JPH0767643A - プラスミドｐＴＴ２７ - Google Patents
プラスミドｐＴＴ２７Info
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- JPH0767643A JPH0767643A JP21466593A JP21466593A JPH0767643A JP H0767643 A JPH0767643 A JP H0767643A JP 21466593 A JP21466593 A JP 21466593A JP 21466593 A JP21466593 A JP 21466593A JP H0767643 A JPH0767643 A JP H0767643A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- ptt27
- thermus
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- dna
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Links
Abstract
(57)【要約】
【構成】 図１に示す制限酵素切断地図を有し、長さ約
２４０kbのプラスミドｐＴＴ２７。 【効果】 本発明のプラスミドは、高度好熱性細菌を宿
主として増殖可能な、１コピーのプラスミドである。
２４０kbのプラスミドｐＴＴ２７。 【効果】 本発明のプラスミドは、高度好熱性細菌を宿
主として増殖可能な、１コピーのプラスミドである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高度好熱性細菌サーマ
ス(Thermus) 属細菌を宿主として増殖できるプラスミド
ｐＴＴ２７に関する。
ス(Thermus) 属細菌を宿主として増殖できるプラスミド
ｐＴＴ２７に関する。
【０００２】
【従来の技術】好熱性細菌は、それらが有する酵素、生
体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れていることが知られて
おり、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素および耐熱性生
体機能のバイオリアクター等への応用という点から、工
業的に極めて重要な微生物群である。このような好熱性
細菌を宿主として利用して、組換えＤＮＡ技術によりこ
れらの好熱性細菌を形質転換するため、既にいくつかの
プラスミドが知られている〔Munster, M. J. et al., A
ppl. Environ. Microbiol., Vol.50, 1325(1985)； Mat
her, M. W. & J. A. Fee, Appl. Environ. Microbiol.,
Vol.58, 421(1992)； Lasa, I. et al., J. Bacterio
l., Vol.174, 6424(1992)〕。これらのプラスミドはい
ずれも多コピー（８〜１０コピー）であり、組換えたＤ
ＮＡ断片が発現し過ぎたために、細胞内代謝系のバラン
スが大きく崩れたり、生育阻害が起こるなどの影響を及
ぼす場合が生じ得る。また、複数の遺伝子群をコードす
る長鎖ＤＮＡなどを多コピープラスミドに導入すること
により、プラスミドの安定性が低下し、細胞からの脱落
率が高まる場合も生じ得る。従って、遺伝子組換えによ
り微生物を形質転換する際に、低コピー（１〜２コピ
ー）のプラスミドが必要となるが、高度好熱性細菌にお
いては、かかるプラスミドは未だ報告されていない。
体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れていることが知られて
おり、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素および耐熱性生
体機能のバイオリアクター等への応用という点から、工
業的に極めて重要な微生物群である。このような好熱性
細菌を宿主として利用して、組換えＤＮＡ技術によりこ
れらの好熱性細菌を形質転換するため、既にいくつかの
プラスミドが知られている〔Munster, M. J. et al., A
ppl. Environ. Microbiol., Vol.50, 1325(1985)； Mat
her, M. W. & J. A. Fee, Appl. Environ. Microbiol.,
