JPH0770207A - β−１，３−グルカンの新規製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】窒素源として無機塩を使用しないβ−１，３−
グルカンの製造法を提供する。 【構成】β−１，３−グルカンを生産する能力を有する
微生物を、該微生物が資化しうる有機カルボン酸のアン
モニウム塩を窒素源とする培地で培養し、β−１，３−
グルカンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とするβ−１，３−グルカンの製造法。 【効果】本発明は、β−１，３−グルカンの製造法にお
いて、β−１，３−グルカンを生産する能力を有する微
生物を、該微生物が資化しうる有機カルボン酸のアンモ
ニウム塩を窒素源とする培地で培養するため、培地のｐ
Ｈが低下せず、ｐＨ修正のための炭酸カルシウムまたは
アルカリイオン等の添加が不要である。このため培養は
悪影響を及ぼされることなく、かつ培地中に塩も形成さ
れないため、該グルカンの精製が容易となり工業的に優
れた製造法である。さらに、本発明の方法によれば、生
産性が高く、対糖収率も高くβ−１，３−グルカンを製
造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はβ−１，３−グルカンの
製造法に関する。本発明で得られるβ−１，３−グルカ
ンは食品工業、化学工業または土木工業等の各分野にお
いて使用しうる。

【０００２】

【従来の技術】天然界にはβ−１，３−グルカンを生産
する微生物が種々存在する。例えば、アルカリゲネス属
またはアグロバクテリウム属などの微生物によって菌体
外に産出されるβ−１，３−グルカンとしてカードラン
が（ニュー・フード・インダストリー、２０巻、４９頁
(１９７８)、特公昭４８−３２６７３号公報等）、ユー
グレナ属などの微生物によって産出されるβ−１,３−
グルカンとしてパラミロン（特開昭６０−５８０６４号
公報等）等がそれぞれ知られている。従来、β−１，３
−グルカンの製造法としてこれらの微生物を用いた培養
法では、窒素源として、燐酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、塩酸アンモニウム等のアンモニウムを含む種々
の無機塩や尿素、アスパラギン等が用いられている〔特
公昭４８−３２６７３号公報、アグリカルチュラル・バ
イオロジカル・ケミストリー、３０巻、７６４〜７６９
頁(１９６６)、特開昭６０−５８０６４号公報等〕。こ
れらの無機塩を使用する場合、培養中、培地のｐＨが低
下するため、培地へ炭酸カルシウムを添加する、あるい
は、ｐＨを測定しながら苛性ソーダ等のアルカリイオン
を添加する等により所定のｐＨに維持修正する手段が取
られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来法では、培地に添
加された炭酸カルシウムが、窒素源として添加された化
合物中の陰イオン、例えば燐酸、硫酸または塩酸等と反
応し、難溶性の塩が生成される、あるいは、ｐＨ修正用
として添加されたアルカリイオンが培養に悪影響を与え
たりすることが知られている。さらに、培養液中に塩が
形成された場合、これらの塩を精製工程で除去するとい
う余分な単位操作、工程等が必要となり、いずれも好ま
しいものではない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】かかる状況に鑑み、本発
明者らは、培養中に塩を形成させることなく、かつ生産
性および対糖収率の高いβ−１，３−グルカンの製造法
を鋭意検討し、本発明を完成するに至った。すなわち、
本発明は、（１）β−１，３−グルカンを生産する能力
を有する微生物を、該微生物が資化しうる有機カルボン
酸のアンモニウム塩を窒素源とする培地で培養し、β−
１，３−グルカンを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするβ−１，３−グルカンの製造法、（２）
有機カルボン酸が炭素数３ないし６のモノないしトリカ
ルボン酸である上記（１）記載の製造法、（３）有機カ
ルボン酸がクエン酸回路にあずかる有機カルボン酸であ
る上記（１）記載の製造法、（４）有機カルボン酸が酸
性アミノ酸である上記（１）記載の製造法、（５）有機
カルボン酸がコハク酸、フマール酸、α−ケトグルタル
酸または乳酸である上記（１）記載の製造法、（６）有
機カルボン酸がコハク酸である上記（１）記載の製造
法、（７）有機カルボン酸の使用量が約０.５ないし２
０ｇ／リットルである上記（１）記載の製造法、（８）
有機カルボン酸のアンモニウム塩が、培地中の全窒素量
が約０.４ないし３ｇ／リットルになる量である上記
（１）記載の製造法、（９）β−１，３−グルカンがカ
ードランである上記（１）記載の製造法、および（１
０）微生物がアグロバクテリウム属またはアルカリゲネ
ス属に属する微生物である上記（１）記載の製造法を提
供するものである。

