JPH07506241A - ヒト クニツ−タイプ プロテアーゼ阻害剤変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト　クニツータイプ　プロテアーゼ阻害剤変異体発明の分野 本発明は、ヒト　クニツ（Ｋｕｎｉ　ｔｚ）−タイプ　プロテアーゼ阻害剤ドメ インの変異体、該ドメインをコードするＤＮＡ　、該変異体の製造方法および該 変異体を含有する医薬組成物に関する。

発明の背景 多形核の白血球（好中球又はＰＭＮＳ）および単核性の食細胞（単球）は、組織 損傷、感染、急性および慢性炎症および創傷治ゆにおいて重要な役割を演じてい る。細胞は、血液から炎症の部位に移動し次いで適当な刺激が続き、それらは酸 化体化合物（Ｏｓ　”　、　０２−　。

Ｈ２Ｏ，および）ＩＯｃＩ）並びに多様の蛋白質分解酵素を含有する顆粒を放出 する。分泌物の顆粒は、特にアルカリホスファターゼ、メタロブロティナーゼ例 えばゲラチナーゼおよびコラゲナーゼおよびセリンプロテアーゼ例えば好中球エ ラスターゼ、カテピシンＧおよびブロティナーゼ３を含有する。

潜在的メタロブロティナーゼは、組織阻害剤又はメタロブロティナーゼ（ＴＩＭ Ｐ）と共に放出される。活性化機構は十分に解明されていないがしかし、チオー ル基の酸化および／又は蛋白質分解は、プロセスにおいて役割を演じていそうで ある。また、遊離メタロブロティナーゼ活性は、ＴＩＭＰの失活に依存する。

白血球のアズール好性顆粒において、セリンプロテアーゼ好中球エラスターゼ、 カテプシンＧおよびプロテアーゼー３はゲルコサミノグリカンで錯化される活性 酵素としてまとめられる。これらの錯体は不活性であるがしかし分泌の際解離し 活性酵素を放出する。

プロテアーゼ活性を中和するため、多量の阻害剤α１−ブロティナーゼ阻害剤（ α１−ＰＩ）およびα１−キモトリプシン阻害剤（α１−Ｃｈｉ）が血漿中に見 出されている。しかし、ＰＭＮｓは阻害剤を局部的に失活することが可能である 。

従って、好中球エラスターゼの最も重要な阻害剤であるαｌ　−ＰＩは誘発され たＰＭＮｓによって生産される酸素代謝物による反応中心（Ｍｅｔ−３５８）で の酸化に対し感受性である。これは好中球エラスターゼに対するα、　−ＰＩの 親和性を約２０００倍だけ減少させる。

α、−ＰＩの局部的中和後、エラスターゼは他の蛋白質分解酵素の多数の阻害剤 を分解することができる。エラスターゼはα、　−Ｃｈｉを開裂しそしてこれに よりカテプシンＧ活性を促進する。また、それはＴＩＭＰを開裂し、メタロプロ ティナーゼによる組織分解をもたらす。更に、エラスターゼはアンチトロンビン ■およびヘパリン補因子、並びにおそらく血餅形成を促進する組織因子経路阻害 剤（ＴＦＰＩ）を分解する。一方、凝固因子を分解する好中球エラスターゼの能 力は、相反する作用を有するものと推定されその結果エラスターゼの合計作用は 不明である。繊維素溶解に対する好中球エラスターゼの作用は、不明確さが少な い。プラスミノーゲン活性止剤阻害剤は０２代謝生成物により酸化されそして失 活する。

ＰＭＮｓは多量のセリンプロテアーゼを含有し、そして約２００■の各白血球プ ロテアーゼが毎日放出されそして体内で健康な組織を冒す剤と戦う。急性の炎症 は、放出される酵素の量の多数倍増加をもたらす。正常の条件下、蛋白質分解は 、多量の阻害剤α、　−ＰＩ、α１−Ｃｈｌおよびα８マクログロブリンにより 許容できる程度に低いレベルで保持される。しかし、多数の慢性疾患が、例えば 自己免疫応答、慢性感染、タバコ又は他の刺激物等により引きおこされる、ＰＭ Ｎｓの過剰刺激による病理学の蛋白質分解により引きおこされるという幾分の示 唆がある。

