JP3169611B2 - 有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養物の製造 - Google Patents
有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養物の製造Info
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Description
【発明の詳細な説明】 序論 本発明は、NIH認可番号NS18616によって提供された研
究中に得られた。本発明の当然の権利は政府にある。
究中に得られた。本発明の当然の権利は政府にある。
背景 成熟哺乳動物ニューロンは細胞分裂することができな
いし、しかも、嗅覚ニューロンを除いては、成体神経系
の幹細胞から発生することは有り得ない。したがって、
ニューロン特性を有する連続的に分裂するクローン細胞
系は、神経生理学者が神経系のほとんど全ての態様を研
究するのに極めて有用であることが分かった。このよう
な細胞系は、多数の同種細胞の発生および遺伝子転移に
よるこれらの細胞の操作によって、異種遺伝子産物を発
現する新規の誘導体の生成を可能にする。これらの利点
は種々のニューロン細胞系の開発および特性決定をもた
らし、そのいくつかは細胞生物学、生化学および分子生
物学の研究に有用であった。これらの異なる細胞系の有
用性およびニューロン発現型の外観に近づくそれらの能
力は広範に変化する。しかしながら、過去十年間にわた
って行なわれた研究は、細胞系の有用さが、主として二
つの特性、すなわち、（１）特定の細胞系が有糸分裂後
ニューロンに似ている程度；および（２）倍加時間に依
ることを示した。しばしば、これら二つの重要な特性は
逆の関係にある。ニューロンの多数の分化した性質は、
幹細胞が有糸分裂後になるまではインビボにおいて完全
に明確になっているとは言えない。しかしながら、速や
かに分裂するニューロン細胞系は、通常、最終的に分化
した非分裂性ニューロンの表現型性質を持たない代わり
に、それらは、しばしばインビボにおいて神経芽細胞ま
たは胚ニューロンに似ている。例えば、多数のこれらの
細胞系は未熟細胞骨格と一緒に未熟神経突起（neurit
e）を生成するが、有糸分裂後ニューロンの形態学およ
び神経突起の分化がほとんど存在しない。それにもかか
わらず、それらは速やかに分裂するので、これらの細胞
系は生化学およびトランスフェクション実験に有用であ
る。中枢（CNS）および末梢（PNS）神経系の多数のニュ
ーロン細胞種の天然に存在する新生物形成誘導体は、通
常、この範疇（例えば、神経芽細胞腫、クロム親和性細
胞腫および髄芽細胞腫）に入る。もう一方の種類とし
て、HCN1で例示された細胞系がある（ロネット（Ronnet
t）ら、1990,Science,248:603〜605）。これらの細胞は
分化したニューロンの多数の特性を有するが、それらは
ゆっくりと分裂するので（すなわち、未分化の場合、倍
加時間72時間）、それらは多数の実験操作で扱いにく
い。ニューロン細胞系の古典的な例であるPC12細胞でさ
えも、NGFの除去によって、それらのより少ないニュー
ロンの速やかに分裂する表現型に逆戻りする（グリーン
（Greene）およびティシュラー（Tischler）、1982,Adv
ances in Cellular Neurobiology,S.フェデロフ（Fe
deroff）およびL.ハーツ（Hertz）監修、アカデミック
・プレス（Academic Press），ニューヨーク）。
いし、しかも、嗅覚ニューロンを除いては、成体神経系
の幹細胞から発生することは有り得ない。したがって、
ニューロン特性を有する連続的に分裂するクローン細胞
系は、神経生理学者が神経系のほとんど全ての態様を研
究するのに極めて有用であることが分かった。このよう
な細胞系は、多数の同種細胞の発生および遺伝子転移に
よるこれらの細胞の操作によって、異種遺伝子産物を発
現する新規の誘導体の生成を可能にする。これらの利点
は種々のニューロン細胞系の開発および特性決定をもた
らし、そのいくつかは細胞生物学、生化学および分子生
物学の研究に有用であった。これらの異なる細胞系の有
用性およびニューロン発現型の外観に近づくそれらの能
力は広範に変化する。しかしながら、過去十年間にわた
って行なわれた研究は、細胞系の有用さが、主として二
つの特性、すなわち、（１）特定の細胞系が有糸分裂後
ニューロンに似ている程度；および（２）倍加時間に依
ることを示した。しばしば、これら二つの重要な特性は
逆の関係にある。ニューロンの多数の分化した性質は、
幹細胞が有糸分裂後になるまではインビボにおいて完全
に明確になっているとは言えない。しかしながら、速や
かに分裂するニューロン細胞系は、通常、最終的に分化
した非分裂性ニューロンの表現型性質を持たない代わり
に、それらは、しばしばインビボにおいて神経芽細胞ま
たは胚ニューロンに似ている。例えば、多数のこれらの
細胞系は未熟細胞骨格と一緒に未熟神経突起（neurit
e）を生成するが、有糸分裂後ニューロンの形態学およ
び神経突起の分化がほとんど存在しない。それにもかか
わらず、それらは速やかに分裂するので、これらの細胞
系は生化学およびトランスフェクション実験に有用であ
る。中枢（CNS）および末梢（PNS）神経系の多数のニュ
ーロン細胞種の天然に存在する新生物形成誘導体は、通
常、この範疇（例えば、神経芽細胞腫、クロム親和性細
胞腫および髄芽細胞腫）に入る。もう一方の種類とし
て、HCN1で例示された細胞系がある（ロネット（Ronnet
t）ら、1990,Science,248:603〜605）。これらの細胞は
分化したニューロンの多数の特性を有するが、それらは
ゆっくりと分裂するので（すなわち、未分化の場合、倍
加時間72時間）、それらは多数の実験操作で扱いにく
い。ニューロン細胞系の古典的な例であるPC12細胞でさ
えも、NGFの除去によって、それらのより少ないニュー
ロンの速やかに分裂する表現型に逆戻りする（グリーン
（Greene）およびティシュラー（Tischler）、1982,Adv
ances in Cellular Neurobiology,S.フェデロフ（Fe
deroff）およびL.ハーツ（Hertz）監修、アカデミック
・プレス（Academic Press），ニューヨーク）。
近年、開発中に一時的に見出される特定のニューロン
前駆体を不死化するために多大な努力が成された（最近
の評論に関しては、セプコ（Cepko）、Ann.Rev.Neuro.,
12:47〜65,1989;またはレンダール（Lendahl）およびマ
ッケイ（McKay）、TINS,13:132〜137,1990を参照された
い；そして具体的な例に関しては、バートレット（Bart
lett）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3255〜3259,198
8;フレデリクセン（Fredericksen）ら、Neuron,1:439〜
448,1998;ビレン（Birren）ら、Neuron,4:189〜201（19
90）；ハマング（Hammang）ら、Neuron,4:775〜782,199
0;ライダー（Ryder）ら、J.Neurobiol.,21:356〜375,19
90;ロ（Lo）ら、Dev.Biol.,145:139〜153,1991を参照さ
れたい）。このアプローチは、これらの細胞系が、発生
の特定段階での具体的な細胞種の特性に近いと考えられ
るので特に有効である。既に、重要な発生機能を助ける
ことができる新規の分子は、これらの新規の細胞系を用
いて単離された（ジョンソン（Johnson）ら、Nature,34
6:858〜861,1990;レンダールら、Cell,60:585〜595,199
0）。しかしながら、MAH細胞を例外として（ビレンら、
Neuron,4:189〜201（1990）、この方法を用いて生成さ
れた細胞系の更にニューロン分化する能力には限界があ
る。むしろ、それらは、ニューロン系統の発生において
特定の分岐点を調べるのに一層有用であると考えられ
る。
前駆体を不死化するために多大な努力が成された（最近
の評論に関しては、セプコ（Cepko）、Ann.Rev.Neuro.,
12:47〜65,1989;またはレンダール（Lendahl）およびマ
ッケイ（McKay）、TINS,13:132〜137,1990を参照された
い；そして具体的な例に関しては、バートレット（Bart
lett）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:3255〜3259,198
8;フレデリクセン（Fredericksen）ら、Neuron,1:439〜
448,1998;ビレン（Birren）ら、Neuron,4:189〜201（19
90）；ハマング（Hammang）ら、Neuron,4:775〜782,199
0;ライダー（Ryder）ら、J.Neurobiol.,21:356〜375,19
90;ロ（Lo）ら、Dev.Biol.,145:139〜153,1991を参照さ
れたい）。このアプローチは、これらの細胞系が、発生
の特定段階での具体的な細胞種の特性に近いと考えられ
るので特に有効である。既に、重要な発生機能を助ける
ことができる新規の分子は、これらの新規の細胞系を用
いて単離された（ジョンソン（Johnson）ら、Nature,34
6:858〜861,1990;レンダールら、Cell,60:585〜595,199
0）。しかしながら、MAH細胞を例外として（ビレンら、
Neuron,4:189〜201（1990）、この方法を用いて生成さ
れた細胞系の更にニューロン分化する能力には限界があ