【０００５】本発明のβ−１，３−グルカンは、グルコ
ースが主にβ−１，３−結合によって結合されている多
糖類であり、例えばカードラン、パラミロン等が挙げら
れ、特にカードランが好ましい。本発明で用いられる微
生物は、β−１，３−グルカンを生産するものであれば
いずれのものでもよい。例えば、β−１，３−グルカン
がカードランである場合、前記のアルカリゲネス属また
はアグロバクテリウム属に属する微生物が挙げられる。
具体的には、アルカリゲネス属に属する微生物として、
例えば、アルカリゲネス・フェカリス・バール・ミクソ
ゲネス１０Ｃ３Ｋ（アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第３０巻，１９６頁(１９６６年)、
アルカリゲネス・フェカリス・バール・ミクソゲネス１
０Ｃ３Ｋの変異株ＮＴＫ−ｕ（ＩＦＯ １３１４０）
（特公昭４８−３２６７３号公報）等が挙げられる。ま
た、アグロバクテリウム属に属する微生物としては、例
えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター（ＩＦＯ
１３１２７）およびその変異株Ｕ−１９（ＩＦＯ １３
１２６）（特公昭４８−３２６７４号公報）等が挙げら
れる。なお、アルカリゲネス・フェカリス・バール・ミ
クソゲネス１０Ｃ３（ＩＦＯ １３７１４）は、ＩＦＯ
リサーチ・コミュニケーションズ（IFO Res. Com
m.）、１５巻、５７〜７５頁（１９９１年）およびリス
ト・オブ・カルチャーズ（List of Cultures）第９版
（１９９２年）（ＩＦＯ発行）にアグロバクテリウム・
エスピー・バイオバー Ｉ（Agrobacterium sp. biova
r Ｉ）（ＩＦＯ １３７１４）として記載されている。

【０００６】例えば、パラミロンである場合、ユーグレ
ナ属に属する微生物等が挙げられる。具体的にはユーグ
レナ・グラシリス クレブス（Euglena gracilis Kle
bs）ＮＩＥＳ−４７、ユーグレナ・グラシリス クレブ
スＮＩＥＳ−４８あるいはユーグレナ・グラシリス・バ
ラェティ・バチラリス・プリンシェイン（Euglena gra
cilis var. bacillaris pringsheim）ＮＩＥＳ−４
９等が挙げられる。これらの菌株は、(財)地球・人間環
境フォーラムに保管されている公知株である。

【０００７】本発明で用いる窒素源としての有機カルボ
ン酸のアンモニウム塩における有機カルボン酸は、β−
１，３−グルカンを生産する能力を有する微生物が資化
しうるものであればいずれでもよい。好ましくは、酸性
を示す有機カルボン酸である。さらに好ましくは、炭素
数３ないし６のモノないしトリカルボン酸である。特に
好ましくは、クエン酸回路にあずかる有機カルボン酸お
よびアミノ酸等である。ここで、クエン酸回路とは、ト
リカルボン酸回路、ＴＣＡ回路、クレブス回路などとも
よばれるもので、糖・脂肪酸・多くのアミノ酸などの炭
素骨格を最終的に完全酸化するための代謝回路である。
クエン酸回路にあずかる有機カルボン酸としては、例え
ば、コハク酸、フマール酸、α−ケトグルタル酸、クエ
ン酸、リンゴ酸等が挙げられる。有機カルボン酸として
は、コハク酸、フマール酸、α−ケトグルタル酸、乳酸
が好ましい。アミノ酸としては、例えば、グルタミン
酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリン、セリン、ス
レオニン、ヒスチジン等が挙げられる。このうちアスパ
ラギン酸やグルタミン酸等の酸性アミノ酸が好ましい。
本発明で用いる有機カルボン酸のアンモニウム塩は、培
地中でアンモニウム塩を形成しうる状態のものであれば
よく、あらかじめ有機カルボン酸のアンモニウム塩とし
て培地に添加する、あるいは有機カルボン酸とアンモニ
ウム塩とを別々に培地に添加する等、いずれの方法を採
用してもよい。とりわけ有機カルボン酸とアンモニウム
塩とを別々に培地に添加する方法が好ましい。

