JPH07502645A - 有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養物の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １０　請求項５に記載の方法にしたかって製造された安定な有糸分裂後ヒトニコ ーロン細胞。

１１　前記プラスミドかβ−カラクトシダーセ発現プラスミドを含む請求項５に 記載の方法。

１２、請求項１１に記載の方法にし、たがって製造された安定な有糸分裂後ヒト ニューロン細胞。

１３　実質的に全部か少なくとも１種類のトランスフェクトされた外因性遺伝子 を含む安定なを糸分裂後ヒトニューロン細胞。

明　細　書 有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養物の製造卒論 本発明は、Ｎ　Ｉ　Ｈ認可番号Ｎ５１８６１６によって提供された研究中に得ら れた。本発明の当然の権利は政府にある。

窪贋 成執哺乳動物ニューロンは細胞分裂することかできないし、しかも、嗅覚ニュー ロンを除いては、成体神経系の幹細胞から発生することは有り得ない。したかっ て、ニューロン特性を有する連続的に分裂するクローン細胞系は、神経生理学者 か神経系のはとんと全ての態様を研究するのに極めて有用であることか分かった 。

このような細胞系は、多数の同種細胞の発生および遺伝子転移によるこれらの細 胞の操作によって、異種遺伝子産物を発現する新規の誘導体の生成を可能にする 。

これらの利点は種々のニューロン細胞系の開発および特性決定をもたらし、その いくつかは細胞生物学、生化学および分子生物学の研究に有用であった。これら の異なる細胞系の有用性およびニューロン表現型の外観に近づくそれらの能力は 広範に変化する。しかしながら、過去十年間にわたって行なわれた研究は、細胞 系の有用さが、主として二つの特性、すなわち、（１）特定の細胞系か有糸分裂 後ニューロンに似ている程度、および（２）倍加時間に依ることを示した。しば しば、これら二つの重要な特性は逆の関係にある。ニューロンの多数の分化した 性質は、幹細胞か有糸分裂後になるまではインヒポにおいて完全に明確になって いるとは言えない。しかしなから、速やかに分裂するニューロン細胞系は、通常 、最終的に分化した非分裂性ニューロンの表現型性質を持たない代わりに、それ らは、しばしばインヒポにおいて神経芽細胞または胚ニューロンに似ている。例 えば、多数のこれらの細胞系は未熟細胞骨格と一緒に未熟神経突起（ｎｅｕｒｉ ｔｅ）を生成するか、有糸分裂後ニューロンの形態学および神経突起の分化かほ とんと存在しない。それにもかかわらず、それらは速やかに分裂するので、これ らの細胞系は生化学およびトランスフエクンヨン実験に有用である。中枢（ＣＮ Ｓ）および末梢（ＰＮＳ）神経系の多数のニューロン細胞種の天然に存在する新 生物形成誘導体は、通常、このａｌｌ（例えば、神経芽細胞腫、クロム親和性細 胞腫および髄部細胞腫）に入る。もう一方の種類として、ＨＣＮＩで例示された 細胞系かある（口不ツト（Ｒｏｎｎｅｔｔ）ら、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ、２ ４８６０３〜６０５）。これらの細胞は分化したニューロンの多数の特性を有す るが、それらはゆっくりと分裂するので（すなわち、未分化の場合、倍加時間７ ２時間）、それらは多数の実験操作で扱いにくい。ニューロン細胞系の古典的な 例であるＰＣＩ２細胞でさえも、ＮＧＦの除去によって、それらのより少ないニ ューロンの速やかに分裂する表現型に逆戻りする（グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）お よびティンニラ−（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ）、１９８２、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　 Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏ　、Ｓ、フエデロフ（Ｆｅｄｅ　ｒｏ 　ｒ　ｆ）および■、　ハーフ（Ｈｅｒｔｚ）監修、アカデミツク・プレス（Ａ ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、　ニューヨーク）。

近年、開発中に一時的に見出される特定のニューロン前駆体を不死化するために 多大な努力か成された（最近の論評に関しては、セブコ（Ｃｅｐｋｏ）、Ａｎｎ 、Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏ、、１２：４７−６５．１９８９；またはレンダール（Ｌ ｅｎｄａｈｌ）およびマツケイ（ＭｃＫａｙ）　、ＴｌＮ５．１３　：１３２〜 １３７．１９９０を参照されたい、そして具体的な例に関しては、ハートレット 　（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）　ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。

８５：３２５５−３２５９．１９８８；フレデリクセン（Ｆ　ｒｅｄｅ　ｒ　ｉ 　ｃｋｓｅｎ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ、１：４３９−４４８．１９８８：ピレン（Ｂ ｉｒｒｅｎ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ、４：１８９−２０１　（１９９０）；ハマング （Ｈａｍｍａｎｇ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ、４ニア７５−７８２．１９９０；ライダ ー（Ｒｙｄｅｒ）ら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、、２１．：３５６−３７５．１ ９９０；ｏ　（ＬＯ）呟Ｄｅｖ、Ｂ　ｉ　ｏ　１．、］Ｊ５　：１３９−１５３ ．１９９１を参照されたい）。このアプローチは、これらの細胞系か、発生の特 定段階での具体的な細胞種の特性に近いと考えられるので特に有効である。既に 、重要な発生機能を助けることかできる新規の分子は、これらの新規の細胞系を 用いて単離された（ノヨンソノ（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４６： ８５８−８６１．１９９０、レンダールら、Ｃｅ　ｌ　１．６０　：　５８５〜 ５９５．１９９０）。しかしながら、ＭＡＨ細胞を例外として（ヒレンら、Ｎｅ ｕｒｏｎ、４：１８９−２０１　（１９９０）、この方法を用いて生成された細 胞系の更にニューロン分化する能力には限界がある。むしろ、それらは、ニュー ロン系統の発生において特定の分岐点を調へるのに一層有用であると考えられる 。

ニューロン表現型の決定に影響を与えるニューロン成熟の過程および固有因子の 分析に理想的な細胞系は、速やかに分裂する結果として多量に増殖し且つ外因性 遺伝子産物を発現する安定な細胞集団を生しるようにトランスフェクトすること かできるものであると考えられる。分化を促進する物質による誘導の際に、この 理想的な細胞系は細胞周期を離れ、ニューロン表現型に対して不可逆的に委ねら れ、そして安定な有量分裂後状態で存在する。次に、これらの細胞は広範な神経 突起を生成し且つ培養中の主要なニューロンと同様の状態まで成熟すると考えら れる。

肝癌細胞系は上記基準のいくつかを満足させる。ネズミおよびヒト双方の胚腫瘍 に由来したこれらの細胞は、ある種の条件下（通常、レチノイン酸（ｒｅｔｉｎ ｏｉｃａｃｉｄ）　［ＲＡ　］による処理を含む）におかれた場合に１種類また はいくつかの細胞種に分化する未分化多能性細胞からなる。この過程は、インビ ボにおいて見出される種々の表現型に対して実際に委ねられることに似ている。

これらの細胞種としては、しばしば、分化の様々な段階でのニューロン、ダリア 、筋および／または内皮細胞かある。したかって、神経生理学者にとってのそれ らの有用性は、それらの異質性によって制限される。ヒト奇形癌細胞系であるＮ Ｔｅｒａ２／Ｄ１　（ＮＴ２）は、それらかＲＡに応答して表現型を変化するこ とかできるという点で、そのネズミ対応物と共通の特性を有する。しかしながら 、大部分のネズミ胚癌細胞系とは異なり、ＮＴ２細胞をＲＡ焙処理た後に見出さ れる唯一の識別しＩｎｖｅｓ　ｔ、、５０　：１４７−１６２　（１９８４）： リー（Ｌｅｅ）およびアントルーズ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃ±、、６：５１４−５ ２１　（１９８６））。残念ながら、従来の研究のいずれにおいても、これらの ニューロンは一部分の細胞であるにすぎないし、そしてそれらは分裂性大型偏平 細胞の大型の未同定集団および残数の未分化幹細胞と共存していた（アンドルー ズ、１９８４）。