る。むしろ、それらは、ニューロン系統の発生において
特定の分岐点を調べるのに一層有用であると考えられ
る。
ニューロン表現型の決定に影響を与えるニューロン成
熟の過程および固有因子分析にの理想的な細胞系は、速
やかに分裂する結果として多量に増殖し且つ外因性遺伝
子産物を発現する安定な細胞集団を生じるようにトラン
スフェクトすることができるものであると考えられる。
分化を促進する物質による誘導の際に、この理想的な細
胞系は細胞周期を離れ、ニューロン表現型に対して不可
逆的に委ねられ、そして安定な有糸分裂後状態で存在す
る。次に、これらの細胞は広範な神経突起を生成し且つ
培養中の主要なニューロンと同様の状態まで成熟すると
考えられる。
熟の過程および固有因子分析にの理想的な細胞系は、速
やかに分裂する結果として多量に増殖し且つ外因性遺伝
子産物を発現する安定な細胞集団を生じるようにトラン
スフェクトすることができるものであると考えられる。
分化を促進する物質による誘導の際に、この理想的な細
胞系は細胞周期を離れ、ニューロン表現型に対して不可
逆的に委ねられ、そして安定な有糸分裂後状態で存在す
る。次に、これらの細胞は広範な神経突起を生成し且つ
培養中の主要なニューロンと同様の状態まで成熟すると
考えられる。
胚癌細胞系は上記基準のいくつかを満足させる。ネズ
ミおよびヒト双方の胚腫瘍に由来したこれらの細胞は、
ある種の条件下（通常、レチノイン酸（retinoicacid）
［RA］による処理を含む）におかれた場合に１種類また
はいくつかの細胞種に分化する未分化多能性細胞からな
る。この過程は、インビボにおいて見出される種々の表
現型に対して実際に委ねられることに似ている。これら
の細胞種としては、しばしば、分化の様々な段階でのニ
ューロン、グリア、筋および／または内皮細胞がある。
したがって、神経生理学者にとってのそれらの有用性
は、それらの異質性によって制限される。ヒト奇形癌細
胞系であるNTera2/D1（NT2）は、それらがRAに応答して
表現型を変化することができるという点で、そのネズミ
対応物と共通の特性を有する。しかしながら、大部分の
ネズミ胚癌細胞系とは異なり、NT2細胞をRA処理した後
に見出される唯一の識別しうる表現型はニューロンであ
る（アンドルーズ（Andrews）ら、Dev.Biol.,103:285〜
293（1984）；アンドルーズら、Lab.Invest.,50:147〜1
62（1984）；リー（Lee）およびアンドルーズ、J.Neuro
sci.,6:514〜521（1986））。残念ながら、従来の研究
のいずれにおいても、これらのニューロンは一部分の細
胞であるにすぎないし、そしてそれらは分裂性大型偏平
細胞の大型の未同定集団および残数の未分化幹細胞と共
存していた（アンドルーズ、1984）。
ミおよびヒト双方の胚腫瘍に由来したこれらの細胞は、
ある種の条件下（通常、レチノイン酸（retinoicacid）
［RA］による処理を含む）におかれた場合に１種類また
はいくつかの細胞種に分化する未分化多能性細胞からな
る。この過程は、インビボにおいて見出される種々の表
現型に対して実際に委ねられることに似ている。これら
の細胞種としては、しばしば、分化の様々な段階でのニ
ューロン、グリア、筋および／または内皮細胞がある。
したがって、神経生理学者にとってのそれらの有用性
は、それらの異質性によって制限される。ヒト奇形癌細
胞系であるNTera2/D1（NT2）は、それらがRAに応答して
表現型を変化することができるという点で、そのネズミ
対応物と共通の特性を有する。しかしながら、大部分の
ネズミ胚癌細胞系とは異なり、NT2細胞をRA処理した後
に見出される唯一の識別しうる表現型はニューロンであ
る（アンドルーズ（Andrews）ら、Dev.Biol.,103:285〜
293（1984）；アンドルーズら、Lab.Invest.,50:147〜1
62（1984）；リー（Lee）およびアンドルーズ、J.Neuro
sci.,6:514〜521（1986））。残念ながら、従来の研究
のいずれにおいても、これらのニューロンは一部分の細
胞であるにすぎないし、そしてそれらは分裂性大型偏平
細胞の大型の未同定集団および残数の未分化幹細胞と共
存していた（アンドルーズ、1984）。
発明の概要 レチノイン酸による処理および１次培養技術（組織培
養プラスチックに対する分別付着および有糸分裂阻害剤
による処理を含む）を用いて、高度に精製されたニュー
ロン集団をヒト奇形癌細胞系から得る。この培養法は、
高度に分化した有糸分裂後細胞を生成することができ
る。未分化細胞をβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）発
現プラスミドでトランスフェクトした場合、β−gal発
現は、未分化細胞および有糸分裂後細胞双方において存
在することが分かった。したがって、未分化細胞中への
発現プラスミドのトランスフェクションは、外因性遺伝
子産物の細胞中への導入を許し、次に、その細胞が安定
な有糸分裂後ヒトニューロンになるように誘導すること
ができる。
養プラスチックに対する分別付着および有糸分裂阻害剤
による処理を含む）を用いて、高度に精製されたニュー
ロン集団をヒト奇形癌細胞系から得る。この培養法は、
高度に分化した有糸分裂後細胞を生成することができ
る。未分化細胞をβ−ガラクトシダーゼ（β−gal）発
現プラスミドでトランスフェクトした場合、β−gal発
現は、未分化細胞および有糸分裂後細胞双方において存
在することが分かった。したがって、未分化細胞中への
発現プラスミドのトランスフェクションは、外因性遺伝
子産物の細胞中への導入を許し、次に、その細胞が安定
な有糸分裂後ヒトニューロンになるように誘導すること
ができる。
図面の説明 図１は、RA処理されたNT2細胞からNT2−Ｎ細胞の純粋
培養物を生成する方法の略図である。
培養物を生成する方法の略図である。
図2A〜Ｆは、図１に示した方法の途中で起こる形態学
的変化を示す位相差光学顕微鏡写真である。Ａ、未処理
NT2細胞;B、リプレート（Replate）＃１後のNT2細胞
（下方の付着細胞上にある塊の丸い相明細胞に注目され
たい）;C、リプレート＃２後１日（多数の細胞が多数の
ヒト神経芽細胞腫細胞系と同様の痕跡突起を生成し始め
たことに注目されたい）;D、リプレート＃２後７日（非
ニューロン細胞は死滅し始め、ここで培養物はニューロ
ン様NT2−Ｎ細胞によって支配される）;E、リプレート
＃２後30日（大部分の細胞がニューロンの形態学を示し
且つ大型の凝集体に移行したこと並びに広範な突起成長
が生じたことに注目されたい）;F、これらの細胞の典型
的なニューロン形態学を示すNT2−Ｎ細胞の高倍率光学
顕微鏡写真。矢印は、図2Fでの細胞から出ている軸索に
似た長く細い先細でない突起を示している。くさび型
は、樹状突起に似た２本の主な突起を示している。Ｅに
おける棒線はＡ〜Ｅに対して適用され且つ200μｍであ
り、そしてＦにおける棒線は30μｍである。
的変化を示す位相差光学顕微鏡写真である。Ａ、未処理
NT2細胞;B、リプレート（Replate）＃１後のNT2細胞
（下方の付着細胞上にある塊の丸い相明細胞に注目され
たい）;C、リプレート＃２後１日（多数の細胞が多数の
ヒト神経芽細胞腫細胞系と同様の痕跡突起を生成し始め
たことに注目されたい）;D、リプレート＃２後７日（非
ニューロン細胞は死滅し始め、ここで培養物はニューロ
ン様NT2−Ｎ細胞によって支配される）;E、リプレート
＃２後30日（大部分の細胞がニューロンの形態学を示し
且つ大型の凝集体に移行したこと並びに広範な突起成長
が生じたことに注目されたい）;F、これらの細胞の典型
的なニューロン形態学を示すNT2−Ｎ細胞の高倍率光学
顕微鏡写真。矢印は、図2Fでの細胞から出ている軸索に
似た長く細い先細でない突起を示している。くさび型
は、樹状突起に似た２本の主な突起を示している。Ｅに
おける棒線はＡ〜Ｅに対して適用され且つ200μｍであ
り、そしてＦにおける棒線は30μｍである。
図3A〜Ｃは、NT2およびNT2−Ｎ細胞のBrDU標識の結果
を示す。Ａ、BrDUで標識され且つBU−１で染色された未
分化NT2細胞。Ｂ、BrDUで標識され且つBU−１で染色さ
れたNT2−Ｎ細胞。Ｃ、抗NF−Ｌ抗血清で標識されたＢ
と同一の視野。Ｃにおける棒線は200μｍである。
を示す。Ａ、BrDUで標識され且つBU−１で染色された未
分化NT2細胞。Ｂ、BrDUで標識され且つBU−１で染色さ
れたNT2−Ｎ細胞。Ｃ、抗NF−Ｌ抗血清で標識されたＢ
と同一の視野。Ｃにおける棒線は200μｍである。
図4A〜Ｆは、NT2−Ｎ細胞におけるニューロンマーカ
ーの発現を実証する免疫細胞化学的結果を示す。Ａおよ
びＢ、マウス抗NF−MmAbであるRMO254と、NF−66に対し
て生じたウサギ抗血清である抗NF−66とによる二重標
識;C、1WM3G5、マウス抗MAP1b mAb;D、AP14、マウス抗
MAP2 mAb;E、A2B5、多数のニューロン上で見出された
ガングリオシドに特異的なマウスmAb;F、T14、マウス抗
tau mAb。Ｆにおける棒線は30μｍである。
ーの発現を実証する免疫細胞化学的結果を示す。Ａおよ
びＢ、マウス抗NF−MmAbであるRMO254と、NF−66に対し
て生じたウサギ抗血清である抗NF−66とによる二重標
識;C、1WM3G5、マウス抗MAP1b mAb;D、AP14、マウス抗
MAP2 mAb;E、A2B5、多数のニューロン上で見出された
ガングリオシドに特異的なマウスmAb;F、T14、マウス抗
tau mAb。Ｆにおける棒線は30μｍである。
図５は、NT2−Ｎ細胞における細胞骨格マーカーの発
現のイムノブロット分析の結果を示す。列１〜６は６％