【０００８】有機カルボン酸のアンモニウム塩の使用量
は、培地中の全Ｎ量が約０.４〜３ｇ／リットルになる
ように適宜調製される。培地中の全Ｎ量は、好ましくは
約０.６〜１.８ｇ／リットルである。例えば、有機カル
ボン酸とアンモニウム塩とを別々に培地に添加する場
合、有機カルボン酸の使用量は、使用する微生物により
適宜選択されるが、培地中の全Ｎ量が約０.４〜３ｇ／
リットルとなるように調製されるのが好ましい。例え
ば、β−１，３−グルカンがカードランである場合、有
機カルボン酸の使用量は約０.５〜２０ｇ／リットルが
好ましい。さらに好ましくは約１.５〜１０ｇ／リット
ルである。有機カルボン酸が、例えばコハク酸の場合、
約１.５〜１０ｇ／リットルが使用しうる。好ましくは
約２〜６ｇ／リットルである。アンモニウム塩としては
無機のアンモニウム塩またはこの水溶液が好ましい。さ
らに好ましくはアンモニア水を用いる。例えば、アンモ
ニア水を使用する場合には、アンモニア水中のＮ量を算
出して使用するアンモニア水の量を選択すればよい。こ
れら有機カルボン酸のアンモニウム塩、有機カルボン
酸、アンモニウム塩の培地への添加方法は、培養開始時
に全量添加する、また、培養中に分割して添加する等、
いずれの方法を用いてもよい。

【０００９】尿素や硝酸塩は、培地中のＮ量が前述の本
発明の範囲内にあるようにすれば、培地に添加してもよ
い。前述の培地の成分以外の成分としては、通常のβ−
１，３−グルカンの培養に用いられる培地の成分が利用
される。炭素源として、例えば、ぶどう糖、果糖、蔗
糖、粗糖、糖蜜（甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜等）および各種澱
粉（例、タピオカ澱粉，サゴヤシ澱粉，甘薯澱粉，馬鈴
薯澱粉，トウモロコシ澱粉等）の糖化液などがあげられ
る。燐酸源としては、例えば、燐酸一カリウム、燐酸二
カリウム、燐酸一ナトリウム、燐酸二ナトリウムなどが
あげられる。これらの培地成分は適宜、単独でまたは二
種以上組み合わせて使用する。さらに、菌の生育に必要
な無機物（例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウ
ム、マンガン、鉄および亜鉛など）の硫酸塩、塩酸塩、
炭酸塩および燐酸塩等の塩類、あるいは、菌の生育に必
要なアミノ酸類、ビタミン類などを適宜選択して、これ
らを単独または、２種以上組合わせて用いてもよい。さ
らに、必要に応じ、シリコンオイルなどの消泡剤等を添
加してもよい。

【００１０】また、培養中のｐＨは修正しなくても十分
であるが、アルカリや酸を用いて、より好ましいｐＨ値
に修正してもかまわない。培養の温度は使用する微生物
の至適生育温度などにより適宜選択すればよく、通常約
２５〜３５℃である。培養時間はβ−１，３−グルカン
の生成量が最大に達するまで培養すればよい。通常約４
０〜１２０時間である。上記の培地に蓄積されたβ−
１，３−グルカンは、公知の手段（例、遠心分離、ろ
過、膜分離等）によって採取され、必要に応じ精製すれ
ばよい（特公昭４８−３２６７３号、特公昭４８−３２
６７４号公報等）。

【００１１】本発明で得られるβ−１，３−グルカンは
食品工業、化学工業、土木工業等の各分野において使用
しうる。例えば食品に用いる場合、増粘剤、結着剤とし
て用い得る。対象食品としては、特に限定されないが、
例えば魚肉加工品類（例、蒲鉾、ちくわ、はんぺん、て
んぷら、蟹足蒲鉾、魚肉ソーセージ等）、畜肉加工品類
（例、ソーセージ、コンビーフ、ロースハム、ハンバー
グ、肉だんご等）、調理加工食品類（例、ギョウザ、シ
ューマイ等）、めん類（例、生・蒸し・茹で中華めん、
うどん、即席めん、そば、焼きそば、はるさめ、ビーフ
ン、マカロニ、スパゲッティ、ギョウザの皮、シュウマ
イの皮等）、大豆加工品類（例、豆腐、凍り豆腐、油
揚、がんもどき等）、調味料類（例、味噌、ソース類、
ケチャップ、たれ等）、飲料類、ペースト食品類（例、
ジャム、マーマレード、ピーナッツバター、フラワーペ
ースト等）、あん類、珍味食品類、乳製品類（例、バタ
ー、マーガリン、チーズ、ホイップドクーム等）、餅・
団子類（例、わらび餅、みたらし団子、ぼた餅類）、米
飯類、菓子類（例、あられ、おかき、せんべい、キャン
ディー、クッキー、羊羹、和生菓子、油揚げ菓子、ババ
ロア、ムース、シュークリーム、マシュマロ、チューイ
ンガム、アイスクリーム、アスピックゼリー等）が挙げ
られる。

