HUT70294A

HUT70294A - A human kunitz-type protease inhibitor variant

Info

Publication number: HUT70294A
Application number: HU9401992A
Authority: HU
Inventors: Kjeld Norris; Fanny Norris; Lars Christian Petersen; Soren Erik Bjorn; Ole Hvilsted Olsen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1992-01-07
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 1995-09-28
Also published as: ATE152735T1; NZ246568A; FI943232A; WO1993014120A1; CA2127250A1; IL104326A0; FI943232A0; NO942551D0; NO942551L; EP0621870B1; RU94045952A; JPH07506241A; DE69310499D1; CZ164594A3; AU3345893A; EP0621870A1; ZA9397B; AU675925B2; HU9401992D0

Description

A találmány tárgya humán Kunitz-típusú proteázinhibítordomén változata, a változatot kódoló DNS, eljárás a változat előállítására, és a változatot tartalmazó gyógyszerkészítmény.

A polimorfmagvú leukociták (neutrofilek vagy PMN-ek) és a mononukleáris fagociták (monociták) fontos szerepet töltenek be a szövetkárosodásnál, fertőzésnél, akut vagy krónikus gyulladásnál és a sebhegedésnél. A sejtek a vérből a gyulladás helyéhez vándorolnak és - a megfelelő stimulációt követve - oxidánsokat (0·, 0₂, H₂0₂ és H0C1), valamint különféle proteoiitikus enzimeket tartalmazó szemcséket hoznak létre. A kiválasztó szemcsék többek között alkalikus foszfatázt, metaloproteinázokat - például zselatinázt és kollagenázt - és szerin-proteázokat - például neutrofil elasztázt, katepszin G-t és proteináz 3-t tartalmaznak.

Látens metaloproteinázok szabadulnak fel metaloproteináz szöveti gátlóval (TIMP) együtt. Az aktívíciós mechanizmus nem teljesen felderített, de valószínű, hogy tiolcsoportok oxidációja és/vagy a proteolízis szerepet játszik a folyamatban. A szabad metaloproteináz-aktívitás a TIMP inaktivációtól is függ.

A leukociták azurofil szemcséiben a szerin-proteázok neutrofil elasztáz, katepszin G és proteináz-3 - aktív enzimként talalálhatók glükóz-amino-glükánokkal komplexet alkotva. Ezek a komplexek inaktívak, de a szekréciókor disszociálnak, és felszabadulnak az aktív enzimek. A proteáz aktivitás semlegesítésére nagy mennyiségű α-^-proteináz inhibitor (α^-PI) és a-^-kimotripszin inhibitor (a^-Chl) található a plazmában. A polimorfmagvú • · · · • · · · · · · • ·· ······ · * ····· · « · · ·

- 3 leukociták viszont képesek helyileg inaktiválni az inhibitorokat, így a neutrofil elasztáz legfontosabb inhibitora, az a^-PI reaktív centruma (Met-358) érzékeny az aktiválódott PMN-ek által termelt metabolitok oxidáló hatására. Ez kb. 2000-szeres mértékben csökkenti az α^-PI neutrofil elasztázzal szembeni affinitást.

Az α-^-Ρΐ helyi semlegesítése után az elasztáz más porteolitikus enzimek számos gátlóját képes tönkretenni. Az elasztáz hasítja az α^-ChI-t és ezáltal elősegíti a katepszin G aktivitását. Ugyancsak hasítja a TIMP-t, ami a metaloproteinázok általi szöveti degradációt eredményezi. Továbbá az elasztáz hasítja az antitrombin Ill-t és a heparin kofaktor ΙΙ-t, valamint a szöveti faktor folyamatgátlót (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), ami valószínűleg elősegíti a rögképződést. Másrészt a neutrofil elasztáz koagulációs faktorokat lebontó képessége feltételezhetően ellentétes hatású, úgyhogy az elasztáz teljes hatása nem világos. A neutrofil elasztáz fibrinolízisre gyakorolt hatása egyértelműbb. A fibrinolítikus aktivitás fokozódik, amikor az elasztáz hasítja a plazminogén aktívátor-gátlót és az a₂ plazmin-inhibítort. Ezenkívül, ezen mindkét inhibitort oxidálják és inaktiválják az 02^-metabolitok.

