JPH07504652A

JPH07504652A - 新規のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体

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Publication number: JPH07504652A
Application number: JP5512084A
Authority: JP
Inventors: ノリス，ファニィー; ノリス，クヨルト; ビョルン，セーレン　エリク; ペテルセン，ラルス　クリスティアン; オルセン，オレ　フビルテズ; フォスター，ドナルド　キャメロン; スプレッチャー，シンディー　アン
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1992-01-07
Filing date: 1993-01-07
Publication date: 1995-05-25
Anticipated expiration: 2017-11-18
Also published as: NZ246571A; WO1993014123A1; KR940703860A; ZA9394B; CA2127247A1; CZ164894A3; AU3346193A; NO942553D0; JP3345420B2; HU9401989D0; ES2123635T3; IL104314A0; AU670059B2; US5618696A; DE69321342T2; EP0621873B1; ATE171712T1; HUT70291A; DE69321342D1; FI943235A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３５、請求項１記載のヒトクニッ型プロテアーゼインヒビター又は請求項２−３１のいづれか１項に記載のその変異体を製造する方法であって、請求項３４記載の細胞をタンパク質の発現が誘発される条件のもとで培養し、そしてその培養物から得られるタンパク質を回収することを含んで成る方法。

３６、請求項１記載のヒトクニッ型プロテアーゼインヒビター又は請求項２−３１のいづれか１項記載のその変異体と、薬理学的に許容されている担体又は賦形剤とを含んで成る薬理組成物。

明細書新規のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体発明の分野本発明は新規のヒトクニツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型プロテアーゼインヒビター及びその変異体、この新規のインヒビター又は変異体をエンコードするＤＮ＾、この新規のインヒビター又は変異体を製造するための方法、及びこの新規のインヒビター又は変異体を含む薬理組成物に関する。

発明の背景多形核白血球（好中球又はＰＭＮ　）及び単核食細胞（単球）は組織損傷、感染症、急性及び慢性炎症並びに創傷治癒に重要な役割を果している。これらの細胞は血液から炎症部位へと移動し、そして適宜の刺激を経て、それらは酸化剤化合物（０，・、　Ｏｔ−、ＨｚＯ＊及びＨＯＣＩ）　、並びに様々なタンパク質分解酵素を含む顆粒を放出する。

この分泌顆粒はとりわけアルカリホスファターゼ、金属プロテアーゼ、例えばゼラチナーゼ及びコラゲナーゼ、並びにセリンプロテアーゼ、例えば好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテアーゼ３を含む。

潜伏型金属プロテアーゼは、金属プロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）と−緒に放出される。その活性化メカニズムは完全には理解されていないが、しかしチオール基の酸化及び／又はタンパク質分解がその過程における一部を担っているようである。また、遊離性金属プロテアーゼ活性はＴＩＭＰの不活性化に依存する。

白血球のアズール好性顆粒において、セリンプロテアーゼの好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテアーゼー３は、ゲルコサミノグリカンと複合した活性酵素としてパックされている。これらの複合体は不活性ではあるが、分泌により解離して活性酵素を遊離せしめる。このプロテアーゼ活性を中和するのに、大量のインヒビター、α１−プロテイナーゼインヒビター（αＩ　−ＰＩ）及びα− ＝キモトリプシンインヒビター（α、　−Ｃｈｉ）が血漿中に見い出されている。しかしながら、ＰＭＳはこれらのインヒビターを局所的に不活性することができるものである。従って、好中球エラスターゼの最も重要なインヒビターである α、−ＰＩは誘引化ＰＭＨにより産生された酸素代謝物により反応中枢（Ｎｅ　ｔ　−３５８）において酸化を受け易い。

これは、好中球エラスターゼに対するα＋　ＰＩの親和力を約２．０００倍小さくする。

α、−ＰＩの局所的中和の後、エラスターゼはその他のタンパク質分解酵素の数多くのインヒビターを分解することができる。エラスターゼはα、−Ｃｈｌを切断し、これによりカテプシンＧ活性を促進せしめる。これはＴＩＭＰも切断し、金属プロテイナーゼによる組織分解をもたらす、更に、エラスターゼは、抗トロンビン■及びヘパリン捕因子■、並びに凝塊形成をおそらく助長している組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ　）を切断する。他方、凝固因子を分解する好中球エラスターゼの能力は反対の効果を有するものと推定されており、従ってエラスターゼの総合的な作用は不明である。フィブリン溶解に対する好中球エラスターゼの作用はそこまではあいまいでない。

フィブリン分解活性は、エラスターゼがプラスミノゲン活性因子インヒビター及びα８プラスミンインヒビタ−を切断せしめたときに上昇する。更に、この両者のインヒビターはＯ！代謝物により酸化及び不活性化される。

ＰＭＮは大量のセリンプロテアーゼを含み、そして約２００園ｇづつの白血球プロテアーゼが身体における侵襲性因子を処理するために毎日放出される。急性炎症は放出される酵素の量を何倍にも高める。

正常な状態では、大量のインヒビターα１−ＰＩ、αＩ−Ｃｈｉ及びα！マクログロブリンによってタンパク質分解は許容の低いレベルに保たれている。しかしながら、数多くの慢性疾患は、例えば自己免疫反応、慢性感染症、喫煙又はその他の刺激等により生ずるＰＭＨの過剰刺激に原因する病理的タンパク質分解により生ずることのいくつかの示唆がある。

アプロチニン（牛膵臓トリプシンインヒビター）は様々なセリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインを阻害することで知られ、そして息性膵臓炎、様々な状態のショック症状、線溶亢進性出血及び心筋梗塞の処置において治療的に利用されている（例えばＪ、Ｅ、Ｔｒａｐｎｅｌｌ　ら、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｓｕｒ　。

６１．１９７４．　ｐ、Ｉ７７；　Ｊ、ＭｃＭｉｃｈａｎら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｏｒ　５ｈｏｃｋ　９　、１９８２＋１１．１０７；　Ｌ、Ｈ，Ａｕｅｒ　ら、＾ｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ、　４９＋１９７９＋ｐ、２０７；　Ｇ、５ｈｅｒ＋Ａｍ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、Ｇ　ｎｅｃｏｌ、１２９１９７７＋　ｐ、１６４　；及びＢ、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ。

Ａｒｔｚｎｅｉｍ、−Ｆｏｒｓｃｈ、２６＋１９７６＋　ｐ、１６０６を参照のこと）、高い用量のアプロチニンの投与は、心肺バイパス手術を含む心臓外科にかかわる血液損失を有意に低める（例えば、Ｂ、Ｐ、Ｂｉｄｓｔｒｕｐら、Ｊ、Ｔｈｏｒａｃ。

Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、Ｓｕｒ　、９７，１９８９．９ｐ、３６４−３７２：　Ｗ、ｖａｎ　０ｅｖｅｒｅｎら、Ａｎｎ。

Ｔｈｏｒａｃ、Ｓｕｒ、４４，１９８７．　ｐｐ、６４０−６４５を参照のこと）、一定のアプロチニン類似体、例えばアプロチニン（１−５８，Ｖａｌ　Ｉｓ）は顆粒球エラスターゼに対する比較的高い選択性及びコラゲナーゼに対する阻害作用を示し、アプロチニン（１−５８，Ａｌａ　１５）はエラスターゼに対する弱い作用を有し、一方アブロチニン（３−５８，Ａｒｇ　１５゜Ａｌａ　１７．　Ｓｅｒ　４２）は優れたプラスマカリクレイン阻害作用を示す（Ｗ０８９／１０３７４を参照のこと）ことが今までに実証されている（Ｈ，Ｒ，Ｗｅｎｚｅｌと）１．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ、Ａｎ　ｅｗ　Ｃｈｅｍ、１ｎｔｅｒｎａｔ、Ｂｄ　２０．＋１９８１＋ｐ、２９５を参照のこと）。