【００１２】本発明によって得られたβ−１，３−グル
カンはそれ自体または他の食品素材と組み合わせること
により、種々のタイプの食品を作ることができる。該食
品としては、例えばこんにゃく様食品、くらげ様食品、
各種ゼリー類、シート状・ソーメン状等の各種成型食
品、煮こごり様食品、米飯の成型品、食用フィルム、低
カロリー食品、食物繊維含有食品等が挙げられる。例え
ば、化学工業、土木工業分野等で用いられる場合、水硬
性組成物（例、コンクリート、モルタル等）の分離低減
剤として用い得る。

【００１３】

【実施例】以下に実験例および実施例を示し、本発明を
さらに詳しく説明する。後記の実験例および実施例に記
載のアグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ
１０Ｃ３Ｋは１９９３年６月２９日より受託番号ＩＦＯ
１５５０６として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に、
また１９９３年７月６日より受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
４３５７として通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所にそれぞれ寄託されている。 実験例１ 〔表１〕に示す種培地を１リットル調製し、ｐＨ７に調
整し、ついで、２００ml用三角フラスコに２０ml分注
後、オートクレーブにて１１８℃で１５分間滅菌した。
この培地へ、アグロバクテリウム・エスピー・バイオバ
ー Ｉ（Agrobacterium sp. biovar Ｉ）（ＩＦＯ １３
７１４）の斜面培養物を１エーゼ接種した。これを３２
℃で２４時間培養し、種培養終了液とした。〔表２〕に
示す主培地に、窒素源として〔表３〕に示す各アンモニ
ウム塩を、培地中のＮ量が０.６４ｇ／リットルとなる
ように各々添加し、ｐＨ７.５に調整した。各窒素源を
含む培地を各々等分し、一方の培地のみに炭酸カルシウ
ムを０.３Ｗ／Ｖ％となるように添加した。一方、窒素
源としてコハク酸２.０ｇ／リットルおよびアンモニア
水約３.０ml／リットルを培地中のＮ量が約０.６１ｇ／
リットルとなるように添加した主培地を調製し（ｐＨ
７.５）、これを等分し、一方の培地のみに炭酸カルシ
ウムを０.３Ｗ／Ｖ％となるように添加した。上記の各
培地を２００ml用三角フラスコに２０mlずつ分注し、オ
ートクレーブにて１１８℃で１５分間滅菌した。ただ
し、グルコースは別途滅菌し、種培地の移植前に所定量
添加した。

【００１４】これらの主培地に前述の種培養終了液を２
mlずつ移植して、３２℃で９６時間培養した。この培養
終了液１０mlに、１.０Ｎの苛性ソーダ５０mlずつ添加
後、約１時間撹拌し、培養終了液中に生成したカードラ
ンを溶解した。遠心分離により菌体を除去した後該液を
適宜希釈して、フェノール硫酸法により全糖量を測定し
た。さらに、培養液上清中のグルコース残量をグルコー
ス測定用キット（テクニコン社(製)）により定量した。
全糖量よりグルコース残量を差引き、その値に０.９を
乗じてカードラン生成量とした。各培地におけるカード
ラン生成量を〔表３〕に示す。

【表１】

【００１５】

【表２】

【００１６】

【表３】

【００１７】窒素源として、リン酸水素二アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムを用いた
培地では、炭酸カルシウム無添加では、ほとんどカード
ランを生成せず、炭酸カルシウムの添加が必要であるこ
とが分かる。一方、尿素や硝酸アンモニウムを用いた場
合は、炭酸カルシウムの添加の有無にかかわらずカード
ランは生成したが、その生成量はいずれも少なかった。
これらに比べ、コハク酸アンモニウムを用いた培地で
は、炭酸カルシウムを添加しなかった方がカードランの
生成量は多かった。また、培養上清中の全糖量は、グル
コース残量とほとんど同一値を示した。これより、上清
中にはオリゴマーはほとんど存在していないことがわか
った。