Vol.58, 421(1992)； Lasa, I. et al., J. Bacterio
l., Vol.174, 6424(1992)〕。これらのプラスミドはい
ずれも多コピー（８〜１０コピー）であり、組換えたＤ
ＮＡ断片が発現し過ぎたために、細胞内代謝系のバラン
スが大きく崩れたり、生育阻害が起こるなどの影響を及
ぼす場合が生じ得る。また、複数の遺伝子群をコードす
る長鎖ＤＮＡなどを多コピープラスミドに導入すること
により、プラスミドの安定性が低下し、細胞からの脱落
率が高まる場合も生じ得る。従って、遺伝子組換えによ
り微生物を形質転換する際に、低コピー（１〜２コピ
ー）のプラスミドが必要となるが、高度好熱性細菌にお
いては、かかるプラスミドは未だ報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、高度好熱性
細菌内で増殖し得る低コピーのプラスミドの開発を目的
としてなされたものである。
細菌内で増殖し得る低コピーのプラスミドの開発を目的
としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、サーマス・サーモ
フィラス(Thermus thermophilus)ＨＢ２７株由来の変異
株の１つであるサーマス・サーモフィラスＣＯＰ１０１
株(FERM P-12992)から高度好熱性細菌内で増殖可能な１
コピーの新規プラスミドを単離し、本発明を完成するに
至った。
を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、サーマス・サーモ
フィラス(Thermus thermophilus)ＨＢ２７株由来の変異
株の１つであるサーマス・サーモフィラスＣＯＰ１０１
株(FERM P-12992)から高度好熱性細菌内で増殖可能な１
コピーの新規プラスミドを単離し、本発明を完成するに
至った。
【０００５】以下、本発明について更に詳細に説明す
る。サーマス(Thermus) 属細菌内で複製増殖可能な低コ
ピープラスミドｐＴＴ２７の分離源微生物としては、サ
ーマス属細菌であれば特定の種もしくは株に限定される
ものではないが、殊にサーマス・サーモフィラスＣＯＰ
１０１株、サーマス・サーモフィラスＨＢ２７株および
該ＨＢ２７株をニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro
-N-nitrosoguanidine)処理して得られるアミノ酸要求株
などの突然変異株等が好適に使用される。例えば、トリ
プトファン要求性変異株であるｔｒｐＢ１、ｔｒｐＢ２
およびｔｒｐＢ５等を使用することができる。
る。サーマス(Thermus) 属細菌内で複製増殖可能な低コ
ピープラスミドｐＴＴ２７の分離源微生物としては、サ
ーマス属細菌であれば特定の種もしくは株に限定される
ものではないが、殊にサーマス・サーモフィラスＣＯＰ
１０１株、サーマス・サーモフィラスＨＢ２７株および
該ＨＢ２７株をニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro
-N-nitrosoguanidine)処理して得られるアミノ酸要求株
などの突然変異株等が好適に使用される。例えば、トリ
プトファン要求性変異株であるｔｒｐＢ１、ｔｒｐＢ２
およびｔｒｐＢ５等を使用することができる。
【０００６】以下に、これらの分離源微生物から該プラ
スミドｐＴＴ２７を調製するための基本操作の一例を示
す。
スミドｐＴＴ２７を調製するための基本操作の一例を示
す。
【０００７】該プラスミドを保有するサーマス・サーモ
フィラスＣＯＰ１０１株をサーマス培地〔ディフコ・イ
ーストエキストラクト２ｇ、ポリペプトン（大五栄養）
４ｇ、ＮａＣｌ １ｇ、ニトリロ三酢酸０．１ｇ、Ｃａ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０６ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．１ｇ、ＫＮＯ3 ０．１０５ｇ、ＮａＮＯ3 ０．７
ｇ、ＮａＨＰＯ4 ０．１１ｇ、ＦｅＣｌ3 ０．３mg、Ｍ
ｎＳＯ4 ２．２mg、ＺｎＳＯ4 ０．５mg、Ｈ3 ＢＯ3
０．５mg、ＣｕＳＯ4 ０．０１６mg、Ｎａ2 ＭｏＯ4
０．０２５mg、ＣｏＣｌ2 ・３Ｈ2 Ｏ ０．０４６mgを
純水１リットルに含み、pH７．５に調整したもの〕に接