ところで、インビボ投与したとき、アプロチニンは、比較的高い用量のアプロチニンの反復注射を経たラット１．ウサギ及びイヌにおいて腎毒性作用を有することが見い出された（Ｂａｙｅｒ＋・Ｔｒａｓ　ｌｏｌ　Ｉｎ−ｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｒｏｔｅｉｎａｓｅ　；　Ｅ、Ｇｌａｓｅｒら、ｒＶｅｒｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ　ｄｅｒ　Ｄｅｕｔ−ｓｃｈｅｎ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｕｒ　Ｉｎｎｅｒｅ　Ｍｅｄｉｚｉｎ＋７８＋　Ｋｏｎｇｒｅｓｓ」　、　Ｂｅｒｇｍａｎｎ＋Ｍ＃ｎｃｈｅｎ、１９７２．　ｐｐ、　１６１２−１６１４）　、アプロチニンついて認められたこの腎毒性（とりわけ病巣の状態で現れる）は、腎臓の近位細管細胞におけるアブロチンの蓄積に原因しうる（これは、その細管の負に荷電した表層にアプロチニンを結合させてしまう、その高い正の正味荷電の結果である）、この腎毒性は、アプロチニンを臨床目的、特に大量のインヒビター用量の投与を必要とするもの（例えば心肺バイパス手術）にとってあまり適切でないものにしてしまう、更に、アプロチニンは牛タンパク質であり、従ってヒトへのアプロチニンの投与に基づいて望ましくない免疫応答をもたらしてしまいうる１又は複数のエピトープを含みうる。

従って、本発明の目的は、類似のインヒビタープロフィールを有する、又は所望のインヒビタープロフィールを示すように改変された、アプロチニンと同一のタイプのヒトプロテアーゼインヒビター（即ち、クニッ型インヒビター）を同定することにある。

発明の概要本発明は、下記のアミノ酸配列を含んで成る新規のヒトクニッ型プロテアーゼインヒビターＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙ、T Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈ＠Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＬａｕＡｒｑ　ＬＹＳ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙＳ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＣＹＳ　ＬＹＳ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　（ＳＥＱよりＮｏ、ｌ）又はプロテアーゼインヒビター特性を有するその変異体に関する。

別の観点において、本発明は下記のアミノ酸配列を含んで成るそのインヒビターの変異体（ここで、ＸＩ　はＨであるか、又はＣｙｓを除く１〜５個の天然アミノ酸残基を示し、Ｘｌ−）（１−はそれぞれ互いに独立してＣｙｓを除く天然のアミノ酸を示し、そしてＸｌはＯＨであるか、又はＣｙｓを除く１〜５個の天然のアミノ酸を示し、ただしアミノ酸残基Ｘ−−Ｘ１７のうちの少なくともいづれかは天然配列の対応のアミノ酸残基とは相違する）に関する。

本明細書において、「天然アミノ酸残基」なる語は２０個の一般の天然アミノ酸、即ち、Ａｌａ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　Ｍｅｔ。

ＧＩｙ＋　Ｓｅｒ＋　Ｔｈｒ、、　Ｃｙｓ＋　”ｙｒ＋　Ａｓｎ＋　Ｇｉｎ、　ＡＳｐＩ　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ＋　Ａｒｇ及び旧Ｓのいづれかを示していることを意味する。

この新規のインヒビターは相同性ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニングによりヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離した。既知のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビタードメインのアミノ酸配列をアプロチニンのそれと整合させ、そしてアプロチニンアミノ酸残定した。相同領域Ｉに対応する縮重ＰＣ１１をデザインし、そして相同領域■に対応する縮重Ｐｃｔ？をデザインした。これらのＰＣＲプライマーは、クローニングの目的のための制限認識部位を含む５′伸長部を有する。この２種のプライマーを抱括するＰＣＲ実験より、新規のクニツ型プロテアーゼインヒビタードメインに対応するＤＮＡ配列を同定した。このＤＮＡ配列を、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる全長ＤＮＡ配列の単離のためのプローブとして用いた。その単離手順は、図１及び２を参考にしながら下記の例１において更に詳しく説明する。以降、この新規インヒビターをＩｔＫｌ　８９と呼ぶ。

前述の１又は複数の位置において１又は複数のアミノ酸を置換することにより、ＩＬＫＩ　Ｂ９のインヒビタープロフィールを変えて、それが好中球エラスターゼ、カテプシンＧ及び／又はプロテアーゼー３を優先的に阻害するようにすることが可能でありうる。更に、凝血もしくはフィブリン溶解（例えばプラスミンもしくはプラズマカリクレイン）又は補体カスケードにかかわる酵素を特異的に阻害する変異体を構築することが可能となりうる。

ＨＫＩの一利点は、前述した通り強力な正の正味電荷を有するアプロチニンと異なりゼロの正味電荷を有することにある。従って、アプロチニンよりも低い正の正味電荷を有する本発明の変異体を構築することが可能であり、これにより大用量の変異体の投与による腎臓障害の危険性は低まる。別の利点は、アプロチニンとは異なり、これはヒトタンパク質（フラグメント）であり、従ってヒトへの投与による望ましくない免疫応答性は顕著に低まる。

発明の詳細な開示ＨＫＩ　Ｂ９の好適な変異体の例は、ＸｌがＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏであるか；又はＸ２がＡｌａ、＾ｒｇ＋　Ｔｈｒ、　Ａｓｐ、　Ｐｒｏ＋　Ｇ１ｕ＋　Ｌｙｓ、　Ｇｌｎ＋　Ｓｅｒ、　Ｉｌｅ及びＶａｌより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸｌがＴｈｙもしくはＬｙｓであるか；又はＸＳがＰｒｏ、　Ｔｈｒ＋　Ｌｅｕ＋　Ａｒｇ、　Ｖａｌ及びｌｉｅより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸＳがＰｒｏもしくはｌｉｅであるか；又はＸ４がＬｙｓ＋　Ａｒｇ、　Ｖａｉｎ　Ｔｈｒ、　Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ＋　Ｐｈｅ、　Ｇｌｙ。

Ｓｅｒ、　ＭｅＬ＋　Ｔｒｐ＋　Ｔｙｒ、　Ｇｌｎ、　Ａｓｎ及びＡｌａより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ４がＬｙｓ、νａｌ、　Ｌｅｕ、　１１ｅ＋　Ｔｈｒ、　Ｍｅｔ、　ＧｉｎもしくはＡｒｇであるか；又はＸＳが＾ｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｔｈｒ＋　Ａｒｇ、　Ｐｈｅ、　Ｇｌｎ及びＡｓｐより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特に）（ｓがＡ１ａ＋　Ｔｈｒ。

ＡｓｐもしくはＧｌｙであるか；又はＸ６がＡｒｇ、　Ａｌａ、　Ｌｙｓ、　Ｌｅｕ＋　Ｇｌｙ。

旧ｓ、　Ｓｅｒ＋　Ａｓｐ＋　ＧＩｎ＋　Ｇｌｕ、　Ｖａｉｎ　Ｔｈｒ＋　Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ、　Ａｓｎ＋　Ｉｌｅ及びＭｅｔより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ６がＡｒｇ、　Ｐｈｅ＋　Ａｉａ。

ＬｅｕもしくはＴｙｒであるか；又はＸ丁がＩｌｅ、　Ｍｅｔ、　Ｇｉｎ、　Ｇ１ｕ＋　Ｔｈｒ。

Ｌｅｕ、　Ｖａｌ及びＰｈｅより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ？がＩｌｅであるか；又はＸ虐がＩｌｅ、　Ｔｈｒ＋　Ｌｅｕ＋　Ａｓｎ、　Ｌｙｓ、　Ｓｅｒ＋　Ｇｌｎ。

ＧＩｕ＋　Ａｒｇｔ　Ｐｒｏ及びＰｈｅより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にｘｌがＩｌｅもしくはＴｈｅであるか；又はＸ９がＡｒｇ、　Ｓｅｒ、　Ａｌａ。

ＧＩｎ＋　Ｌｙｓ及びＬｅｕより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ９がＡｒｇであるか；又はＸｌｏがＧｉｎ、　Ｐｒｏ＋　Ｐｈｅ、　ｌｉｅ、　Ｌｙｓ＋　Ｔｒｐ＋　Ａｌａ。

Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ、　Ｔｙｒ＋　Ｈｉｓ、　Ａｓｐ、　Ｍｅｔ、Ａｒｇ及びＶａｌより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にｘＩＯがＶａｌもしくはＡｌａであるか；又はＸｌがＧ１３Ｉｔ　Ｍｅｔ、　ＧＩｎ＋　Ｇ１ｕ＋　Ｌｅｕ＋　Ａｒｇｔ　Ｌｙｓ＋　Ｐｒｏ及びＡｓｎより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ　目がＡｒｇもしくはＧｌｙであるか；又はＸ　Ｉ　１がＡｉａもしくはＧｕｙであるか；又は）（＋３がＬｙｓ。

