活性を有しないコレス
テリンエステラーゼをコードすることによって識別され
る。第２表は、種々のプソイドモナス属菌株における表
現を示す。活性測定は例５に記載したように行なった。
237頁〜第247頁）によってプソイドモナス突然変異体DS
M5902に伝達する。この菌株は、活性を有しないコレス
テリンエステラーゼをコードすることによって識別され
る。第２表は、種々のプソイドモナス属菌株における表
現を示す。活性測定は例５に記載したように行なった。
例４ プラスミド上にクローン化したコレステリンエステラー
ゼを含有する微生物の培養 菌株の培養は、１につきバクトトリプトン（Difco）1
6g、酵母エキス（Difco）10gおよび塩化ナトリウム5gを
含有する培地中で、誘発物質なしで30℃で夜通し行なっ
た。
ゼを含有する微生物の培養 菌株の培養は、１につきバクトトリプトン（Difco）1
6g、酵母エキス（Difco）10gおよび塩化ナトリウム5gを
含有する培地中で、誘発物質なしで30℃で夜通し行なっ
た。
第２表は、得られたコレステリンエステラーゼ活性を示
す。
す。
（Pseudmonas alcaligenes） ＊基質としてコレステリンリノレエートを有する培養液
の550nmにおける単位/l/OD（５つの独立測定からの平
均、例６により測定）。
の550nmにおける単位/l/OD（５つの独立測定からの平
均、例６により測定）。
例５ 例２に示したように、活性中心におけるアミノ酸Ｘの交
換によってコレステリンエステラーゼの種々の誘導体を
製造した。112のアミノ酸Hisをグルタミンと交換する
と、基質コレステリン−３−グルタル酸・レゾルフィン
エステル（エステラーゼ着色基質、例5b）に比して活性
が増加する。
換によってコレステリンエステラーゼの種々の誘導体を
製造した。112のアミノ酸Hisをグルタミンと交換する
と、基質コレステリン−３−グルタル酸・レゾルフィン
エステル（エステラーゼ着色基質、例5b）に比して活性
が増加する。
これらのエステラーゼは、第３表から認められるよう
に、種々の基質に対して著しく異なる酵素活性を示す。
これは、基質混合物の反応の際に有利である。
に、種々の基質に対して著しく異なる酵素活性を示す。
これは、基質混合物の反応の際に有利である。
ａ）リパーゼ定量（方法１） リパーゼ定量のために、1,2−ｏ−ジラウリル−rac−グ
リセロ−３−グルタル酸−レゾルフィンエステルをリパ
ーゼで切断する。生じるグルタル酸−レゾルフィンエス
テルを加水分解してグルタル酸およびレゾルフィンを得
る。572nmにレゾルフィンの吸光が測定される。
リセロ−３−グルタル酸−レゾルフィンエステルをリパ
ーゼで切断する。生じるグルタル酸−レゾルフィンエス
テルを加水分解してグルタル酸およびレゾルフィンを得
る。572nmにレゾルフィンの吸光が測定される。
試薬： 1.基質溶液 1,2−ｏ−ジラウリル−rac−グリセロ−３−グルタル酸
レゾルフィンエステル1mgをジオキサン／テシット（The
sit登録商標（ベーリンガー・マンハイム社、No.83663
0））（1:1）1mlに溶解。
レゾルフィンエステル1mgをジオキサン／テシット（The
sit登録商標（ベーリンガー・マンハイム社、No.83663
0））（1:1）1mlに溶解。
2.緩衝液 0.1mol/lのリン酸カリウム緩衝液、pH6.8 3.試料溶液 リパーゼ６〜８単位/lリン酸カリウム緩衝液、pH6.8 定量を実施するために、緩衝液0.85mlと基質溶液0.1ml
とを混合し、25℃に温置し、反応を試料溶液0.05mlで開
始する。572nmにおける吸光変化を追跡し、線型範囲か
らΔE/minを計算する。
とを混合し、25℃に温置し、反応を試料溶液0.05mlで開
始する。572nmにおける吸光変化を追跡し、線型範囲か
らΔE/minを計算する。
リパーゼの活性は次式によって計算する： V :試験容積 （1ml） v :試料容積 0.05ml ε:pH6.8、572nmにおけるレゾルフィンの吸光係数（60.