種し、７０℃で１６〜１８時間振とう培養する。菌体を
遠心分離により収集した後、実施例１で詳述する溶菌法
〔Casse, F.,et al., J. Gen. Microbiol., Vol.113, 2
29(1979) 〕による溶菌処理を行い、細胞混合液を得
る。これを遠心分離して得られる上清にポリエチレング
リコール６０００を１０％(w/v) 添加して氷中に静置
し、次いで遠心分離することにより該プラスミドの沈殿
物を得る。この沈殿物を、塩化セシウムを用いた平衡密
度勾配遠心にかけてバンドを回収することで、該プラス
ミド溶液を調製することができる。また、該プラスミド
を切断しない制限酵素ＣｌａＩにより全ＤＮＡ溶液を処
理した後、パルスフィールドゲル電気泳動を行うことに
より、ゲルの原点に環状の該プラスミドを存在させ、こ
れを回収することができる。あるいは、該プラスミドを
１ケ所のみで切断する制限酵素、例えばＭｕｎＩを用い
て全ＤＮＡ溶液を処理した後、パルスフィールドゲル電
気泳動を行うことにより、大きさ約２４０kbの直鎖状Ｄ
ＮＡとして分離できる。
フィラスＣＯＰ１０１株をサーマス培地〔ディフコ・イ
ーストエキストラクト２ｇ、ポリペプトン（大五栄養）
４ｇ、ＮａＣｌ １ｇ、ニトリロ三酢酸０．１ｇ、Ｃａ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０６ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．１ｇ、ＫＮＯ3 ０．１０５ｇ、ＮａＮＯ3 ０．７
ｇ、ＮａＨＰＯ4 ０．１１ｇ、ＦｅＣｌ3 ０．３mg、Ｍ
ｎＳＯ4 ２．２mg、ＺｎＳＯ4 ０．５mg、Ｈ3 ＢＯ3
０．５mg、ＣｕＳＯ4 ０．０１６mg、Ｎａ2 ＭｏＯ4
０．０２５mg、ＣｏＣｌ2 ・３Ｈ2 Ｏ ０．０４６mgを
純水１リットルに含み、pH７．５に調整したもの〕に接
種し、７０℃で１６〜１８時間振とう培養する。菌体を
遠心分離により収集した後、実施例１で詳述する溶菌法
〔Casse, F.,et al., J. Gen. Microbiol., Vol.113, 2
29(1979) 〕による溶菌処理を行い、細胞混合液を得
る。これを遠心分離して得られる上清にポリエチレング
リコール６０００を１０％(w/v) 添加して氷中に静置
し、次いで遠心分離することにより該プラスミドの沈殿
物を得る。この沈殿物を、塩化セシウムを用いた平衡密
度勾配遠心にかけてバンドを回収することで、該プラス
ミド溶液を調製することができる。また、該プラスミド
を切断しない制限酵素ＣｌａＩにより全ＤＮＡ溶液を処
理した後、パルスフィールドゲル電気泳動を行うことに
より、ゲルの原点に環状の該プラスミドを存在させ、こ
れを回収することができる。あるいは、該プラスミドを
１ケ所のみで切断する制限酵素、例えばＭｕｎＩを用い
て全ＤＮＡ溶液を処理した後、パルスフィールドゲル電
気泳動を行うことにより、大きさ約２４０kbの直鎖状Ｄ
ＮＡとして分離できる。
【０００８】この約２４０kbのプラスミドｐＴＴ２７を
各種制限酵素で切断したときの認識部位数および切断断
片の大きさを下記表１に、制限酵素による切断点地図を
図１に示す。
各種制限酵素で切断したときの認識部位数および切断断
片の大きさを下記表１に、制限酵素による切断点地図を
図１に示す。
【０００９】
【表１】
【００１０】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、プラスミドを制限酵素の存在下で完
全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に従
い、パルスフィールドゲル電気泳動あるいは通常のアガ
ロースゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から決
定した値を採用した。
「認識部位数」は、プラスミドを制限酵素の存在下で完
全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に従
い、パルスフィールドゲル電気泳動あるいは通常のアガ
ロースゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から決
定した値を採用した。
【００１１】また、プラスミドの「全体の大きさ」およ
び「切断断片の大きさ」は、以下のように求めた。すな