Ａｓｎ及びＡｓｐより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ１３がＬｙｓもしくはＡｓｎであるか；又はＸ　１４がＶａｌ、　Ｔｙｒ、　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ、　Ｔｈｒ＋　Ｇ１ｙ＋Ｌｅｕ＋　Ｓｅｒ＋　ＩＩｅ＋　Ｇｉｎ、　Ｈｉｓ、　／ｌｓｎ、　Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、　Ｍｅｔ、＾Ｌａ＋　Ａｒｇｔ　Ｔｒｐ及びＬｙｓより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸ＋４がＬｙｓもしくはＬｅｕであるか；又はＸＩＳがＡｒＬ　ＳｅｒもしくはＴｈｒであるか；又はＸ１″がＧｌｕ、　Ｌｙｓ、　Ｇｉｎ及びＡｌａより成る群から選ばれるアミノ酸残基、特にＸｌ＆がＬｙｓもしくはＡｌａであるか；又は）（ＩｆｆがＴｈｒである；変異体である。好適な１！様においては、ＸＩ　はＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒ。

であり、そしてＸＩ？がＴｈｒであり、そしてＸ′！−ＸＩ＆は上記の通りである。

本発明のＨＫＩ　８９の変異体はプロテアーゼ結合領域（即ち、ＸＳ−Ｘ”により示されるアミノ酸残基）においてＭｅｔ残基を含まないことが好ましい、前述のα、−ＰＩに対する類似性により、これらの位置のいづれかにおけるＭｅｔ残基はそのインヒビターを、ＰＡＩＮにより生成される酸素代謝物による酸化不活性化を受け易くしてしまい、そして反対に、これらの位置においてＮｅｔ酸基がないことは、かかる酸素代謝物の存在下でそのインヒビターをより安定なものとするであろう。

現状好ましい本発明の変異体は、クニツインヒビターのプロテアーゼ結合部位に位置しているアミノ酸残基（即ち、アプロチニンの位置１３．１５．１６．１７．１Ｂ、　１９．２０．３４．３９．４０．４１及び４６に対応するＸ４　Ｘｌ４）が天然アプロチニンのそれと同じ位置に存在しているアミノ酸に対して置換されているものである。この変異体は下記のアミノ酸配列を含んで成る。

Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　（ＳＥＱ　よりＮｏ、コ）別の観点において、本発明は本発明にかかわるヒトクニッ型インヒビター又はその変異体をエンコードするＤＮＡ構築体に関する０本発明のＤＮＡ構築体は、樹立された標準的な方法、例えばＳ、Ｌ、ＢｅａｕｃａｇｅとＭ、Ｈ，ＣａｒｕＬｈｅｒｓのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２，１９８１．ｐｐ、１８５９−１８６９に記載のホスホアミジット法又はＭｅｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３＋　１９８４＋ｐｐ、８０１−８０５に記載の方法によって合成的に製造できうる。

ホスホアミジット法に従うと、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成し、精製し、アニールに付し、リゲートし、そして適当なベクターの中でクローンする。

他方、ＨＫＩ　８９についてコードするゲノム又はｃＤＮＡ　（例えば、前述の通りにゲノムライブラリーをスクリーニングにかけることによって獲得できる）を利用することが可能である。このＩＩＮＡ配列は、アミノ酸置換を導入することが所望される位置に対応する１又は複数の部位で、例え↓ｉよく知られた手順に従う相同性組換にとって所望されるアミノ酸配列をエンコードする合成オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発により改変されていてよい。

更なる別の観点において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築体を含んで成る組換発現ベクターに関する。この組換発現ベクターは、組換ＤＮ八へ順に委ねるのに好都合でありうるあらゆるベクターであってよく、そしてベクターの選択は導入される宿主細胞に通常依存するであろう、従って、このベクターは自己複製型ベクター、即ち、染色体外物として存在し、その複製が染色体複製と独立している、例えばプラスミドであってよい、他方、このベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞ゲノムの中に組込ませ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるようなものであってよい。

このベクターにおいて、ｌｌＫ１８９又は本発明にかかわる変異体をエンコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に作動連結しているべきである。このプロモーターは選ばれた宿主細胞の中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種のいづれかであるタンパク質をエンコードする遺伝子に由来しうる。＠乳系細胞の中で本発明のインヒビターをエンコードするＤＮＡの転写をもたらしめる適当なプロモーターの例は、ＳＶ　４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｆｏｌ、土、１９８１．　ｐｐ、８５４−８６４）、ＭＴ−１（金属チオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　１９８３＋　ｐｐ、８０９−８１４）又はアデノウィルス２主要後期プロモーターである。酵母宿主細胞において利用するのに適当なプロモーターには、酵母解糖酵素（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、２５５Ｌ１９８０、　Ｉ）Ｐ、１２０７３− １２０８０；ＡｌｂｅｒとＫａｗａｓａｋｉ＋　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎ、上。

１９８２、　ｐｐ、４１９−４３４）又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｕｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒ　ａｎｉｓｅｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（Ｈｏｌ−１ａｅｎｄｅｒら、ｅｄｓ、）　、Ｐｌｅｎｕｓ＋　Ｐｒｅｓｓ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２）由来のプロモーター、又はｎ旦（ＵＳ　４．５９９．３１１）もしくはＡＤ）１２−４Ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ　３０４　１９８３．　ｐｐ、６５２−６５４）プロモーターである。糸状菌宿主細胞において利用するのに適当なプロモーターは、例えば朋プロモーターＣＭｃＫｎ　ｉｇｈ　Ｌら、Ｔｈｅ　［！ｍｂｏ　Ｊ、４．１９８５．　ｐｐ、２０９３−２０９９）又は」且Ａプロモーターである。

本発明のインヒビターをエンコードするＤＮＡ配列は適当なターミネータ−１例えばヒト成長ホルモンターミネータ−（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、前掲）又は（菌類宿主にとって）双Ｕ（ＡｌｂｅｒとにａｗａｓａｋＬ前掲）もしくはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、前掲）プロモーターに作動連結していてもよい、このベクターは更に、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ　４０又はアデノウィルス５ａ＋ｂ領域由来）、転写エンハンサ−配列（例えばＳＶ　４０エンハンサ−）及び翻訳エンハンサ−配列（例えばアデノウィルスＶＡ　ＲＮＡをエンコードするもの）の如きの因子を含んで成りうる。

本発明の組換発現ベクターは更に、このベクターが課題の宿主細胞の中で復製できるようにするＤＮＡ配列を含んで成りうる。かかる配列の例（その宿主細胞が哺乳系細胞のとき）はＳＶ　４０の複製起点、又は（その宿主細胞が酵母細胞のとき）酵母プラスミドの２μ複製遺伝子ＲＥＰ　１−３及び複製起点である。このベクターは選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロホレートリダクターゼ（ＤＨＰＲ）をコードする遺伝子、又はネオマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキセートに対する耐性を授けるもの、又はシゾサソカロマイシス　ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ−堕肛坦■翌７７ＰＩ遺伝子（Ｐ、Ｒ，Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　Ｇｅｎｅ　４０＋　１９８５＋　ＰＬ１２５−１３０）を含んで成ることもある。

本発明のインヒビターをコードするＤＮＡ配列、プロモーター及びターミネータ −それぞれをリゲートし、そしてそれらを複製にとって必須な情報を含む適当なベクターの中に挿入するために用いた手順は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ支Ａ　Ｌ　ｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｅｋ、１９８９）　＠本発明の発現ベクターを導入せしめる宿主細胞は、本発明のインヒビターを産生ずることの可能な任意の細胞であってよく、そして好ましくは真核細胞、例えば哺乳類、酵母又は菌類の細胞である。

本発明に従って宿主細胞として利用される酵母生物は任意の酵母生物であって、培養により、大量の本発明のインヒビターを産生ずるものであってよい。適当な酵母生物の例は、酵母の種孟ヱ互旦ヱｕｖａｒｕｗ）である、酵母細胞の形質転換は例えばプロトプラストの形成、それに続く周知の方法による形質転換によって行われうる。

適当な哺乳細胞系の例はＣ０５（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３２゜ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）又はＣｌｌ０（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）細胞系である。哺乳細胞をトランスフェクトし、そしてその細胞の中に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は例えば、Ｋａｕｆｓａｎと５ｈａｒｐ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　且ム１９８２＋　ｐｐ。

６０１−６２１；５ｏｕｔｈｅｒｎとＢｅｒｇ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎｅｔ、上、１９８２．ｐｐ、３２７−３４１；ＬｏｙＬｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　７９，１９８２．ｐｐ、４２２−４２６ＨＷｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１４．１９７８＋ｐ、７２５；Ｃｏｒｓａｒｏ　とＰｅａｒｓｏｎ、ＳｏｍａＬｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７．１９８１．ｐ、６０３．Ｇｒａｈａ＋＊とｖａｎｄｅｒ　ｌ！ｂ、ｎ匹蝕■５２．１９７３．ｐ、４５６；及びＮｅｕ＋ｍａｎｎ　ら、堕胆ユ、土、　１９８２．　ｐｐ、８４１−８４５に記載されている。