SDS−PAGEゲルにより、列７〜13は10％SDS−PAGEゲルに
よる。１、抗MAP1b mAbである1WM 3G5でブロットした
NT2−Ｎ細胞からの細胞骨格抽出物20μｇおよび２、ウ
シMAPs。３、抗MAP2 mAbであるAP14でブロットした細
胞骨格抽出物20μｇおよび４、ウシMAP2。５、抗NF−Ｍ
mAbであるRMO254でブロットした細胞骨格抽出物10μ
ｍおよび６、ヒト神経根IF標品。７、ヒトNF−Ｌに対し
て生じた抗血清である抗NF−Ｌでブロットした細胞骨格
抽出物20μｇおよび８、ヒト神経根中間体フィラメント
標品。９、ラットNF−66に対して生じた抗血清である抗
NF−66でブロットした細胞骨格抽出物20μｇおよび10、
ウシNF−66。11、抗tau mAbであるT14でブロットした
精製成人tau;12、精製ヒト胎児tauおよび13、細胞骨格
抽出物60μｇ。MWマーカーは指示されたようにkDであ
る。
現のイムノブロット分析の結果を示す。列１〜６は６％
SDS−PAGEゲルにより、列７〜13は10％SDS−PAGEゲルに
よる。１、抗MAP1b mAbである1WM 3G5でブロットした
NT2−Ｎ細胞からの細胞骨格抽出物20μｇおよび２、ウ
シMAPs。３、抗MAP2 mAbであるAP14でブロットした細
胞骨格抽出物20μｇおよび４、ウシMAP2。５、抗NF−Ｍ
mAbであるRMO254でブロットした細胞骨格抽出物10μ
ｍおよび６、ヒト神経根IF標品。７、ヒトNF−Ｌに対し
て生じた抗血清である抗NF−Ｌでブロットした細胞骨格
抽出物20μｇおよび８、ヒト神経根中間体フィラメント
標品。９、ラットNF−66に対して生じた抗血清である抗
NF−66でブロットした細胞骨格抽出物20μｇおよび10、
ウシNF−66。11、抗tau mAbであるT14でブロットした
精製成人tau;12、精製ヒト胎児tauおよび13、細胞骨格
抽出物60μｇ。MWマーカーは指示されたようにkDであ
る。
図6:軸索および樹状突起に関するマーカーで染色され
たNT2−Ｎ細胞の同焦点顕微鏡検査。ＡおよびＢは、HO1
4（緑色）およびRMdO20（赤色）で染色された顕微鏡視
野を示す。HO14は、高リン酸化状態のNF−Ｍに特異的な
ラットmAbであり、RMdO20は、低リン酸化状態のNF−Ｍ
に特異的なマウスmAbである。Ｃは、HO14と、MAP2に特
異的なマウスmAbであるAP14とで染色された細胞の高倍
率視野を示す。これらの像は、各チャンネルの個別のデ
ータを集めた後、それらを一緒にし、そして計算機で作
成された擬色をそれらに与えることによって作成され
た。Ｃにおける棒線は、Ｃに対して適用された場合25μ
ｍであり、ＡおよびＢに対して適用された場合50μｍで
ある。
たNT2−Ｎ細胞の同焦点顕微鏡検査。ＡおよびＢは、HO1
4（緑色）およびRMdO20（赤色）で染色された顕微鏡視
野を示す。HO14は、高リン酸化状態のNF−Ｍに特異的な
ラットmAbであり、RMdO20は、低リン酸化状態のNF−Ｍ
に特異的なマウスmAbである。Ｃは、HO14と、MAP2に特
異的なマウスmAbであるAP14とで染色された細胞の高倍
率視野を示す。これらの像は、各チャンネルの個別のデ
ータを集めた後、それらを一緒にし、そして計算機で作
成された擬色をそれらに与えることによって作成され
た。Ｃにおける棒線は、Ｃに対して適用された場合25μ
ｍであり、ＡおよびＢに対して適用された場合50μｍで
ある。
図7:リプレート＃２の５週間後のNT2−Ｎ細胞培養物
の3H−ウリジン標識。Ａ（低倍率）およびＢ（高倍率）
は、ホフマン・モデュレーション・コントラスト（Hoff
man Modulation Contrast）光学を用いて作成されたN
T2−Ｎ細胞の光学顕微鏡写真である。標識された細胞お
よび突起は、NTB−２エマルジョンオートラジオグラフ
ィーによる銀色粒子のために暗灰色または黒色に見え
る。Ａは、標識された細胞本体および樹状突起（くさび
形）を含む細胞の視野を示し、多数の未標識軸索突起
（若干の例を矢印で示す）が該視野および培養皿上の他
の所の細胞塊から出ている。Ｂは、若干の細胞の高倍率
写真を示す。これらの細胞の一つからの樹状突起をくさ
び形を用いて示した。Ａにおける棒線は、Ａに適用され
た場合50μｍであり、Ｂに適用された場合100μｍであ
る。
の3H−ウリジン標識。Ａ（低倍率）およびＢ（高倍率）
は、ホフマン・モデュレーション・コントラスト（Hoff
man Modulation Contrast）光学を用いて作成されたN
T2−Ｎ細胞の光学顕微鏡写真である。標識された細胞お
よび突起は、NTB−２エマルジョンオートラジオグラフ
ィーによる銀色粒子のために暗灰色または黒色に見え
る。Ａは、標識された細胞本体および樹状突起（くさび
形）を含む細胞の視野を示し、多数の未標識軸索突起
（若干の例を矢印で示す）が該視野および培養皿上の他
の所の細胞塊から出ている。Ｂは、若干の細胞の高倍率
写真を示す。これらの細胞の一つからの樹状突起をくさ
び形を用いて示した。Ａにおける棒線は、Ａに適用され
た場合50μｍであり、Ｂに適用された場合100μｍであ
る。
図8A〜Ｄは、リプレート＃３後の神経突起再生を示す
写真である。Ａ、マトリゲル（Matrigel）上でリプレー
ト＃３後１週間増殖させたNT2−Ｎ細胞。Ｂ、ポリ−Ｄ
−リシン上でリプレート＃３後１週間増殖させたNT2−
Ｎ細胞。図6Dの矢印は偏平な非ニューロン細胞を示す。
Ｄにおける棒線はＡ、ＢおよびＤに関し且つ200μｍで
ある。Ｃにおける棒線は30μｍである。
写真である。Ａ、マトリゲル（Matrigel）上でリプレー
ト＃３後１週間増殖させたNT2−Ｎ細胞。Ｂ、ポリ−Ｄ
−リシン上でリプレート＃３後１週間増殖させたNT2−
Ｎ細胞。図6Dの矢印は偏平な非ニューロン細胞を示す。
Ｄにおける棒線はＡ、ＢおよびＤに関し且つ200μｍで
ある。Ｃにおける棒線は30μｍである。
図9A〜Ｃは、ホフマンモジュレーションコトンラスト
顕微鏡検査を用いるＸ−gal組織化学によって可視化さ
れたNT2−SPUD細胞のβ−gal発現を示す写真である。
Ａ、RA処理前のNT2−SPUD細胞。ＢおよびＣ、リプレー
ト＃２後のNT2−SPUD細胞。Ｃにおける棒線は、Ａおよ
びＣに適用された場合100μｍであり、そしてＢに適用
された場合50μｍである。
顕微鏡検査を用いるＸ−gal組織化学によって可視化さ
れたNT2−SPUD細胞のβ−gal発現を示す写真である。
Ａ、RA処理前のNT2−SPUD細胞。ＢおよびＣ、リプレー
ト＃２後のNT2−SPUD細胞。Ｃにおける棒線は、Ａおよ
びＣに適用された場合100μｍであり、そしてＢに適用
された場合50μｍである。
発明の説明 ヒト奇形癌細胞系（NTera2/Cl.D1またはNT2細胞）
を、レチノイン酸（RA）による処理後に操作して、95％
を越えて純粋なニューロン細胞（NT2−Ｎ細胞）培養物
を生成した。
を、レチノイン酸（RA）による処理後に操作して、95％
を越えて純粋なニューロン細胞（NT2−Ｎ細胞）培養物
を生成した。
これらの安定な有糸分裂後細胞の高度に精製された培
養物の生成を図１において模式図によって概説する。未
分化NT2細胞を最初に平板培養した場合、それらは粒状
外観を有する相暗細胞（phase dark cells）として見え
た（図2A）。RA処理の４週間後に、細胞は極度に密集し
た多層培養物を形成した。次に、これらの培養物を分散
させ且つより低密度でリプレートして、細胞の数の層の
中央に埋没していたNT2−Ｎ細胞を解放した。この処理
の後、NT2−Ｎ細胞は偏平細胞層上に小型の相明細胞と
して見えた（リプレート＃1;図2B）。RA処理後のこの時
点まで（すなわち、リプレート＃１）のNT2細胞の誘
導、分化パラダイムおよび初期の形態学的外観を予め詳
細に検査した（アンドルーズら、1984年；アンドルー
ズ、1984年）、リプレート＃１後の細胞の約５％は、ニ
ューロン特異的マーカーの存在によって判定されるニュ
ーロンである。これらのニューロンを更に増加させるた
めに、本発明者は、小型の相明NT2−Ｎ細胞がリプレー
ト＃１培養後の偏平細胞層にゆるく付着していて、機械
的に除去し且つ増加させることができるという利点を用
いた。この処理（リプレート＃２）は、主として小型の
丸い相明細胞から成る培養物を生じ、そのいくつかはヒ
ト神経芽細胞腫細胞系を連想させる短い突起を有してい
た（図2C）。この工程は、ニューロン特異的酵素の測定
によって検定したところ、ニューロン細胞を約４倍増加
させた。これらの培養物は、更に、未検査で増殖させた
場合に小型の相明細胞（phase bright cells）を上部に
有する単層を徐々に形成した未分化NT2細胞に似た若干
の偏平細胞を含んだ。リプレート＃２後、相明NT2−Ｎ
細胞は２週間以内に多数の突起を生長させ且つ大型の細
胞凝集体を形成し、そしてニューロン特異的マーカーの
継続的存在によって決定したところ、いずれの表現型復
帰も全く示すことなく最大５か月間まで生育可能であっ
た。しかしながら、これらの培養物は、偏平細胞を有す
る汚染単層の存在ゆえに、リプレート＃１由来の混合培
養物にまさる有意の改良ではなかった。これらの分裂性
偏平細胞を排除するために、リプレート＃２の後に培養
物オン複数の有糸分裂阻害剤の組合せで処理した。この
処理はNT2−Ｎ細胞に対して作用しなかったが、それは
偏平細胞の増殖を完全に抑制した。したがって、ほぼ全
部の偏平細胞は排除され、広範な細胞質を有する極めて
少数の有糸分裂に関して有害な細胞が後に残った。２週
間の処理で、約95％の細胞が分化したニューロン、すな
わち、NT2−Ｎ細胞であった。本発明者は、位相差顕微
鏡検査によって概略的に得られたこの観察を、未分化NT
2細胞に対して（ケラチン８および18と反応するCam5.