わち、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces c
erevisiae)の染色体ＤＮＡ、およびラムダファージ（λ
phage) のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII あるいはＢｓ
ｔＰＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片（分
子量マーカー）を、同一アガロースゲル上で泳動し、そ
の泳動距離で描かれる標準線に基づいてプラスミドまた
は切断ＤＮＡ断片の大きさを算出する。プラスミドの大
きさは切断断片それぞれの大きさを加算して求める。な
お、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１０kbより
大きい断片については、パルスフィールドゲル電気泳動
（１％アガロースゲル）によって得られる結果を採用
し、１０kb以下の断片の大きさは通常の１％アガロース
ゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
び「切断断片の大きさ」は、以下のように求めた。すな
わち、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces c
erevisiae)の染色体ＤＮＡ、およびラムダファージ（λ
phage) のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII あるいはＢｓ
ｔＰＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片（分
子量マーカー）を、同一アガロースゲル上で泳動し、そ
の泳動距離で描かれる標準線に基づいてプラスミドまた
は切断ＤＮＡ断片の大きさを算出する。プラスミドの大
きさは切断断片それぞれの大きさを加算して求める。な
お、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１０kbより
大きい断片については、パルスフィールドゲル電気泳動
（１％アガロースゲル）によって得られる結果を採用
し、１０kb以下の断片の大きさは通常の１％アガロース
ゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
【００１２】本発明のプラスミドで形質転換し得る宿主
微生物として、サーマス属細菌、例えばサーマス・サー
モフィラスＣＯＰ１０１株、サーマス・サーモフィラス
ＨＢ２７株およびそれより誘導される変異株であるアミ
ノ酸要求性変異株（ｔｒｐＢ１、ｔｒｐＢ２、ｔｒｐＢ
５、Ｐｒｏ- 、Ｌｅｕ- 、Ｍｅｔ- 、Ｌｙｓ- ）等が挙
げられる。また、サーマス・サーモフィラスＨＢ８株
〔Oshima, T. & Imahori, K., Int. J. Syst. Bact., V
ol.24, 102(1974)〕、サーマス・フラバス(Thermus fla
vus)ＡＴ６２〔Saiki, T. et al., Agric. Biol. Che
m., Vol.36, 2357(1972)〕、サーマス・カルドフィラス
(Thermus caldophilus)ＧＫ２４〔Taguchi,H., et a
l., J. Biochem., Vol.91, 1343(1982)〕、サーマス・
アクアティカス(Thermus aquaticus) ＹＴ１〔Brock,
T. D. & Freeze, H., J. Bacteriol., Vol.98, 289(196
9) 〕、サーマス(Thermus) Ｔ２〔Ulrich, T., et al.,
J. Bacteriol., Vol.110, 691(1972) 〕およびこれら
の変異株等も宿主微生物として用いることができる。
微生物として、サーマス属細菌、例えばサーマス・サー
モフィラスＣＯＰ１０１株、サーマス・サーモフィラス
ＨＢ２７株およびそれより誘導される変異株であるアミ
ノ酸要求性変異株（ｔｒｐＢ１、ｔｒｐＢ２、ｔｒｐＢ
５、Ｐｒｏ- 、Ｌｅｕ- 、Ｍｅｔ- 、Ｌｙｓ- ）等が挙
げられる。また、サーマス・サーモフィラスＨＢ８株
〔Oshima, T. & Imahori, K., Int. J. Syst. Bact., V
ol.24, 102(1974)〕、サーマス・フラバス(Thermus fla