他方、菌類細胞を本発明の宿主細胞として使用できうる。適当な菌類細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス（ハ匹ユ旦Ｗ種又ハニューロス’ｊ−（ｍ■）種の細胞、特にアスペルギルス±ｍ＜担」シ１ｕユ懸−肛ｕ憇）又はアスペルギルス　ニガー（バー赳■旦ｈＬ　紅［ａの細胞である。アスペルギルス種のタンパク質の発現のための利用は例えばＥＰ　２３Ｂ、０２３号に記載されている。

本発明は更に、本発明にかかわるインヒビターの製造方法に関連し、この方法は、上記の細胞を、このインヒビターの発現を誘発せしめる条件のもとで培養し、次いでこの培養物から得られるインヒビターを回収することを含んで成る。

細胞を培養するのに用いられる培地は、宿主細胞の選択に応じて、哺乳細胞又は菌類（酵母を含む）細胞を増殖せしめるのに適切な任意の常用の培地でありうる。このインヒビターは宿主細胞によって増殖培地へと分泌され、そしてそれらより、遠心又は濾過によってその培地から細胞を分け、その上清液又は濾液のタンパク質成分を塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿させ、様々なりロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー等により精製することを含む常用の手順によって回収できうる。

本発明はまた、ＨＫＩ　８９又は本発明のその変異体を、薬理学的に許容されている担体又は賦形剤と一緒に含んで成る薬理組成物に関連する０本発明の組成物の中に、この変異体は、例えばＲｅ５ｉｎ　ｔｏｎ’５Ｐｈａｒ−ａｃｅｕｔｊｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、１９８５に記載の薬理組成物を配合する任意の引立された方法によって配合されうる。この組成物は典型的には全身系注射又は点滴にとって適する形態であってよく、そして滅菌水又は等張の食塩水もしくはグルコース溶液を伴って配合されうる。

ＨＫＩ　Ｂ９又は本発明のその変異体は従って、天然アプロチニン又は別のインヒビタープロフィールを有するアプロチニン類似体に関して提唱されている治療的用途、特に大量のアプロチニン用量の利用が必須である用途のために使用するのに有利であると考えられる。

本発明の変異体を使用する治療的用途は、そのヒトセリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、プラスミン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテアーゼー３を阻害する能力として示唆され、急性肝臓炎、炎症、血小板減少症、血小板機能の維持、器官維持、創傷治癒、ショック（ショック肺を含む）、並びに腺溶充進性出血、気腫、リウマチ性関節炎、成人呼吸困難症候群、慢性炎症腸障害及び範回が含まれ、換言すれば、誘引化ＰＭＮより放出されたエラスターゼ、カテプシンＧ及びプロテアーゼー３による病理的タンパク質分解により生ずるものと推定される障害が含まれる。

上記の薬理学的用途の他に、ＨＫＩ　８９又は前記の特定するその変異体は有用な天然物質、例えばプロテアーゼ又はレセプターであって、ＴＦＰ　Ｉクニッ型ドメインＨに直接又は間接的に結合する物質を例えばスクリーニングアッセイ又はアフィニティークロマトグラフィーによりヒト材料から単離するのに用いることができうる。

実施例二股立法標準のＤＮＡ技術を記載の通りに実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　＋　Ｆｒｉ　ｔｓｃｈ＋Ｅ、Ｆ、、とＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ−（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｔ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）　＊合成オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置（３８０Ｂ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ）で、コントロールボアガラス支持体上でホスホラミジット化学品を利用して調製した（Ｂｅａｕｃａｇｅ＋　Ｓ、Ｌ、とＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，、Ｔｅｔｒ−ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．（１９８１）１８５９　１８６９）　、ＤＮＡ配列決定はジデオキシ連鎖停止技術によって行った（Ｓａｎｇｅｒ＋Ｆ、、Ｍｉｃｋｌｅｎ、　ｓ、とＣｏｕ　ｌ　−５ｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４（１９７７）５４６３−５４６７）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＯＮ＾サーマルサイクラ−（Ｐ＠ｒｋｉｎ　ｔ！ｌｌ１ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）で行った。

アミノ酸分析は、真空シールチューブの、中で１１０℃で６ＭのＩＩｃＩ中で２４時間加水分解した後に実施した０分析は、マイクロポア操作のために改良されたＢｅｃｋｍａｎ　１２１ＭＢ自動アミノ酸分析器で行った。

Ｎ末端アミノ酸配列分析は、自動Ｅｄｓａｎ分解により、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ−ｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａ気相シーケンサ−を用いて得た。オンライン逆相ＨＰＬＣによる分析を、各シーケンサ−サイクルから遊離されたＰＴＨアミノ酸の検出及び定量のために実施した。

分子量決定は、約１５ｃｍのフライトチューブが備っており、そして正のモードで運転したＢＩＯ−１ＯＮ　２０プラズマ脱着マススペクトロメーター（ＰＯＭＳ）で得た。５μｌのアリコートを１５ＫＶに設定した加速電圧で分析し、そしてイオンを５百分回の核分裂事象にわたって集めた。

指定の分子イオンに基づく精度は明確なピークに関して約０．１％であり、それ以外は幾分低かった。

ヒトクニツ刑プローアーゼインヒビ　−ドメインＨＫＩ　Ｂ９のクローニｌｕｇのヒト胎盤ゲノムＤＮＡ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ＋ＣＡ＋Ｕ、Ｓ、Ａ、＋Ｃａｔ。

ｎｏ、６５５０−２）を、１００　ｐｉ＋ｏｌｅの「右」プライマーＡ、Ｂ、Ｃ，Ｅ、Ｆ又はＨと１００　ｐｍｏｌｅの「左」プライマーｘ、ｙ又はＺ（図２参照）とによる１８回のＰＣＲ反応のそれぞれにおける鋳型として用いた。　ＰＣＲ反応は市販のキット（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ、Ｐｅｒｋｉｎ　［ｉｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用し１て１００μｍの容量の中で実施した。その反応混合物を９５° Ｃで４分熱し、次いで下記のサイクルにかけた：９５℃で１分、５０℃で１分、そして７２℃で１分、３０サイクルの後、その温度を７２°Ｃに１０分保った。

反応混合物を２％のアガロースゲルでのゲル電気泳動にかけ、そして０．１　ｋｂのＯＮ＾フラグメントを単離した。　ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉによる消化の後、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＷＢ、ｌ１ｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ＋ｃｏｄｅｎｏ、２７−４９８６−０１　、　Ｍｅａｄ＋　Ｄ、Ａ、　、　５ｚｃｚｅｓｎａ−３ｋｏｒｕｐａ、　ＥとＫｅｅｐｅｒ、Ｂ、（１９８６j Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇｉｎ、土、６７−７４）の２．８　ｋｂのＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉフラグメントへのリゲーシ四ンを行った。そのリゲーション混合物を、アンピシリン耐性について選別されるコンピテントＬユｇ　（［：、ｃｏｌｉ）株（ｒ゛。

ｍ’）を形質転換せしめるために用いた。得られるコロニー由来のプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉにより消化、それに続（２％のアガロースゲルでのゲル電気泳動により分析した。　ＤＮＡ配列決定を、約９１ｂρのインサートを有するプラスミドに基づいて行った。

ヒトクニツ型プロテアーゼインヒビタードメインを、２種のＰＣＲプライマーから適正な距離にある不変のＣｙｓ　３０及びＰｈｅ　３３　（アプロチニンの番号、図１上に星印で記しである）についてのコドンを含む領域に対応する特徴的なりＮＡ配列、ＴＧ　（Ｔ／Ｃ）　ＮＮＮＮＮＮ　（Ｔ／Ｃ）　ＮＮＮにより同定した。

既知のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビタードメイン及び無関係の配列とは別に、ヒトクニツ型プロテアーゼインヒビタードメイン、）ＩＫＩ　Ｂ９に対応する新たなりＮＡ配列を、プライマーＢ及びＹを包括するＰＣＲ反応より同定した。　ＩＩＮＩ　Ｂ９のうちの２種のＰＣＲプライマー間のＤＮＡ配列がこれによって得られ、そして対応のアミノ酸配列を以下に示す：ＴＹＭＴＲＷＦＦＮＦＥＴＧＥＣＥＬＦＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＧＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＡＪＩ、ＣＴＧＧＴＧＡＡ工９工ＧＡＧＴＴ八ＴエエＧＣＴ前記のこの特徴的なりＮＡ配列に下線を付した。