2）かまたはNT2−Ｎ細胞に対して（低分子量ニューロフ
ィラメントタンパク質と排他的に反応するウサギ抗NF−
Ｌ）特異的な単クローン性抗体（mAb）を用いる二重染
色細胞培養物によって確認した。これらの実験は、NFP
−抗血清で染色された多数のNT2−Ｎ細胞および、極め
て希にのみ、Cam5.2で染色された広範な細胞質を有する
偏平細胞を示した。これらの細胞に対してポリ−Ｄ−リ
シンまたはポリ−Ｄ−リシンおよびラミニン（lamini
n）よりも優れた基質として役立ったマトリゲル上で培
養した場合、これらのほぼ純粋なNT2−Ｎ細胞培養物は
約10週間生育可能であった。
養物の生成を図１において模式図によって概説する。未
分化NT2細胞を最初に平板培養した場合、それらは粒状
外観を有する相暗細胞（phase dark cells）として見え
た（図2A）。RA処理の４週間後に、細胞は極度に密集し
た多層培養物を形成した。次に、これらの培養物を分散
させ且つより低密度でリプレートして、細胞の数の層の
中央に埋没していたNT2−Ｎ細胞を解放した。この処理
の後、NT2−Ｎ細胞は偏平細胞層上に小型の相明細胞と
して見えた（リプレート＃1;図2B）。RA処理後のこの時
点まで（すなわち、リプレート＃１）のNT2細胞の誘
導、分化パラダイムおよび初期の形態学的外観を予め詳
細に検査した（アンドルーズら、1984年；アンドルー
ズ、1984年）、リプレート＃１後の細胞の約５％は、ニ
ューロン特異的マーカーの存在によって判定されるニュ
ーロンである。これらのニューロンを更に増加させるた
めに、本発明者は、小型の相明NT2−Ｎ細胞がリプレー
ト＃１培養後の偏平細胞層にゆるく付着していて、機械
的に除去し且つ増加させることができるという利点を用
いた。この処理（リプレート＃２）は、主として小型の
丸い相明細胞から成る培養物を生じ、そのいくつかはヒ
ト神経芽細胞腫細胞系を連想させる短い突起を有してい
た（図2C）。この工程は、ニューロン特異的酵素の測定
によって検定したところ、ニューロン細胞を約４倍増加
させた。これらの培養物は、更に、未検査で増殖させた
場合に小型の相明細胞（phase bright cells）を上部に
有する単層を徐々に形成した未分化NT2細胞に似た若干
の偏平細胞を含んだ。リプレート＃２後、相明NT2−Ｎ
細胞は２週間以内に多数の突起を生長させ且つ大型の細
胞凝集体を形成し、そしてニューロン特異的マーカーの
継続的存在によって決定したところ、いずれの表現型復
帰も全く示すことなく最大５か月間まで生育可能であっ
た。しかしながら、これらの培養物は、偏平細胞を有す
る汚染単層の存在ゆえに、リプレート＃１由来の混合培
養物にまさる有意の改良ではなかった。これらの分裂性
偏平細胞を排除するために、リプレート＃２の後に培養
物オン複数の有糸分裂阻害剤の組合せで処理した。この
処理はNT2−Ｎ細胞に対して作用しなかったが、それは
偏平細胞の増殖を完全に抑制した。したがって、ほぼ全
部の偏平細胞は排除され、広範な細胞質を有する極めて
少数の有糸分裂に関して有害な細胞が後に残った。２週
間の処理で、約95％の細胞が分化したニューロン、すな
わち、NT2−Ｎ細胞であった。本発明者は、位相差顕微
鏡検査によって概略的に得られたこの観察を、未分化NT
2細胞に対して（ケラチン８および18と反応するCam5.
2）かまたはNT2−Ｎ細胞に対して（低分子量ニューロフ
ィラメントタンパク質と排他的に反応するウサギ抗NF−
Ｌ）特異的な単クローン性抗体（mAb）を用いる二重染
色細胞培養物によって確認した。これらの実験は、NFP
−抗血清で染色された多数のNT2−Ｎ細胞および、極め
て希にのみ、Cam5.2で染色された広範な細胞質を有する
偏平細胞を示した。これらの細胞に対してポリ−Ｄ−リ
シンまたはポリ−Ｄ−リシンおよびラミニン（lamini
n）よりも優れた基質として役立ったマトリゲル上で培
養した場合、これらのほぼ純粋なNT2−Ｎ細胞培養物は
約10週間生育可能であった。
位相差顕微鏡検査を用いて様々な時間にこれらの培養
物を検査した場合（図2DおよびＥ）、培養皿全体を覆う
広範な神経突起網状構造の漸進的発生が観察された。初
代ニューロトルン培養において記載した軸索突起と同様
の細く先細でない長い突起もまた明らかであった。図2F
で示されたように、これらの培養物中の単細胞は、基部
で太く且つ細胞本体から漸進的に先細りした突起を生成
した（図2Fのくさび形）。更に、細く先細でない突起は
これらの細胞から出ていた（図2Fの矢印）。これら二つ
の形態学的に異なる種類の突起は、CNSおよびPNSニュー
ロンの初代培養の樹状突起および軸索にそれぞれ似てい
た。これら２種類の突起の樹状突起および軸索としての
同一性は、それらが発現した軸索および樹状突起の分子
マーカーによって確証された（図６および７を参照され
たい。）広範な突起成長のこの期間中に、NT2−Ｎ細胞
は、神経系の様々な部分からのニューロンの初代培養物
に典型的な成長コーンを示した。純粋なNT2−Ｎ細胞の
もう一つの一貫した特徴はそれらの運動性であった。最
初に、NT2−Ｎ細胞は培養皿の全表面上に均一に分散し
ていたが（図2C）、時間が経つと、それらは互いに移動
して大型の相互に連結した軸索の束を有する細胞凝集体
を形成した（図2D）。単独かまたはラミニン含有のポリ
−Ｄ−リシン上で細胞を平板培養した場合、それらは、
対外培養されたガングリアに似た一層大型の凝集体を形
成した。
物を検査した場合（図2DおよびＥ）、培養皿全体を覆う
広範な神経突起網状構造の漸進的発生が観察された。初
代ニューロトルン培養において記載した軸索突起と同様
の細く先細でない長い突起もまた明らかであった。図2F
で示されたように、これらの培養物中の単細胞は、基部
で太く且つ細胞本体から漸進的に先細りした突起を生成
した（図2Fのくさび形）。更に、細く先細でない突起は
これらの細胞から出ていた（図2Fの矢印）。これら二つ
の形態学的に異なる種類の突起は、CNSおよびPNSニュー
ロンの初代培養の樹状突起および軸索にそれぞれ似てい
た。これら２種類の突起の樹状突起および軸索としての
同一性は、それらが発現した軸索および樹状突起の分子
マーカーによって確証された（図６および７を参照され
たい。）広範な突起成長のこの期間中に、NT2−Ｎ細胞
は、神経系の様々な部分からのニューロンの初代培養物
に典型的な成長コーンを示した。純粋なNT2−Ｎ細胞の
もう一つの一貫した特徴はそれらの運動性であった。最
初に、NT2−Ｎ細胞は培養皿の全表面上に均一に分散し
ていたが（図2C）、時間が経つと、それらは互いに移動
して大型の相互に連結した軸索の束を有する細胞凝集体
を形成した（図2D）。単独かまたはラミニン含有のポリ
−Ｄ−リシン上で細胞を平板培養した場合、それらは、
対外培養されたガングリアに似た一層大型の凝集体を形
成した。
本発明者は、一連の実験においてリプレート＃２から
採集された細胞数を記録することによって、多数のNT2
−Ｎ細胞を生成するこの新規の方法の再現性を検査し
た。NT2細胞2x106個を播種したT75培養フラスコで開始
する多数の実験（ｎ＝９）に対して、1x10-5M RAで４
週間処理した後、リプレート＃１およびリプレート＃２
を行ない、そして本発明者は、平均48.9x106個（s.e.m.
3.3x106、ｎ＝９）の細胞を回収した。NT2−Ｎ細胞数を
推定するのに利用可能な技術の限界にもかかわらず、本
発明者の定量的データは、リプレート＃２の後に回収さ
れた細胞の約20％がNT2−Ｎ細胞であったことを示して
いる。したがって、T75当りの平均収量は細胞数10x106
個であった。これまでのところ、この培養法は１週間間
隔でほぼ２年間再現されてきた。
採集された細胞数を記録することによって、多数のNT2
−Ｎ細胞を生成するこの新規の方法の再現性を検査し
た。NT2細胞2x106個を播種したT75培養フラスコで開始
する多数の実験（ｎ＝９）に対して、1x10-5M RAで４
週間処理した後、リプレート＃１およびリプレート＃２
を行ない、そして本発明者は、平均48.9x106個（s.e.m.