発明犯盟！ レチノイン酸による処理および１次培養技術（組織培養プラスチックに対する分 別付着および有糸分裂阻害剤による処理を含む）を用いて、高度に精製されたニ ューロン集団をヒト奇形癌細胞系から得る。この培養法は、高度に分化した有糸 分裂微細胞を生成することができる。未分化細胞をβ−カグラクトシダーゼ（β −ｇａ　Ｉ）発現プラスミドでトランスフェクトした場合、β−ｇａ１発現は、 未分化細胞および有量分裂後細胞双方において存在することが分かった。したか って、未分化細胞中への発現プラスミドのトランスフェクシタンは、外因性遺伝 子産物の細胞中への導入を許し、次に、その細胞が安定な有糸分裂後ヒトニュー ロンになるように誘導することができる。

区面凶税朋 図１は、ＲＡ焙処理れたＮＴ２細胞からＮＴ２−Ｎ細胞の純粋培養物を生成する 方法の略図である。

図２Ａ−Ｆは、図１で示した方法の途中で起こる形態学的変化を示す位相差光学 顕微鏡写真である。Ａ、未処理ＮＴ２細胞、Ｂ１リプレー）（Ｒｅｐｌａｔｅ） ＃１後のＮＴ２細胞（下方の付着細胞上にある塊の丸い相明細胞に注目されたい ）、Ｃ１リブレート＃１１日（多数の細胞が多数のヒト神経芽細胞腫細胞系と同 様の痕跡突起を生成し始めたことに注目されたい）、Ｄ、リブレート＃２後７日 （非ニューロン細胞は死滅し始め、ここで培養物はニューロン様ＮＴ２−Ｎ細胞 によって支配される）、Ｅ、リブレート＃２後３０日（大部分の細胞がニューロ ンの形態学を示し且つ大型の凝集体に移行したこと並びに広範な突起成長が生じ たことに注目されたい）、Ｆ、これらの細胞の典型的なニューロン形態学を示す ＮＴ２−Ｎ細胞の高倍率光学顕微鏡写真。矢印は、図２Ｆでの細胞から出ている 軸索に似た長く細い先細でない突起を示している。くさび型は、樹状突起に似た ２本の主な突起を示している。Ｅにおける棒線はＡ−Ｅに対して適用され且つ２ ００μｍであり、モしてＦにおける棒線は３０μｍである。

図３Ａ−Ｃは、ＮＴ２およびＮＴ２−Ｎ細胞のＢｒＤＵ標識の結果を示す。Ａ、 ＢｒＤＬＩて標識され且つＢＵ−１で染色された未分化ＮＴ２細胞。Ｂ、ＢｒＤ Ｕで標識され且つＢＵ−１で染色されたＮＴ２−Ｎ細胞。Ｃ１抗ＮＦ−Ｌ抗血清 で標識されたＢと同一の視野。Ｃにおける棒線は２００μｍである。

図４Ａ−Ｆは、ＮＴ２−Ｎ細胞におけるニューロンマーカーの発現を実証する免 疫細胞化学的結果を示す。ＡおよびＢ、マウス抗Ｎ　Ｆ　−ＭｍＡ　ｂであるＲ ＭＯ２５４と、ＮＦ−６６に対して生したウサギ抗血清である抗ＮＦ−６６とに よる二重標識、ＣｌＩＷＭ３Ｇ５、マウス抗ＭＡＰ１ｂ　ｍＡｂ；ＤＳＡＰ１４ 、マウス抗ＭＡＰ２　ｍＡｂ　：　Ｅ、Ａ２　ＢＳ　、多数のニューロン上で見 出されたガングリオシドに特異的なマウスｍＡｂ：Ｆ、Ｔ１４、マウス抗ｔａｕ 　ｍＡｂ、Ｆにおける棒線は３０μｍである。

図５は、ＮＴ２−Ｎ細胞における細胞骨格マーカーの発現のイムノプロント分析 の結果を示す。列１〜６は６％５ＤＳ−ＰＡＧＥケルにより、列７〜１３は１０ ％５ＤＳ−ＰＡＧＥケルによる。１、抗ＭＡＰ１ｂ　ｍＡｂであるＩＷＭ　３Ｇ ５てプロットしたＮＴＩ−Ｎ細胞からの細胞骨格抽出物２０μｇおよび２、ウシ ＮＩ　Ａ　Ｐ　Ｓ　ａ　３、抗ＭＡＰ２　ｍＡｂであるＡＰ１４でプロットした 細胞骨格抽出物２０μｇおよび４、ウシＭＡＰ２゜５、抗ＮＦ−ＭｍＡｂである ＲＭＯ２５４てプロットした細胞骨格抽出物１０μｍおよび６、ヒト神経根ＩＦ 標品。７、ヒトＮＦ−Ｌに対して生した抗血清である抗ＮＦ−Ｌでプロットした 細胞骨格抽出物２０μｇおよび８、ヒト神経根中間体フィラメント標品。９、ラ ットＮ１６６に対して生した抗血清である抗ＮＦ−６６でプロットした細胞骨格 抽出物２０ｕｇおよび１０、ウシＮＦ−６６゜１１、抗ｔａｕ　ｍＡｂであるＴ １４でプロットした精製成人ｔａｕ：１２、精製ヒト胎児ｔａｕおよび１３、細 胞骨格抽出物６０μｇ、ＭＷマーカーは指示されたようにｋＤである。

図６　軸索および樹状突起に関するマーカーで染色されたＮＴ２−Ｎ細胞の同焦 点顕微鏡検査。ＡおよびＢは、ＨＯ１４（緑色）およびＲＭｄ０２０　（赤色） て染色された顕微鏡視野を示す。ＨＯ１４は、高リン酸化状態のＮＦ−Ｍに特異 的なラットｍＡｂであり、ＲＭｄ０２０は、低リン酸化状態のＮＦ−Ｍに特異的 なマウスｍＡｂである。Ｃは、ＨＯ１４と、ＭＡＰ２に特異的なマウスｍＡｂで あるＡＰ１４とて染色された細胞の高倍率視野を示す。これらの像は、各チャン ネルの個別のデータを集めた後、それらを−緒にし、そして計算機で作成された 擬色をそれらに与えることによって作成された。Ｃにおる棒線は、Ｃに対して適 用された場合２５μｍであり、ＡおよびＢに対して適用された場合５０μｍであ る。

図７　リブレート＃２の５週間後のＮＴ２−Ｎ細胞培養物の３Ｈ−ウリジン標識 。Ａ（低倍率）およびＢ（高倍率）は、ホフマン・モジュレーション・コントラ スト（Ｈｏｆｆｍａｎ　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｔｒａｓｔ）光学を用い て作成されたＮＴ２−Ｎ細胞の光学顕微鏡写真である。標識された細胞および突 起は、ＮＴＢ−２エマルジヨンオートラジオグラフイーによる銀色粒子のために 暗灰色または黒色に見える。Ａは、標識された細胞本体および樹状突起（くさび 形）を含む細胞の視野を示し、多数の未標識軸索突起（若干の例を矢印で示す） が該視野および培養皿上の他の所の細胞塊から出ている。Ｂは、若干の細胞の高 　□倍率写真を示す。これらの細胞の一つからの樹状突起をくさび形を用いて示 した。