Ｂ　−イブ−１−スフ１−ニングヒトゲノムＤＮＡニスミドライブラリーを下記の通りに構築した：ヒトゲノムＤＮＡをヒト全血から単離した０部分的な５ａｕ３Ａ消化の後、ＩＩＮ八をコスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ＋υ、Ｓ、Ａ、）のＢａａ＋Ｈ１部位にリゲートした。約４２０，０００のコロニーを、５′位が３２ｐでラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ４２８０５’　ＣＡＡＡＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴαＴＧＴＡＧＧＴ　３’を用いてスクリーンした。フィルターを５Ｘのｓｓｃ、　ｓ　ｘのデンハーツ、０．１％のＳＯ５の中で６５°Ｃで一夜ハイブリダイズさせた０次いでそのフィルターをＩＸのＳＳＣ、０，１％のＳＯＳの中で６５°Ｃで１時間洗い、そして最後にフィルムに暴露せしめた。陽性コスミドを同定し、次いで３．５　ｋｂのＰｓｔｌフラグメントを単離し、そしてプラスミドｐＵｃ１８にサブクローンして、プラスミドｐＭｂ−１０６を得た。　ｐｕｂ−１０６のＤＮＡ配列決定はＳＥＱ　１０　Ｎｏ、４に示す配列をもたらした。

■又ＫＦＮ−１８０に　るヒ　クニツ　プローアーゼインヒビ　−′メインＨにＩ　Ｂ９の　告ｌμｇのヒト胎盤ゲノムＤＮＡ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、）’ａｌｏ＾ｌｔｏ、Ｃ＾、υ、Ｓ、Ａ、ｃａｔ。

ｎｏ、　６５５０−２）を、１００　ｐｍｏｌｅづつのプライマー−Ｎ−１（ＣＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧ−ＡＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＣＴＣＩ　及びＮ−２（ＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴｒＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣｒＣＣｒＣＣＣ−ＡＡＡＴＧＴ　）を含むＰＣＲ反応において鋳型として用いた。Ｎ−１は図３におけるＨＫＩ　８９のゲノムＤＮＡ配列中の塩基ｎｏ、３４６−３６７に対して相補性であり、そしてＸｂａ１部位が後続する翻訳停止コドンを含む５ ′伸長部を保有する。Ｎ−２の１７個の３′−末端塩基はＳＦ！０１０　Ｎｏ、４におけるＨＫＩＢ９のゲノムＤＮＡ配列中の塩基ｎｏ、　１Ｂ？−２０７と同一であり、そして２１個の５′−末端塩基は下記に説明するプラスミドｐＫＦＮ −１０００に由来する合成リーダー配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、５）中の塩基２１５から２３５と同一である。

ＰＣＲ反応を市販のキット（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ＋Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び下記のサイクル：９４°Ｃで２０ｓｅｃ　、　５０°Ｃで２０ｓｅｃ　、そして７２°Ｃで３０ｓｅｃ　。

を利用して、１００　μｌの容量で実施した。１９サイクルの後、７２°Ｃの工程を１０分維持する最終サイクルを行った。　２１５ｂｐのフラグメントであるＰＣＲ生成物が２％のアガロースゲルでの電気泳動により単離された。

シグナルーリーダー二下記に説明するｐＫＦＮ−１０００に由来する０、ＩＩＩ　ｇの０．７　ｋｂのＰｖｕｌｌ　フラグメントを、１００ｐ１００ｐづつのプライマーＮ０Ｒ−１４７８（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）及びＮ０Ｒ −２５２３（ＴＣＴＣＴＴ（：ＴＣＣＡＡＴＣｔＣＴＣＡＧＣ）を含むＰＣＲ反応において鋳型として用いた。　Ｎ０Ｒ−１４７８はＳＥＱ　ＩＤＮｏ、６におけるＥｃｏＲ１部位のすぐ上流の配列と対合する。プライマーＮ０Ｒ−２５２３はｐＫＦＮ−１０００の合成リーダー遺伝子の１７個の３′−末端塩基に相補性である。　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ、６を参照のこと、　ＰＣＩ！反応を前述の通りに実施し、２５７ｂｐのフラグメントが得られた。

プラスミドｐＫＦＮ−１０００は、合成酵母シグナル−リーダーペプチドをエンコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（Ｍｅａｄ、　Ｄ、Ａ、＋５ｚｃｚｅ−ｓｎａ−５ｋｏｒｕｐａ＋　Ｅ、とにｅｍｐｅｒ、Ｂ、＋Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇｉｎ、土（１９８６）６７−７４）の誘導体である。プラスミドｐＫＦＮ− １０００は一０９０／１００７５に記載されている。

ｐＫＦＮ−１０００のＥｃｏＲ１部位から２３５ｂＰの下流の［ｌＮＡ配列及び合成酵母シグナル−リーダー配列のエンコード化アミノ酸配列をＳＢｏ　１０　Ｎｏ、６に示す。

シグナル−リーダー−０ＫＩＢ９：上記の２種のＰＣＲ−フラグメント約０．１　μｇづつを混合した。　ＰＣＲ反応を、１００ｐａ＋ｏｌｅづつのプライマーＮＯＲ区４７８及びＮ−１、並びに下記のサイクル：９４℃で１分、５０℃で２分、そして７１”Ｃで３分を利用して行った。１６サイクル後、７２°Ｃ工程を１０分維持する最終サイクルを行った。

得られる４５１ｂＰのフラグメントを０．１％のアガロースゲルでの電気泳動により精製し、次いでＥｃｏＲＩ及びＸｂａｌで消化した。得られる４１８ｂｐのフラグメントをプラスミドｐＴＺ１９Ｒに由来する２、８ｋｂのＢｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントにリゲートした。そのリゲーシ目ン混合物をアンピシリン耐性について選別性のコンピテントＥ、ユニ株（ｒ−１ｍ”　）を形質転換するために用いた。　ＩＩＮＡ配列決定は、得られるコロニーに由来するプラスミドが、合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に適正に融合したＩＩＩ　８９についてのＤＮＡ配列を含むことを示した。

１プラスミドｐＫＦＮ−１８２６を更なる利用のために用いた。

ｐＫＦＮ−１８２６に由来する４１８ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントを、ｐＨＴ６３６由来の９．５　ｋｂのＮｃｏｌ−Ｘｂａｌ　フラグメント及びｐＭＴ６３６由来の１．４　ｋｂのＮｅａｔ−ＥｃｏＲＩフラグメントにリゲートし、プラスミドｐＫＦＮ−１８２７を得プラスミドｐＭ７６３６は国際特許出願ＰＣＴ　／ＤＫ８８１００１３８に記載されている。　ｐＭ７６３６は、シゾサッカロマイシス　±７＜　ＴＰＩ遺伝子（ＰＯ↑）（Ｒｕｓｓｅｌ、Ｐ、Ｒ，Ｇｅｎｅ　観（１９８５）１２５−１３０）、Ｓ、セレビシェ　トリオセホスフェートイソメラーゼプロモーター、並びにターミネータ−１ＴＰＩ、及びＴＰＩｙ　（Ａｌｂｅｒ、Ｔ、とＫａｗａｓａｋｉ　Ｇ、Ｊ、Ｍｏ上］旦１工む旦」− （１９８２）　、４１９〜４３４）を含む、Ｌ　ユ丈−５エ　セレビシェ　シャトルベクターである。

プラスミドｐＫＦＮ−１８２７の発現カセットは下記の配列を含む：ＴＰＩ、　 −ＫＦＮｌｏｏＯシグナル−リーダー−１１ＫＩ　Ｂ９−　ＴＰＩＴプラスミドｐＫＰＮ−１８２７の構築を図３に示す。

ｐＫＦＮ−１８２７由来の４２４ｂＰのＥｃｏＲＩ−ＸｂａｌフラグメントのＤＮＡ配列をＳＥＱ　ＩＱ　Ｎｏ、８に示す。

酵母の形質転換：Ｓ、セレビシェ株ＭＴ６６３（Ｅ２−７Ｂ　ＸＥＩＩ−３６ａ／　ｔｘ、Δｔｐｉ／Δｔｐｉ、ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３）をＹＰＧａＬ（１％のＢａｃｔｏ酵母抽出物、２％のＢａｃ　ｔｏペプトン、２％のガラクトース、１％のラクテート）で６００ｎｍにて０．６の０．Ｄ、となるまで増殖させた。