3.3x106、ｎ＝９）の細胞を回収した。NT2−Ｎ細胞数を
推定するのに利用可能な技術の限界にもかかわらず、本
発明者の定量的データは、リプレート＃２の後に回収さ
れた細胞の約20％がNT2−Ｎ細胞であったことを示して
いる。したがって、T75当りの平均収量は細胞数10x106
個であった。これまでのところ、この培養法は１週間間
隔でほぼ２年間再現されてきた。
NT2−Ｎ細胞が細胞分裂することができなかったこと
を実証するために、NT2−Ｎ細胞および未分化NT2細胞双
方の培養物をブロモデオキシウリジン（BrDU）と一緒に
インキュベートし、そしてDNA中に取込まれたBrDUに対
するmAbを用いる間接免疫蛍光法によって、標識された
核を可視化した。未分化細胞からの50％を越える核が、
BrDU標識の３時間後にmAbによって免疫染色された（図3
A）。対照的に、純粋なリプレート＃２培養物中には標
識されたNT2−Ｎ核が存在しなかったし（図3B）、20時
間の暴露後にも標識されなかった。更に、NT2−Ｎ細胞
が視野の中に存在することを示すために、同細胞をNF−
Ｌに対する抗血清で染色した（図3C）。更に、有糸分裂
阻害剤から回収後の純粋な培養物中かまたは混合培養物
中のNT2−Ｎ細胞の可視検査では、ニューロン細胞数の
増加は全く検出されなかった。実際に、本発明者は、NT
2−Ｎ細胞の単一塊を３か月間にわたって追跡したが、
全培養期間中、培地中に有糸分裂阻害剤が不存在であり
且つ10％ウシ胎児血清が存在したにもかかわらず、細胞
数の増加は検出されなかった。総合すると、これらのデ
ータは、NT2−Ｎ細胞が有糸分裂後であることを強く示
唆している。
を実証するために、NT2−Ｎ細胞および未分化NT2細胞双
方の培養物をブロモデオキシウリジン（BrDU）と一緒に
インキュベートし、そしてDNA中に取込まれたBrDUに対
するmAbを用いる間接免疫蛍光法によって、標識された
核を可視化した。未分化細胞からの50％を越える核が、
BrDU標識の３時間後にmAbによって免疫染色された（図3
A）。対照的に、純粋なリプレート＃２培養物中には標
識されたNT2−Ｎ核が存在しなかったし（図3B）、20時
間の暴露後にも標識されなかった。更に、NT2−Ｎ細胞
が視野の中に存在することを示すために、同細胞をNF−
Ｌに対する抗血清で染色した（図3C）。更に、有糸分裂
阻害剤から回収後の純粋な培養物中かまたは混合培養物
中のNT2−Ｎ細胞の可視検査では、ニューロン細胞数の
増加は全く検出されなかった。実際に、本発明者は、NT
2−Ｎ細胞の単一塊を３か月間にわたって追跡したが、
全培養期間中、培地中に有糸分裂阻害剤が不存在であり
且つ10％ウシ胎児血清が存在したにもかかわらず、細胞
数の増加は検出されなかった。総合すると、これらのデ
ータは、NT2−Ｎ細胞が有糸分裂後であることを強く示
唆している。
従来の研究により、NT2−Ｎ細胞の通常の培養物（即
ち、リプレート＃１由来の培養物−図１を参照された
い）が全細胞集団の少量成分から成ることが予想された
（アンドルーズ、1984年；リーおよびアンドルーズ、19
86年）。従来、これらの細胞は、A2B5（ニューロンおよ
び若干のグリア細胞に特有の細胞表面糖脂質を認識する
mAb）によって認識された抗原であるニューロフィラメ
ントタンパク質を発現し（アンドルーズ、1984年；リー
およびアンドルーズ、1986年）且つテトロドトキシン感
受性Na+チャンネルを有することが知られていた（レン
ト（Rendt）ら、1989年）。本発明者は、インビボおよ
びインビトロでのニューロンの典型的ないくつかのマー
カーの発現を検査するように設計された実験においてNT
2−Ｎ細胞の純粋な培養物を用いて多数のこれらの知見
を確証し且つ拡大した（表Ｉ）。周知のニューロフィラ
メントトリプレットタンパク質（表I;図3C、4Aおよび図
５）に加えて、NT2−Ｎ細胞は、ニューロン中間体フィ
ラメント系列の２種類のより最近記載されたメンバーで
あるNF−66（α−インターネキシンとしても知られてい
る；図4B）を発現したが、ペリフェリン（peripherin）
（表Ｉ）を発現しなかった。したがって、NT2−Ｎ細胞
は、NF−66がCNSにおいてのみ豊富であるのでCNSニュー
ロンに似ていてよいし、そしてペリフェリンは実質的に
全部のPNSニューロンにおいて見出される。NT2−Ｎ細胞
は、更に、いくつかのニューロン微小管関連タンパク質
（MAP）、即ち、MAP1A、MAP1B、MAP2およびtauを発現し
た（表I;図4C、ＤおよびＦ）。更に、ニューロン膜また
は膜関連抗原はNT2−Ｎ細胞によって発現された。これ
らとしては、A2B5によって認識された抗原（図4E）、NC
AM（ニューロンおよびニューロン新生物によってしばし
ば発現されるもう一つの細胞表面分子）およびGAP43
（成長コーン中で濃縮された成長関連タンパク質）があ
った。本発明者は、更に、NT2−Ｎ細胞が、ニューロン
および神経内分泌細胞の典型的な分泌活性のマーカーを
発現したことを発見した（例えば、シナプトフィシン
（synaptophysin）およびクロモグラニン（chromograni
n;表Ｉ）。シナプトフィシンは、古典的神経伝達物質を
貯蔵し且つ放出する小型の透明なシナプス小胞のマーカ
ーであり、そしてクロモグラニンは、神経ペプチドおよ
びカテコールアミン生合成に関与する更に大型の濃密−
中空の小胞に関するマーカーである。
ち、リプレート＃１由来の培養物−図１を参照された
い）が全細胞集団の少量成分から成ることが予想された
（アンドルーズ、1984年；リーおよびアンドルーズ、19
86年）。従来、これらの細胞は、A2B5（ニューロンおよ
び若干のグリア細胞に特有の細胞表面糖脂質を認識する
mAb）によって認識された抗原であるニューロフィラメ
ントタンパク質を発現し（アンドルーズ、1984年；リー
およびアンドルーズ、1986年）且つテトロドトキシン感
受性Na+チャンネルを有することが知られていた（レン
ト（Rendt）ら、1989年）。本発明者は、インビボおよ
びインビトロでのニューロンの典型的ないくつかのマー
カーの発現を検査するように設計された実験においてNT
2−Ｎ細胞の純粋な培養物を用いて多数のこれらの知見
を確証し且つ拡大した（表Ｉ）。周知のニューロフィラ
メントトリプレットタンパク質（表I;図3C、4Aおよび図
５）に加えて、NT2−Ｎ細胞は、ニューロン中間体フィ
ラメント系列の２種類のより最近記載されたメンバーで
あるNF−66（α−インターネキシンとしても知られてい
る；図4B）を発現したが、ペリフェリン（peripherin）
（表Ｉ）を発現しなかった。したがって、NT2−Ｎ細胞
は、NF−66がCNSにおいてのみ豊富であるのでCNSニュー
ロンに似ていてよいし、そしてペリフェリンは実質的に
全部のPNSニューロンにおいて見出される。NT2−Ｎ細胞
は、更に、いくつかのニューロン微小管関連タンパク質
（MAP）、即ち、MAP1A、MAP1B、MAP2およびtauを発現し
た（表I;図4C、ＤおよびＦ）。更に、ニューロン膜また
は膜関連抗原はNT2−Ｎ細胞によって発現された。これ
らとしては、A2B5によって認識された抗原（図4E）、NC
AM（ニューロンおよびニューロン新生物によってしばし
ば発現されるもう一つの細胞表面分子）およびGAP43
（成長コーン中で濃縮された成長関連タンパク質）があ
った。本発明者は、更に、NT2−Ｎ細胞が、ニューロン
および神経内分泌細胞の典型的な分泌活性のマーカーを
発現したことを発見した（例えば、シナプトフィシン
（synaptophysin）およびクロモグラニン（chromograni
n;表Ｉ）。シナプトフィシンは、古典的神経伝達物質を
貯蔵し且つ放出する小型の透明なシナプス小胞のマーカ
ーであり、そしてクロモグラニンは、神経ペプチドおよ
びカテコールアミン生合成に関与する更に大型の濃密−
中空の小胞に関するマーカーである。
表Ｉは、その第一列に示したタンパク質に特異的な多
数の抗体を用いてNT2−Ｎ細胞を検査した場合に得られ
た結果を示す。記号（＋）は、NT2−Ｎ細胞中の放出タ
ンパク質を抗体が染色しおよび／またはブロットしたこ
とを示す。記号（−）は、適切な抗体がNT2−Ｎ細胞を
染色しないことを示す。
数の抗体を用いてNT2−Ｎ細胞を検査した場合に得られ
た結果を示す。記号（＋）は、NT2−Ｎ細胞中の放出タ
ンパク質を抗体が染色しおよび／またはブロットしたこ
とを示す。記号（−）は、適切な抗体がNT2−Ｎ細胞を
染色しないことを示す。
免疫化学的研究を行って、上述のいくつかのマーカー
の発現を確認し（図５）、更には、生化学実験にNT2−
Ｎ細胞を用いる可能性を実証した。NT2−Ｎ細胞骨格抽
出物のゲルレプリカを用いて、本発明者は、MAP1B、MAP
2、tau、NF−Ｌ、NF−ＭおよびNF−66がこれらの細胞中
に実際に存在したことを確認した。クーマシーブルー
（Coomassie blue）染色されたゲルは、図５のイムノブ
ロット（immunoblot）と共に、NT2−Ｎ細胞中のMAP2が
ウシMAP2の２種類のイソ型の下方と一緒に同時移行する
ことを示している。タンパク質分解に対するその感受性
ゆえに、MAP2がヒト組織から生化学的に同定されたこと
はなかった。それにもかかわらず、本発明者は、NT2−
Ｎ細胞からのMAP2が、低リン酸化状態のMAP2であるMAP2
bであるらしいと考えており、それは、発生の際に優勢
であり且つウシMAP2標品中の２種類のMAP2ポリペプチド
の更に迅速な移動に対応している。図５は、更に、NT2
−Ｎ細胞中で見出されたtauが、tauの成体型よりもむし
ろ胎児型に対応することを示している。胎児tauは、胚
期間中に優勢である分化によってスプライスされた形の