Ａにおける棒線は、Ａに適用された場合５０μｍであり、Ｂに適用された場合１ ００μｍである。

図８Ａ−Ｄは、リブレート＃３後の神経突起再生を示す写真である。Ａ、マトリ ゲル（Ｍａ　ｔ　ｒ　ｉ　ｇｅ　Ｉ）上でリブレート＃３後１週間増殖させたＮ Ｔ２−Ｎ細胞。Ｂ１ポリ−Ｄ−リシン上でリブレート＃３後１週間増殖させたＮ Ｔ２−Ｎ細胞。図６Ｄの矢印は偏平な非ニューロン細胞を示す。Ｄにおける棒線 はＡ、ＢおよびＤに関し且つ２００μｍである。Ｃにおける棒線は３０μｍであ る。

図９Ａ−Ｃは、ホフマンモジュレーションコントラスト顕微鏡検査を用いるＸ− ｇａ　１組織化学によって可視化されたＮＴ２−９ＰＵＤ細胞のβ−ｇａ１発現 を示す写真である。Ａ、ＲＡ処理前のＮＴ２−８ＰＵＤ細胞。ＢおよびＣ１リブ レート＃２後のＮＴ２−３ＰＵＤ！ＩＩ胞。Ｃにおける棒線は、ＡおよびＣに適 用された場合１００μｍであり、そしてＢに適用された場合５０μｍである。

問−ｑ説朋 ヒト奇形癌細胞系（ＮＴｅ　ｒ　ａ　２／Ｃ１，Ｄ　１またはＮＴ２細胞）を、 レチノイン酸（ＲＡ）による処理後に操作して、９５％を越えて純粋なニューロ ン細胞（ＮＴ２−Ｎ細胞）培養物を生成した。

これらの安定な合糸分裂後細胞の高度に精製された培養物の生成を図１において 模式図によって概説する。未分化ＮＴ２細胞を最初に平板培養した場合、それら は粒状外観を有する相暗細胞（ｐｈａｓｅ　ｄａｒｋ　ｃｅｌｌｓ）として見え た（図２Ａ）。

ＲＡ処理の４週間後に、細胞は極度に密集した多層培養物を形成した。次に、こ れらの培信物を分散させ且つより低密度でリブレートして、細胞の多数の層の中 央に埋没していたＮＴ２−Ｎ細胞を解放した。この処理の後、ＮＴ２−Ｎ細胞は 偏平細胞層上に小型の川明細胞として見えた（リブレート＃１１図２Ｂ）。ＲＡ 処理後のこの時点まで（すなわち、リブレート＃１）のＮＴ２細胞の誘導、分化 パラダイムおよび初期の形態学的外観を予め詳細に検査した（アントルーズら、 １９８４年、アントルーズ、１９８４年）。リブレート＃１後の細胞の約５％は 、ニューロン特異的マーカーの存在によって判定されるニューロンである。これ らのニューロンを更に増加させるために、本発明者は、小型の相明ＮＴ２−Ｎ細 胞かりプレート＃１培養後の偏平細胞層にゆるく付着していて、機械的に除去し 且つ増加させることかできるという利点を用いた。この処理（リブレート＃２） は、主として小型の丸い川明細胞から成る培養物を生し、そのいくつかはヒト神 経芽細胞腫細胞系を連想させる短い突起を何していた（図２Ｃ）。この工程は、 ニューロン特異的酵素の測定によって検定したところ、ニューロン細胞を約４倍 増加させた。これらの培養物は、更に、未検査で増殖させた場合に小型の川明細 胞（ｐｈａｓｅ　ｂｒｉｇｈｔ　ｃｅｌｌｓ）を上部に有する単層を徐々に形成 した未分化ＮＴ２細胞に似た若干の偏平細胞を含んだ。リブレート＃２後、相明 ＮＴ２−Ｎ細胞は２週間以内に多数の突起を生長させ且つ大型の細胞凝集体を形 成し、そしてニューロン特異的マーカーの継続的存在によって決定したところ、 いずれの表現型復帰し全く示すことなく最大５か月間まで生育可能であった。し かしなから、これらの培養物は、偏平細胞を何する汚染単層の存在ゆえに、リブ レート＃１由来の混合培養物にまさる有意の改良ではなかった。これらの分裂性 偏平細胞を排除するために、リブレート＃２の後に培養物を複数の有糸分裂阻害 剤の組合せで処理した。

この処理はＮＴ２−Ｎ細胞に対して作用しなかったか、それは偏平細胞の増殖を 完全に抑制した。したかって、はぼ全部の偏平細胞は排除され、広範な細胞質を 何する極めて少数の有糸分裂に関して有害な細胞か後に残った。２週間の処理で 、約９５％の細胞か分化した二１−ロン、すなわち、ＮＴ２−Ｎ細胞てあった。

本発明者は、位相差顕微鏡検査によって概略的に得られたこの観察を、未分化Ｎ Ｔ２細胞に対して（ケラチン８および１８と反応するＣａｍ５．２）かまたはＮ Ｔ２−Ｎ細胞に対して（低分子壜ニューロフィラメントタンパク質と排他的に反 応するウザギ抗ＮＦ−Ｌ）特異的な単クローン性抗体（ｍＡｂ）を用いる二重染 色細胞培養物によって確認した。これらの実験は、Ｎ　Ｆ　−Ｌ抗血清で染色さ れた多数のＮＴ２−Ｎ細胞および、極めて希にのみ、Ｃａｍ５．２で染色された 広範な細胞質を有する偏平細胞を示（７た。これらの細胞に対してポリーＤ−リ シンまたはポリーＤ−リシンおよびラミニン（ｌａｓｉｎｉｎ）よりも優れた基 質として役立ったマトリケル上で培養した場合、これらのほぼ純粋なＮＴ２−Ｎ 細胞培養物は約１０週間生育可能であった。

位相差顕微鏡検査を用いて様々な時間にこれらの培養物を検査した場合（図２Ｄ およびＥ）、培養皿全体を覆う広範な神経突起網状構造の漸進的発生が観察され た。初代ニューロン培養において記載した軸索突起と同様の細く先細でない長い 突起もまた明らかであった。図２Ｆで示されたように、これらの培養物中の単細 胞は、基部で太く且つ細胞本体から漸進的に先細りした突起を生成した（図２Ｆ のくさび形）。更に、細く先細でない突起はこれらの細胞から出ていた（図２Ｆ の矢印）。これら二つの形態学的に異なる種類の突起は、ＣＮＳおよびＰＮＳニ ューロンの初代培養の樹状突起および軸索にそれぞれ似ていた。これら２種類の 突起の樹状突起および軸索としての同一性は、それらが発現した軸索および樹状 突起の分子マーカーによって確証された（図６および７を参照されたい）。広範 な突起成長のこの期間中に、ＮＴ２−Ｎ細胞は、神経系の様々な部分からのニュ ーロンの切代培養物に典型的な成長コーンを示した。純粋なＮＴ２−Ｎ細胞のも う一つの一貫した特徴はそれらの連動性であった。最初に、ＮＴ　２−ＮＩｌｌ 胞は培養皿の全表面上に均一に分散していたか（図２０）、時間か経つと、それ らは互いに移動して大型の相互に連結した軸索の東を何する細胞凝集体を形成し た（図２Ｄ）。単独かまたはラミニン含ず１のポリーＤ−リンン上て細胞を平板 培養した場合、それらは、体外培養されたガングリアに似た一層大型の凝集体を 形成した。