１００　μｌの培養物を遠心により集め、１０−１の水で洗い、再遠心し、そして１．２Ｍのソルビトール／ｌのジチオトレイトールを含む溶液１０麟１の中に再懸濁した．その懸濁物を３０°Ｃで１５分インキュベートし、遠心し、そしてその細胞を、１、２Ｍのソルビトール、１〇−門のＮａＪＤＴＡ　、　０．１　Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐ）ｌ＝５．８　、及び２ｍｇのＮｏｖｏｚｙｌ＋（商標）２３４を含む溶液１０１に再懸濁した．その！ｌ！濁物を３０°Ｃで３０分インキュベートし、その細胞を遠心により集め、１．２Ｍのソルビトール１０ｍｌ及びＣＡＳ（１．２　Ｍのソルビトール、１０＋ｓＭのＣａＣＩｚ　、１０ｍＭのトリスＩＩｃＩ　（　）リス−トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）　ｐＨ＝７．５）１０ｍｌで洗い、そしてＣＡＳ　２■ｌに再懸濁した．形質転換のため、０．１　ｍｌのＣＡＳ再懸濁細胞を約ｌμｇのプラスミドｐＫＦＮ−１８２７と混合し、そして室温で１５分放置した。

１■ｌの（２０％のポリエチレングリコール４０００、２０ｓＭのＣａＣ１ｇ　、１０−ＭのＣａＣＩｚ　、１０＋＊ＭのトリスＨＣＩ　、　ｐｉ（＝７．５）を加え、そしてその混合物を室温で更に３０分放置した。その混合物を遠心し、そしてそのパレットを０．１　ｍｌのＳＯＳ（１．２　Ｍのソルビトール、３３％ｖ　／　ｖのＹＰ［ｌ　。

６、７１のＣａＣｌｚ　、１４μｇ　／ａ１１のロイシン）に再懸濁し、そして３０’Ｃで２時間インキュベートした．次いでその懸濁物を遠心し、そしてそのペレットを１．２Ｍのソルビトール０．５■ｌに再懸濁した．次に、５２°Ｃの６■ｌのトップアガー（Ｓｈｅｒｍａｎら（Ｍｅｔｈ３１ジｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，−Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））のＳＣ培地；１．２Ｍのソルビトールと２．５％のアガーを含む）を加え、そしてその懸濁物を同一のアガー固形化ソルビトール含有培地を含んでいるプレートの上に注いだ。

３０°Ｃで３日後に形質転換コロニーを拾い、再単離し、そして液体培養を始めるために用いた．−のかかる形質転換体ＫＦＮ−１８３０を更なる特性化のために開いた。

発酵：酵母株ＫＦＮ−１８３０を、ＹＰＤ培地（１％の酵母抽出物、２％のペプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ由来）及び３％のグルコース）で増殖させた．その種の培養物２００１を３０℃で振謄して６５０ｎ−で２４の光学密度にした。遠心後、その上清液を単離した。

その酵母抽出物を５％の酢酸及びリン酸でｐＨ３．０に合わせ、そしてＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムに載せ、次いで５０１Ｍのギ酸、ｐＨ３．７で平衡化した。平衡バッファーで洗った後、ＩＩＫ！−ドメインをＩＭの塩化ナトリウムで溶離させた．脱塩は、０．１％の炭酸水素アンモニウムｐＨ７．９で平衡、且つ溶離せしめてＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒ＋＊ａｃｔａ）により得た．平衡バッファーで洗った後、平衡バッファー中で００−ＩＭの塩酸ナトリウムでの勾配溶離を行った。

最終精製は、Ｖｙｄｏｃ　Ｃｄカラム（Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ、Ｃ＾）での５−５５％のア七ト二トリル、０．１％のＴＰ＾による勾配溶離での逆相ＨＰＬＣにより実施した。精製した生成物を真空遠心により凍結乾燥し、そして水に再溶解させた。

アリコートをマスＰＯ−マススペクトロメトリーにより分析しく実験値：　ＭＷ　６８５３−５　、計算値：　Ｍ！１６８５３−８）、そして４５Ｅｄｍａｎ分解サイクルにわたるＮ−末端アミノ酸配列決定はＨＫＩ　Ｂ９ドメインの一次構造を確定した。

班ユＨにＩ　Ｂ９にお番る　１５　び１６に番る　７炊・プラスミドｐＫＦＮ−１８２７に由来するＨＫＩ　Ｂ９をエンコードする１、３　ｋｂの５ｐｈｌ−Ｂａ− 旧フラグメント０．１８ｇを２通りのＰＣＲ反応において鋳型として用いた。第一のＰＣＲ反応においては、１００ｐ１００ｐづつのプライマーＮ０Ｒ−２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及びＭ−７５２（ＧＡ＾＾ＡＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＡＴＧＴＡＧ　（Ｃ／Ｇ）　Ｃ−（Ｃ／Ｇ）＾（Ａ／Ｃ）＾ＣＡＡＧＧＧＣ）を使用した。第二のＰＣＲ反応においては、１００ｐ＋５ｏｌｅづつのプライマーＮ０ＩＩ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及びＭ−７５１（ＧＣＣＣＴＴＳＴ　（Ｔ／Ｇ）Ｔ　（Ｃ／に）　Ｇ　（Ｃ／Ｇ）　ＣＴＡＣＡＴＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＣ）を使用した。　Ｎ０Ｒ −２０２２は５ｐｈｌ部位の９４ｂｐ下流の位置をプライムする。

ドア５２はＳＥＱ　１０　Ｎｏ、８のＨＫＩ　Ｂ９　ＤＮＡ−配列位置２７６− ３１０に対して５つの誤対合を除いて相補性である。　Ｎ０Ｒ−１４９５はＢａ −旧部位の５６１ｂｐ上流の位置をプライムする。

ＰＣＲ反応は、市販のキット（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ＋Ｐｅｒｋｉｎ　ｔｉｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び下記のサイクル＝９５°で１分、５０°Ｃで１分、そして７２＠で２分を利用して１００　μｍの容量の中で行った。２４サイクル後、７２ °Ｃの工程を１０分維持する最終サイクルを実施した。第−ＰＣＨに由来する４４９ｂＰのフラグメント及び第二に由来する２７９ｂｐフラグメントのＰＣＲ生成物を２％のアガロースゲルでの電気泳動により単離した。上記の２種類のＰＣＲフラグメント約０．１％ｇづつを混合した。　ＰＣＲ反応を、１００　ｐｍｏｌｅづつのＨプライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５、並びに下記のサイクル：９５＠で１分、ｓｏ’ｃで２分、そして７２℃で３分を利用して行った。２２サイクル後、７２℃の工程を１０分維持する最終サイクルを実施した。

得られる６９３ｂｐのフラグメントを０．１％のアガロースゲルでの電気泳動により精製し、次いでＥｃｏＲＩ及びＸｂａｌで消化した。得られる４１８ｂｐのフラグメントを、ｐＴＺ１９Ｒ（Ｍｅａｄ＋Ｄ、Ａ、、５ｚｃｚｅｓｎａ−３ｋｏｐｕｒａ、Ｅ、＋とＫｅｍｐｅｒ、Ｂ、Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇｉｎ、上（１９８６）６７−７４）由来の２．８　ｋｂのＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌフラグメントにリゲートした。

そのリゲーション混合物を、アンピシリン耐性について選別性であるコンピテントＬユニ株（ｒ−、ｍ”　）を形質転換するために用いた。　ＤＮＡ配列決定により、合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に融合した表示の１ＩＫＩ　Ｂ９類似体をエンコードする下記の５つのプラスミドが同定された。

ブースミドｐＫＦＮ−１８９２１Ｑ１５Ｖ、Ｔ１６Ｇ１−ＨＫＩ　Ｂ９ｐＫＦＮ−１９１６［Ｑ１５Ｖ、７１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９ｐＫＦＮ−１９０９１Ｑ１５Ｆ、７１６Ｇ］−ＨＫＩ　Ｂ９ｐＫＰＮ−１９１２［０１５Ｆ、７１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９ｐＫＦＮ−１９１３［Ｑ１５Ｌ、７１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９これらのプラスミドに由来する４１８ｂｐのＥｃｏＲＩ−χｂａｒフラグメントを、例２に記載の発現プラスミドの構築のために用いた。

例２に記載の酵母株ＭＴ−６６３の形質転換は下記の酵母株をもたらした：〜にＦＮ４９０２　［Ｑ１５Ｖ、Ｔｌ６Ｇ］−ＨＫＩ　Ｂ９ＫＦ１１−１９３０　［Ｑ１５Ｖ、７１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９ＫＦＮ−１９３２（Ｑ１５Ｆ、Ｔ１６Ｃ）−１１１ｔｌ　Ｂ９ＫＦＮ−１９６５ＩＱ１５Ｆ、Ｔ１６Ａ］−１１Ｉ　Ｂ９ＫＦＮ−１９６６［Ｑ１５Ｌ、Ｔ１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９ｙｐｏ−培地の中でのこの形質転換酵母株の培養を例２に記載の通りに実施した。