A PMN-ek nagy mennyiségű szerin-proteázt tartalmaznak, és az egyes leukocita proteázokból 200 mg szabadul fel naponta, hogy leküzdjék a szervezetbe behatoló ágenseket. Akut gyulladáskor a felszabaduló enzim mennyisége többszörösére növekszik. Normális körülmények között az a^-PI, a^-Chl és az a-j. makroglobulin gátlók • · ·

nagy mennyisége kellően alacsony szinten tartja a proteolízist. Több jel azonban arra mutat, hogy számos krónikus betegséget patológiás proteolízis okoz, ami a PMN-ek túlstimuláltságának következménye. Ezt eredményezi például az autoimmun válasz, a krónikus fertőzés, a dohányfüst vagy más irritáló tényező, stb.

Az aprotinin (borjú hasnyálmirigy-tripszin inhibitor) ismert gátlója a különféle proteázoknak, ideértve a tripszint, kimotripszint, plazmint és kallikreint, ezért terápiás céllal alkalmazzák az akut hasnyálmirigy-gyulladás, a sokk-szindróma különböző állapotai, hiperfibrinolitikus vérzés és miokardiális infarktus kezelésére [például J. E. Trapnell és munkatársai, Brit. J. Surg., 61:177 (1974); J. McMichan és munkatársai, Circulatory shock, 9:107 (1982); L. M. Auer és munkatársai, Acta Neurochir., 49:207 (1979); G. Sher, Am. J. Obstet. Gynecol., 129:164 (1977); és B. Schneider, Artzneim.-Forsch., 26:1606 (1976)]. Az aprotinin nagy dózisú adagolásával lényegesen csökkenthető a szívműtéteknél - beleértve a kardio-pulmonáris sönt kialakítását - jelentkező vérveszteség [például B.P. Bidstrup és munkatársai, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 97:364-372 (1989); W. van Oeveren és munkatársai, Ann. Thorac. Surg., 44:640-645 (1987)]. Megelőzőleg kimutatták [például H. R. Wenzel és H. Tschesche, Angew. Chem. Internat. Ed., 20: 295 (1981)], hogy bizonyos aprotinin analógok, például az aprotinin (1-58, Vall5) viszonylag magas szelektivitást mutatnak a granulocita-elasztázt illetően és gátló hatást a kollagenázra, míg az aprotinin (3-58, Argl5, Alal7, Ser42) kiváló plazmakallikreint gátló hatással rendelkezik (lásd; WO 89/10374).

Viszonylag magas aprotinin dózisok ismételt injektálásánál vesekárosító hatást figyeltek meg patkányoknál, nyulaknál és kutyáknál (Bayer, Trasylol, Inhibitor of proteainase; E. Glaser és munkatársai, in: Verhandlungen dér Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin, 78. Kongress, Bergmann, München 1972, 1612-1614. old.). Az aprotinin nefrotoxikus hatása (többek között elváltozásokként jelenik meg) a hatóanyagnak a vese proximális tubulussejtjeiben való felhalmozódásával magyarázható, ami az aprotinin magas pozitív töltésének az eredménye, minthogy megkötődik a tubulusok negatív töltésű felületén. Ez a nefrotoxicitás az aprotinint klinikai felhasználásra kevésbé alkalmassá teszi különösen ott, ahol az inhibitor nagy dózisban történő adagolására van szükség (például a kardiopulmonális sönt kialakításánál). Emellett az aprotinin egy borjúprotein, ami ezért egy vagy több epitopot tartalmazhat, ami nemkívánatos immunválaszt vált ki az embernél.

A jelen találmány tehát olyan humán proteinázinhibítorokkal foglalkozik, melyek aprotinin típusúak (azaz Kunitz-típusú inhibitorok), hasonló gátlási profillal, illetve ezek olyan módosulataival, melyek a kívánt gátlási profillal rendelkeznek.

A találmány tárgya a szöveti faktor folyamat gátló (TFPI) humán, Kunitz-tipusú proteázinhibítor dómén III-jánek változata, amelynek aminosavszekvenciája:

X¹ Ser

Trp

Cys

Leu

Thr

Pro

Alá

Asp

X²

Gly X

:³ Cys X⁴ X⁵

x⁶ :

X⁷ X⁸

Phe

Tyr

Asn

Ser

Val

Ile

Gly

Lys

Cys

Arg

Pro

Phe X¹⁰

Tyr

χΐι

Gly

Cys

X¹²

_x14

Glu

Asn

Phe

_X15

Ser

Lys

Gin Glu

Cys

Lys

Arg

Alá

Cys

Lys

X¹⁶

(SEC

! ID

No.