本発明者は、一連の実験においてリブレート＃２から採集された細胞数を記録す ることによって、多数のＮＴ２−Ｎｉ胞を生成するこの新規の方法の再現性を検 査した。ＮＴ２細胞２ｘｌＯ６個を播種したＴ７５培養フラスコで開始する多数 の実験（ｎ＝９）に対して、１ｘｌＯ−５Ｍ　ＲＡて４週間処理した後、リブレ ート＃１およびリブレート＃２を行ない、そして本発明者は、平均４８．９ｘｌ Ｏ６個（ｓ、ｅ、　ｍ、３．　３ｘｌＯ’　、ｎ　＝９）の細胞を回収した。Ｎ Ｔ２−Ｎ細胞数を推定するのに利用可能な技術の限界にもかかわらず、本発明者 の定量的データは、リブレート＃２の後に回収された細胞の約２０％かＮＴ２− Ｎ細胞であったことを示している。したかつて、Ｔ７５当りの東向収量は細胞層 １−　Ｏｘ１０６個であった。これまでのところ、この培養法は１週間間隔でほ ぼ２年間再現されてきた。

ＮＴ２−Ｎ細胞か細胞分裂することかできなかったことを実証するために、ＮＴ ２−ＮＷ胞および未分化ＮＴ２細胞双方の培養物をプロモデオキシウリンン（Ｂ ｒＤＵ）と−緒にインキュベートし、そしてＤＮＡ中に取込まれたＢｒＤＵに対 するｍＡｂを用いる間接免疫蛍光法によって、標識された核を可視化した。未分 化細胞からの５０％を越える核か、ＢｒＤＵ標識の３時間後にｍＡｂによって免 疫染色された（図３Ａ／）。対照的に、純粋なリブレート＃２培養物中には標識 されたＮ　Ｔ　２、−　Ｎ核か存在しなかったしく図３Ｂ）、２０時間の暴露後 にも標識されなかった。史に、ＮＴ：２−Ｎ細胞か視野の中に存在することを示 すために、同冊胞をＮ　Ｆ　−Ｌに対する抗血清で染色した（図３Ｃ）、更に、 有糸分裂阻害剤から回収後の純粋な培養物中かまたは混合培養物中のＮＴ２−Ｎ 細胞の可視検査ては、ニューロン細胞数の増加は全く検出されなかった。実際に 、本発明者は、ＮＴ２−Ｎ細胞の単−塊を３か月間にわたって追跡（７たか、全 培養期間中、培地中に有糸分裂阻害剤か不存在であり且つ１０％ウシ胎児血清か 存在したにもかかわらす、細胞数の増加は検出されなかった。総合すると、これ らのデータは、ＮＴ２−Ｎ細胞か有余分裂後であることを強く示唆している。

従来の研究により、ＮＴ２−Ｎ細胞の通塔の培養物（即ち、リブレート＃１由来 の培養物−図１を参照されたい）か全細胞集団の少量成分から成ることか予想さ れたくアントルーズ、１９８４年、リ−およびアントルーズ、１９８６年）。

従来、これらの細胞は、Ａ２Ｂ’、にニューロンおよび若干のダリア細胞に特有 の細胞表面糖脂質を認識するｍＡｂ）によって認識された抗原であるニューロフ ィラメントタンパク質を発現しくアントルーズ、１９８４年、リーおよびアント ルーズ、１９８６年）Ｆｌつテトロトトキンン感受性Ｎａ”チャンネルを有する ことか知られていた（レット（Ｒｅｎｄ　ｔ）　呟１９８９年）。本発明者は、 インヒポおよびイノヒドロでのニューロンの典型的ないくつかのマーカーの発現 を検査するように設計された実験においてＮＴ２−Ｎ細胞の純粋な培養物を用い て多数のこれらの知見を確証し且つ拡大した（表１）。周知の二、−ロフイラメ ントトリブレントタンパク質（表１１図３０、・１Δおよび図５）に加えて、Ｎ Ｔ２−Ｎ細胞は、ニューロン中間体フィラメント系列の２種類のより最近記載さ れたメンバーであるＮＦ−６６（α−インターネキンンとしても知られている１ 図４Ｂ）を発現したか、ベリフェリン（ｐｅｒｉｐｂｅｒｉｎ）　（表１）を発 現しなかった。したかつて、ＮＴ２−Ｎ細胞は、ＮＦ−６６かＣＮＳにおいての み豊富であるのてＣＮＳニューロンに似ていてよいし、そしてベリフェリンは実 質的に全部のＰＮＳニューロンにおいて見出される。ＮＴ２−Ｎ細胞は、更に、 いくつかのニューロン微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）、即ち、ＭＡＰＩＡ、Ｍ ＡＰＩＢＳＭＡＰ２およびｔａｕを発現した（表１１図４Ｃ，ＤおよびＦ）。更 に、ニューロン膜または膜関連抗原はＮＴ２−Ｎ細胞によって発現された。これ らとしては、Ａ２Ｂ５によってｇ１識された抗原（図４Ｅ）、ＮＣＡＭにニュー ロンおよびニューロン新生物によってしばしば発現されるもう一つの細胞表面分 子）およびＧＡＰ４３　（成長コーン中で濃縮された成長関連タンパク質）があ った。本発明者は、更に、ＮＴ２−Ｎ細胞が、ニューロンおよび神経内分泌細胞 の典型的な分泌活性のマーカーを発現したことを発見した（例えば、シナブトフ ィシン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）および知モグラニン（ｃｈｒｏｍｏｇｒ ａｎｉｎ）　；表■）。シナブトフィシンは、古典的神経伝達物質を貯蔵し且つ 放出する小型の透明なノナブス小胞のマーカーであり、そしてクロモグラニンは 、神経ペプチドおよびカテコールアミン生合成に関与する更に大型の濃密−中空 の小胞に関するマーカーである。

表１は、その第一列に示したタンパク質に特異的な多数の抗体を用いてＮ７２− Ｎ細胞を検査した場合に得られた結果を示す。記号（＋）は、ＮＴ２−Ｎ細胞中 の放出タンパク質を抗体が染色しおよび／またはプロットしたことを示す。記号 （−）は、適切な抗体がＮＴ２−Ｎ細胞を染色しないことを示す。

表■ ＮＴ２ユゴリ旺Ｄ（Ｄ三ニューロン　現型のマーカータンパク質　抗体　結果　 参考文献または抗体源ＮＦ−Ｌ　ウサギ抗ＮＦ−Ｌ　＋　トロヤノウスキ（Ｔｒ ｏ　ｊａｎｏｗｓｋ　ｉ）呟 Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏ１．１３５ ７４７〜７５８　（１９８９） 、７：３４７４〜３４８８ ヒメンチン　ウサギ抗ビメン　＋＊　プレシャー（Ｐｌｅａｓｕｒｅ）チン　ら 、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、。

１０・２４２８〜２４３７ ベリフェリン　ウサギ抗ペリフ　バリセフ（ｐａｒｙｓｅｋ）ら、ニリン　−Ｊ 、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、ｇ：５５〜６３　（１９８８） ＧＦＡＰ　２．２Ｂ１０　−　クーら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、。

４２．２５〜３２　（１９８４） ケラチン８　Ｃａｍ５゜２　−　ヘクトン・ディキンマンおよび１８　（Ｂｅｃ ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ） ＭＡＰＩＡ　ＨＭＩ　＋　ツーバー（Ｈｕｂｅｒ）およびマドウス（Ｍａｔｕｓ ）、丈。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ−，４：１５１ 〜１６０　（１９８４） ＭＡＰＩＢ　ＩＷＭ３Ｇ５　＋　Ｌ、バインダー（Ｂｉｎｄｅｒ）、未公開 ＭＡＰ２　ＡＰ１４　＋　ガイサート（Ｇｅｉｓｅｒｔ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 　１．Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８７：３９６ ７〜３９７１　（１９９０） ２０９〜２１．５（１９８９） シナブトフィ　５Ｙ−３８＋　ヘーリンガー・マンハイムノン　（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） クロモグラニン　ＬＫＨＩＩＯ＋　ヘーリノヵー・マンハイムＧＡＰ−４３９− ＩＥＩＯ＋　−ｆスリン（Ｇｏｓｌｉｎ）ら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、１０ ５８８〜６０２　（１９９０） カングリオノ／１１？［３５＋　デュホア（Ｄｕｂｏｉｓ）呟Ｆ’ＧＴ３　、Ｊ 、Ｂ　ｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、、。