■土ＫＦＮ−１９７４び−ＫＦＮ−１９７５か゛の旧５に−ＨＫＩＢ９の　びＱ１５にＴ１６＾　−１１ＫＩ　８９の１°１プラスミドｐＫＦＮ−１８２７由来の１ｔＫＩ　Ｂ９をエンコードする１、３　ｋｂの５ｐｈｌ−Ｂａ−旧フラグメント０．１８ｇを２通りのＰＣＲ反応において用いた。第一のＰＣＲ反応においては、１００ｐ１００ｐづつのプライマーＮ０１ｉ−２０２２（ＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＣ）及びＬ７５５　（ＧＣＧＴＣＡＴＧＴＡＧＧ　（Ｃ／Ｔ）　ＴＴＴＡＣＡＡＧＧＧＣ）を用いた。

第二のＰＣＲ反応においては、１００ｐ１００ｐづつのプライマーＮ０Ｒ−１４９５（ＴＡＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡ）及び？ｌ−７５９　（ＧＣＣＣＴＴＧＴＡＡＡ　（Ｇ／Ａ）　ＣＣＴＡＣＡＴＧＡＣＧＣ）を使用した。

Ｎ０Ｒ−２０２２は５ｐｈｌ部位の９４ｂｐ下流の位置をプライムする。　Ｍ− ７５５は）ＩＫＩ　８９　ＤＮＡ配列位置２７６−２９９（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、８）に対して、２つの誤対合を除き相補性である。　Ｎ０Ｒ−１４９５はＢａ膳旧部位から５６１ｂｐ上流の位置をプライムする。　Ｍ−７５９はＭ−７５５に対して相補性である。

ＰＣＲ反応は、市販のキット（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び下記のサイクル：９５＠で１分、５０°Ｃで１分、そして７２ ′″で２分を利用して１００μｍの容量の中で行った。２４サイクル後、７２℃ の工程を１０分維持する最終サイクルを実施した。第−ＰＣＲに由来する４３８ｂｐのフラグメント及び第二に由来する２７９ｂｐフラグメントのＰＣＲ生成物を２％のアガロースゲルでの電気泳動により単離した。上記の２種類の１’（、＋１フラグメント約０．１８ｇづつを混合した。　ＰＣＲ反応を、１００　ｐｍｏｌｅづつのプライマーＮ０Ｒ−２０２２及びＮ０Ｒ−１４９５、並びに下記のサイクル：９５＠で１分、５０°Ｃで２分、そして７２°Ｃで３分を利用して行った。２２サイクル後、７２℃の工程を１０分維持する最終サイクルを実施した。

得られる６９３ｂｐのフラグメントを０．１％のアガロースゲルでの電気泳動により精製し、次いでＥｃｏＲＩ及びＸｂａｌで消化した。得られる４１８ｂｐのフラグメントを、ｐＴＺ１９Ｒ（１１ｅａｄ、Ｄ、＾、　、　５ｚｃｚｅｓｎａ −５ｋｏｐｕｒａ、　Ｅ、　＋とＸｅ＋ｗｐｅｒ＋Ｂ、Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇｉｎ、工（１９８６）　６７−７４）由来の２．８　ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントにリゲートした。

そのリゲーション混合物を、アンピシリン耐性について選別性であるコンピテントＬユ１株（ｒ−、ｍ’　）を形質転換するために用いた。　ＤＮＡ配列決定により、合成酵母シグナル−リーダー遺伝子に融合した表示のＨＫＩ　Ｂ９類似体をエンコードする下記の５つのプラスミドが同定された。

プラスミド　ｔｐＫＦＮ−１９１９（Ｑ１５Ｋ］　−ｔｌＫＩ　Ｂ９ｐＫＦＮ−１９２１［Ｑ１５に、Ｔ１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９これらのプラスミドに由来する４１８ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントを、例２に記載の発現プラスミドの構築のために用いた。

例２に記載の酵母株ＭＴ−６６３の形質転換は下記の酵母株をもたらした：ＫＦＮ−１９７４［Ｑ１５Ｋ］−ＨＫＩ　Ｂ９ＫＦＮ−１９７５［０１５に、Ｔ１６Ａ］−ＨＫＩ　Ｂ９ＹＰＤ−培地の中でのこの形質転換酵母株の培養を例２に記載の通りに実施した。

ｔ５ＨＫＩＢ９゛　にＦＮ１９０２　び１９３０によるセ１ンブローイ　−ゼのクニッドメイン変異体を例２に記載の方法により酵母培養培地から精製した。

それらの４度を、標準品としてアプロチニンを用いて、２１４ｎ■での吸光度より決定した。ブタトリプシンはノボ　ノルディスクＡ／Ｓより入手し、牛キモトリプリン（ＴＬＣＫ処理）はＳＬｇｓａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　（ＳＩＬｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）より入手した。ヒト好中球カテプシンＧ及びエラスターゼは、Ｂｏｕｇｈ　とＴｒａｖｉｓの旦犯上凹Ｄｌ１１５．１９７６、ｐｐ、　８３６−８４３に記載の方法に従ってＰＭＳの抽出物から精製した。

ペプチジルニトロアニリド基質５２２５１及び３２５８６はＫａｂｉ　（ＳＬｏｃｋｈ。

Ｉｔ＋　Ｓｗｅｄｅｎ）より入手した。　５７３８８及びＭ４７６５はＳｉｇｍａ　Ｃｂｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ。

より入手した。

セリンプロテイナーゼを様々な濃度の変異体と３０分間インキユベートシた。

次いで基質を加え、残留プロテイナーゼ活性を４０５０■で測定した。

にＦＮ　１９０２及びにＦＮ　１９３０はそれぞれＫｉ　＝　１４０ｎｍ及び６４ｎＭの好中球エラスターゼのインヒビターであることが認められ、そして１μ Ｍで若干キモトリプシンを阻害したが（５％）、これらの条件のもとてトリプシン及びカテプシンＧは阻害しなかった。