アプロチニン（牛の膵臓トリプリン阻害剤）が、トリプリン、キモトリプシン、 プラスミンおよびカリケレンを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害することが 知られており、そして急性膵炎、ショック症状の種々の状態、線溶亢進出血およ び心筋梗塞形成の治療において治療的に用いられている（注、例えば、Ｊ、Ｅ、 トラブネル等、アプロチニンを高用量で投与すると、心肺のバイパス手術を含む 心臓手術に関連して血液損失を著るしく減少させる（注、例えばＢ。

すでに以下の内容は示されていた（例えば、Ｈ，Ｒ，ウエンゼルおよびＨ，シュ スシエ、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｅｄ、　２０．１９８１． ２９５頁）；すなわち、幾つかのアプロチニン類似体、例えばアプロチニン（１ −５８゜Ｖａｌ１５）は顆粒球エラスターゼに対する比較的高い選択性およびコ ラゲナーゼに対する阻害作用を示し、アプロチニン（１−５８，Ａｌａ１５）は エラスターゼに対する弱い作用を有し、一方アブロチニン（３−５８゜Ａｒｇ１ ５．　Ａｌａ１７．５ｅｒ４２）は、秀れたプラスマカリクレイン阻害作用を示 す（注、国際公開８９／１０３７４）。

しかし、生体内で投与すると、アプロチニンは比較的高用量のアプロチニンのく りかえし注射後、ラット家兎および犬において腎毒素作用を有することが見出さ れた（バイエル、Ｔｒａｓｙｌｏｌ。

Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ」皿ＬｅｉｎａｓＬＥ、グラーゼル等“Ｖｅｒｈａｎ ｄｌｕｎｇｅｎ　ｄｅｒＤｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆａ ｎ　１ｎｎｅｒｅ　Ｍｅｄｉｚｉｎ、７Ｂ、Ｋｏｎｇｒｅｓｓ”において、ベル クマン、ミュンヘン、１９７２．１６１２−１６１４頁）。

アプロチニンに対して観察される腎毒素（特に損傷の形で現われる）は、細管の 負に荷電した表面にそれを結合せしめるアプロチニンの高い正の全荷電の結果、 腎臓の近位細管細胞においてアプロチニンの蓄積に帰因すると思われる。この腎 毒素は臨床の目的、特に多用量の阻害剤を投与を必要とする目的（例えば心肺バ イパス手術）に対しアプロチニンをより少なく適合したものとする。その上、ア プロチニンは半量白質であり、これは従って１個以上のエピトープを有しこのエ ピトープは、ヒトに対しアプロチニンの投与の際好ましくない免疫応答をもたら すであろう。

従って、本発明の目的は、同様の阻害剤プロフィール又は望ましい阻害剤プロフ ィールを示すように改変されたアプロチニン（すなわち、クニツータイプ阻害剤 ）と同じタイプのヒトプロテアーゼ阻害剤を同定することにある。

発明の要約 本発明は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）のヒト　クニツ（Ｋｕｎｉｔｚ）− タイプ　プロテアーゼ阻害剤ドメイン■の変異体に関し、この変異体は次のアミ 酸配列： Ｘ’　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｘ ’　Ｇｌｙ　Ｘ”　Ｃｙｓ　Ｘ’　Ｘ″ｘ’　ｘ’Ｘ’　Ｘ’　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ 　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ 　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｘ”Ｔｙｒ　Ｘ”　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｘ１２Ｘ”　Ｘ１４Ｇ ｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｘ”　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＧｌｎＧｌｕ　Ｃｙｓ 　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｘ”　（配列番号ｌ）（ 式中、Ｘｌは水素又は１〜５個の天然アミノ酸残基（Ｃｙｓを除く）であり、Ｘ ２〜Ｘ１ｓは各々独立に天然アミノ酸残基（Ｃｙｓを除く）であり、そしてＸ” はＯＨ又は１〜５個の天然アミノ酸残基（Ｃｙｓを除く）であり、但しアミノ酸 残基ｘ’　−ｘ”の少なくとも１個は、天然配列の対応するアミノ酸残基と異な る）を含んでなる。

本発明に関し、語句「天然アミノ酸残基」は２０個の普通に生じるアミノ酸、す なわちＡｌａ、　Ｖａｔ、　Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ 、　Ｍｅｔ。