２６５　：　２７９７〜２８０３ Ｎ−ＣＡＭ　ＥＲＩＣ−１＋　パテル（Ｐａｔｅｌ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏ ｃ。

Ｐ　Ｓ　Ａ−Ｍ　ｅ　ｎ　Ｂ　＋　テオトーシスＮＣＡＭ　（Ｔｈｅｏｄｏｓ　 ｉ　ｓ）呟Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、（１９９１） Ｌ　１　モルモント抗　＋　り一呟Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、。

（ＮＩＬＥ）　ＮＩＬＥ　６：２７７３〜２７８６＊ウサギ抗ヒメンチンはＮＴ ２−Ｎ細胞抽出物のウェスタンプロットで陽性であるか、間接免疫蛍光法によっ てこれらの細胞を染色しない。この抗血清は池の細胞（未分化ＮＴ２細胞を含む ）中のヒメンチンを染色することができないので、ヒメンチンを有する同一フィ ラメント中に集合した多量のＮＦタンパク質がＮＴ２−Ｎ細胞中のヒメンチンの 反応性を隠していると考えられる。

免疫化学的研究を行って、上述のいくつかのマーカーの発現を確認しく図５）、 更には、生化学実験にＮＴ２−Ｎ細胞を用いる可能性を実証した。ＮＴ２−Ｎ細 胞骨格抽出物のケルレプリカを用いて、本発明者は、ＭＡＰＩＢ、ＭＡＰ２、ｔ ａｕ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−ＭおよびＮＦ−６６がこれらの細胞中に実際に存在した ことを確認した。クーマン−ブルー（Ｃｏｏｓ＋ａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色さ れたゲルは、図５のイムノプロット（ｉ＋ｎ＋ａｕｎｏｂｌｏｔ）と共に、ＮＴ ２−Ｎ細胞中のＭＡＰ２がウシＭＡＰ２の２種類のイソ型の下方と一緒に同時移 行することを示している。タンパク質分解に対するその感受性ゆえに、ＭＡＰ２ がヒト組織から生化学的に同定されたことはなかった。それにもかかわらず、本 発明者は、ＮＴ２−Ｎ細胞がらのＭＡＰ２が、低リン酸化状態のＭＡＰ２である ＭＡＰ２ｂであるらしいと考えており、それは、発生の際に優勢であり且つウシ ＭＡＰ２標品中の２種類のＭＡＰ２ポリペプチドの更に迅速な移動に対応してい る。図５は、更に、ＮＴ２−Ｎ細胞中で見出されたｔａｕが、ｔａｕの成体型よ りもむしろ胎児型に対応することを示している。胎児ｔａｕは、胚期間中に優勢 である分化によってスプライスされた形のｔａｕ　ｍＲＮＡから翻訳されている 。ＭＡＰＩＢ　（ＭＡＰ５としても知られている）は胚ＭＡＰでもあり、成体中 にてはあるが大きく減少した濃度で持続している。ＮＴ２−Ｎ細胞は、低濃度の ＭＡＰＩＡおよびＮＦ−Ｈを発現しく表■）、これら２種類のタンパク質は発生 の際のそれらの発現においてアップレギュレートされるが、ヒトの神経系を含む 成体神経系におけるそれらの最高濃度を達成するにすぎない。この知見は、３種 類の胚ＭＡＰｓおよびＮＦ−６６の発現と共に、ＮＴ２−Ｎ細胞の細胞骨格が胚 ＣＮＳニューロンのそれと似ていることを示唆する。

ニューロンの大部分の識別しつるおよび高度に分化した特徴の一つとしてそれら の高度に分極した表現型がある。ニューロンは、典型的に、単一の軸索および多 数の樹状突起を有し、それらの形態学、それらが含む細胞小器官およびいくつか の示差的に分布した分子マーカーによって区別することができる。例えば、細胞 本体および樹状突起（体−樹状突起トメイン）はリポソームを有する（したがっ て、ＲＮＡを含む）が、軸索（軸索ドメイン）にはリポソームが存在しない。更 に、樹状突起中の微小管は両方向に配向されているか、軸索中のこれらは禾梢部 に配向（７たそれらの（＋）末端を有する。最後に、軸索は高すン酸化ＮＦタン パク質およびｔａｕに富むが、細胞本体および樹状突起は主として低リン酸化種 のＮＦタンパク質を有する。これらの相違はいずれも、主としてノナジス後突起 としての樹状突起および突出するシナプス前突起としての軸索の独特の機能の原 因となっていると考えられる。

培養中の３〜４週間後のＮＴ２−Ｎ細胞の高度に分極した形態学ゆえに、本発明 者は、ＮＴ２−Ｎ細胞の突起か軸索および樹状突起に分化することかできるかど うかを検査することにした。実際に、本発明者か同焦点顕微鏡検査を用いてＮＴ ２−Ｎ細胞中のＮＦ−Ｍのポスホーイソ型の分布を検査した場合、本発明者は、 高リン酸化ＮＦ−ＭはＮＴ２−Ｎ細胞から出た長く細い突起中に優先的に見出さ れるか、低リン酸化ＮＦ−Ｍは細胞本体および短い先細の突起中に見出されるこ とを全県した（図６Ａおよび６Ｂ）。更に、ＭＡＰ２はＮＴ２−Ｎ細胞の細胞体 および短突起中に独占的に局在している（図６Ｃ）。これらのタンパク質の非重 複分布は、図６の計算機で作成した重層擬色映像を用いると極めて明瞭に見える 。

細胞の体−樹状突起トメインは、低リン酸化ＮＦ−Ｍ　（ＲＭｄ０２０−図６Ａ および６Ｂ）およびＭＡＰ２　（ＡＰ１４−図６Ｃ）に対するｍＡｂで（赤色に ）染色されたか、高リン酸化Ｎ１−Ｍに特異的なｍＡｂであるＨＯ１４ては（緑 色に）染色されなかった。逆に、図６に示された視野を通過する軸索はｌ−１０ １４によってのみ染色された。

ＮＴ２−Ｎ細胞か機能性樹状突起を有するかとうかを決定するために、樹状突起 の更に直接的な機能特性を検査をした。前述のように、樹状突起は、タンパク質 合成の変化によるシナプスシグナルに対してそれらか速やかに応答できるように リポソームを蓄積する。これは、培養中のニューロンの樹状突起を標識するのに ３１１−ウリシンを用いることを可能にする。この技法を用いてＮＴ２−Ｎ細胞 を標識し、そしてエマルションオートランオグラフィー後に、樹状突起に似た突 起は実際に銀粒子によって暗く標識されるか、長い突出した先細でない突起は標 識されないまま残ることが分かった（図７）。これは、ＮＴ２−Ｎ細胞か実際に いくつかの基準によって決定されるような識別しうる樹状突起および軸索を有す ることを実証する。一つの興味深い点は、ＮＴ２−Ｎ細胞中の細胞本体、樹状突 起および軸索のいたるところにｔａｕが局在していることである（図４Ｆ）。こ れは、培養中の交感神経および大脳ニューロンにおける知見とは異なるが、海馬 ニューロンにおいて観察されたことと全く同様である。したかって、培養中のあ る種のニューロン（おそらく、ｔａｕが軸索に限定されているところにおいての み）の軸索伸長にｔａｕか不可欠であることは明らかであるが、軸索におけるｔ ａｕの機能的役割を決定するには更に別の実験が不可欠である。ＮＴ：２−Ｎ細 胞および海馬ニューロンのこの特性は、成体ｔａｕよりもむしろ胎児ｔａｕの発 現に関係しているかもしれない。