【００１８】実験例２ コハク酸２.０ｇを約５００mlの水道水に溶解したもの
を３種用意し、これらの溶液を各々水酸化ナトリウム、
水酸化カリウムまたは水酸化カルシウムで中和し（ｐＨ
７.５）、ついでグルコース ７５.０ｇ、(ＮＨ₄)₂ＨＰ
Ｏ₄ ３.０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １.０ｇ、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ ０.５ｇおよびＣaＣＯ₃ ３.０ｇを添加後、水で全
量を１リットルとして主培地とした。これらの培地を実
験例１に準じて滅菌した。一方、実験例１と同様の方法
により、コハク酸アンモニウムを窒素源とする主培地を
調製した。コハク酸の代わりにフマール酸を用いて、前
記と同様の方法により主培地を調製した。これらの主培
地に、実験例１と同様の方法により培養したアグロバク
テリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Agrobacterium
sp. biovar Ｉ）（ＩＦＯ １３７１４）の種培養終了
液を２mlずつ接種し、３２℃で９６時間培養した。

【００１９】培養終了液中のカードランの生成量を実験
例１に準じて測定した。結果を〔表４〕に示す。

【表４】

【００２０】コハク酸およびフマール酸のどちらにおい
ても、アンモニウム塩として使用したものが、炭酸カル
シウム無添加にもかかわらず最も高いカードラン生成量
を示した。 実験例３ 〔表２〕に示す主培地の窒素源として、アンモニア水３
ml／リットルおよび〔表５〕に示す各有機酸を各々添加
して中和し（ｐＨ７.５）、実験例１と同様の方法によ
り滅菌処理した。これらの主培地に、実験例１と同様の
方法で培養したアグロバクテリウム・エスピー・バイオ
バー Ｉ（Agrobacterium sp. biovar Ｉ）（ＩＦＯ
１３７１４）の種培養終了液を２mlずつ接種し、３２℃
で９６時間培養した。培養終了液中のカードランの生成
量を実験例１に準じて測定した。結果を〔表５〕に示し
た。

【表５】 これより、いずれの有機酸を使用してもカードラン生成
量は高く、特にコハク酸、フマール酸、α−ケトグルタ
ル酸およびＬ−乳酸を使用した場合、カードラン生成量
が高いことがわかる。

【００２１】実験例４ 〔表２〕に示す主培地の窒素源として、〔表６〕に示す
アミノ酸を各々添加し、アンモニア水にてｐＨ７.５に
調製した。これらの主培地のＮ量は約０.６ｇ／リット
ルと算出された。この主培地を用い、実験例３に準じて
培養し、得られたカードランの生成量を測定した。結果
を〔表６〕に示す。

【表６】 これより、いずれのアミノ酸を使用した場合でもカード
ラン生成量は高く、特にグルタミン酸、アスパラギン酸
およびプロリンを使用した場合、カードラン生成量は最
も高いことがわかる。

【００２２】実験例５ アグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Agro
bacterium sp. biovarＩ）（ＩＦＯ １３７１４）より
カードラン生産能の向上した変異株を選定し、該変異株
をアグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Ag
robacteriumsp. biovar Ｉ）１０Ｃ３Ｋ ＩＦＯ １５
５０６と命名し、実験例１の方法に準じて各培地におけ
るカードランの生成量を測定した。結果を〔表７〕に示
す。

【表７】

【００２３】これより、窒素源としてリン酸水素二アン
モニウム、硫酸アンモニウムを用いた培地では、炭酸カ
ルシウム無添加ではほとんどカードランを生成せず、炭
酸カルシウムの添加が必要であることが分かる。コハク
酸アンモニウムを用いた培地では、炭酸カルシウムを添
加しなかった方が、炭酸カルシウムを添加した場合に比
べてカードランの生成量は高かった。

【００２４】実験例６ アグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Agro
bacterium sp. biovarＩ） １０Ｃ３Ｋ ＩＦＯ １５
５０６を用いて、実験例３の方法に順じて〔表８〕に示
す各有機酸を使用した場合のカードランの生成量を測定
した。結果を〔表８〕に示す。