Ｇｌｙ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｃｙｓ、　Ｔｙｒ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｎ、　Ａ ｓｐ、　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ、　Ａｒｇ　ａｎｄＨｉｓのいずれか１つを示すもの と意図される。

外因性経路阻害剤（ＥＰＩ）としても知られているＴＦＰ　ｒ又はリポタンＮａ ｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４，１９８７．１８８６〜１８９０頁）そ して蛋白質をコードする遺伝子がクローン化された（注、ヨーロッパ特許３１８ ４５１）。

蛋白質の二次構造の分析は次の内容を示した：すなわち、蛋白質は３個のクニツ ータイプ阻害剤ドメイン、アミノ酸２２がらアミノ酸７９（■）、アミノ酸９３ からアミノ酸１５０（ｎ）およびアミノ酸１８５がらアミノ酸２４２（Ｉ［）を 有している。ＴＦＰ　ＩのクニッータイプドメインはＴＦ／ＦＶＩＩａを結合す ることが知られ、一方りニッータイプドメイン■はＦＸａに対し結合することが 示された（ギラルド等、Ｎａｔｕｒｅ。

４棧−，１９８９，５１８〜５２０頁）。

１個以上の先に示された位置において、１個以上のアミノ酸を置換することによ り、ＴＦＰ　Ｉクニッータイプドメイン■の阻害剤プロフィルを変化させる可能 があり、その結果それは好中球エラスターゼ、カテプシンＧおよび／又はプロテ アーゼー３を優先的に阻害する。

更に、凝固又は繊維素溶解（例えばプラスミン又はプラスマヵリクレイン）又は 補体カスケードにおいて含まれる酵素を特異的に阻害する変異体を構築すること が可能である。

ＴＦＰ　Ｉクニッータイプドメイン■の１つの利点は次の通りである：すなわち 、それは前記の如く強い正の実効電荷を有するアプロチニンとは反対に負の実効 電荷を有する。従って、アプロチニンよりもより低い正の実効電荷を有する本発 明の変異体を構築することが可能であり、これにより多用量の変異体の投与の際 腎臓損傷の危険を減少することができる。他の利点は、アプロチニンとは反対に 、それがヒト蛋白質（フラグメント）であり、その結果ヒトに投与の際の望まし くない免疫学的反応が著るしく減少する。

発明の詳細な開示 クニツータイプドメイン■又はＴＦＰ　Ｉの好ましい変異体の例は、変異体（こ こにおいて、ＸｌはＧｌｙ−Ｐｒｏであるか；又はＸＩはＡｌａ。

Ａｒｇ、　Ｔｈｒ、　Ａｓｐ、　Ｐｒｏ、　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ、　Ｇｌｎ、　Ｓ ｅｒ、　ｌｉｅおよびＶａｌから成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、特に ここにおいてＸＩはＴｈｒ又はＡｒｇであるか；又はここにおいてＩ３はＰｒｏ 、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ。

Ａｒｇ、　Ｖａｌおよびｌｉｅから成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、特 にここにおいてＩ３はＰｒｏ又はＬｅｕであるか、又はここにおいてＩ４はＬｙ ｓ、　Ａｒｇ、　Ｖａｌ、　Ｔｈｒ、ｌｉｅ、Ｉｌｕ＋　Ｐｈｅ、　Ｇｌｙ、　 Ｓｅｒ、　Ｍｅｔ、　Ｔｒｐ。

Ｔｙｒ、　Ｇｉｎ、　ＡｓｎおよびＡｌａから成る群から選ばれたアミノ酸残基 であり、特にここにおいてＩ４はＬｙｓ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ｔ ｈｒ、　Ｍｅｔ。

Ｇｉｎ又はＡｒｇであるか、又はここにおいてＩ５はＡｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｔｈ ｒ。

Ａｒｇ、　Ｐｈｅ、　ＧｉｎおよびＡｓｐから成る群から選ばれるアミノ酸残基 であり、特にＸｓはＡｌａ、　Ｔｈｒ、　Ａｓｐ又はｃｒｙであるか、又はここ においてＩ６はＡｒｇ、　Ａｌａ、　Ｌｙｓ、　Ｌｅｕ、　Ｇｌｙ、　Ｈｉｓ、 　Ｓｅｒ、　Ａｓｐ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕ。