ＮＴ２−Ｎ細胞は未熟ＣＮＳニューロンのモデルでありうるので、それらの適応 性を評価する実験を実施した。ＮＴ２−Ｎ細胞の純粋培養物（リブレート＃２後 １〜３週間増殖させた細胞）を酵素によって分離し且つリブレート（リプレー１ −＃３）した場合、それらは神経突起を速やかに再伸長した。これらの突起は、 神経突起の緻密な網状構造かりプレート後１週間で形成されるまで伸長し続けた （図８Ａ）。神経突起の急速な生成および突起の網状構造の最終的な形成は、用 いられた生存基盤に大きく依存していることが分かった。例えば、急速な成長は ポリーＤ−リジンおよびラミニンまたはマトリゲル基質上の細胞増殖で生じたが 、ポリーＤ−リンンのみては生じなかった。図８Ｂは、ポリーＤ−リノンのみて 増殖した細胞塊を図示する。７日後でも、これらの細胞は、先端が偏平な広い成 長コーンになっている極めて短い突起を有していた。２０時間目に、マトリゲル 上のＮＴ２−Ｎ細胞はそれらの突起を伸長し始めた（図８Ｃ）。ＮＴ２−Ｎ細胞 における神経突起再成長に対するマトリケル（またはラミニン）およびポリーＤ −リノンのこれらの示差的作用は、培養中の種々のＰＮＳおよびＣＮＳニューロ ン細胞に対するラミニンの周知の神経突起成長促進作用と一致する。多数のリブ レート後の神経突起を再生するＮＴ２−Ｎ細胞の能力は、それらが未熟ニューロ ンの適応性を保持することを示す。更に、リブレート＃３は、より純粋な培養物 の利用可能性に応した将来の実験の追及を可能にするＮＴ２−Ｎ細胞の一層純粋 な培養物を得る手段を我々に与える。

下層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）に加えて、非ニューロン細胞は神経突起成長促進 においである役割を果たしており、これはリブレート＃３培養物において最も明 らかである。本発明者は、ポリーＤ−リノンのみてリブレートされたＮＴ２−Ｎ 細胞が、これらの培存物中で見出される極めて希な非ニューロン細胞の回りに密 集したことおよびＮＴ２−Ｎ細胞塊からの多数の神経突起か非ニューロン細胞の 方へまっすくに伸長したことを観察した。この現象の劇的な例を図８Ｄに示し、 そこにおいていくつかの突起は、非ニューロン細胞に向かって成長するように劇 的に方向を変えたように９える。図８Ｄの細胞を繰り返し観察することにより、 神経突起は非ニューロン細胞の死滅後に完全に収縮したことか分かった。この結 果は、残留する非ニューロン細胞か、ＮＴ２−Ｎ細胞に関して化学属性である拡 散性物質を放出しうろことを暗示する。同様に、非ニューロン細胞の存在は、純 粋なＮＴ２−Ｎ細胞培養物（８〜１０週間）と比較して延長された非ニューロン 細胞単層上のＮＴ２−Ｎの生育可能性（最大５か月間まで）を説明することがで きる。総合すると、これらの実験は、ＮＴＩ−Ｎ細胞の生存および神経突起伸長 双方を促進する場合の非ニューロン細胞の役割を示唆する。

遺伝子転移実験のためのＮＴ２．−Ｎ細胞の有用性を評価するために、本発明者 は、未分化ＮＴ２細胞を、β−ガラクトンダーゼ（β−ｇａ　ｌ）発現プラスミ ドである５ＰＵＤＩによって安定してトランスフェクトした。これらの実験は、 ＮＴ２−Ｎ細胞かＲＡによる分化後に外因性タンパク質生成物を発現し続けるが どうかを決定するように設計された。５ＰＵＤ１が（選択しうるマーカーとして 用いられる）ｐＳＶ２ｎｅｏｃ！ニー緒に未分イヒＮＴ２細胞中に同時トランス フェクトされた場合、本発明者は、組織化学的染色によって検定されるβ−ｇａ ｌを発現したＧ４１．８ｉｉ４性細胞集団を誘導した（図９Ａ）。図１に記載し たのと同様のプロトコル後に、ＲＡてこれらのＮＴ２−３ＰＵＤ細胞を刺激する ことにより、本発明−Ｗｉ１、β−ｇａｌ陽性Ｎ　Ｔ　２−Ｎ細胞の純粋培養物 を誘導することができた（図９８ｊｊよびＣ）。β　ｇａｌタンパク質の存在を 示す青色反応生成物は細胞体に集中しており、若干のＮＴ２−Ｎ細胞の突起には 単に伸長されただけてあまた（図９Ｂの矢印を参詔されたい）。β−ｇａ１反応 生成物は、細胞本体のいたるところで粒状凝集体に集中して見えた（図９Ｂ）。

この知見は、ＮＴ２−Ｎ細胞か、ＮＴ２細胞中に導入された外因性遺伝子産物を 発現し続けることを示唆する。

本発明者は、ＮＴＩ−Ｎ細胞か理想的なニューロン細胞系の探求基準に極めて近 いことを示した。本発明者のＮＴ２−Ｎ細胞についての観察およびそれらの培養 物用に開発された新規の方法は、ＲＡ処理後に速やかに分裂するＮＴ２奇形癌細 胞から有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養物を生成することか可能であること を明らかにした。これらの非分裂性ＮＴ２−Ｎ細胞は安定なニューロン表現型を 有し、そしてそれらは、血清中にあるもの以外の何等かの外因性分化促進または 同性因子の連続的存在を伴うことなく培養中に８〜１０週間生存しうる。実際に 、本発明の方法を用いて、本発明者は１週間間隔てほぼ２年間−貫してＮＴ２− Ｎ細胞を製造しており、十分な数のこれらの細胞が生化学実験用に容易に生成さ れた。更に、有余分裂後ニューロン様ＮＴ２−Ｎ細胞か、未分化ＮＴ２細胞中に トランスフェクトされたプラスミドによってコートされたタンパク質を発現し続 けることも極めて重要である。この特徴の組合せは独特であり、それは、完全に 分化したニューロン表現型を有する培養されたヒト細胞か、時限の神経突起成長 、神経突起両極性の基準および発展、細胞骨格成熟並びにニューロン適応性を含 む神経生理学における基本的な問題の研究用に始めて多量に利用可能であるこＮ Ｔ２細胞は、ＲＡか何等かの他の４因的影響を必要きすることなく幹細胞を前駆 ニューロンに分化させることかできる機序を研究するための重要なシステムであ る。レチノイド（特に、ＲＡ）は、胚形成の際に奇形発生作用を有することか知 られており、神経堤およびＣＮＳ欠損をもたらす。更に、ＲＡおよびおそらくは 他のレチノイドは、神経系以外の発生において重要なインヒポの生理学的役割を 何するということか最近明らかになった。ニコーロン発生の際のレチノイド作用 の研究は、実験用の発育する神経システムか比較的利用しにくいことによって妨 ケラれてきた。ＮＴ２細胞は、レチノイドの細胞性作用並びにそれらの神経の誘 導および分化における役割を研究するために利用可能なインビトロシステムを提 供する。

