JPH07506004A - 炭水化物モノエステルを分割する部位選択性方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は炭水化物モノエステルの生合成による分割方法に関するものである。

この分割方法は、上記モノエステルの１種類以上の位置異性体について選択的で ある。さらに詳しくは、本発明はスクロースモノエステルの混合物を特定の酵素 に接触させることにより、その混合物中に含まれる特定成分を選択的に加水分解 することによりスクロースモノエステルを分割する方法に関するものである。さ らに本発明は、本発明の方法により作られたモノエステルを薬品、食品、化粧品 における賦形剤として、または乳化剤、コーティング剤、防腐剤等として使用す ることに関するものである。

発明の背景 炭水化物モノエステル、具体的にはスクロースモノエステルが、食品乳化剤とし て、コーティング剤として、そして薬品、化粧品および他の製品における防腐剤 として、商業的に用いられている。一般的に化学的手段により製造される市販の モノエステルは、位置異性体（ｐｏｓｉｔｆｏｎａｌ　ｉｓｏｍｅｒ　）の里企 惣からなるか、またはある量のジエステルおよびトリエステル（通常、混合物の 約２０％）としばしば混合されている。しかしながら、純粋なモノエステル、す なわち、６−０−モノエステル、６’−０−モノエステル、または１’　−０− モノエステルのようなモノエステルの１種類の位置異性体から実質的になるモノ エステルを選択的に生産する商業的に実施できる合成方法は今までになかった。

化学的手段により製造された市販の混合物をモノエステルの特定の異性体を単離 できるように分割できれば、モノエステルは、異性体の選択的な単離により混合 物と比較して食品および化粧品用途に独特の特性を有するかもしれないので、そ のような分割は好ましい。

したがって、炭水化物モノエステル、特にスクロースモノエステルの異性体を部 位選択的に分割する方法が要望されている。本発明の目的は、化学反応により得 られた炭水化物モノエステルの混合物を、６−０−エステル、６’　−０−エス テル、または１′−〇−エステルから実質的になる所定構造のモノエステルに分 割する方法を提供することにある。

発明の概要 本発明は炭水化物モノエステルの混合物を部位選択的に分割する方法に関するも のである。その方法は、適切な溶媒系中のエステル混合物を１種類以上の部位選 択性の酵素とともにインキュベーションし、所望のモノエステルを精製する工程 から成り立つものである。

本発明の実施態様において、炭水化物モノエステル（またはその混合物）は、長 さにおいて少なくとも８の炭素原子、好ましくは約８−２２の炭素原子を有する 脂肪酸のスクロースモノエステルまたはグルコースモノエステルである。最も好 ましいものは、約８−１８の炭素原子を有する脂肪酸のモノエステルである。本 発明の特に好ましい実施態様は、グルコースおよびスクロースからなる群より選 択される炭水化物と、バルミチン酸、ラウリン酸およびカプリン酸からなる群よ り選択される脂肪酸とのエステルからなる。６−０−エステル、６’　−０−エ ステル、または１′−〇−エステルの意味するところを説明するための例示とし て、並びに様々な長さの鎖を有する脂肪酸を使用できることを示すための例示と して、スクロースモノパルミテートおよびグルコース−６−パルミテートの構造 を下記に示す。これらの構造は、本発明を限定するものとしてとらえるべきでは ない。

グルコース−６−パルミテート スクロースモノパルミテート ＲＩ＝ＣＩ５８３１ＣＯ（パルミチン酸基）の場合　６−０−エステル　と表記 する。

本発明に有用な酵素は、モノエステルのある成分を選択的に加水分解する酵素、 特に炭水化物の第１アルコールを加水分解する酵素である。有用な酵素の例とし ては、以下に限定されるものではないが、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアー ゼ、グリコシダーゼ、またはそれらの混合物が挙げられる。

発明の詳細な説明 現在、脂肪酸アシル供与体によるスクロースの化学的な酸または塩基触媒作用反 応により生産されるエステルは、約９０％がスクロースの３つの第１アルコール 基をエステル化することにより生じるエステルである。残りの１０％は、スクロ ースの第２アルコール基のエステルから構成されている。そのような市販のエス テルは一般的に、６−〇−エステル、６’　−０−エステルおよびｉ’　−ｏ− エステルの混合物からなる。一般的に、６−０−エステルおよび６′−〇−エス テルはほぼ等量で存在し、ｉ’　−ｏ−エステルは６−０−エステルおよび６’ 　−０−エステルの合計量の約２０％の量で存在する。残りの量のモノエステル は、スクロース分子中の５つの第２アルコールとの化合物からなる。スクロース の８つのアルコール官能基に見られるモノエステルの比率は、それらの位置での 化学的反応性と直接的に関連性がある。