Ｖａｔ、　Ｔｈｒ、　Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ、ｌｉｅおよびＭｅｔから成 る群から選ばれるアミノ酸残基であり、特にＩ６はＡｒｇ、　Ｐｈｅ、　Ａｌａ 、　Ａｓｎ、　Ｌｅｕ又はＴｈｙであるか；又はここにおいてＩ７はｌｉｅ、　 Ｍｅｔ、　Ｇｌｎ、　Ｇｌｕ、　、Ｔｈｒ。

Ｌｅｕ、　ＶａｌおよびＰｈｅから成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、特 にここにおいてＩ７はｌｉｅ又はＧｌｕであるか；又はここにおいてＸｌはＩｌ ｅ、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｎ、　Ｌｙｓ、　Ｓｅｒ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕ 、　Ａｒｇ、　Ｐｒｏ、およびＰｈｅから成る群から選ばれたアミノ酸残基であ り、特にここにおいてＸｓはｌｉｅ又はＡｓｎであるか、又はここにおいてＩ９ はＡｒｇ。

Ｓｅｒ、　Ａｌａ、　Ｇｉｎ、　ＬｙｓおよびＬｅｕから成る群から選ばれるア ミノ酸残基であり、特にここにおいてＩ９はＡｒｇであるか；又はここにおいて ＸＩｏはＧｉｎ、　Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、ｌｉｅ、　Ｌｙｓ、　Ｔｒｐ、　Ａｌａ 、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ。

Ｔｙｒ、　Ｈｉｓ、　Ａｓｐ、　Ｍｅｔ、　ＡｒｇおよびＶａｌから成る群から 選ばれるアミノ酸残基であり、特にここにおいてＸ１ｏはＶａｌ又はＬｙｓであ るか；又はここにおいてＸ１１はＳｅｒ又はＧｌｙであるか；又はここにおいて ＸＩ２はＧｌｙ、　Ｍｅｔ、　Ｇｌｎ、　Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ、　Ａｒｇ、　Ｌｙ ｓ、　ＰｒｏおよびＡｓｎから成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、特にこ こにおいてＸ１２はＡｒｇ又はＧｌｕであるか；又はここにおいてＸ１２はＡｌ ａ又はＧｌｙであるか、又はここにおいてＸ”はＬｙｓ又はＡｓｎであるか；又 はここにおいてＸ１ｓはＶａｌ、　Ｔｙｒ、　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ、　 Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ、ｌｉｅ、　Ｇｉｎ。

Ｈｉｓ、　Ａｓｎ、　Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、　Ｍｅｔ、　Ａｌａ、　Ａｒｇ、　Ｔ ｒｐおよびＬｙｓから成る群から選ばれるアミノ酸残基であり、特にここにおい てＸ　Ｉ　ＳはＬｙｓ又はＴｈｒであるか；又はここにおいてＸＩ６はＧｌｙで ある）である。好ましい態様において、ＸＩはＬｙｓ−ＰｒｏでありそしてＸ１ ６はＧｌｙであり、一方Ｘ！〜Ｘ′′は前記の如くである。

本発明のＴＦＰ　＋クニツータイプドメイン■の変異体は、プロテアーゼ結合領 域（すなわち、ｘ”　−ｘ”によって表わされるアミノ酸残基）にＭｅｔ残基を 好ましくは含有すべきでない。前記のα、　−ＰＩと同様に、これらの位置のい ずれか１つにおけるＭｅｔ残基は、ＰＭＮｓによって生産される酸素代謝生成物 による酸化的失活に対し阻害剤を感受性にするであろう、そして逆にこれらの位 置におけるＭｅｔ残基の欠落はそのような酸素代謝生成物の存在下、阻害剤をよ り安定にするであろう。

本発明の一般に好ましい変異体は、クニツドメインのプロテアーゼ結合部位に位 置する１個以上のアミノ酸残基（すなわち、アプロチニンの位置１３．１５．１ ６．１？、　１８．１９．２０．３４．３９．４０．４１および４６に対応する ｘ”−ｘ”の１又はそれ以上）が天然アプロチニンの同じ位置に存在するアミノ 酸に対して置換されている変異体である。

この変異体は次のアミノ酸配列を含んでなる：Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ 　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　ＡｌａＡｒｇ　ｌｉｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　 Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　 Ｐｒ。

Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＧｌｎ　Ｇｌｕ　Ｃ ｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　（配列番号 ２）。