ＮＴ２−Ｎ細胞は、本発明者が検査した重要なニューロンマーカーを全て発現し た。更に、それらは、それらがＣＮＳ　（ＰＮＳではない）ニューロンであるこ とを示す具体的な特徴を有する（すなわち、それらは６６ｋＤ　ＮＦタンパク質 を発現するが、ベリフェリンを発現しない１表１］）。培養中の初代ニューロン と同様に、ＮＴ２−Ｎ細胞は、成熟型のＭＡＰおよびＮＦタンパク質によって支 配された細胞骨格を有するか（例えば、それらは主として胎児ｔａｕＳＭＡＰＩ ｂ、ＭＡＰ２ｂを発現する）、それらは一層低量のＭＡＰ　ｌａおよびＮＦ−Ｈ を合成し且つ維持する。ＮＴ２−Ｎ細胞によって考えられる安定なニューロン表 現型と、トランスフェクトされた遺伝子の産物を発現するようにそれらを遺伝子 工学的に処理することかできるという事実とか与えられることにより、これらの 細胞は、ヒトニューロンにおける細胞生物学およびニューロンタンパク質の機能 を検査するのに極めて有用である。リプレーティング後の迅速な神経突起再生（ 図８を参照されたい）および十分に特性決定された細胞接着分子の発現（表１を 参照されたい）は、神経突起成長を調節する因子を研究するのにＮＴ２−Ｎ細胞 を用いることを可能にする。ＮＴ２−Ｎ細胞は血清の存在下でも分裂しないし、 しかもそれらは高度に精製されたヒトニューロン培養物の再現可能な源であるの で、それらは、宿主環境中に取込まれるそれらの能力を決定するためのヌードマ ウスおよび他の哺乳動物への移植実験に有用な細胞でありうる。実際に、引続き 安定な有糸分裂後ニューロンに分化するＮＴ２細胞中への向性因子または他のタ ンパク質のトランスフェクションは、ヒト神経変性疾患における生物活性分子の ための新規の供給システムとして有用でありうる。

本発明は、有糸分裂後ヒトニューロンの純粋な培養物を製造する方法であって、 未分化ヒト奇形癌細胞をレチノイン酸と一緒に培養して多層培養物を得：該培養 細胞を分散させ、そして該分散細胞を有糸分裂阻害剤または有糸分裂阻害剤組合 せと一緒に培養することを含む上記方法を提供する。本発明は、更に、上記方法 の未分化細胞かＮＴｅｒａ２／Ｄｉ細胞を含むことを考慮する。更に、本発明は 、有糸分裂阻害剤組合せがシトシンアラビノラド、フルオロデオキシウリジンお よびウリジンを含んでいるこの方法を含む。更に、上記方法の分散細胞はマトリ ゲル上で培養することかできる。

本発明は、更に、外因性遺伝子産物を発現する有糸分裂後ヒトニューロンの安定 な集団を製造する方法であって、１種類またはそれ以上のプラスミド（選択しう るマーカーを含む）を培養された未分化ヒト奇形癌細胞中にトランスフェクトし 、該未分化ヒト奇形癌細胞をレチノイン酸と一緒に培養して多層培養物を得；該 培養細胞を分散させ、そして該分散細胞を有糸分裂阻害剤または有糸分裂阻害剤 組合せと一緒に培養することを含む上記方法を提供する。単一の選択された発現 ヘクターを、安定な有余分裂後細胞集団においてトランスフェクトし且つ発現さ せることかできるということが考えられる。更に、２種類以上の選択された発現 ヘクターを、安定な有余分裂後細胞集団においてトランスフェクトし且つ発現さ せることかできるということが考えられる。更に、選択された発現プラスミドは β−ガラクトシダーセ発現プラスミドを含むということか考えられる。本発明は 、このトランスフェクション法の未分化細胞がＮＴｅｒａ２／Ｄｉ細胞を含むこ とを考慮する。更に、本発明により、このトランスフェクション法の有糸分裂阻 害剤の組合せがシトンンアラビノシド、フルオロデオキシウリジンおよびウリジ ンを含むことを提供する。更に、このトランスフェクション法の分散細胞はマト リケル上で培養することかできる。

本発明は、更に、上記に記載した方法にしたがって製造された安定な有糸分裂後 ヒトニューロン細胞であって、制限されないが、実質的に全部が少なくとも１種 類のトランスフェクトされた外因性遺伝子を含む安定な有糸分裂後ヒトニューロ ン細胞またはトランスフェクトされていない安定な有糸分裂後ヒトニューロン細 胞を含む上記細胞を提供する。

本発明を、いずれにせよ制限するためのものではない以下の実施例によって更に 例証する。

火施例 大施例↓ ＮＴ２細胞を、前に記載されたように（アントルーズ、１９８４年）１０％０％ ラン血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ　ＨＧ中で維持 した。分化に関して、細胞２ｘｌＯ’個を７５ｃｍ２フラスコ中１こ播種し且つ １ｘ１０−２Ｍ　ＲＡ　（ＤＭＳＯ中に溶解した１ｘｌＯ−２Ｍ原液を毎月新し く調製した）で１週間に２回４週間処理した。ＲＡ処理後、細胞を１６１こりプ レートシた（リブレート＃１３図１を参照されたい）。２日後に、細胞を機械約 ６こ除去し、すなわち、培養フラスコをとちらの側にも１０回打ちつけ、浮遊し た細胞を培地５ｍｌで洗浄し且つ製造者の指示にしたがって（マトリケルに用０ られた希釈度はロフトごとに多少異なった）１：２０（カノ−−スリ・ンプ用） または１６０（ＩＴＩＩ用）に希釈したマトリゲル（コラホレーテイブ・リサー チ（Ｃｏｉｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ））上で再度リブレートし た（リブレート４２１図１を参照されたい）。細胞を、細胞密度０．２ｘｌＯ’ 個／１２ｍｍカバースリンブまたは７．５ｘｌＯ’個／１００ｍｍ皿で、１ＭＭ ントンンアラビノノト、１０ＭＭフルオロデオキシウリジンおよび１０ＭＭウリ ジンを補足した１０％血清およびペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ 　ＨＧ中に播種した。ントシンアラヒノンドは培養の最初の１週間継続し、フル オロデオキシウリジンおよびウリジンは最初の４週間継続した。神経突起再生実 験に関して、３退会培養物を００２５％シスパーセまたは０．０２５％トリプシ ン（こよって酵素的に取出し且つマトリケル、ポリーＤ−リッツ（１０Ｍｇ／ｍ ｌ）まｔこζよ、ポリーＤ−リノ＞　（１０ｕ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）およびラミ ニン（１０Ｍｇ／ｍｌ）上でＩノブレートした（リブレート４３９図１を参照さ れたい）。マトリケル（よ、コラーゲン、ラミニンおよびニドジエン（ｎｉｄｏ ｇｅｎ）を含む基底膜抽出物である（クラインマン（Ｋ　ｌ　ｅ　ｉ　ｎｍａｎ ）呟１９８６年）。図１に概説され且つここで詳細に記載のこの方法を、同様の 結果を有する３種類の異なるＮＴｅｒａ２サブクローン（ＮＴ２／Ｄｉ、ＮＴ２ １０３およびＮＴ２／Ｂ９）ｌこ適用しｊこ。

ここで示した結果はいずれもＮＴ／Ｄ１から得た。実験の途中で、ＮＴ２細胞番 よ５％ウン胎県血清（ＦＢＳ）含有Ｏｐ　ｔ　ｉ　−ＭＥＭ　Ｃギｌコ（ＧＩ　 ＢＣＯ））を好むことか観察され、そして次に、未分化ＮＴ２細胞の維持用にこ の培地を用いた。

未分化ＮＴ２細胞および分化したＮＴ２−Ｎ細胞を有糸分裂阻害剤不含で４日間 増殖させた後、ＢｒＤＵ３ｍｇ／ｍｌで３時間（または若干の場合最大２０時間 まで）標識した。次に、細胞を洗浄し、固定し、そして以下に記載したように、 変性することなくＤＮＡに取込まれたＢｒＤＵを認識するｍａｂであるＢＵ−１ を用いて間接免疫蛍光法のための処理をした。