vus)ＡＴ６２〔Saiki, T. et al., Agric. Biol. Che
m., Vol.36, 2357(1972)〕、サーマス・カルドフィラス
(Thermus caldophilus)ＧＫ２４〔Taguchi,H., et a
l., J. Biochem., Vol.91, 1343(1982)〕、サーマス・
アクアティカス(Thermus aquaticus) ＹＴ１〔Brock,
T. D. & Freeze, H., J. Bacteriol., Vol.98, 289(196
9) 〕、サーマス(Thermus) Ｔ２〔Ulrich, T., et al.,
J. Bacteriol., Vol.110, 691(1972) 〕およびこれら
の変異株等も宿主微生物として用いることができる。
【００１３】以上に本発明を説明してきたが、下記の実
施例により本発明を更に具体的に説明する。しかしなが
ら、下記の実施例は本発明の具体的認識を得る一助とみ
なすべきものであり、本発明の範囲を何等制限するもの
ではない。
施例により本発明を更に具体的に説明する。しかしなが
ら、下記の実施例は本発明の具体的認識を得る一助とみ
なすべきものであり、本発明の範囲を何等制限するもの
ではない。
【００１４】
実施例１ （１）プラスミドｐＴＴ２７の調製 プラスミドｐＴＴ２７を保持するサーマス・サーモフィ
ラスＣＯＰ１０１株(FERM P-12992)を１００mlのサーマ
ス培地（前記）に接種し、７０℃で１６〜１８時間振と
う培養した。次いで、この培養液を１リットルのサーマ
ス培地に接種し、７０℃で５時間培養した。遠心により
集菌してＴＥＳ（２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５mMＥＤＴ
Ａ、１００mMＮａＣｌ、pH７．５）で洗浄した後、菌体
を、湿重量４ｇ当たり１０mlの２５％ショ糖含有ＴＥＳ
に懸濁した。この懸濁液に、リゾチーム（１０mg/ml ）
を２ml、０．２５M ＥＤＴＡ（pH８）を４mlそれぞれ添
加した後、０℃で１０分間静置し、続いて３７℃に１０
分間保温した。この細胞混合液に２mlの１０％ＳＤＳお
よび５mlの５M 塩化ナトリウムを加え、４℃に１５〜１
８時間静置した。これを２，８００rpm で１時間の遠心
分離に付して上清を得た。得られた上清にポリエチレン
グリコール６０００を１０％ (w/v)添加して０℃で２〜
３時間静置した後、２，２００rpm 、２分間の遠心分離
により沈殿を得た。得られた沈殿を１５mlのＴＥＳに溶
解し、これにＣｓＣｌおよびエチジウムブロマイドを添
加して密度を１．６１〜１．６２に調製した。この試料
を３８，０００rpm で３０〜４０時間の平衡密度勾配遠
心に付した。生じたプラスミドＤＮＡのバンドを収集
し、イソアミルアルコールでエチジウムブロマイドを除
去した後、ＴＥＮ（２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１mMＥＤ
ＴＡ、２０mMＮａＣｌ）で透析することにより、プラス
ミドＤＮＡ溶液が得られた。
ラスＣＯＰ１０１株(FERM P-12992)を１００mlのサーマ
ス培地（前記）に接種し、７０℃で１６〜１８時間振と
う培養した。次いで、この培養液を１リットルのサーマ
ス培地に接種し、７０℃で５時間培養した。遠心により
集菌してＴＥＳ（２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５mMＥＤＴ
Ａ、１００mMＮａＣｌ、pH７．５）で洗浄した後、菌体
を、湿重量４ｇ当たり１０mlの２５％ショ糖含有ＴＥＳ
に懸濁した。この懸濁液に、リゾチーム（１０mg/ml ）
を２ml、０．２５M ＥＤＴＡ（pH８）を４mlそれぞれ添
加した後、０℃で１０分間静置し、続いて３７℃に１０
分間保温した。この細胞混合液に２mlの１０％ＳＤＳお
よび５mlの５M 塩化ナトリウムを加え、４℃に１５〜１
８時間静置した。これを２，８００rpm で１時間の遠心
分離に付して上清を得た。得られた上清にポリエチレン
グリコール６０００を１０％ (w/v)添加して０℃で２〜
３時間静置した後、２，２００rpm 、２分間の遠心分離
により沈殿を得た。得られた沈殿を１５mlのＴＥＳに溶
解し、これにＣｓＣｌおよびエチジウムブロマイドを添
加して密度を１．６１〜１．６２に調製した。この試料
を３８，０００rpm で３０〜４０時間の平衡密度勾配遠