1)

ahol X¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, X²-X¹⁵ jelentése egymástól függetlenül valamelyik természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t és X¹⁸ jelentése hidroxilcsoport vagy 1-5 természetes aminosavrészek közül legalább egy eltér a természetes aminosavszekvencia megfelelő aminosavrészétől.

A természetes aminosavrész kifejezésen értjük a 20 általánosan előforduló aminosav, tehát Alá, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg és His valamelyikét.

A TFPI-t, ami exogén pathway-inhibitorként (EPI) vagy lipoproteinnel kapcsolatos koaguláció inhibitorként (LACI) is ismert, Broze és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1886-1890 (1987) és EP 300 988] izolálták és a proteint kódoló gént klónozták (EP 318451). A fehérje másodlagos szerkezetének analízise azt mutatja, hogy a proteinnek három Kunitz-típusú inhibítor-doménje van: 22-79. aminosavszakasz (I), 93-150. aminosavszakasz (II) és 185-242. aminosavszakasz (III). A Kunitz-típusú domén-I TF/FVIIa-hoz, a Kunitz-típusú dómén II az FXa-hoz kötődik [Girard és munkatársai, Natúré, 338:518-520 (1989).

Egy vagy több aminosavnak a fentebb említett helyeken

történő helyettesítésével lehetőség nyílik a TFPI Kunitz-típusú dómén III gátlási profiljának megváltoztatására oly módon, hogy az elsődlegesen gátolja a neutrofil elasztázt, a katepszin G-t és/vagy a proteináz-3-t. Továbbá lehetőség van olyan változatok elkészítésére, melyek specifikusan gátolják a koagulációban vagy fibrinolízisben (például plazmin vagy plazma-kallikrein), illetve a komplement kaszkádban résztvevő enzimeket.

A TFPI Kunitz típusú dómén III-nak egyik előnye, hogy az ossz töltése negatív, ellentétben az aprotininével, mely - mint fentebb jeleztük - erős pozitív töltésű. Olyan találmány szerinti változatokat készíthetünk tehát el, melyeknek töltésösszege az aprotinin töltésénél kevésbé pozitív, és így e változatok nagy dózisban való adagolásánál csökken a vesekárosodás esélye. A másik előnye az aprotininhez képest, hogy ez humán fehérje (fragmens), így tehát az emberi szervezetbe való bevitelénél a nemkívánatos immunkreakciók lényegesen lecsökkennek.

A TFPI Kunitz-típusú dómén III előnyös variánsai közül példaként említjük azt, ahol X⁴ jelentése Gly-Pro; vagy vagy ahol X² jelentése Alá, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile vagy Val, különösen ahol X² jelentése Thr vagy Arg; vagy ahol X³ jelentése Pro, Thr, Leu, Arg, Val vagy Ile, különösen, ahol X³ jelentése Pro vagy Ile; vagy ahol X⁴jelentése Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn vagy Alá, különösen ahol X⁴ jelentése Lys, Val, Leu, Ile, Thr, Met, Gin vagy Arg; vagy ahol X⁵ jelentése Alá, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin vagy Asp, különösen, ahol X⁵ jelentése Alá, Thr, Asp vagy Gly; vagy ahol X⁸ jelentése Arg, Alá, Lys, * · · · • · · ·····« • · · · · · · · • 4 · 4 · ·

Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile vagy Met, különösen, ahol Χθ jelentése Arg, Phe, Alá, Asn, Ile, Leu vagy Tyr; vagy ahol X⁷ jelentése Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val vagy Phe, különösen ahol X⁷ jelentése Ile vagy Glu; vagy ahol X® jelentése Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro vagy Phe, különösen, ahol X® jelentése Ile vagy Asn; vagy ahol X⁹jelentése Arg, Ser, Alá, Gin, Lys vagy Leu, különösen, ahol X⁹jelentése Arg; vagy ahol X¹⁰ jelentése Gin, Pro, Phe, Ile, Lys,

Trp, Alá, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg vagy Val, különösen, ahol Χ⁴θ jelentése Val vagy Lys; vagy ahol X¹¹1 2 jelentese Ser vagy Gly, vagy ahol X jelentese Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro vagy Asn, különösen ahol X⁴² jelentése Arg vagy Glu; vagy ahol X⁴³ jelentéseAla vagy Gly; vagy ahol X⁴⁴jelentése Lys vagy Asn; vagy ahol X⁴⁵ jelentése Val, Tyr, Asp,

Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Alá, Arg, Trp vagy Lys, különösen ahol X⁴³ jelentése Lys vagy Thr; vagy ahol X⁴³ jelentése Gly. Előnyös kivitelezési módnál X⁴jelentése Lys-Pro és X⁴³ jelentése Gly, míg az X²-X⁴⁵ jelentése azonos a fentebb tett meghatározásokkal.