【表８】 これより、コハク酸、フマール酸、α−ケトグルタル酸
を使用した場合、カードラン生成量が非常に高いことが
わかる。

【００２５】実験例７ アグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Agro
bacterium sp. biovarＩ） １０Ｃ３Ｋ ＩＦＯ １５
５０６を用いて、実験例４の方法に順じて〔表９〕に示
す各アミノ酸を使用した場合のカードランの生成量を測
定した。結果を〔表９〕に示す。

【表９】 これより、グルタミン酸およびアスパラギン酸を使用し
た場合、カードラン生成量は高いことがわかる。

【００２６】実施例１ 水道水５００mlにＫＨ₂ＰＯ₄ １.０ｇおよびＭgＳＯ₄
・７Ｈ₂Ｏ ０.５ｇを添加し、これにコハク酸を〔表１
０〕に示す分量ずつ加え、アンモニア水により中和（ｐ
Ｈ７.５）した後、水道水で全量を１リットルとした。
これらの溶液を２００ml用三角フラスコに２０mlずつ分
注し、オートクレーブにて１１８℃で１５分間滅菌し
た。ここへ、別に滅菌しておいたグルコース液を、７.
５Ｗ／Ｖ％となるように各々添加し、主培地を調製し
た。これらの主培地に、実験例１と同様の方法で培養し
たアグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Ag
robacterium sp. biovar Ｉ）（ＩＦＯ １３７１４）
の種培養終了液を２mlずつ接種し、３２℃で９６時間培
養した。

【００２７】培養終了液中のカードランの生成量、カー
ドランの対糖収率および残存グルコース量を実験例１に
準じて測定した。結果を〔表１０〕に示す。

【表１０】 これより、コハク酸２.５ｇ／リットルのとき、カード
ランの生成量が最大となり、コハク酸２.０ｇ／リット
ルのとき、カードランの対糖収率が最大となることがわ
かる。さらに、コハク酸の使用量が増えると、残存グル
コース量は減少するため、培養速度は向上することもわ
かった。これらの結果より、コハク酸の使用量を任意に
選択することにより、所望のカードランの収率、生成
量、単位時間当りの生産性等を得ることが可能であるこ
とがわかった。

【００２８】次に、コハク酸２.５ｇ／リットルとした
培養終了液約２５ml（フラスコ一本分）に１Ｎ ＮaＯ
Ｈを１００ml添加して、約１時間撹拌し、生成したカー
ドランを溶解した後、遠心分離（９０００rpm，１０
分）し、菌体を除去した。ここへ、４Ｎ ＨＣlを加え
て中和したところ、中和ゲルが得られた。該ゲルを含む
液を遠心分離して、沈澱画分を脱イオン水で洗浄し、再
度、遠心分離（９０００rpm，１０分）を行った。該操
作を２回繰り返し、十分に脱塩した後、アセトンを加
え、真空乾燥を行ったところ精製されたカードランが７
８０mg得られた。該カードラン２００mgを脱イオン水１
０mlで膨潤し、ホモジナイズし、さらに、脱気した液を
試験管に入れ、１００℃で１０分加熱したところ、加熱
凝固ゲルが得られた。該ゲルをレオメーター（ＳＵＮ
ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ Ｃo. ＬＴＤ）で測定した結
果、ゲル強度は１０２０ｇ／cm²であった。

【００２９】実施例２ 水道水５００mlにコハク酸を１ｇ添加し、約１.８mlの
アンモニア水を加えて中和後、グルコース１０ｇ、ＫＨ
₂ＰＯ₄ １ｇ、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.５ｇ、ＦeＳＯ₄
・５Ｈ₂Ｏ ０.０５ｇ、ＭnＳＯ₄・nＨ₂Ｏ（ｎ＝４〜
６） ０.０２ｇ、ＺnＣl₂ ０.００１ｇおよびＣoＣl₂
０.００１ｇを添加し、アンモニア水でｐＨ７.５に調
整した後、全量が１リットルとなるように水道水を加
え、種培地とした。該培地を２００ml用三角フラスコに
２０mlずつ分注し、１１８℃で１５分間滅菌した。ここ
へ、Agrobacterium sp. biovar Ｉ （ＩＦＯ １３７
１４）または Agrobacterium radiobacter ＩＦＯ １
２６０７の斜面培養物を１エーゼずつ加え、３２℃で２
４時間培養した。主培地として、コハク酸６.２５ｇ、
アンモニア水８.８ml、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２.５ｇおよびＭgＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ １.２５ｇを水道水で溶解し、さらに、
アンモニア水でｐＨを７.５に調整した後、水道水にて
全量を１.８リットルとした。これを５リットル容ジャ
ーファーメンターへ移し、１１８℃で１５分間滅菌し
た。一方、グルコースを１８７.５ｇ秤量し、水道水に
て溶解し全量を０.６リットルとし、 １２１℃で１５分
間滅菌処理した。