0［１・m mol-1・cm-1］） d :キュベットの層厚（1cm） ΔE/min:吸光変化/min ｂ）コレステリンエステラーゼ定量（方法２） この方法では、基質コレステリル−３−グルタル酸−レ
ゾルフィンエステルをコレステリンエステラーゼでコレ
ステリンとグルタル酸レゾルフィンエステルとに交換す
る。グルタル酸レゾルフィンエステルを加水分解し、生
じるレゾルフィンの色を572nmで測定する。
0［１・m mol-1・cm-1］） d :キュベットの層厚（1cm） ΔE/min:吸光変化/min ｂ）コレステリンエステラーゼ定量（方法２） この方法では、基質コレステリル−３−グルタル酸−レ
ゾルフィンエステルをコレステリンエステラーゼでコレ
ステリンとグルタル酸レゾルフィンエステルとに交換す
る。グルタル酸レゾルフィンエステルを加水分解し、生
じるレゾルフィンの色を572nmで測定する。
試薬 1.基質溶液 基質コレステリル−３−グルタル酸／レゾルフィンエス
テル2mgを、ジオキサン／テシット（Thesit登録商標）
（1:1）1mlおよび酢酸３μｌ（2mol/l）に溶解 2.緩衝液 0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液、pH6.8 3.試料溶液 コレステリンエステラーゼ３〜５単位/lリン酸カリウム
緩衝液（6.8）で希釈測定の実施のために、緩衝液0.85m
lと基質溶液0.05mlとを混合し、25℃に温置し、反応を
試料溶液0.1mlで開始する。572nmにおける吸光変化を追
跡し、線型範囲からΔE/minを計算する。
テル2mgを、ジオキサン／テシット（Thesit登録商標）
（1:1）1mlおよび酢酸３μｌ（2mol/l）に溶解 2.緩衝液 0.1mol/lリン酸カリウム緩衝液、pH6.8 3.試料溶液 コレステリンエステラーゼ３〜５単位/lリン酸カリウム
緩衝液（6.8）で希釈測定の実施のために、緩衝液0.85m
lと基質溶液0.05mlとを混合し、25℃に温置し、反応を
試料溶液0.1mlで開始する。572nmにおける吸光変化を追
跡し、線型範囲からΔE/minを計算する。
コレステリンエステラーゼの活性は次式によって確かめ
られる。
られる。
V :試験容積 （1ml） v :試料容積 （0.1ml） ε:pH6.8、572nmにおけるレゾルフィンの吸光係数（60.
0［１・m mol-1・cm-1］） d :キュベットの層厚 （1cm） ΔE/min:吸光変化/min Ｃ）コレステリンの測定 この方法によれば、基質をコレステリンエステラーゼで
コレステリンと脂肪酸とに分解し、生じたコレステリン
をコレステリンエステラーゼでコレステリンと過酸化水
素とに変換し、生じた過酸化水素を４−アミノアンチピ
リンとフェノールとで色素に変換し、500nmにおけるそ
の色を光度計で測定する。
0［１・m mol-1・cm-1］） d :キュベットの層厚 （1cm） ΔE/min:吸光変化/min Ｃ）コレステリンの測定 この方法によれば、基質をコレステリンエステラーゼで
コレステリンと脂肪酸とに分解し、生じたコレステリン
をコレステリンエステラーゼでコレステリンと過酸化水
素とに変換し、生じた過酸化水素を４−アミノアンチピ
リンとフェノールとで色素に変換し、500nmにおけるそ
の色を光度計で測定する。
試薬： 1.反応混合物 0.25mol/l リン酸カリウム緩衝液、pH7.05mg/ml コー
ル酸ナトリウム 2.4mg/ml フェノール 0.4mg/ml ４−アミノアンチピリン 2.ペルオキシダーゼ溶液 リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）0.25mol/l中のペルオキ
シダーゼ 6000単位/ml 3.コレステリンオキシダーゼ NaCl lmol/l中のコレステリンオキシダーゼ（活性25単
位/mg） 25単位/ml 4.基質溶液 次の基質の１つ ２μmol/l コレステリルリノレエート コレステリルオクタノエート コレステリル−ｎ−ブチレート コレステリルオレエート 測定を実施するために、反応混合物2.5ml、ペルオキシ
ダーゼ溶液0.01ml、コレステリンオキシダーゼ溶液0.2m
lおよび基質溶液0.5mlを混合し、37℃に温置し、反応を
試料0.05mlで開始する。吸光変化を線型範囲からΔE/mi
nで追跡する。
ル酸ナトリウム 2.4mg/ml フェノール 0.4mg/ml ４−アミノアンチピリン 2.ペルオキシダーゼ溶液 リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）0.25mol/l中のペルオキ
シダーゼ 6000単位/ml 3.コレステリンオキシダーゼ NaCl lmol/l中のコレステリンオキシダーゼ（活性25単
位/mg） 25単位/ml 4.基質溶液 次の基質の１つ ２μmol/l コレステリルリノレエート コレステリルオクタノエート コレステリル−ｎ−ブチレート コレステリルオレエート 測定を実施するために、反応混合物2.5ml、ペルオキシ
ダーゼ溶液0.01ml、コレステリンオキシダーゼ溶液0.2m
lおよび基質溶液0.5mlを混合し、37℃に温置し、反応を
試料0.05mlで開始する。吸光変化を線型範囲からΔE/mi
nで追跡する。
コレステリンエステラーゼの活性は次のようにして計算
する： ε:500nmにおける色素の吸光係数6.89［m mol-1・１・c
m-1］ ΔE/min:吸光変化/min SEQ ID NO:4 配列の型：核酸 配列の長さ:26塩基対 GAGCCGAACC AGAAAGCCGC GTGCGC 26 SEQ ID NO:5 配列の型：核酸 配列の長さ:26塩基対 CTCGAGCCGA ACCAAGCCGC GTGCGC 26
する： ε:500nmにおける色素の吸光係数6.89［m mol-1・１・c
m-1］ ΔE/min:吸光変化/min SEQ ID NO:4 配列の型：核酸 配列の長さ:26塩基対 GAGCCGAACC AGAAAGCCGC GTGCGC 26 SEQ ID NO:5 配列の型：核酸 配列の長さ:26塩基対 CTCGAGCCGA ACCAAGCCGC GTGCGC 26