A találmány szerinti TFPI Kunitz-típusú dómén III variánsok előnyösen nem tartalmaznak Met-t a proteázkötő régióban (vagyis az X³-X⁴⁴ aminosavak által reprezentált szakaszban). Az α^-ΡΕΙ fent leírt analógiájára, e helyek bármelyikén lévő Met maradék az inhibitort érzékennyé tenné a PMN-ek által termelt oxigén-metabolitok oxidatív inaktiváló hatásával szemben és fordítva, ha e • · · · · • 4 • · · ♦ · · · · · • · ·♦ · · • · « · · ··*·*· · ν • · · ·« • · ·« ···· helyeken nem szerepel Met maradék, az az inhibitornak nagyobb stabilitást biztosít az oxigén-metabolitok jelenlétében.

Általában előnyösek azok a találmány szerinti változatok, ahol a Kunitz-típusú dómén proteázkötő helyén lévő aminosavak közül egy vagy több (azaz az X²-X⁴⁴ aminosavak közül egy vagy több, ami megfelel az aprotinin 13., 15., 16., 17., 18., 19., 20., 34., 39., 40., 41. és 46. helyének) azonos a természetes aprotinin megfelelő helyén lévő aminosavával.

Az ilyen változat az alábbi aminosavszekvenciájú:

Gly

Pro

Ser

Trp

Cys

Leu

Thr

Pro

Alá

Asp

Arg

Gly

Pro

Cys

Lys

Alá

Arg

Ile

Arg

Phe

Tyr

Asn

Ser

Val

Ile

Gly

Lys

Cys

Arg

Pro

Phe

Val

Tyr

Gly

Cys

Arg

Alá

Lys

Glu

Asn

Phe

Lys

Ser

Lys

Gin

Glu

Cys

Lys

Arg

Alá

Cys

Lys

Gly

(SEC

! ID

No.

2) .

A találmány további tárgya, DNS szerkezet, ami humán Kunitz-típusú inhibítor-domén találmány szerinti változatát kódolja. A találmány szerinti DNS szintetikus úton a szokásos módszerekkel előállítható, például S. L. Beaucage és Μ. H. Caruthers által leírt foszfoamidit módszerrel [Tetrahedron Letters, 22:1859-1869 (1981)] vagy Matthes és munkatársai módszerével [EMBO Journal, 3:801-805 (1984)]. A foszfoamidit módszer szerint oligonukleotidokat szintetizálunk, például egy automata DNS szintetizátorban azokat tisztítjuk, hasítjuk, ligáljuk és megfelelő vektorokban klónozzuk.

A TFPI Kunitz-típusú dómén III klónozásához alternatív módon használhatunk genomális vagy cDNS-t (a genomiális vagy cDNS könyvtár szűrővizsgálatával szintetikus oligonukleotid próbákat * ·

- 10 alkalmazva és a dómén Ill-t kódoló DNS szekvenciát izolálva).

A DNS szekvencia módosítható egy vagy több olyan helyen, ahol a kívánt aminosavcserét akarjuk elvégezni, például hely-irányította mutagenezissel, amihez a homológ rekombináció jól ismert eljárásában a kívánt aminosavszekvenciát kódoló szintetikus oligonukleotidokat használjuk.

A találmány további tárgya, a találmány szerinti DNS szerkezetet tartalmazó rekombináns expressziós vektor. A rekombináns expressziós vektor lehet bármilyen vektor, ami előnyösen alávethető rekombináns DNS eljárásoknak. A vektor kiválasztása gyakran a gazdasejt függvénye. így a vektor lehet önállóan sokszorozódó vektor, azaz amelyik extrakromoszómálisan, elkülönülten létezik, replikációja független a kromoszómális replikációtól; ilyen például a plazmid. Másrészt a vektor lehet olyan is, hogy a gazdasejtbe való bevitel után beépül a gazdasejt genomjába és a kromoszómá(k)val replikálódik, amelybe beépült. A vektorban a TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változatát kódoló DNS szekvenciának működő kapcsolatban kell legyen egy alkalmas promoter szekvenciával. A promoter bármilyen olyan DNS szekvencia lehet, ami a kiválasztott gazdasejtben transzkripciós aktivitást mutat, és származhat homológ vagy heterológ fehérjéket kódoló génekből. így például emlős sejtekben a TFPI Kunitz-típusú dómén II találmány szerinti változatát kódoló DNS transzkripciójának irányítására alkalmas az SV promoter [Subramani és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 1:854-864 (1981)], az MT-1 (metalotionein) promoter [Palmiter és munkatár··· ··· • · · • ····« * · · ·· • · · · · · · ····

- 11 sai, Science, 222:809-814 (1983)] vagy az adenovírus 2 major késői promoter. Élesztő gazdasejtekben alkalmazható promoterek lehetnek az élesztő glikolitikus génjeiből [Hitzeman és munkatársai, J.