心に付した。生じたプラスミドＤＮＡのバンドを収集
し、イソアミルアルコールでエチジウムブロマイドを除
去した後、ＴＥＮ（２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１mMＥＤ
ＴＡ、２０mMＮａＣｌ）で透析することにより、プラス
ミドＤＮＡ溶液が得られた。
【００１５】（２）プラスミドｐＴＴ２７の分子量決定 本プラスミドの分子量は、その超らせん構造のＤＮＡを
Casse らの方法〔Casse, F., et al., J. Gen. Microbi
ol., Vol.113, 229(1979) 〕によるアガロースゲル電気
泳動の結果より、および制限酵素によって切断された断
片のパルスフィールド・アガロースゲル電気泳動の結果
（表１）より、前述の分子量マーカーを用い、約２４０
kbであることを確認した。このような巨大プラスミド
は、サーマス属細菌ではこれまでに報告されておらず、
ｐＴＴ２７は従来知られていない新規なプラスミドであ
る。
Casse らの方法〔Casse, F., et al., J. Gen. Microbi
ol., Vol.113, 229(1979) 〕によるアガロースゲル電気
泳動の結果より、および制限酵素によって切断された断
片のパルスフィールド・アガロースゲル電気泳動の結果
（表１）より、前述の分子量マーカーを用い、約２４０
kbであることを確認した。このような巨大プラスミド
は、サーマス属細菌ではこれまでに報告されておらず、
ｐＴＴ２７は従来知られていない新規なプラスミドであ
る。
【００１６】（３）プラスミドｐＴＴ２７ＤＮＡの制限
酵素切断地図の作成 制限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタ
ノール沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に
溶解して行った。制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｐＩ、
ＭｕｎＩの３種類を用い、３７℃にて１２時間処理し
た。制限酵素切断処理後の試料は、ＴＢ緩衝液（４５mM
Ｔｒｉｓ、４５mMボレート、１mMＥＤＴＡ、pH８）中に
て１％アガロースゲルを用いたパルスフィールドゲル電
気泳動（ＢＩＯ−ＲＡＤ製ＣＨＥＦ−ＤＲ２装置）によ
り各ＤＮＡ断片を分離し、分子量マーカーをもとに（前
述）各断片の分子量を求めた（表１）。
酵素切断地図の作成 制限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタ
ノール沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に
溶解して行った。制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｐＩ、
ＭｕｎＩの３種類を用い、３７℃にて１２時間処理し
た。制限酵素切断処理後の試料は、ＴＢ緩衝液（４５mM
Ｔｒｉｓ、４５mMボレート、１mMＥＤＴＡ、pH８）中に
て１％アガロースゲルを用いたパルスフィールドゲル電
気泳動（ＢＩＯ−ＲＡＤ製ＣＨＥＦ−ＤＲ２装置）によ
り各ＤＮＡ断片を分離し、分子量マーカーをもとに（前
述）各断片の分子量を求めた（表１）。
【００１７】（４）ｐＴＴ２７のコピー数の測定 プラスミドｐＴＴ２７を保持するサーマス・サーモフィ
ラスＣＯＰ１０１株（FERM P-12992) を１００mlのサー
マス培地（前記）に接種し、７０℃で１６〜１８時間振
とう培養した。次いで、この培養液を１リットルのサー
マス培地に接種して培養後、対数増殖期の終わり近くで
集菌し、約６ｇの湿菌体を得た。これをリゾチーム１２
mgを溶解した６mlの０．１５M ＥＤＴＡ（pH８）に懸濁
し、３７℃で２０分間保温した後、エタノール・ドライ
アイスの冷媒中にいれて速やかに凍らせた。５０mlの
０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH９．０）−１％Ｓ
ＤＳ−０．１M 塩化ナトリウムを加えて撹拌した後、上
記緩衝液で飽和させたフェノール５６mlを加えて４℃で
振とうし、次いで、これを遠心に付してその上清を分取
する。これに２容の冷アルコールを加えて核酸画分を沈
殿として回収し、２０mlの０．１×ＳＳＣ（０．１５M
塩化ナトリウム−０．０１５M クエン酸ナトリウム）に