他の面において、本発明は本発明に係るヒト　クニツータイプ阻害剤ドメイン変 異体をコードするＤＮＡ構築体に関する。本発明のＤＮＡ構築体は確立された標 準法、例えばＳ、　Ｌ、ベケージおよびＭ、　Ｈ，力８０１〜８０５頁に記載さ れた方法により合成的に調製できる。フォスフアミダイト法に従がい、オリゴヌ クレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成器中で合成し、精製し、アニールし、結合さ せそして適当なベクター中でクローン化される。

択一的に、（例えば合成オリゴヌクレオチドプローブを用いＴＦＰ　１をコード するＤＮＡに対するゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしそして そこからドメイン■に対しコードするＤＮＡ配列を単離することによって得られ る）ＴＦＰ［クニツータイプドメイン■をコードするゲノム又はｃＤＮＡライブ ラリーを使用することが可能である。

ＤＮＡ配列は、例えば周知の手順に従かい相同組換えに対し所望のアミノ酸配列 をコードする合成ヌクレオチドを用い部位特異的変異誘発により、アミノ酸置換 を導入することが望まれている部位に相当する１以上の部位で修飾される。

更に別の面において、本発明は本発明のＤＮＡ構築体を含んでなる組換え発現ベ クターに関する。組換え発現ベクターは組換え体ＤＮＡ工学に好都合で委ねられ 得るいかなるベクターであってよく、そしてベクターの選択はそれが導入される べき宿主細胞にしばしば依存するであろう。従って、ベクターは自己復製ベクタ ー、すなわち染色体外物（その復製は染色体復製に独立である）として存在する ベクター例えばプラスミドであってよい。択一的にベクターは、宿主細胞に導入 されるとき、宿主細胞ゲノム内に組込まれそしてそれが組込まれた染色体と共に 復製されるベクターである。

ベクターにおいて、本発明のＴＦＰ　Ｉクニッータイプドメイン■変異体をコー ドするＤＮＡ配列は、適当なプロモータ配列に作動連結されるべきである。プロ モーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいかなるＤＮＡ配列であっ てよくそして宿主細胞に相同であるか又は非相同であるプロテアーゼをコードす る遺伝子から誘導され得る。哺乳動物細胞において本発明のＴＦＰＩクニッータ イプドメイン■変異体をコードするＤＮＡの転写を行うための適当なプロモータ ーの例は、ＳＶ４０プロモーター（スブラマニー等、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌ、１　。

１９８１、８５４−８６４頁）　、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモ ーター（パルミター等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２，１９８３．８０９−８１４頁 ）又はアデノウィルス２メジヤーレートプロモーターである。酵母宿主細胞にお いて使用するための適当なプロモーターには、酵母解糖遺伝子からの頁）又はア ルコールデバイドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター（ユング等、Ｇｅｎｅｔ ｉｃ　［！ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏ ｒ　Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ　（ヘレンダー等編）、ブレナス社、ニューヨーク、 １９８２）　、又はＴＰＩＩ　（米国特許４．５９９．３１１）又はＡＤＨ２− ４Ｃ（ラッセル等、ＮａｔｕｒｅｔｐｉＡプロモーターである。

本発明のＴＦＰ　Ｉクニツータイプドメイン■変異体をコードするＤＮＡ配列は 又、適当なターミネータ−１例えばヒト成長ホルモンターミネータ−（バルミタ ー等、同上）又は（菌類宿主に対し）　ＴＰＩＩ　（アルバーおよびカワサキ、 同上）又はＡＤＨ３（ミックナツト等、同上）プロモーターに作動連結され得る 。更に、ベクターはポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０又はアデノウィル ス５Ｅｌｂ領域）、転写エンハンサ−配列（例えばＳＶ４０エンハンサ−）およ び転写エンハンサ−配列（例えば、アデノウィルスＶＡ　ＰＮＡｓをコードする 配列）の如き要素を含んでなる。

本発明の組換え体発現ベクターは、対象の宿主細胞中でベクターを復製せしめる ＤＮＡ配列を更に含んでなる。（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）そのよう な配列の例は、復製のＳＶ４０開始点、又は（宿主細胞が酵母細胞である場合） 酵母プラスミドの２μ復製遺伝子ＲＥＰ１３および復製開始点である。ベクター は又、選択マーカー、例えば遺伝子（その生成物は宿主細胞内の欠損を補う）、 例えばジヒドロフオレートリダクターゼ（ＨＤＰＲ）をコードする遺伝子又は薬 物、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサレートに耐性を与 える遺伝子、又はシゾサッカロマイセス　ボムベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｐ、　Ｒラッセル等により記載、Ｇｅ ｎｅ　４０，１９８５．１２５〜１３０頁）を含んでなる。