Bioi. Chem., 255:12073-12080 (1980); Alber és Kawasaki, J. Mól.

Appl. Gén., 1:419-434 (1982)], az alkohol-dehidrogenáz génekből [Young és munkatársai; in: Genetic Engeineering of Microorganisms fór Chemicals, szerk.: Hollaender és munkatársai, Plenum Press, New York, 1982) származó promoterek vagy a TPI 1 (4 599 311 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) vagy ADH2-4c [Russel és munkatársai, Natúré 304:652-654 (1983)] promoterek. Amennyiben a gazdasejt fonalasgomba, alkalmas promoter lehet az ADH3 promoter [McKnight és munkatársai, The EMBO J. , 4:2093-2099 (1985)] vagy a tpiA promoter.

A TFPI Kunitz-típusú dómén III változatot kódoló kódoló DNS szekvenciának egy alkalmas terminátorhoz is működőképesen kell kapcsolódjon. Ilyen terminátor lehet a humán növekedési hormon terminátora (Palmiter és munkatársai, lásd fent) vagy ha a gazdasejt gomba - a TPI1 (Alber és Kawasaki, lásd fent) vagy az ADH3 (McKnight és munkatársai, lásd fent) promoterek. A vektor további elemeket is tartalmazhat, például poliadenilációs szignált (például az SV40-ből vagy az adenovírus 5 Elb régiójából), transzkripciós enhancer szekvenciát (például SV40 enhancer) és transzlációs enhancer szekvenciát (például VA adenovírus RNS-t kódoló.

A találmány szerinti rekombináns expressziós vektor tartalmazhat még olyan DNS szekvenciát, ami lehetővé teszi a vektor • · · β · Μ · • ·· ·····« « 4 • ····· ·· « 9« •· · ·· · * · · ··

- 12 számára, hogy az adott gazdasejtben replikálódjon. Ilyen szekvenciára példa - ha a gazdasejt emlőssejt - az SV40 replikációs origója vagy - ha a gazdasejt élesztősejt - a 2 μ-os élesztőplazmid REP 1-3 replikációs gének vagy replikációs origó. A vektor tartalmazhat szelektációs markert, például olyan gént, aminek terméket kiegészíti a hiányos gazdasejtet, ilyen lehet a dihidrofolát-reduktázt (DHFR) kódoló gén; vagy amelyik rezisztenciát biztosít egy adott hatóanyaggal, például neomicinnel, higromicinnel vagy metotrexáttal szemben; vagy a Schizosaccharomyces pombe TPJ gént [P. R. Russel, Gene, 40:125-130, (1985)].

Az eljárás, mellyel a TFPI Kunitz-típusú dómén III változatot kódoló DNS szekvenciát, a promotert, illetve a terminátort ligáijuk és a replikációs információkat tartalmazó alkalmas vektorba beépítjük; jól ismert a szakemberek előtt (lásd például: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

A gazdasejt, amelybe a találmány szerinti expressziós vektort bevisszúk, bármilyen sejt lehet, ami a találmány szerinti TFPI Kunitz-típusú dómén III változatot termelni képes, ez előnyösen egy eukarióta sejt, például emlős-, élesztő- vagy gombasej t.

A gazdasejtként alkalmazható élesztősejt bármilyen olyan élesztőgomba lehet, ami a tenyésztése alatt nagy mennyiségű TFPI Kunitz-típusú dómén I találmány szerinti változatot termel. Példaként említhető alkalmas élesztőgombák a Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe vagy a ***** · · ·· 9 · • * · · ♦ · » * · * ««···· · A ♦ ····♦ « · « ·» ·· · «· ·· ··«·

- 13 Saccharomyces uvarum törzsei. Az élesztősejt transzformálása történhet protoplasztképzéssel, amit természetesen az ismert módon végzett transzformáció követ.