部位選択性酵素を使用することにより、化学反応により得られた炭水化物モノエ ステルの混合物を、所定の構造が、以下のエステル、すなわち、６−ｏ−エステ ル、６’−０−エステル、または１′−〇−エステルのうちの１つから実質的に なるモノエステルに分割することが可能であることを発見した。本発明の方法は 、適切な溶媒中の炭水化物モノエステルの混合物を、個々の成分を選択的に加水 分解し、所望のエステルの量を多くする特定の酵素またはその組合せとともにイ ンキュベーションする工程からなる。その後、未加水分解エステルを標準的な方 法により精製する。

ここでは、「適切な溶媒系」とは、水性溶媒、好ましくは水またはテトラヒドロ フラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、アセトンの ような溶媒からなる有機溶媒系、並びに水と様々な量で混合される同様の溶媒を 意味する。

本発明において有用な酵素は、炭水化物モノエステルの特定の成分を選択的に加 水分解する酵素である。好ましくはこれらの酵素は、モノエステル混合物の第１ アルコールに対して部位選択性を有するものである。有用な酵素の例としては、 以下に限定されるものではないが、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼおよ びグリコシダーゼが挙げられる。特に有用な酵素は下記の表１に列記したもので ある。これらの酵素は、実施例１に記載した方法を用いてスクリーニングしたも のである。グリコシダーゼを用いる場合、反応は特定の第１アルコールに対して 選択性を有する加水分解ではなく、むしろ、所望の反応は、二糖類グリコシド結 合の選択性加水分解である。

本発明の炭水化物モノエステルはどのような炭水化物モノエステルであってもよ い。制限を意図するものではないが、様々な脂肪酸のスクロースエステルおよび ／またはグルコースエステルについて本発明を実施した。スクロースモノエステ ルが商業的な見地からみておそらく最も重要である。したがって、スクロースモ ノエステルを本発明の主な実施例として用いる。炭水化物の例としては、以下に 限定するものではないが、グルコース、スクロース、ラクトース、セロビオース 、ラフィノース、マルトース、マンノース、ガラクトースおよびリボースが挙げ られる。そのような炭化水素は、少なくとも約８の炭素原子からなる脂肪酸のモ ノエステルである。そのような脂肪酸は、約８から約２２の炭素原子からなるも のであってよく、その例としては、好ましくは、パルミチン酸、カプリン酸、ラ ウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸が挙げられる。

酵素スクリーニング方法 ３種類の加水分解酵素をスクリーニングした：すなわち、リパーゼ（エステラー ゼ）、プロテアーゼおよびグリコシダーゼである。その方法の概略を以下に示す ニ 一般的手順ニスクロースモノパルミテート（リョート−Ｐ−１７６０）１００ｍ ｇをｐ　Ｈ７，０，５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液１０ｍ１中に加熱しながら 溶解させた。

室温（２３℃）まで冷却した後、１００ｍｇ（乾燥粉末）の酵素を加えた。その 混合物を室温で５日間までの期間に亘り撹拌した。試料（２００μＬ）を３時間 間隔、１日間隔、そしである場合には５日間隔で採取した。気流が生じているホ ットプレート上で試料を乾燥させた後、１００℃で１時間に亘り加熱しながら、 １：１のピリジンとＢＳＴＦＡ　（ピアース）との混合物１ｍｌによりその試料 の誘導体を形成させた（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ　）。

分析方法：構造の予備指定（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ） をｇｃりｏｖトゲラフイーにより行なった。ｇｃクロマトグラムにより、３つの 主要ピークが３つの第１エステルに属することが分かった。この予備指定は、エ ステル化反応において第１アルコールと第２アルコールとの間に選択の可能性が ある場合、第１アルコールが優勢という仮定に基づいて行なった。一般的に、第 １アルコールは第２のアルコールより少なくとも約１０倍速く反応する。ｇＣク ロマトグライーによる製造物の分析の後に酸加水分解を行ない、酸による処理に よってグルコース−６−パルミテートのみが得られることが分かった。その物質 分析用の標準液は入手可能であった。他の２種類の第１エステルからは、遊離グ ルコースのみが観察された。

１μＬの注入量で炎イオン化検出器とともにＤＢ−５カラム、１５ｍ１　（Ｊ＆ Ｗサイエンティフィック）を用いて、ガスクロマトグラフ分析を行なった。出発 温度は１８０℃であり、１分当たり１０℃の速度で２８０℃まで上昇させて、６ 分間の保持期間を設けた。６−０−エステル、１’−０−エステル、および６′ −０−エステルに対応するピーク下の面積を比較することにより、酵素の活性と 特異性を評価した。