【００３０】前述のジャーファーメンターへ上記の２種
の種培養終了液（１２本分）およびグルコース液を加
え、培養を開始した（主培地中のＮ量は０.７５ｇ／リ
ットル）。通気量１リットル／min、撹拌数７００rpm、
培養温度３２℃で、９６時間培養した。この間、両培地
のｐＨは５.５まで低下したが、アルカリは添加しなか
った。消泡剤として、シリコンオイル（信越化学製）
０.５mlを２回、培養中に各々添加した。培養終了液に
おけるカードラン生成量、カードラン収量およびカード
ランの対糖収率を実験例１に準じて測定した。結果を
〔表１１〕に示す。

【表１１】

【００３１】これより、いずれもカードラン生成量、カ
ードラン収量およびカードランの対糖収率は高いことが
わかる。さらに、２種の培養終了液２０mlを用いて、実
施例１に準じ精製カードランを調製したところ、精製カ
ードランは各々、ＩＦＯ １３７１４では８２０mg、Ｉ
ＦＯ １２０６７では７４０mgが得られ、それらのゲル
強度はそれぞれ、９８２ｇ／cm²、１００５ｇ／cm²であ
った。

【００３２】実施例３ 実施例２に準じて種培地を調製し、Agrobacterium sp.
biovar Ｉ （ＩＦＯ１３７１４）の斜面培養物を１エ
ーゼ加えて、３２℃で２４時間培養した。実施例２に準
じて主培地を調製した。一方、グルコース１８７.５ｇ
を水道水に溶解し０.６リットルとし、１２１℃で１５
分間滅菌した。５リットル容ジャーファーメンターに前
述の種培養終了液（１２本分）およびグルコース液２０
０mlを添加し、培養を開始した。培養条件は実施例２と
同様にした。培養後２４時間目に前述のグルコース液２
００mlを、培養後４８時間目にさらに２００mlを添加し
た。培養時間８２時間で培養は終了した。この間、培地
のｐＨは５.６まで低下したが、アルカリは特に添加し
なかった。

【００３３】培養終了後、培養液量は２.３７リット
ル、カードラン生成量は４２.３mg／ml、カードラン収
量は１００.３ｇ、カードランの対糖収率は約５３.５％
であった。 該培養液に水５リットルを加え、４Ｎ苛性
ソーダ１０リットルを添加して、６０℃で２時間撹拌
し、カードランを十分に溶解した。この溶解液を、ハイ
フロスーパーセルをろ過除剤としてろ過し、固形分を除
いた後、ろ過液を２０℃まで冷却した。ここへ、４Ｎ塩
酸液を滴下して、ｐＨを４.５に調整したところ、中和
ゲルが得られた。中和ゲルを連続遠心機により分離し、
沈澱画分を得た。沈澱画分をさらに水道水約２０リット
ルに懸濁し、遠心分離後洗浄した。この操作を再度繰り
返し、ついで、アセトン１０リットルを加えて脱水し、
真空下で乾燥したところ、精製カードランが９３.５ｇ
得られた。該精製カードランのゲル強度を 実施例１に
準じて測定した結果、９９５ｇ／cm²であった。