細胞をハンクスの（［１ａｎｋ’ｓ）緩衝塩類溶液で洗浄し且つ０．１５Ｍ　Ｎ ａＣ１含有７０％エタノールを用いて室温で１０分間固定した。細胞を一次抗体 と一緒に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで１時間に４回洗浄し、二次抗 体（ローダミンに結合したロバ抗マウスＩｇＧ、フルオレセインに結合した口ｌ へ抗ラットおよびフルオレセインに結合したロノー抗ウサギ、ンヤクソン・イム ノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））と−緒に１時 間インキュベートし、そして最後に、アクアマウント（Ａｑｕａｍｏυｎｔ）（ レーナー・ラブズ（Ｌｅｒｎｅｒ　Ｌａｂｓ））中に固定する前に、ＰＢＳ中に おいて１時間に４回洗浄した。同焦点顕微鏡検査に関して、その手順は、テキサ ス・レッド結合二次抗体をローダミンの代わりに用い且つカバースリップを５％ ＤＡＢＣＯを用いて固定して漂白を防止したことを除き、本質的に同様であった 。カッ１−スリ７プを、バイオ・ラド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ）ＭＲＣ−６００レ 一サー走査同焦点顕微鏡上においてクリプトンレーザーを用いて検査した。

ＰＡＰ免疫細胞化学を実施して、間接免疫蛍光法と比較した場合のこの技術の大 きな感受性によって低濃度の胎児ｔａｕを可視化した。カバースリップを上記の ように固定し、そして２％仔ウシ血清およびｏ、２５％冷水魚セラチン含有の０ 、ＩＭＩ−リス　ｐＨ７，０で３０分間ブロックした。この後、カバースリップ を、本発明者の実験室においてＰＡＰ免疫細胞化学に関して前に記載したように 処理した（カーテシ（Ｃａｒｄｅｎ）ら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｌ、、７　：　３ ４８９〜３５０４　（１９８７））。

大施珂５ 免凝化字 ＭＡＰに富む細胞骨格試料を、０．５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＜　、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、 ２ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＧＴＰ、２０μＭ　タキソール（Ｔａｘｏｌ）、１％ トリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒヒターの反応 混液を含むＯ，ＩＭ　ＭＥＳ　ｐＨ６，８を用いて細胞を室温で１５分間抽出す ることによって調製した。ペレットを、ＴＬ１００超遠心機において３０．００ Ｏｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収し、染料不含の試料緩衝液中に可溶 化し、そして試料のタンパク質濃度をクーマノ−ブルー染料結合検定（ピアス（ Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて決定した。これらの試料を５Ｄｓ−ＰＡＧＥゲル上に 流した後、本発明者の実験室において前に記載された方法（クーら、１９８７年 ）を用いて抗体でプローブするためにニトロセルロース膜に対してエレクトロプ ロットした。

実施撚旦 ＮＴ２−Ｎ栂胞ｐ二１し／υしベイ儂禅６０ｍｍ皿のＮＴ２−Ｎ細胞を［５，６ −’Ｈ］ウリ／ン（１，７０ＴＢＱ／ミリモル）５０μＣｉと一緒に１６〜２４ 時間インキュベートした。次に、これらの皿を１０μＭ非標識ウリジン含有ＰＢ Ｓて洗浄し且っブヮンの（Ｂｏｕｉｎ’　ｓ）固定液で固定した。次に、水で１ １に希釈したＮＴＢ−２エマル／ヨンで皿を被覆し、−晩中乾燥させ、そして４ ℃で４日間貯蔵した。皿をコダック（Ｋｏｄａｋ）Ｄｌ、９中で１分間現像し且 つコダソク・ラピツド・フィツス（Ｒａｐｉｄ−Ｆｉｘ）で定着させた。

実施珂ユ にｊラー久上ングニセのトライ人工と久＞ｇン耘側び朶暗未分化ＮＴ２細胞に、 リボフエクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ヘセスダ・リサーチ・ラホラトリー ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用 いるリポフエクションによって５ＰＵＤＩを１００μｇおよびｐｓＶ２ｎｅｏを １０μｇトランスフェクトした。完全培地中において２日後に、Ｇ４１８（ギブ コ）２００μｇ／ｍｌを７日間用いてトランスフェクタントを選択した。リン酸 緩衝溶液ｐＨ７，４中の２％パラホルムアルデヒド、０゜２％グルタルアルデヒ ド中での固定後に、ＰＢＳ中においてＸ−ｇａｌを１ｍｇ／ｍｌ、５ｍＭフエロ ンアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウム、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２を用い て細胞をβ−ガラクトシダーセ活性に関して染色した。β−ｇａ　ｌ陽性培養物 を２回サブクローン化し、そのサブクローンを更に別の実験に用いた。５ＰＵＤ Ｉ　（Ｃ，セブコ（Ｃｅｐｋｏ）博士によって快く提供された）は、ＳＶ４０プ ロモーターを用い且つモロネーネズミ白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉ ｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）長末端反復を上流および下流に有するβ −ガラクトシダーセ発現ベクターである。ホフマンモシュレーンヨンコントラス トを用いて細胞の写真を撮り、青色反応生成物および突起の同時可視化を可能に した。

＋２　３４５６　７８９１０１１１２１３ＦＩＧ、　６Ａ　ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ、　７Ａ　ＦＩＧ、　７Ｂ ＦＩＧ、　９Ａ　ＦＩＧ、　９Ｂ フロントページの続き （７２）発明者　プレジャー、サミュエルアメリカ合衆国ペンシルバニア州１９ １０４゜フィラデルフィア、セント・マークス・スフウェア　２１１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．有糸分裂後ヒトニューロンの純粋な培養物を製造する方法であって、未分化 ヒト奇形癌細胞をレチノイン酸と一構に培養して多層培養物を得：該培養細胞を 分散させ； 該分散細胞を単一の有糸分裂阻害剤または複数の有糸分裂阻害剤の組合せと一緒 に培養することを含む上記方法。
2. ２．前記未分化細胞がＮＴｅｒａ２／Ｄ１細胞を含む請求項１に記載の方法。
3. ３．前記複数の有糸分裂阻害剤の組合せがシトシンアラビノシド、フルオロデオ キシウリジンおよびウリジンを含む請求項１に記載の方法。
4. ４．前記分散細胞をマトリゲル上で培養する請求項１に記載の方法。
5. ５．外因性遺伝子産物を発現する有糸分裂後ヒトニューロンの安定な集団を製造 する方法であって、 選択しうるマーカーを含む少なくとも１種類のプラスミドを培養された未分化ヒ ト奇形癌細胞中にトランスフェクトし：該未分化ヒト奇形癌細胞をレチノイン酸 と一緒に培養して多層培養物を得；該培養細胞を分散させ；そして 該分散細胞を単一の有糸分裂阻害剤または複数の有糸分裂阻害剤の組合せと一緒 に培養することを含む上記方法。
6. ６．前記未分化細胞がＮＴｅｒａ２／Ｄ１細胞を含む請求項５に記載の方法。
7. ７．前記複数の有糸分裂阻害剤の組合せがシトシンアラビノシド、フルオロデオ キシウリジンおよびウリシンを含む請求項５に記載の方法。
8. ８．前記分散細胞をマトリゲル上で培養する請求項５に記載の方法。
9. ９．請求項１に記載の方法にしたがって製造された安定な有糸分裂後ヒトニュー ロン細胞。
10. １０．請求項５に記載の方法にしたがって製造された安定な有糸分裂後ヒトニュ ーロン細胞。
11. １１．前記プラスミドがβ−ガラクトシクーゼ発現プラスミドを含む請求項５に 記載の方法。
12. １２．請求項１１に記載の方法にしたがって製造された安定な有糸分裂後ヒトニ ューロン細胞。
13. １３．実質的に全部が少なくとも１種類のトランスフェクトされた外因性遺伝子 を含む安定な有糸分裂後ヒトニューロン細胞。