Alkalmas emlős sejtvonalakra példaként említjük a COS (ATCC

CRL 1650), a BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) vagy a CHO (ATCC

CCL 61) sejtvonalakat. Az emlőssejtek transzfektálására és a sejtekbe bevitt DNS szekvenciák kifejezésére szolgáló módszereket írják le az alábbi munkák: Kaufman és Sharp, J. Mól. Bio., 159:601-621 (1982); Southern és Berg, J. Mól. Appl. Génét., 1:327-341 (1982); Loyter és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79:422-426 (1982); Wigler és munkatársai, Cell, 14:725 (1978); Corsaro és Pearson, Somatic Cell Genetics, 7:603 (1981);

Graham és van dér Eb, Virology, 52:456 (1973); Neumann és munkatársai, EMBO J., 1:841-845 (1982).

Gazdasejtként alkalmazhatunk gombasejteket is. Alkalmasak a fonalasgombák sejtjei, például az Aspergillus vagy Neurospora fajok, különösen az Aspergillus oryzae vagy az Aspergillus niger törzsek. Aspergillus faj fehérjék kifejezésére való felhasználását írja le például az EP 238023 szabadalom.

A találmány további tárgya, eljárás a találmány szerinti

TFPI Kuniz-típusú dómén III változat előállítására, mely eljárás áll a fenti sejtek olyan körülmények között történő tenyésztéséből, mely a találmány szerinti inhibitor kifejeződéséhez vezet, valamint a nyert inhibitor tenyészléből való kinyeréséből.

A sejtek tenyésztéséhez használt tápközeg bármely olyan táptalaj lehet, mely alkalmas az emlőssejtek vagy a gombák • · ·· 9 * · • · « ·«···· · 9 ••••ν « * · «» • · «· < · ···· (beleértve az élesztőket) tenyésztésére. A gazdasejt az inhibitort kiválasztja a tápközegbe, ahonnan az a szokásos módszerekkel kinyerhető. Ehhez elválasztjuk a sejteket a közegtől centrifugálással vagy szűréssel, a felülúszóból vagy a szürletből sóval - például ammónium-szulfáttal - lecsapjuk a fehérjeszerű alkotórészeket, majd különféle kromatográfiás eljárással - például ioncserés kromatografálással vagy affinitás -kromatograf álással , stb. - tisztítunk.

A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény, mely a TFPI Kunitz-típusú dómén III találmány szerinti változatát tartalmazza gyógyászati szempontból alkalmazható vívőanyagok vagy közegül szolgáló anyagok kíséretében. A találmány szerinti készítmény bármely ismert módszerrel formulázható, erre példákat találunk a Reminton's Pharmaceutical Sciences (1985) munkában. A készítmény tipikus formájában alkalmas a szisztémás injekcióra vagy infúzióra és ehhez steril vízben, izotóniás sóoldatban vagy glükózoldatban készült oldatot használunk.

A TFPI Kunitz-típusú dómén III találmány szerinti változata tehát előnyösen alkalmazható gyógyászati célra ott, ahol natív aprotinin vagy más gátlási profilú aprotinin analóg javasolt, különösen abban az esetben, ha nagy aprotinin dózisok adagolása szükséges. A találmány szerinti változat alkalmazhatósága annak köszönhető, hogy gátolni képes a humán szerin-proteázokat, például a tripszint, plazmint, kallikreint, elasztázt, katepszin G-t, proteináz-3-at. Olyan betegségek kezelésére alkalmas, ahol feltételezhető, hogy azok oka az aktív PMN-ekből felszabaduló elasztáz, «··· · » 4 »4 • ·» 4 · *>4 « katepszin G és proteináz-3 által· kiváltott patológiás proteolízis. Ide tartozik (de nem korlátozódva csak ezekre) az akut hasnyálmirigy-gyulladás, gyulladások, trombocitopénia, vérlemezfunkció védelem, szervvédelem, sebhegesedés, sokk (beleértve a tüdősokkot) hiperfibrínolitikus vérzés, emfiszéma, reumatoid izületi gyulladás, felnőttkori légzési nehézségek, krónikus gyulladásos bélártalmak és pikkelysömör.

A találmány további tárgya a fent TFPI Kunitz-tipusú inhibitor dómén III-nak vagy változatának felhasználása olyan gyógyszer elkészítésére, mely alkalmas a túlstimulált PMN-ekből felszabaduló proteázok okozta patológiás proteolízissel kapcsolatos állapotok vagy betegségek vagy állapotok megelőzésére vagy kezelésére.