本発明のＴＦＰ　Ｉクニツータイプドメイン■変異体をコードするＤＮＡ配列を 連合するために用いられる手順、およびそれらを、復製に対し必要な情報を含有 する適当なベクター内に挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である （注、例えば、サンプルツク等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド　スプリングハーバ−、ニューヨ ーク、１９８９）。

本発明の発現ベクターが導入される宿主細胞は、本発明のＴＦＰ　Ｉクニツータ イプドメイン■変異体を生産できる如何なる細胞であってよくそして好ましくは 真核細胞、例えば哺乳動物、酵母又は菌類細胞である。

本発明に従って、宿主細胞として用いられる酵母生物体は、培養により、本発明 のＴＦＰ　Ｉクニッータイプドメイン■変異体を多量に生産する如何なる酵母生 物体であってよい。適当な酵母生物体の例は、酵母菌種サツカロマイセス　セレ ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サツカロマイ セス　クルベリ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）　、シゾ サッカＯ’フイセス　ボムベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍ ｂｅ）又はサツカロマイセス　ラバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａ ｒｕｍ）の菌株である。酵母細胞の形質転換は、例えばプロトプラスト形成、次 いで自体公知方法で形質転換により行うことができる。

適当な哺乳動物細胞系の例は、ＣＯ３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）　、ＢＨＫ 　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）又はＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）細胞系である 。哺乳動物細胞に移入し次いで細胞内で導入されたＤＮＡ配列を発現する方法は 、例えば８４１−８４５頁に記載されている。

択一的に、菌類細胞は本発明の宿主細胞として使用できる。適当に記載されてい る。

本発明は更に、本発明に係るＴＦＰＩクニツータイプドメイン■変異体の製造方 法に関し、この方法は変異体の発現を誘発する条件のもとて前記細胞を培養し次 いで得られた変異体を培養物から回収することを含んでなる。

細胞を培養するために用いられる培地は、宿主細胞の選択に応じ、哺乳動物細胞 又は菌類（酵母を含む）細胞を増殖するために適当な如何なる通常の培地であっ てよい。変異体は増殖培地に対し宿主細胞により分泌されそして細胞を培地から 遠心分離により又は濾過により分離し、上澄み又は濾液の蛋白質成分を塩、例え ば硫酸アンモニウムにより沈殿させ、種々のクロマトグラフィー法、例えばイオ ン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー等により精製 することを含む常法によりそこから回収される。

本発明は又、本発明のＴＦＰ　Ｉクニツータイプドメイン■変異体並びに医薬と して許容され得る担体又は賦形剤を含んでなる医薬組成物する確立された方法に より製剤化できる。組成物は典型的には全身性注射用又は注入用に適した形態で あってよく、そしてそのま＼殺菌水又は等張食塩水又はグルコース溶液と共に製 剤化できる。

従って、本発明のＴＦＰ　Ｉクニツータイプドメイン■変異体は、天然アプロチ ニン又は他の阻害剤プロフィールを有するアプロチニン類似体に対し提案されて いる治療的適用、特に多量のアプロチニン用量の使用を必要とする適用に対し有 利に使用することが意図される。

本発明の変異体の使用が、その能力の結果として、ヒトセリンプロテアーゼ、例 えばトリプシン、プラスミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧおよ びプロテアーゼー３を阻害することが示される治療的適用には、（以下に制限さ れないカリ急性膵炎、炎症、血小板減少症、血小板機能の保存、器官保存、創傷 治ゆ、ショック（ショック肺を含む）および線溶亢進出血、気腫、リューマチ様 関節炎、成人呼吸性疾患症状、慢性炎症腸疾患および乾癖、換言すればエラスタ ーゼ、カテプシンＧおよびトリガード（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）ＰＭＮｓから放出 されるブロティナーゼー３により病理学的タンパク質分解によりひきおこされる と推定される疾患が含まれる。