tau mRNAから翻訳されている。MAP1B（MAP5としても知
られている）は胚MAPであり、成体中にではあるが大き
く減少した濃度で持続している。NT2−Ｎ細胞は、低濃
度のMAP1AおよびNF−Ｈを発現し（表Ｉ）、これら２種
類のタンパク質は発生の際のそれらの発現においてアッ
プレキュレートされるが、ヒトの神経系を含む成体神経
系におけるそれらの最高濃度を達成するにすぎない。こ
の知見は、３種類の胚MAPsおよびNF−66の発現と共に、
NT2−Ｎ細胞の細胞骨格が胚CNSニューロンのそれと似て
いることを示唆する。
の発現を確認し（図５）、更には、生化学実験にNT2−
Ｎ細胞を用いる可能性を実証した。NT2−Ｎ細胞骨格抽
出物のゲルレプリカを用いて、本発明者は、MAP1B、MAP
2、tau、NF−Ｌ、NF−ＭおよびNF−66がこれらの細胞中
に実際に存在したことを確認した。クーマシーブルー
（Coomassie blue）染色されたゲルは、図５のイムノブ
ロット（immunoblot）と共に、NT2−Ｎ細胞中のMAP2が
ウシMAP2の２種類のイソ型の下方と一緒に同時移行する
ことを示している。タンパク質分解に対するその感受性
ゆえに、MAP2がヒト組織から生化学的に同定されたこと
はなかった。それにもかかわらず、本発明者は、NT2−
Ｎ細胞からのMAP2が、低リン酸化状態のMAP2であるMAP2
bであるらしいと考えており、それは、発生の際に優勢
であり且つウシMAP2標品中の２種類のMAP2ポリペプチド
の更に迅速な移動に対応している。図５は、更に、NT2
−Ｎ細胞中で見出されたtauが、tauの成体型よりもむし
ろ胎児型に対応することを示している。胎児tauは、胚
期間中に優勢である分化によってスプライスされた形の
tau mRNAから翻訳されている。MAP1B（MAP5としても知
られている）は胚MAPであり、成体中にではあるが大き
く減少した濃度で持続している。NT2−Ｎ細胞は、低濃
度のMAP1AおよびNF−Ｈを発現し（表Ｉ）、これら２種
類のタンパク質は発生の際のそれらの発現においてアッ
プレキュレートされるが、ヒトの神経系を含む成体神経
系におけるそれらの最高濃度を達成するにすぎない。こ
の知見は、３種類の胚MAPsおよびNF−66の発現と共に、
NT2−Ｎ細胞の細胞骨格が胚CNSニューロンのそれと似て
いることを示唆する。
ニューロンの大部分の識別しうるおよび高度に分化し
た特徴の一つとしてそれらの高度に分極した表現型があ
る。ニューロンは、典型的に、単一の軸索および多数の
樹状突起を有し、それらの形態学、それらが含む細胞小
器官およびいくつかの示差的に分布した分子マーカーに
よって区別することができる。例えば、細胞本体および
樹状突起（体−樹状突起ドメイン）はリボソームを有す
る（したがって、RNAを含む）が、軸索（軸索ドメイ
ン）にはリボソームが存在しない。更に、樹状突起中の
微小管は両方向に配向されているが、軸索中のこれらは
末梢部に配向したそれらの（＋）末端を有する。最後
に、軸索は高リン酸化NFタンパク質およびtauに富む
が、細胞本体および樹状突起は主として低リン酸化種の
NFタンパク質を有する。これらの相違はいずれも、主と
してシナプス後突起としての樹状突起および突出するシ
ナプス前突起としての軸索の独特の機能の原因となって
いると考えられる。
た特徴の一つとしてそれらの高度に分極した表現型があ
る。ニューロンは、典型的に、単一の軸索および多数の
樹状突起を有し、それらの形態学、それらが含む細胞小
器官およびいくつかの示差的に分布した分子マーカーに
よって区別することができる。例えば、細胞本体および
樹状突起（体−樹状突起ドメイン）はリボソームを有す
る（したがって、RNAを含む）が、軸索（軸索ドメイ
ン）にはリボソームが存在しない。更に、樹状突起中の
微小管は両方向に配向されているが、軸索中のこれらは
末梢部に配向したそれらの（＋）末端を有する。最後
に、軸索は高リン酸化NFタンパク質およびtauに富む
が、細胞本体および樹状突起は主として低リン酸化種の
NFタンパク質を有する。これらの相違はいずれも、主と
してシナプス後突起としての樹状突起および突出するシ
ナプス前突起としての軸索の独特の機能の原因となって
いると考えられる。
培養中の３〜４週間後のNT2−Ｎ細胞の高度に分極し
た形態学ゆえに、本発明者は、NT2−Ｎ細胞の突起が軸
索および樹状突起に分化することができるかどうかを検
査することにした。実際に、本発明者が同焦点顕微鏡検
査を用いてNT2−Ｎ細胞中のNF−Ｍのホスホ−イソ型の
分布を検査した場合、本発明者は、高リン酸化NF−Ｍは
NT2−Ｎ細胞から出た長く細い突起中に優先的に見出さ
れるが、低リン酸化NF−Ｍは細胞本体および短い先細の
突起中に見出されることを発見した（図6Aおよび6B）。
更に、MAP2はNT2−Ｎ細胞の細胞体および短突起中に独
占的に局在している（図6C）。これらのタンパク質の非
重複分布は、図６の計算機で作成した重層擬色映像を用
いると極めて明瞭に見える。細胞の体−樹状突起ドメイ
ンは、低リン酸化NF−Ｍ（RMdO20−図6Aおよび6B）およ
びMAP2（AP14−図6C）に対するmAbで（赤色に）染色さ
れたが、高リン酸化NF−Ｍに特異的なmAbであるHO14で
は（緑色に）染色されなかった。逆に、図６に示された
視野を通過する軸索はHO14によってのみ染色された。
た形態学ゆえに、本発明者は、NT2−Ｎ細胞の突起が軸
索および樹状突起に分化することができるかどうかを検
査することにした。実際に、本発明者が同焦点顕微鏡検
査を用いてNT2−Ｎ細胞中のNF−Ｍのホスホ−イソ型の
分布を検査した場合、本発明者は、高リン酸化NF−Ｍは
NT2−Ｎ細胞から出た長く細い突起中に優先的に見出さ
れるが、低リン酸化NF−Ｍは細胞本体および短い先細の
突起中に見出されることを発見した（図6Aおよび6B）。
更に、MAP2はNT2−Ｎ細胞の細胞体および短突起中に独
占的に局在している（図6C）。これらのタンパク質の非
重複分布は、図６の計算機で作成した重層擬色映像を用
いると極めて明瞭に見える。細胞の体−樹状突起ドメイ
ンは、低リン酸化NF−Ｍ（RMdO20−図6Aおよび6B）およ
びMAP2（AP14−図6C）に対するmAbで（赤色に）染色さ
れたが、高リン酸化NF−Ｍに特異的なmAbであるHO14で
は（緑色に）染色されなかった。逆に、図６に示された
視野を通過する軸索はHO14によってのみ染色された。
NT2−Ｎ細胞が機能性樹状突起を有するかどうかを決
定するために、樹状突起の更に直接的な機能特性を検査
した。前述のように、樹状突起は、タンパク質合成の変
化によるシナプスシグナルに対してそれらが速やかに応
答できるようにリボソームを蓄積する。これは、培養中
のニューロンの樹状突起を標識するのに3H−ウリジンを
用いることを可能にする。この技法を用いてNT2−Ｎ細
胞を標識し、そしてエマルジョンオートラジオグラフィ
ー後に、樹状突起に似た突起は実際に銀粒子によって暗
く標識されるが、長い突出した先細でない突起は標識さ
れないまま残ることが分かった（図７）。これは、NT2
−Ｎ細胞が実際にいくつかの基準によって決定されるよ
うな識別しうる樹状突起および軸索を有することを実証
する。一つの興味深い点は、NT2−Ｎ細胞中の細胞本
体、樹状突起および軸索のいたるところにtauが局在し
ていることである（図4F）。これは、培養中の交感神経
および大脳ニューロンにおける知見とは異なるが、海馬
ニューロンにおいて観察されたことと全く同様である。
したがって、培養中のある種のニューロン（おそらく、
tauが軸索に限定されているところにおいてのみ）の軸
索伸長にtauが不可欠であることは明らかであるが、軸
索におけるtauの機能的役割を決定するには更に別の実
験が不可欠である。NT2−Ｎ細胞および海馬ニューロン
のこの特性は、成体tauよりもむしろ胎児tauの発現に関
係しているかもしれない。
定するために、樹状突起の更に直接的な機能特性を検査
した。前述のように、樹状突起は、タンパク質合成の変
化によるシナプスシグナルに対してそれらが速やかに応
答できるようにリボソームを蓄積する。これは、培養中
のニューロンの樹状突起を標識するのに3H−ウリジンを
用いることを可能にする。この技法を用いてNT2−Ｎ細
胞を標識し、そしてエマルジョンオートラジオグラフィ
ー後に、樹状突起に似た突起は実際に銀粒子によって暗
く標識されるが、長い突出した先細でない突起は標識さ
れないまま残ることが分かった（図７）。これは、NT2
−Ｎ細胞が実際にいくつかの基準によって決定されるよ
うな識別しうる樹状突起および軸索を有することを実証
する。一つの興味深い点は、NT2−Ｎ細胞中の細胞本
体、樹状突起および軸索のいたるところにtauが局在し
ていることである（図4F）。これは、培養中の交感神経
および大脳ニューロンにおける知見とは異なるが、海馬
ニューロンにおいて観察されたことと全く同様である。
したがって、培養中のある種のニューロン（おそらく、
tauが軸索に限定されているところにおいてのみ）の軸
索伸長にtauが不可欠であることは明らかであるが、軸
索におけるtauの機能的役割を決定するには更に別の実
験が不可欠である。NT2−Ｎ細胞および海馬ニューロン
のこの特性は、成体tauよりもむしろ胎児tauの発現に関
係しているかもしれない。
NT2−Ｎ細胞は未熟CNSニューロンのモデルでありうる
ので、それらの適応性を評価する実験を実施した。NT2
−Ｎ細胞の純粋培養物（リプレート＃２後１〜３週間増
殖させた細胞）を酵素によって分離し且つリプレート
（リプレート＃３）した場合、それらは神経突起を速や
かに再伸長した。これらの突起は、神経突起の緻密な網
状構造がリプレート後１週間で形成されるまで伸長し続