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/44 6807−4Ｂ 1/60 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 フィッシャー，シュテファン ドイツ連邦共和国 デー―8128 ポリング ヤコビフェルトヴェーク 11 (56)参考文献 特開 昭58−175488（ＪＰ，Ａ)
Claims (15)
- 【請求項１】活性中心が配列−Gly−His−Ser−Ｘ−Gly
−（ここでＸはアミノ酸HiSを表わす）を有する、SEQ.I
D.No.1による配列を有しかつプラスミドDSM5902、DSM59
03またはDSM6541から入手しうるコレステリンエステラ
ーゼ遺伝子をベクター中でクローン化し、微生物をこの
ベクターで形質転換し、コレステリンエステラーゼ遺伝
子を発現することにより、変化した基質特異性を有する
コレステリンエステラーゼの製造方法において、突然変
異誘発によって活性中心の部位Ｘのアミノ酸HiSを他の
アミノ酸Leuと交換することを特徴とする変化した基質
特異性を有するコレステリンエステラーゼの製造方法。 - 【請求項２】コレステリンエステラーゼ遺伝子から、活
性中心のコードを有するオリゴヌクレオチドを切取り、
その代りに部位Ｘに他のアミノ酸のコードを有する新し
いオリゴヌクレオチドを遺伝子に結合することを特徴と
する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】新しいオリゴヌクレオチドを化学的に合成
することを特徴とする請求の範囲２載の方法。 - 【請求項４】新しいオリゴヌクレオチドを固相合成を用
いて得ることを特徴とする請求項２または３記載の方
法。 - 【請求項５】新しいオリゴヌクレオチドをホスホルアミ
ダイト法によって製造する請求項２から４までのいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項６】形質転換のために、活性のコレステリンエ
ステラーゼを発現しない微生物を使用することを特徴と
する請求項１から５までのいずれ１項記載の方法。 - 【請求項７】コレステリンエステラーゼを発現する微生
物を使用し、菌株を突然変異誘発によって変えて、菌株
がもはや活性のコレステリンエステラーゼを発現しない
ようにし、引き続きこの菌株を、変化したコレステリン
エステラーゼ遺伝子をコードするベクターで形質転換す
ることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項８】プソイドモナススペックDSM5902を使用す
ることを特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】出発菌株として、E.コリまたはプソイドモ
ナススペックを使用することを特徴とする請求項７記載
の方法。 - 【請求項１０】ＸのコドンとしてHisに対してCAT、Met
に対してATG、Pheに対してTTC、Glnに対してCAG、Leuに
対してTTG、Ileに対してATC、Valに対してGTC、Serに対
してTCT、Proに対してCCC、Thrに対してACT、Alaに対し
てGCT、Tyrに対してTAT、Hisに対してCAC、Asnに対して
AAC、Lysに対してAAG、Aspに対してGAC、Gluに対してGA
G、Cysに対してTGT、Argに対してCGTおよびGlyに対して
GGAを使用することを特徴とする請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】ベクターとしてpBR322またはbBT306.1
（ヨーロッパ公開特許EP−A187138号に記載）を使用す
ることを特徴とする請求項１から10までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項１２】コレステリンエステラーゼ遺伝子中のヌ
クレオチド配列を変えることにより活性中心外のペプチ
ドフレームをも変えることを特徴とする請求項１から11
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１３】請求項１から12までに記載の方法のいず
れかによって得られるコレステリンエステラーゼ。 - 【請求項１４】請求項13によるコレステリンエステラー
ゼまたは幾つかのかかるエステラーゼの混合物を使用す
る、コレステリンの測定方法。 - 【請求項１５】請求項13による少なくとも１つのコレス
テリンエステラーゼを含有する、体液中のコレステリン
の測定試薬。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4018152.9 | 1990-06-06 | ||
| DE4018152A DE4018152A1 (de) | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Cholesterinesterasen mit variabler substrat-spezifitaet |
| PCT/EP1991/001089 WO1991018987A1 (de) | 1990-06-06 | 1991-06-06 | Cholesterinesterasen mit variabler substrat-spezifität |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04506609A JPH04506609A (ja) | 1992-11-19 |
| JPH0779688B2 true JPH0779688B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=6407905
Family Applications (1)
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