溶かした後、２mlの１０×ＳＳＣを加え、１×ＳＳＣに
溶けた粗ＤＮＡ溶液を得た。次にＲＮａｓｅＡ（シグマ
社製）、ＲＮａｓｅＴ１（シグマ社製）をそれぞれ５０
μg/mlになるように加えて３７℃で３０分間静置し、Ｒ
ＮＡを分解した後、上記フェノール処理を繰り返して、
ＤＮＡ溶液を得た。これを０．８％アガロースゲル電気
泳動にかけ、泳動ネガフィルムをデンシトメーターにか
け、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合を測定し、
染色体ＤＮＡの分子量を１，８２０kb、ｐＴＴ２７を２
４０kbとした計算によりコピー数を求めたところ、ｐＴ
Ｔ２７は、１染色体当たり１コピー存在することが判明
した。
ラスＣＯＰ１０１株（FERM P-12992) を１００mlのサー
マス培地（前記）に接種し、７０℃で１６〜１８時間振
とう培養した。次いで、この培養液を１リットルのサー
マス培地に接種して培養後、対数増殖期の終わり近くで
集菌し、約６ｇの湿菌体を得た。これをリゾチーム１２
mgを溶解した６mlの０．１５M ＥＤＴＡ（pH８）に懸濁
し、３７℃で２０分間保温した後、エタノール・ドライ
アイスの冷媒中にいれて速やかに凍らせた。５０mlの
０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH９．０）−１％Ｓ
ＤＳ−０．１M 塩化ナトリウムを加えて撹拌した後、上
記緩衝液で飽和させたフェノール５６mlを加えて４℃で
振とうし、次いで、これを遠心に付してその上清を分取
する。これに２容の冷アルコールを加えて核酸画分を沈
殿として回収し、２０mlの０．１×ＳＳＣ（０．１５M
塩化ナトリウム−０．０１５M クエン酸ナトリウム）に
溶かした後、２mlの１０×ＳＳＣを加え、１×ＳＳＣに
溶けた粗ＤＮＡ溶液を得た。次にＲＮａｓｅＡ（シグマ
社製）、ＲＮａｓｅＴ１（シグマ社製）をそれぞれ５０
μg/mlになるように加えて３７℃で３０分間静置し、Ｒ
ＮＡを分解した後、上記フェノール処理を繰り返して、
ＤＮＡ溶液を得た。これを０．８％アガロースゲル電気
泳動にかけ、泳動ネガフィルムをデンシトメーターにか
け、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの割合を測定し、
染色体ＤＮＡの分子量を１，８２０kb、ｐＴＴ２７を２
４０kbとした計算によりコピー数を求めたところ、ｐＴ
Ｔ２７は、１染色体当たり１コピー存在することが判明
した。
【図１】プラスミドｐＴＴ２７の制限酵素切断地図であ
る。
る。
Claims (1)
- 【請求項１】 図１に示す制限酵素切断地図を有し、長
さ約２４０kbのプラスミドｐＴＴ２７。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21466593A JPH0767643A (ja) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | プラスミドｐＴＴ２７ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21466593A JPH0767643A (ja) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | プラスミドｐＴＴ２７ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767643A true JPH0767643A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=16659543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21466593A Pending JPH0767643A (ja) | 1993-08-31 | 1993-08-31 | プラスミドｐＴＴ２７ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767643A (ja) |
-
1993
- 1993-08-31 JP JP21466593A patent/JPH0767643A/ja active Pending
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