更に、本発明は過剰刺激されたＰＭＮｓから放送されたプロテアーゼによる、病 理学的タンパク質分解に関連した疾患又は症状の予防又は治療に対する医薬の製 造に対し上記の如＜ＴＦＰＩクニツータイプ阻害剤ドメイン■又はその変異体の 使用に関する。上記の如く、ヘパリンをＴＦＰ　ｌクニツータイプ阻害剤ドメイ ン■又は変異体と同時に投与することは有利であろう。

前記の医薬使用とは別に、特定した如きＴＦＰ　Ｉクニツータイプドメイン■又 はその変異体は、例えばスクリーニング分析又はアフィニティクロマトグラフィ ーにより、直接に又は間接にＴＦＰ　Ｉクニツータイプドメイン■を結合する、 有用なな天然物質、例えばプロテアーゼ又はレセプターを単離するために使用で きる。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）命名：ノボ　ノルディスクＡ／５（Ｂ）街：ノボ　アレ （Ｃ）市：バグスバエルト （Ｄ）国：デンマーク （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）　：　ＤＫ−２８８０（Ｇ）（電話）　：　＋４５４ ４４４８８８８（Ｈ）テレファクス：　＋４５４４４９３２５６（１）テレック ス：　３７０３０４ （ｉｉ）発明の名称：ヒト　クニツータイプ　プロテアーゼ阻害剤変異体 （ｉｉ）配列の数＝２ （ｉｖ　）コンピューター読みとり方式（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動システム：　 ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ８（２）配列番号：ｌに対する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝５７個のアミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子タイプ：蛋白質 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名二合成 （ｘｉ）配列の詳細：配列番号２： （２）配列番号＝２に対する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝５８個のアミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子タイプ：蛋白質 （ｖｉ　）起源： （Ａ）生物−合成 （ｘｉ）配列の詳細：配列番号２： 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年７月７日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．組織因子プロテアーゼ阻害剤（ＴＦＰＩ）のヒト　クニツータイプ　プロテ アーゼ阻害剤ドメインＩＩＩの変異体であって、該変異体が次のアミノ酸配列： 【配列があります】 （配列番号１） （式中、Ｘ１は水素又は１〜５個の天然アミノ酸残基（Ｃｙ３を除く）であり、 Ｘ２〜Ｘ１５は各々独立に天然アミノ酸残基を表わし、そしてＸ１６はＯＨ又は １〜５個の天然アミノ酸残基（Ｃｙｓを除く）を表わす、但しアミノ酸残基Ｘ１ 〜Ｘ１６の少なくとも１個は、天然配列の対応するアミノ酸残基と異なる） を含んでなる、前記変異体。
2. ２．Ｘ１がＧｌｙ−Ｐｒｏである、請求の範囲第１項記載の変異体。
3. ３．Ｘ２が、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｔｈｒ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，Ｃｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌ ｎ，Ｓｅｒ，ＩｌｅおよびＶａｌから成る群から選ばれるアミノ酸残基である、 請求の範囲第１項記載の変異体。
4. ４．Ｘ２がＴｈｒ又はＡｒｇである、請求の範囲第３項記載の変異体。
5. ５．Ｘ３がＰｒｏ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＶａｌおよびＩｌｅから成る群か ら選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１項記載の変異体。
6. ６．Ｘ３がＰｒｏ又はＬｅｕである、請求の範囲第５項記載の変異体。
7. ７．Ｘ４が、Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌ ｙ，Ｓｅｒ，Ｍｅｔ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，ＡｓｎおよびＡｌａから成る群 から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１項記載の変異体。
8. ８．Ｘ４がＬｙｓ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ，Ｇｌｎ又はＡｒ ｇである、請求の範囲第７項記載の変異体。
9. ９．Ｘ５がＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｐｈｅ，ＧｌｎおよびＡｓｐから 成る群から選ばれる、アミノ酸残基である請求の範囲第７項記載の変異体。
10. １０．Ｘ５がＡｌａ，Ｔｈｒ，Ａｓｐ又はＧｌｙである、請求の範囲第９項記載 の変異体。