けた（図8A）。神経突起の急速な生成および突起の網状
構造の最終的な形成は、用いられた生存基盤に大きく依
存していることが分かった。例えば、急速な成長はポリ
−Ｄ−リシンおよびラミニンまたはマトリゲル基質上の
細胞増殖で生じたが、ポリ−Ｄ−リシンのみでは生じな
かった。図8Bは、ポリ−Ｄ−リシンのみで増殖した細胞
塊を図示する。７日後でも、これらの細胞は、先端が偏
平な広い成長コーンになっている極めて短い突起を有し
ていた。20時間目に、マトリゲル上のNT2−Ｎ細胞はそ
れらの突起を伸長し始めた（図8C）。NT2−Ｎ細胞にお
ける神経突起再成長に対するマトリゲル（またはラミニ
ン）およびポリ−Ｄ−リシンのこれらの示差的作用は、
培養中の種々のPNSおよびCNSニューロン細胞に対するラ
ミニンの周知の神経突起成長促進作用と一致する。多数
のリプレート後の神経突起を再生するNT2−Ｎ細胞の能
力は、それらが未熟ニューロンの適応性を保持すること
を示す。更に、リプレート＃３は、より純粋な培養物の
利用可能性に応じた将来の実験の追求を可能にするNT2
−Ｎ細胞の一層純粋な培養物を得る手段を我々に与え
る。
ので、それらの適応性を評価する実験を実施した。NT2
−Ｎ細胞の純粋培養物（リプレート＃２後１〜３週間増
殖させた細胞）を酵素によって分離し且つリプレート
（リプレート＃３）した場合、それらは神経突起を速や
かに再伸長した。これらの突起は、神経突起の緻密な網
状構造がリプレート後１週間で形成されるまで伸長し続
けた（図8A）。神経突起の急速な生成および突起の網状
構造の最終的な形成は、用いられた生存基盤に大きく依
存していることが分かった。例えば、急速な成長はポリ
−Ｄ−リシンおよびラミニンまたはマトリゲル基質上の
細胞増殖で生じたが、ポリ−Ｄ−リシンのみでは生じな
かった。図8Bは、ポリ−Ｄ−リシンのみで増殖した細胞
塊を図示する。７日後でも、これらの細胞は、先端が偏
平な広い成長コーンになっている極めて短い突起を有し
ていた。20時間目に、マトリゲル上のNT2−Ｎ細胞はそ
れらの突起を伸長し始めた（図8C）。NT2−Ｎ細胞にお
ける神経突起再成長に対するマトリゲル（またはラミニ
ン）およびポリ−Ｄ−リシンのこれらの示差的作用は、
培養中の種々のPNSおよびCNSニューロン細胞に対するラ
ミニンの周知の神経突起成長促進作用と一致する。多数
のリプレート後の神経突起を再生するNT2−Ｎ細胞の能
力は、それらが未熟ニューロンの適応性を保持すること
を示す。更に、リプレート＃３は、より純粋な培養物の
利用可能性に応じた将来の実験の追求を可能にするNT2
−Ｎ細胞の一層純粋な培養物を得る手段を我々に与え
る。
下層（substratum）に加えて、非ニューロン細胞は神
経突起成長促進においてある役割を果たしており；これ
はリプレート＃３培養物において最も明らかである。本
発明者は、ポリ−Ｄ−リシンのみでリプレートされたNT
2−Ｎ細胞が、これらの培養物中で見出される極めて希
な非ニューロン細胞の回りに密集したことおよびNT2−
Ｎ細胞塊からの多数の神経突起が非ニューロン細胞の方
へまっすぐに伸長したことを観察した。この現象の劇的
な例を図8Dに示し、そこにおいていくつかの突起は、非
ニューロン細胞に向かって成長するように劇的に方向を
変えたように見える。図8Dの細胞を繰り返し観察するこ
とにより、神経突起は非ニューロン細胞の死滅後に完全
に収縮したことが分かった。この結果は、残留する非ニ
ューロン細胞が、NT2−Ｎ細胞に関して化学屈性である
拡散性物質を放出しうることを暗示する。同様に、非ニ
ューロン細胞の存在は、純粋なNT2−Ｎ細胞培養物（８
〜10週間）と比較して延長された非ニューロン細胞単層
上のNT2−Ｎの生育可能性（最大５か月間まで）を説明
することができる。総合すると、これらの実験は、NT2
−Ｎ細胞の生存および神経突起伸長双方を促進する場合
の非ニューロン細胞の役割を示唆する。
経突起成長促進においてある役割を果たしており；これ
はリプレート＃３培養物において最も明らかである。本
発明者は、ポリ−Ｄ−リシンのみでリプレートされたNT
2−Ｎ細胞が、これらの培養物中で見出される極めて希
な非ニューロン細胞の回りに密集したことおよびNT2−
Ｎ細胞塊からの多数の神経突起が非ニューロン細胞の方
へまっすぐに伸長したことを観察した。この現象の劇的
な例を図8Dに示し、そこにおいていくつかの突起は、非
ニューロン細胞に向かって成長するように劇的に方向を
変えたように見える。図8Dの細胞を繰り返し観察するこ
とにより、神経突起は非ニューロン細胞の死滅後に完全
に収縮したことが分かった。この結果は、残留する非ニ
ューロン細胞が、NT2−Ｎ細胞に関して化学屈性である
拡散性物質を放出しうることを暗示する。同様に、非ニ
ューロン細胞の存在は、純粋なNT2−Ｎ細胞培養物（８
〜10週間）と比較して延長された非ニューロン細胞単層
上のNT2−Ｎの生育可能性（最大５か月間まで）を説明
することができる。総合すると、これらの実験は、NT2
−Ｎ細胞の生存および神経突起伸長双方を促進する場合
の非ニューロン細胞の役割を示唆する。
遺伝子転移実験のためのNT2−Ｎ細胞の有用性を評価
するために、本発明者は、未分化NT2細胞を、β−ガラ
クトシダーゼ（β−gal）発現プラスミドであるSPUD1に
よって安定してトランスフェクトした。これらの実験
は、NT2−Ｎ細胞がRAによる分化後に外因性タンパク質
生成物を発現し続けるかどうかを決定するように設計さ
れた。SPUD1が（選択しるうマーカーとして用いられ
る）pSV2neoと一緒に未分化NT2細胞中に同時トランスフ
ェクトされた場合、本発明者は、組織化学的染色によっ
て検定されるβ−galを発現したG418耐性細胞集団を誘
導した（図9A）。図１に記載したのと同様のプロトコル
後に、RAでこれらのNT2−SPUD細胞を刺激することによ
り、本発明者は、β−gal陽性NT2−Ｎ細胞の純粋培養物
を誘導することができた（図9BおよびＣ）。β−galタ
ンパク質の存在を示す青色反応生成物は細胞体に集中し
ており、若干のNT2−Ｎ細胞の突起には単に伸長された
だけであった（図9Bの矢印を参照されたい）。β−gal
反応生成物は、細胞本体のいたるところで粒状凝集体に
集中して見えた（図9B）。この知見は、NT2−Ｎ細胞
が、NT2細胞中に導入された外因性遺伝子産物を発現し
続けることを示唆する。
するために、本発明者は、未分化NT2細胞を、β−ガラ
クトシダーゼ（β−gal）発現プラスミドであるSPUD1に
よって安定してトランスフェクトした。これらの実験
は、NT2−Ｎ細胞がRAによる分化後に外因性タンパク質
生成物を発現し続けるかどうかを決定するように設計さ
れた。SPUD1が（選択しるうマーカーとして用いられ
る）pSV2neoと一緒に未分化NT2細胞中に同時トランスフ
ェクトされた場合、本発明者は、組織化学的染色によっ
て検定されるβ−galを発現したG418耐性細胞集団を誘
導した（図9A）。図１に記載したのと同様のプロトコル
後に、RAでこれらのNT2−SPUD細胞を刺激することによ
り、本発明者は、β−gal陽性NT2−Ｎ細胞の純粋培養物
を誘導することができた（図9BおよびＣ）。β−galタ
ンパク質の存在を示す青色反応生成物は細胞体に集中し
ており、若干のNT2−Ｎ細胞の突起には単に伸長された
だけであった（図9Bの矢印を参照されたい）。β−gal
反応生成物は、細胞本体のいたるところで粒状凝集体に
集中して見えた（図9B）。この知見は、NT2−Ｎ細胞
が、NT2細胞中に導入された外因性遺伝子産物を発現し
続けることを示唆する。
本発明者は、NT2−Ｎ細胞が理想的なニューロン細胞
系の探求基準に極めて近いことを示した。本発明者のNT
2−Ｎ細胞についての観察およびそれらの培養物用に開
発された新規の方法は、RA処理後に速やかに分裂するNT
2奇形癌細胞から有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養
物を生成することが可能であることを明らかにした。こ
れらの非分裂性NT2−Ｎ細胞は安定なニューロン表現型
を有し、そしてそれらは、血清中にあるもの以外の何等
かの外因性分化促進または向性因子の連続的存在を伴う
ことなく培養中に８〜10週間生存しうる。実際に、本発
明の方法を用いて、本発明者は１週間間隔でほぼ２年間
一貫してNT2−Ｎ細胞を製造しており、十分な数のこれ
らの細胞が生化学実験用に容易に生成された。更に、有
糸分裂後ニューロン様NT2−Ｎ細胞が、未分化NT2細胞中
にトランスフェクトされたプラスミドによってコードさ
れたタンパク質を発現し続けることも極めて重要であ
る。この特徴の組合せは独特であり、それは、完全に分
化したニューロン表現型を有する培養されたヒト細胞
が、時限の神経突起成長、神経突起両極性の基準および
発展、細胞骨格成熟並びにニューロン適応性を含む神経
生理学における基本的な問題の研究用に始めて多量に利
用可能であることによる。
系の探求基準に極めて近いことを示した。本発明者のNT
2−Ｎ細胞についての観察およびそれらの培養物用に開
発された新規の方法は、RA処理後に速やかに分裂するNT
2奇形癌細胞から有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養
物を生成することが可能であることを明らかにした。こ
れらの非分裂性NT2−Ｎ細胞は安定なニューロン表現型
を有し、そしてそれらは、血清中にあるもの以外の何等
かの外因性分化促進または向性因子の連続的存在を伴う
ことなく培養中に８〜10週間生存しうる。実際に、本発
明の方法を用いて、本発明者は１週間間隔でほぼ２年間
一貫してNT2−Ｎ細胞を製造しており、十分な数のこれ