この実施例に示したスクリーニング方法を用いて、様々なりラスの酵素を試験し た。表１に要約したスクリーニングには５つのクラスの酵素が示されている。＝ （１）活性を有さないもの（ｒＢＪ　）　；　（２）活性を有するが特異性のな いもの（ｒＡＪ　）；（３）６−０−エステルに特異性を有するもの；（４）　 ６’　−０−エステルに特異性を有するもの；（５）　１’−０−エステルに特 異性を有するもの。全ての場合において、第１エステルは、第２エステルよりも 速い速度で攻撃された。

実施例１の結果に基づいて、３種類の酵素をさらなる研究のために選択した：６ −〇位置の特異性については、カンジダ　シリンドラセア　リパーゼ；６′−Ｏ 位置の特異性については、＋ｈｅ　ジャワニカス　リパーゼ；そして１′−〇位 置の特異性については、ペニシリウム　シクロビウム　リパーゼ（ペニシリウム 　シクロピウム　リパーゼの場合には、６’　−０−エステルよりもいっそう速 ＜１’−０−エステルが加水分解された）。

実施例２ ＳＭＰのＣＣＬ　（リパーゼ）による加水分解スクロースモノパルミテート（Ｓ ＭＰ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用い、立ヱ２ダ　シリンドラセア　リパーゼ（ ＣＣＬ）ｃシグマ　■型）を加え％　５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。インキュ ベーションを水中において室温で撹拌しながら行なった（緩衝液は加えなかった ）。試料（２００μｌ）を５．１０．２０．２５．３０および６０分後に採取し た。採取した試料をドライアイス−プロパツールの槽中に浸漬することによって 、反応を停止させた。試料を２時間に亘り凍結乾燥し、実施例１に記載したよう にｇｃ分析のために誘導体を形成した。ピーク下の面積を計算し、プロットした 。ＣＣＬがスクロースの６−〇−エステルについて著しい特異性を有することが 分かった。

実施例３ ＳＭＰのＭａ　−１０による切断 実施例２に記載した方法の後に、ｔｈｅ　ジャワニカス　リパーゼ（Ｍ−ＡＰｌ ｏ）（１０ｍｇ／ｍｌ）をＳＭＰとともにインキュベーションした。’ｒｆｙｅ 　’）ヤワニカス　リパ・−ゼ（Ｍ−ＡＰＩＯ）は６′−〇−エステルについて 特異性を有することが分かった。

実施例２に記載した方法の後に、ペニシリウム　シクロピウム　リパーゼ（ＰＣ ）（５ｍｇ／ｍｌ）をＳＭＰとともにインキュベーションした。ペニシリウムシ クロピウム　リパーゼ（Ｐ　Ｃ）は１′−〇−エステルについて優先性を有し、 次いで６′−〇−エステルについて優先性を有することが分かった。

実施例５ カンジダ　シリンドラセア　リパーゼ（１００ｍｇ）を１０ｍ１の水中に溶解し たスクロースジパルミテート（１００ｍｇ）に加えた。その混合物を１時間に亘 り室温で撹拌し、ｇｃ分析のために２００μｍの試料を採取した。次いで混合物 に０゜ＩＮのＨＣＩを加え、同一の温度で撹拌を一晩続けた。ｇｃ分析のために 実施例１に記載したように試料を採取した。

酵素を加えたインキュベーション時間を２４時間としたことを除いて、同様の実 験をケカビ　ジャワニカス　リパーゼについて行なった。

ｇｃピークを検討することにより以下のことが分かったニゲルコース−６−パル チミン酸エステルのみが、ケカビ　リパーゼによる加水分解配列中に現れその後 酸加水分解が行なわれたので、この酵素は６′−位置について特異性を有し、同 様の推測により、カンジダ　リパーゼは６−０の特異性を有するという結論に達 した。したがって、化学的なエステル化は第２アルコールよりも第１アルコール のほうをかなり優先することがよく知られているので、２つの大きいｇｃピーク は６−位置および６′−位置における第１エステルわ表わし、一方次に大きいピ ークは１′−エステルに表わすのに違いない。

スクロースジパルミテートとスクローストリパルミテートの５００ｍｇの混合物 の水溶液または懇濁液に、実施例２−５に詳述した３種類の酵素のうちのひとつ （２００ｍｇ）を加えた。試料を３０分間隔で採取し、前述の方法により分析し た。