11. １１．Ｘ５がＡｒｇ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ａｓ ｐ，Ｇｌｎ、Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ａｓｎ，Ｉｌｅおよび Ｍｅｔから成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１項記載の変 異体。
12. １２．Ｘ５がＡｒｇ，Ｐｈｅ，Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ又はＴｙｒである、請求 の範囲第１１項記載の変異体。
13. １３．Ｘ７がＩｌｅ，Ｍｅｔ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ、およ びＰｈｅから成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１項記載の 変異体。
14. １４．Ｘ７がＩｌｅ又はＧｌｕである、請求の範囲第１３項記載の変異体。
15. １５．Ｘ８がＩｌｅ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｃｌｎ，Ｇｉ Ｈ，ＡｒＥ，ＰｒｏおよびＰｈｅから成る群から選ばれるアミノ酸残基である、 請求の範囲第１項記載の変異体。
16. １６．Ｘ８がＩｌｅ又はＡｓｎである、請求の範囲第１５項記載の変異体。
17. １７．Ｘ９がＡｒｇ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｃｌｎ，ＬｙｓおよびＬｅｕから成る群 から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１項記載の変異体。
18. １８．Ｘ９がＡｒｇである、請求の範囲第１７項記載の変異体。
19. １９．Ｘ１０がＧｌｎ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｔｒｐ，Ａｌａ，Ｔ ｈｒ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｍｅｔ，ＡｒｇおよびＶａｌ から成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１項記載の変異体。
20. ２０．Ｘ１０がＶａ１又はＬｙｓである、請求の範囲第１９項記載の変異体。
21. ２１．Ｘ１１がＳｅｒ又はＧｌｙである、請求の範囲第１項記載の変異体。
22. ２２．Ｘ１２がＧｌｙ，Ｍｅｔ，Ｃｌｎ，Ｇｌｕ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐ ｒｏおよびＡｓｎから成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１ 項記載の変異体。
23. ２３．Ｘ１２がＡｌａ又はＬｅｕである、請求の範囲第２２項記載の変異体。
24. ２４．Ｘ１３がＡｌａ又はＧｌｙである、請求の範囲第１項記載の変異体。
25. ２５．Ｘ１４がＬｙｓ，ＡｓｎおよびＡｓｐから成る群から選ばれるアミノ酸残 基である、請求の範囲第１項記載の変異体。
26. ２６．Ｘ１４がＬｙｓ又はＡｓｎである、請求の範囲第２５項記載の変異体。
27. ２７．Ｖａｌ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｉ ｌｅ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｔ ｒｐおよびＬｙｓから成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求の範囲第１ 項記載の変異体。
28. ２８．Ｘ１５がＬｙｓ又はＧｌｕである、請求の範囲第２７項記載の変異体。
29. ２９．Ｘ１６がＧｌｙである、請求の範囲第１項記載の変異体。
30. ３０．Ｘ１がＧｌｙ−ＰｒｏでありそしてＸ１６がＧｌｙである、請求の範囲第 １項記載の変異体。
31. ３１．次のアミノ酸配列： 【配列があります】 （配列番号２）。 を含んでなる、請求の範囲第１項記載の変異体。
32. ３２．請求の範囲第１〜３１項のいずれか１項に記載のヒトクニツータイププロ テアーゼ阻害剤変異体をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築体。
33. ３３．請求の範囲第３２項記載のＤＮＡ構築体を含んでなる組換え発現ベクター 。
34. ３４．請求の範囲第３２項記載のＤＮＡ構築体又は請求の範囲第３３項記載の発 現ベクターを含有する細胞。
35. ３５．請求の範囲第１〜３１項のいずれか１項に記載のヒトクニツータイププロ テアーゼ阻害剤変異体の製造方法であって、請求の範囲第３４項記載の細胞を蛋 白質の発現を誘発する条件下で培養し、次いで培地から得られた蛋白質を回収す ることを含んでなる、前記方法。
36. ３６．請求の範囲第１〜３１項のいずれか１項に記載のヒトクニツータイププロ テアーゼ阻害剤変異体および医薬として許容され得る担体又は賦形剤を含んでな る、医薬組成物。
37. ３７．更にヘパリンを含んでなる、請求の範囲第３６項記載の医薬組成物。
38. ３８．病理学的蛋白質分解と関連した疾患又は症状の予防又は治療のための医薬 の製造に対する、請求の範囲第１〜３１項のいずれか１項に記載のＴＦＰＩのヒ トクニツータイププロテアーゼ阻害剤ドメインＩＩＩ又はその変異体の使用。