A fenti gyógyászati alkalmazáson kívül a TFPI Kunitz-típusú dómén III találmány szerinti változata felhasználható olyan természetes anyagok humán eredetű forrásokból való izolálására, melyek közvetlenül vagy közvetve a TFPI Kunitz-tipusú dómén III-hoz kötődnek. Ezek lehetnek például proteázok vagy receptorok. Az említett tulajdonság felhasználható szűrővizsgálatoknál vagy affinitás kromatográfia alkalmazásakor.

···· · ··		• »
• · w ·	•
• 9 · H·	···	• é
• · ···· *	• ·	··
• * ír « >	• 9

SZEKVENCIA LISTA

i) Bejelentő:

név:	Novo Nordisk A/S
b)	utca: Novo Allé
c)	város:	Bagsvaerd
e)	ország:	Dánia
f)	postai	irányítószám: DK-2880
g)	telefon	: +45 4444	8888
h)	telefax	: +45 4449	3256
i)	telex:	37304

ii) A bejelentés címe: Humán Kunitz-típusú proteázgátló változatai iii) A szekvenciák száma: 2 iv) számítógéppel olvasható forma

a) adathordozó: Floppy disk

b) számítógép IBM PC kompatibilis

c) operatív rendszer: PC-DOS/MS-DOS

d) Softwer: Patentln Release #1.0, Version #1,25 (EPO)

2) Adatok a SEQ ID No. 1-hez:

i) a szekvencia jellemzői:

a) hossza: 57 aminosav

b) típusa:aminosav

c) száltípus: egyszálú

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje vi) eredete

a) organizmus: szintetikus ·· ♦· • · · ··· ··· * · · *· ·· : :

• 4 xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 1:

Xaa 1

Ser

Trp

Cys

Leu 5

Thr

Pro

Alá

Asp

Xaa 10

Gly

Xaa

Cys

Xaa

Xaa 15

Xaa

Phe 20

Tyr

Asn

Ser

Val 25

Ile

Gly

Lys

Cys

Arg 30

Pro

Phe

Xaa

Tyr

Xaa 35

Gly Cys

Xaa

Xaa 40

Glu

Asn

Phe

Xaa 45

Ser

Lys

Gin

Glu

Cys 50

Leu

Arg

Alá

Cys

Lys 55

Lys

Xaa

2) Adatok a SEQ ID No. 2-höz:

i) A szekvencia jellemzői:

a) szekvencia hossza: 58 aminosav

b) típusa: aminosav

d) szerkezete: lineáris ii) a molekula típusa: fehérje vi) eredete

a) organizmus: szintetikus xi) a szekvencia leírása SEQ ID No. 2:

Gly

Pro

Ser

Trp

Cys

Leu

Thr

Pro

Alá

Asp

Arg

Gly

Pro

Cys

Lys

Alá

1

5

10

15

Arg

Ile

Arg

Phe

Tyr

Asn

Ser

Val

Ile

Gly

Lys

Cys

Arg

Pro

20

25

30

Phe

Val

Tyr

Gly

Cly

Cys

Gly

Arg

Lys

Glu

Asn

Phe

Lys

Ser

Lys

35

40

45

Gin Glu Cys Leu Arg Alá Cys Lys Lys Gly 50 55 • · · · ·

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. A szöveti faktor folyamat inhibitor (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) humán, Kunitz-típusú proteázinhibítor dómén III-jának változata, azzal j ellemezve, hogy az aminosavszekvenciáj a:

X⁴ 1 Ser Trp Cys Leu Thr Pro Alá Asp X² Gly X :³ Cys X⁴ X⁵ x⁶ : X⁷ X 8 _X9 Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe X⁴⁰ Tyr X⁴⁴ Gly Cys X⁴² X⁴³ X⁴⁴ Glu Asn Asn Phe X⁴³ Ser Lys Gin Glu Cys Lys Arg Alá Cys Lys Lys _χ16 (SEQ ! ID No. 1)

ahol X⁴ jelentése hidrogénatom vagy 1-5 terészetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, X²-X⁴³ jelentése egymástól függetlenül természetes aminosavrész, Χ⁴θ jelentése hidroxilcsoport vagy 1-5 természetes aminosavrész, kivéve a Cys-t, azzal a feltétellel, hogy Χ⁴-Χ⁴θ aminosavrészek közül legalább egyben eltérés van a natív szekvencia megfelelő aminosavrészeit illetően; továbbá, hogy X⁴ jelentése nem lehet Leu.
2. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁴ jelentése Gly-Pro.
3. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X² jelentése Alá, Arg, Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile vagy Val.
4. A 3. igénypont szerinti változat, ahol X² jelentése Thr vagy Arg.
5. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X³ jelentése Pro,

Thr, Leu, Arg, Val vagy Ile. 6. Az 5. igénypont szerinti változat, ahol X³ jelentése Pro vagy Leu. 7 . Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁴ jelentése Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn vagy

Alá.