これらの実験は、既知の阻害機能を有さないクニツドメインをエラスターゼインヒビターへと変換せしめることが可能であることを示す。

配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：（Ａ）名称二ノボ　ノルディスク　Ａ／５（Ｂ）通り：ノボ　アレ（Ｃ）市：バグスバード（Ｅ）国：デンマーク（Ｆ）　郵便番号（２１Ｐ）　：　ＤＫ−２８８０（Ｇ）電話：　＋４５４４４４８８８８（）［）テレファックス：　＋４５４４４９３２５６（１）テレックス：　３７３０４（ｉｉ　）発明の名称：新規のヒトクニッ型プロテアーゼインヒビター及びその変異体（ｉｉｉ）配列の数：９（ｉｖ）コンピューター読み取り方式：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動シスチムニＰｃ−Ｄｏｓ／ＭＳ−Ｄｏｓ（Ｄ）ソフトウェアｍ：パテントイン　リリース＃１．０　、バージｖ　７＃１．２５（ｔ！ＰＯ）（２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：１　ニツィｒ（７）情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０アミノ酸（Ｂ）タイプ二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：タンパク質（ｖｉ）起源：（Ａ）生物二人類（ｘｉ　）配列の詳細：　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：ｌ：（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５７アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：ペプチド（■１）起源：（Ａ）生物：合成（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＣｙＳ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　ＣＹＳ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａｌ　５　１０　１５ χａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｆｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｅ：　ＧｌｙＧｌｕ　ＣＹｓ　Ｇｌｕ　Ｉｉｕ　Ｐｈｅ（２）　ＳＥＱ　ｒ［ｌ　ＮＯ：３　ニツイテノ情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二６０アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：タンパク質（ｖｉ）起２！Ｉ：（Ａ）生物：合成（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＯＩＤ　ＮＯ：３：（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：４についての情報＝（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５０２塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｖｉ）起ＩＩＩＩ：（Ａ）生物二人類（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤＳ（Ｂ）位置：　１８７．．３６６（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：４：（２）ＳＥ口１０　ＮＯ：５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝６０アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：タンパク質（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：社Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｏｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓｌ　５　１０　Ｌ５（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：６についての情報：（＋）配列の特＠：（Ａ）長さ：２３５塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物二合成（ｉｘ）特徴；（’Ａ　）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位置：　７７、．２３５（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：６：（２）　ＳＥ［ｌ　Ｉｌｌ　ＮＯニアについての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：タンパク質（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥｏ　１０　ＮＯニア：（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４２４塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）分子のタイプ：　ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物：合成／ヒト（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｓｉｇペプチド（Ｂ）位’５７　：　７７、．２３５（ｔｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｍａｔペプチド（Ｂ）位置：　２３６．．４１５（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　Ｃ０５（Ｂ）位置：　７７、．４１５（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：８：π石ＴＴｒ　ＴＴＣＡＡＣ’ ＩＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣｒ　ＧＧｒ　ＧＡＡ　ＴＧｒ　ＧＡＧ　ＴＴｉ　ＴＴＴ　ＧＣｒ　Ｔｉｃ　ＧＧＡ　３４X ＧＧＣＴＣ−ＣＧＧＡ　ＧＧＣＡＡＣＡＣ−ＣＡＡＣＡＡＣＴＴｒ　ＴＫ；　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＴＧｒ　ＧＡＧ　３９７ＡＡＡ　Ｔｍ　！　ＭＧ　ＴｒＴｃＡＣＣｎ　４２４（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎ０＝９についての情報＝（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１１３アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖（ｉｉ）分子のタイプ：タンパク質（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９：ヒトクニツブロテアーげインヒビターのドメインＦｉｇ、　１クンツドメインＰＣＲ−プライマー人：　５’　ＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＮＣＣＮＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＡＡ（入／Ｇ）Ｇ　］’　２３−Ｎ体Ｂ：　５’　ＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧにＮＣＣＮＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＣＧ　３′　２１−量体Ｃ：　５’　ＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＮＮＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＧ（Ｔ／Ｃ）八人（入／Ｇ）６　３′　２３−Ｎ体Ｅ：　５’　ＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＮＮＴ（入／Ｇ）ＴＧ（Ｔ／Ｃ）八入（入／Ｇ）Ｇ　３ｚ　２３−ｊ１体Ｆ：　５’　ＧＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＧＮＮＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＣＧ　３’　２ｌ−１ｌ体Ｈ：　５’　ＧＴＴＧＧＭＴＴＣＧＧＮＮＴ（入／Ｇ）ＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＣＧ　３’　２１−量体ｘ：　５′　ＧＧＴＴＴＣＴＡＧＡ（Ａ／Ｇ）ＣＡＮＣＣ（入／Ｇ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ　３／　２２−１１体Ｙ：　５／　ＧＧＴＴＴＣＴＡＧＡ（Ａ／Ｇ）ＣＡＮＣＣ（Ｔ／Ｃ）ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ　３ｔ　２２−１ｌ体Ｚ：　５’　ＧＧＴＴＴＣＴＡＧＡ（入／Ｇ）ＣＡＮＣＣ（入／Ｇ）ＣＴ（入／Ｇ）ＴＡ　３′　２２−Ｍ体Ｆｉｇ、　２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９／９９　９１５２−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０２　ＺＮＡ　Ｃ９２８２−４Ｂ／／　Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｚ　８６１５−４Ｃ（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：８６５）（７２）発明者　ビョルン、セーレン　エリクデンマーク国、デーコー−２８００リングビー、マリエ　グルベス　アレ　４７（７２）発明者　ペテルセン、ラルス　クリスティアンデンマーク国、デーコー −２９７０ヘールスホルム、ハベベイ　４（７２）発明者　オルセン、オレ　フビルテズデンマーク国、デーコー−２７００ブレーンスヘーイ、ベクケスコウバイ　３８Ｉ（７２）発明者　フォスター、ドナルド　キャメロンアメリカ合衆国、ワシントン　９８１５５．シアトル、ノースイースト　ワンハンドレッドエイティーファースト　３００２（７２）発明者　スプレッチャー、シンディー　アンアメリカ合衆国、ワシントン　９８１１５．シアトル、サーティーナインス　アベニュ

Claims

【特許請求の範囲】

１．下記のアミノ酸配列を含んで成るヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター【配列があります】又はプロテアーゼインヒビター特性を有するその変異体。
２．前記の変異体が下記のアミノ酸配列【配列があります】（ここで、Ｘ１はＨであるか、又はＣｙｓを除く１〜５個の天然アミノ酸残基を表わし、Ｘ２−Ｘ１４は互いに独立して天然アミノ酸残基を表わし、そしてＸ１５はＯＨであるか、又はＣｙｓを除く１〜５個の天然アミノ酸残基を表わし、ただしアミノ酸残基Ｘｌ−Ｘ１５のうちの少なくともいづれかが天然の配列の対応のアミノ酸残基とは異なっている）を含んで成る、請求項１記載のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビターの変異体。
３．Ｘ１がＬｅｕ−Ｐｒｏである、請求項２記載の変異体。
４．Ｘ２が、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｔｈｒ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，ＧＩｎ，Ｓｅｒ，及びＶａｌより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
５．Ｘ２がＴｈｒ又はＬｙｓである、請求項４記載の変異体。
６．Ｘ３が、Ｐｒｏ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｖａｌ及びＩｌｅより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
７．Ｘ３がＰｒｏ又はＩｌｅである、請求項６記載の変異体。
８．Ｘ４が、Ｌｙｓ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ａｓｎ，Ａｌｎ，Ｇｌｎ又はＡｒｇより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
９．Ｘ４がＬｙｓ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ，Ｇｌｎ又はＡｒｇである、請求項８記載の変異体。
１０．Ｘ５が、Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ及びＡｓｐより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
１１．Ｘ５がＡｌａ，Ｔｈｒ，Ａｓｐ又はＧｌｙである、請求項１０記載の変異体。
１２．Ｘ６、Ａｒｇ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｏ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ａｓｎ，Ｉｌｅ及びＭｅｔより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
１３．Ｘ６がＡｒｇ，Ｐｈｅ，Ａｌａ，Ｌｅｕ又はＴｙｒである、請求項１２記載の変異体。
１４．Ｘ７が、Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ．Ｖａｌ及びＰｈｅより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
１５．Ｘ７がＩｌｅである、請求項１４記載の変異体。
１６．Ｘ８が、Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，ＧＩｎ，ＧＩｕ，Ａｒｇ，Ｐｒｏ及びＰｈｅより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
１７．Ｘ８が、Ｉｌｅ又はＴｈｒである、請求項１６記載の変異体。
１８．Ｘ９が、Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ及びＬｅｕより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
１９．Ｘ９が、Ａｒｇである、請求項１８記載の変異体。
２０．Ｘ１０が、ＧＩｎ、Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｔｒｐ，ＡＩａ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｍｅｔ，Ａｒｇ及びＶａｌより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
２１．Ｘ１０がＶａｌ又はＡｌａである、請求項２０記載の変異体。
２２．Ｘ１１が、Ｇｌｙ，Ｍｅｔ，ＧＩｎ，ＧＩｕ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ及びＡｓｎより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
２３．Ｘ１１がＡｒｇ又はＧｌｙである、請求項２２記載の変異体。
２４．Ｘ１２がＡｌａ又はＧｌｙである、請求項２記載の変異体。
２５．Ｘ１３が、Ｌｙｓ，Ａｓｎ及びＡｓｐより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
２６．Ｘ１３がＬｙｓ又はＡｓｎである、請求項２５記載の変異体。
２７．Ｘ１４が、Ｖａｌ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ｉｌｅ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｔｒｐ及びＬｙｓより成る群から選ばれるアミノ酸残基である、請求項２記載の変異体。
２８．Ｘ１４がＬｙｓ又はＬｅｕである、請求項２７記載の変異体。
２９．Ｘ１５がＴｈｒである、請求項２記載の変異体。
３０．Ｘ１がＬｅｕ−Ｐｒｏであり、そしてＸ１５がＴｈｒである、請求項２記載の変異体。
３１．下記のアミノ酸配列を含んで成る請求項２記載の変異体【配列があります】
３２．請求項１記載のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター又は請求項２−３１のいづれか１項に記載のその変異体をエンコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築体。
３３．請求項３２記載のＤＮＡ構築体を含んで成る組換発現ベクター。
３４．請求項３２記載のＤＮＡ構築体又は請求項３３記載の発現ベクターを含む細胞。
３５．請求項１記載のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター又は請求項２−３１のいづれか１項に記載のその変異体を製造する方法であって、請求項３４記載の細胞をタンパク質の発現が誘発される条件のもとで培養し、そしてその培養物から得られるタンパク質を回収することを含んで成る方法。
３６．請求項１記載のヒトクニツ型プロテアーゼインヒビター又は請求項２−３１のいづれか１項記載のその変異体と、薬理学的に許容されている担体又は賦形剤とを含んで成る薬理組成物。