【００３４】実施例４ アグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ（Agro
bacterium sp. biovarＩ）ＩＦＯ １５５０６および
アグロバクテリウム・エスピー・バイオバーＩ（Agroba
cterium sp. biovar Ｉ）（ＩＦＯ １３７１４）を、
コハク酸の添加量を変えた培地で培養し、各々のカード
ラン生産能を比較した。コハク酸を６.２５ｇ、７.５０
ｇおよび８.７５ｇずつ秤量し、水道水で溶解後、アン
モニア水を各々８.８ml、１０.５mlおよび１２.２mlず
つ加えて中和した。各溶液に、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２.５ｇ、
ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １.２５ｇ、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
２５mg、ＣaＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ５０mg、ＣoＣｌ₂ ０.２
５mg、ＺnＣl₂ ０.２５mg、ＣuＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ ０.２
５mgおよびシリコンオイル（信越化学製）１ｍｌを順次
添加し、アンモニア水でｐＨ７.５に調整し、全量を１.
８リットルずつとした。これらをジャーファーメンター
に移し、１２１℃で２０分間滅菌処理し、主培地とし
た。グルコースを２２５ｇずつ秤量し、水道水で全量を
０.６リットルとし、１２１℃で１５分間滅菌処理し
た。アグロバクテリウム・エスピー・バイオバー Ｉ
（Agrobacterium sp. biovarＩ） ＩＦＯ １５５０
６およびアグロバクテリウム・エスピー・バイオバーＩ
（Agrobacterium sp. biovar Ｉ）（ＩＦＯ １３７１
４）は、実施例２の方法に準じて種培養し、得られた種
培養終了液２４０mlおよび上記グルコース滅菌液３００
mlを前述のジャーファーメンターへ添加し、通気量１リ
ットル／min、撹拌数８００rpm、培養温度３２℃で培養
を開始した。培養２４時間後にグルコース滅菌液３００
mlをさらに添加し、最長９６時間まで培養した。各培地
中のコハク酸の濃度は各々約２.５、３.０および３.５
ｇ／リットルであった。各培地におけるカードラン生成
量、カードラン収量および残存グルコース量を実験例１
に準じて測定した。結果を〔表１２〕に示す。

【００３５】

【表１２】 これより、アグロバクテリウム・エスピー・バイオバー
Ｉ（Agrobacteriumsp. biovar Ｉ） ＩＦＯ １５
５０６を使用した場合、コハク酸の添加量の増加に応じ
て培養時間が短縮され、カードラン生産速度が向上した
ことがわかる。同様に、アグロバクテリウム・エスピー
・バイオバー Ｉ（Agrobacterium sp.biovar Ｉ）（Ｉ
ＦＯ １３７１４）を使用した場合も、コハク酸の添
加量の増加に応じてカードラン生産速度は向上した。

【００３６】

【発明の効果】本発明は、β−１，３−グルカンの製造
法において、β−１，３−グルカンを生産する能力を有
する微生物を、該微生物が資化しうる有機カルボン酸の
アンモニウム塩を窒素源とする培地で培養するため、培
地のｐＨが低下せず、ｐＨ修正のための炭酸カルシウム
またはアルカリイオン等の添加が不要である。このため
培養は悪影響を及ぼされることもなく、かつ培地中に塩
も形成されないため、該グルカンの精製が容易となり工
業的に優れた製造法である。さらに、本発明の方法によ
れば、生産性が高く、かつ対糖収率も高くβ−１，３−
グルカンを製造することができる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β−１，３−グルカンを生産する能力を有
   する微生物を、該微生物が資化しうる有機カルボン酸の
   アンモニウム塩を窒素源とする培地で培養し、β−１，
   ３−グルカンを生成蓄積せしめ、これを採取することを
   特徴とするβ−１，３−グルカンの製造法。
2. 【請求項２】有機カルボン酸が炭素数３ないし６のモノ
   ないしトリカルボン酸である請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】有機カルボン酸がクエン酸回路にあずかる
   有機カルボン酸である請求項１記載の製造法。
4. 【請求項４】有機カルボン酸が酸性アミノ酸である請求
   項１記載の製造法。
5. 【請求項５】有機カルボン酸がコハク酸、フマール酸、
   α−ケトグルタル酸または乳酸である請求項１記載の製
   造法。
6. 【請求項６】有機カルボン酸がコハク酸である請求項１
   記載の製造法。
7. 【請求項７】有機カルボン酸の使用量が約０.５ないし
   ２０ｇ／リットルである請求項１記載の製造法。
8. 【請求項８】有機カルボン酸のアンモニウム塩が、培地
   中の全窒素量が約０.４ないし３ｇ／リットルになる量
   である請求項１記載の製造法。
9. 【請求項９】β−１，３−グルカンがカードランである
   請求項１記載の製造法。
10. 【請求項１０】微生物がアグロバクテリウム属またはア
    ルカリゲネス属に属する微生物である請求項１記載の製
    造法。