8. A 7. igénypont szerinti változat, ahol X⁴ jelentése Lys,

Val, Ile, Thr, Met, Gin vagy Arg. jelentése Alá, 9. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁵ Gly, Thr, Arg, Phe, Gin vagy Asp. 10. A 9. igénypont szerinti változat, ahol X⁸ jelentése Alá, Thr, Asp vagy Gly. 11. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁶ j elentése Arg, Alá, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile vagy Met. 12. A 11. igénypont szerinti változat, ahol X⁸ j elentése Arg, Phe, Alá, Asn, Leu vagy Tyr. 13. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X⁷ j elentése Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val vagy Phe. 14. A 13. igénypont szerinti változat, ahol X⁷ j elentése Ile vagy Glu. 15. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X8 jelentése Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro vagy Phe. 16. A 15. igénypont szerinti változat, ahol _X8 jelentése Ile

vagy Asn.

17. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X^ jelentése

Arg, Ser, Alá, Gin, Lys vagy Leu. 18. A 17. igénypont szerinti Arg. 19. Az 1. igénypont szerinti Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Alá Met, Arg vagy Alá. 20. A 19. igénypont szerinti Val vagy Lys. 21. Az 1. igénypont szerinti Ser vagy Gly. 22. Az 1. igénypont szerinti Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys 23. A 22. igénypont szerinti vagy Leu. 24. Az 1. igénypont szerinti Alá vagy Gly. 25. Az 1. igénypont szerinti Lys, Asn vagy Asp. 26. A 25. igénypont szerinti Lys vagy Asn. 27 . Az 1. igénypont szerinti Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu Phe, Met, Alá, Arg, Trp vagy Lys. 28. A 27. igénypont szerinti

Lys vagy Glu.

változat, ahol X⁹ jelentése változat, ahol X¹⁰ j elentése Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, változat, ahol _xio j elentése változat, ahol X¹¹ j elentése változat, ahol X¹² j elentése Pro vagy Asn. változat, aholX¹² jelentése Alá változat, ahol X¹³ j elentése változat, ahol X¹⁴ j elentése változat, ahol X¹⁴ j elentése változat, ahol X¹⁵ j elentése Ser, Ile, Gin, HÍ s, Asn, Pro, változat, ahol X¹⁵ j elentése

29. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol χΐθ jelentése Gly. 30. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol X¹ jelentése Gly-Pro és X 16 j elentése Gly. 31. Az 1. igénypont szerinti változat, ahol az

amino s avs z ekvenci a:

Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Alá Asp Arg Gly Pro Cys Lys Alá Arg Ile Ile Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe val Tyr Gly Gly Cys Gly Arg Lys Glu Asn Asn Phe Lys Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Alá Cys Lys Lys Gly

32. DNS szerkezet, azzal jellemezve, hogy az 1-31. igénypontok bármelyike szerinti humán, Kunitz-típusú proteázinhibítor-változatot kódoló DNS szekvenciát tartalmazza.

33. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a 32. igénypont szerinti DNS szerkezetet tartalmazza.

34. Sejt, azzal jellemezve, hogy a 32. igénypont szerinti DNS szerkezetet vagy a 33. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmazza.

35. Eljárás az 1-31. igénypontok bármelyike szerinti humán, Kunitz-típusú proteázinhibítor-változat előállítására, azzal jellemezve, hogy a 34. igénypont szerinti sejteket olyan körülmények között tenyésztjük, ahol a fehérje kifejeződik, és a nyert fehérjét a tenyészetből kinyerjük.

36. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hogy az 1-

31. igénypontok bármelyike szerinti humán, Kunitz-típusú proteázinhibítor-változatot tartalmazza gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyag vagy közegül szolgáló anyag kíséretében.

37. A 36. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy heparint is tartalmaz.

38. A TFPI humán, Kunitz-típusú proteázinhibíátor dómén III-jának vagy az 1-31. igénypontok bármelyike szerinti változatának felhasználása a patológiás proteolízissel kapcsolatos betegségek vagy állapotok megelőzésére vagy gyógyítására szolgáló gyógyszer elkészítéséhez.

I I