６−特異的酵素によって、はとんど６′−〇−エステルのモノエステルが得られ 、６′−特異的酵素によって、はとんど６−０−エステルのモノエステルが得ら れた。

１）Ｈ７，１０ｍ１のリン酸カリウム中に溶解したグルコースパルミテートモノ エステルの混合物（５０ｍｇ）に、２５ｍｇのカンジダ　シリンドラセア　リパ ーゼを加えた。インキュベーションを１時間に亘り２３℃で行なった。ｇｃ分析 により、加水分解された主要なエステルは６−位置の第１エステルであることが 分かった。

実施例８ スクロースジーおよびトリーパルミテートの酵素的転化１０ｍ１の５０％テトラ ヒドロフラン（ＴＨＦ）水溶液中に溶解したスクロースジーおよびトリーパルミ テートの酵素転化物を２時間に亘り４５℃で１００ｍｇのｆｙ＞工！　シリンド ラセア　リパーゼとともにインキュベーションした。凍結乾燥およびヘキサンと ＴＨＦによる連続的な抽出後、精製した６−０−スクロースパルミテートを得た 。カンジダ　リパーゼをユニ旦　ジャワニカス　リパーゼで置き換え、インキュ ベーションを２０時間に延長することにより、６’　−０−スクロースパルミテ ートを得た。さらに、これらの標品から１′−〇−エステルを除去することが望 ましい場合には、ペニシリウム　シクロピウム　リパーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）に より２０分間のインキュベーションを行なう。

フロントページの続き （７２）発明者　シーメイヤー、ロバートアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４４０４　フォスター　シティ　キャタマラン　ストリート６５５−４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．炭水化物モノエステルの混合物から１′−Ｏ−エステル、６′−Ｏ−エステ ルまたは６−Ｏ−エステルを分割する部位選択性生合成方法であって、ａ）炭水 化物モノエステルの混合物を用意し、ｂ）水溶媒系の存在下で１種類以上の部位 選択性リパーゼとともに前記混合物をインキュベーションして１′−Ｏ−エステ ル、６′−Ｏ−エステルまたは６−Ｏ−エステルを選択的に加水分解し、ｃ）目 的とする前記１′−Ｏ−エステル、６′−Ｏ−エステルまたは６−Ｏ−エステル を単離する各工程からなることを特徴とする方法。 ２．前記炭水化物モノエステルの混合物が、少なくとも約８の炭素を有する脂肪 酸の炭水化物モノエステルの部位異性体の混合物であることを特徴とする請求の 範囲１記載の方法。 ３．前記炭水化物モノエステルのベースとなる炭水化物がスクロースまたはグル コースであることを特徴とする請求の範囲２記載の方法。 ４．前記脂肪酸が約８の炭素から約２２の炭素からなることを特徴とする請求の 範囲２記載の方法。 ５．前記脂肪酸がパルミチン酸であり、前記炭水化物モノエステルのベースとな る炭水化物がスクロースであることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 ６．前記リパーゼの部位選択性が、前記炭水化物モノエステルのベースとなる炭 水化物の第１アルコールにあることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 ７．前記水溶媒系が緩衝液を含むことを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 ８．前記部位選択性リパーゼが前記炭水化物モノエステルの混合物の６位置に選 択的に反応することを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 ９．前記部位選択性リパーゼがカンジダシリノンドラセア由来のものであること を特徴とする請求の範囲８記載の方法。 １０．前記部位選択性リパーゼが前記炭水化物モノエステルの混合物の６′位置 に選択的に反応することを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 １１．前記部位選択性リパーゼがケカピジャワニカス由来のものであることを特 徴とする請求の範囲１０記載の方法。 １２，前記部位選択性リパーゼが前記炭水化物モノエステルの混合物の１′位置 に選択的に反応することを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 １３．前記部位選択性リパーゼがペニソリウムシクロピウム由来のものであるこ とを特徴とする請求の範囲１２記載の方法。 １４．炭水化物モノエステルの混合物から１′−Ｏ−エステル、６′−Ｏ−エス テルまたは６−Ｏ−エステルを分割する部位選択性生合成方法であって、ａ）炭 水化物モノエステルの混合物を用意し、ｂ）水溶媒系の存在下で１種類以上の部 位選択性エステラーゼ、グリコシダーゼまたはプロテアーゼとともに前記混合物 をインキュベーションして１′−Ｏ−エステル、６′−Ｏ−エステルまたは６− Ｏ−エステルを選択的に加水分解し、 ｃ）目的とする前記１′−Ｏ−エステル．６′−Ｏ−エステルまたは６−Ｏ−エ ステルを単離する各工程からなることを特徴とする方法。