らの細胞が生化学実験用に容易に生成された。更に、有
糸分裂後ニューロン様NT2−Ｎ細胞が、未分化NT2細胞中
にトランスフェクトされたプラスミドによってコードさ
れたタンパク質を発現し続けることも極めて重要であ
る。この特徴の組合せは独特であり、それは、完全に分
化したニューロン表現型を有する培養されたヒト細胞
が、時限の神経突起成長、神経突起両極性の基準および
発展、細胞骨格成熟並びにニューロン適応性を含む神経
生理学における基本的な問題の研究用に始めて多量に利
用可能であることによる。
分化したニューロン表現型を研究するためのNT2−Ｎ
細胞の可能性の他に、NT2細胞は、RAが何等かの他の外
因的影響を必要とすることなく幹細胞を前駆ニューロン
に分化させることができる機序を研究するための重要な
システムである。レチノイド（特に、RA）は、胚形成の
際に奇形発生作用を有することが知られており、神経堤
およびCNS欠損をもたらす。更に、RAおよびおそらくは
他のレチノイドは、神経系以外の発生において重要なイ
ンビボの生理学的役割を有するということが最近明らか
になった。ニューロン発生の際のレチノイド作用の研究
は、実験用の発育する神経システムが比較的利用しにく
いことによって妨げられてきた。NT2細胞は、レチノイ
ドの細胞性作用並びにそれらの神経の誘導および分化に
おける役割を研究するために利用可能なインビトロシス
テムを提供する。
細胞の可能性の他に、NT2細胞は、RAが何等かの他の外
因的影響を必要とすることなく幹細胞を前駆ニューロン
に分化させることができる機序を研究するための重要な
システムである。レチノイド（特に、RA）は、胚形成の
際に奇形発生作用を有することが知られており、神経堤
およびCNS欠損をもたらす。更に、RAおよびおそらくは
他のレチノイドは、神経系以外の発生において重要なイ
ンビボの生理学的役割を有するということが最近明らか
になった。ニューロン発生の際のレチノイド作用の研究
は、実験用の発育する神経システムが比較的利用しにく
いことによって妨げられてきた。NT2細胞は、レチノイ
ドの細胞性作用並びにそれらの神経の誘導および分化に
おける役割を研究するために利用可能なインビトロシス
テムを提供する。
NT2−Ｎ細胞は、本発明者が検査した重要なニューロ
ンマーカーを全て発現した。更に、それらは、それらが
CNS（PNSではない）ニューロンであることを示す具体的
な特徴を有する（すなわち、それらは66kD NFタンパク
質を発現するが、ペリフェリンを発現しない［表
Ｉ］）。培養中の初代ニューロンと同様に、NT2−Ｎ細
胞は、成熟型のMAPおよびNFタンパク質によって支配さ
れた細胞骨格を有するが（例えば、それらは主として胎
児tau、MAP1b、MAP2bを発現する）、それらは一層低量
のMAP 1aおよびNF−Ｈを合成し且つ維持する。NT2−Ｎ
細胞によって考えられる安定なニューロン表現型と、ト
ランスフェクトされた遺伝子の産物を発現するようにそ
れらを遺伝子工学的に処理することができるという事実
とが与えられることにより、これらの細胞は、ヒトニュ
ーロンにおける細胞生物学およびニューロンタンパク質
の機能を検査するのに極めて有用である。リプレーティ
ング後の迅速な神経突起再生（図８を参照されたい）お
よび十分に特性決定された細胞接着分子の発現（表Ｉを
参照されたい）は、神経突起成長を調節する因子を研究
するのにNT2−Ｎ細胞を用いることを可能にする。NT2−
Ｎ細胞は血清の存在下でも分裂しないし、しかもそれら
は高度に精製されたヒトニューロン培養物の再現可能な
源であるので、それらは、宿主環境中に取込まれるそれ
らの能力を決定するためのヌードマウスおよび他の哺乳
動物への移植実験に有用な細胞でありうる。実際に、引
続き安定な有糸分裂後ニューロンに分化するNT2細胞中
への向性因子または他のタンパク質のトランスフェクシ
ョンは、ヒト神経変性疾患における生物活性分子のため
の新規の供給システムとして有用でありうる。
ンマーカーを全て発現した。更に、それらは、それらが
CNS（PNSではない）ニューロンであることを示す具体的
な特徴を有する（すなわち、それらは66kD NFタンパク
質を発現するが、ペリフェリンを発現しない［表
Ｉ］）。培養中の初代ニューロンと同様に、NT2−Ｎ細
胞は、成熟型のMAPおよびNFタンパク質によって支配さ
れた細胞骨格を有するが（例えば、それらは主として胎
児tau、MAP1b、MAP2bを発現する）、それらは一層低量
のMAP 1aおよびNF−Ｈを合成し且つ維持する。NT2−Ｎ
細胞によって考えられる安定なニューロン表現型と、ト
ランスフェクトされた遺伝子の産物を発現するようにそ
れらを遺伝子工学的に処理することができるという事実
とが与えられることにより、これらの細胞は、ヒトニュ
ーロンにおける細胞生物学およびニューロンタンパク質
の機能を検査するのに極めて有用である。リプレーティ
ング後の迅速な神経突起再生（図８を参照されたい）お
よび十分に特性決定された細胞接着分子の発現（表Ｉを
参照されたい）は、神経突起成長を調節する因子を研究
するのにNT2−Ｎ細胞を用いることを可能にする。NT2−
Ｎ細胞は血清の存在下でも分裂しないし、しかもそれら
は高度に精製されたヒトニューロン培養物の再現可能な
源であるので、それらは、宿主環境中に取込まれるそれ
らの能力を決定するためのヌードマウスおよび他の哺乳
動物への移植実験に有用な細胞でありうる。実際に、引
続き安定な有糸分裂後ニューロンに分化するNT2細胞中
への向性因子または他のタンパク質のトランスフェクシ
ョンは、ヒト神経変性疾患における生物活性分子のため
の新規の供給システムとして有用でありうる。
本発明は、有糸分裂後ヒトニューロンの純粋な培養物
を製造する方法であって、未分化ヒト奇形癌細胞をレチ
ノイン酸と一緒に培養して多層培養物を得；該培養細胞
を分散させ；そして該分散細胞を有糸分裂阻害剤または
有糸分裂阻害剤組合せと一緒に培養することを含む上記
方法を提供する。本発明は、更に、上記方法の未分化細
胞がNTera2/D1細胞を含むことを考慮する。更に、本発
明は、有糸分裂阻害剤組合せがシトシンアラビノシド、
フルオロデオキシウリジンおよびウリジンを含んでいる
この方法を含む。更に、上記方法の分散細胞はマトリゲ
ル上で培養することができる。
を製造する方法であって、未分化ヒト奇形癌細胞をレチ
ノイン酸と一緒に培養して多層培養物を得；該培養細胞
を分散させ；そして該分散細胞を有糸分裂阻害剤または
有糸分裂阻害剤組合せと一緒に培養することを含む上記
方法を提供する。本発明は、更に、上記方法の未分化細
胞がNTera2/D1細胞を含むことを考慮する。更に、本発
明は、有糸分裂阻害剤組合せがシトシンアラビノシド、
フルオロデオキシウリジンおよびウリジンを含んでいる
この方法を含む。更に、上記方法の分散細胞はマトリゲ
ル上で培養することができる。
本発明は、更に、外因性遺伝子産物を発現する有糸分
裂後ヒトニューロンの安定な集団を製造する方法であっ
て、１種類またはそれ以上のプラスミド（選択しうるマ
ーカーを含む）を培養された未分化ヒト奇形癌細胞中に
トランスフェクトし；該未分化ヒト奇形癌細胞をレチノ
イン酸と一緒に培養して多層培養物を得；該培養細胞を
分散させ；そして該分散細胞を有糸分裂阻害剤または有
糸分裂阻害剤組合せと一緒に培養することを含む上記方
法を提供する。単一の選択された発現ベクターを、安定
な有糸分裂後細胞集団においてトランスフェクトし且つ
発現されることができるということが考えられる。更
に、２種類以上の選択された発現ベクターを、安定な有
糸分裂後細胞集団においてトランスフェクトし且つ発現
させることができるということが考えられる。更に、選
択された発現プラスミドはβ−ガラクトシダーゼ発現プ
ラスミドを含むということが考えられる。本発明は、こ
のトランスフェクション法の未分化細胞がNTera2/D1細
胞を含むことを考慮する。更に、本発明により、このト
ランスフェクション法の有糸分裂阻害剤の組合せがシト
シンアラビノシド、フルオロデオキシウリジンおよびウ
リジンを含むことを提供する。更に、このトランスフェ
クション法の分散細胞はマトリゲル上で培養することが
できる。
裂後ヒトニューロンの安定な集団を製造する方法であっ
て、１種類またはそれ以上のプラスミド（選択しうるマ
ーカーを含む）を培養された未分化ヒト奇形癌細胞中に
トランスフェクトし；該未分化ヒト奇形癌細胞をレチノ
イン酸と一緒に培養して多層培養物を得；該培養細胞を
分散させ；そして該分散細胞を有糸分裂阻害剤または有
糸分裂阻害剤組合せと一緒に培養することを含む上記方
法を提供する。単一の選択された発現ベクターを、安定
な有糸分裂後細胞集団においてトランスフェクトし且つ
発現されることができるということが考えられる。更
に、２種類以上の選択された発現ベクターを、安定な有
糸分裂後細胞集団においてトランスフェクトし且つ発現
させることができるということが考えられる。更に、選
択された発現プラスミドはβ−ガラクトシダーゼ発現プ
ラスミドを含むということが考えられる。本発明は、こ
のトランスフェクション法の未分化細胞がNTera2/D1細
胞を含むことを考慮する。更に、本発明により、このト
ランスフェクション法の有糸分裂阻害剤の組合せがシト
シンアラビノシド、フルオロデオキシウリジンおよびウ
リジンを含むことを提供する。更に、このトランスフェ
クション法の分散細胞はマトリゲル上で培養することが
できる。
本発明は、更に、上記に記載した方法にしたがって製
造された安定な有糸分裂後ヒトニューロン細胞であっ
て、制限されないが、実質的に全部が少なくとも１種類
のトランスフェクトされた外因性遺伝子を含む安定な有
糸分裂後ヒトニューロン細胞またはトランスフェクトさ
れていない安定な有糸分裂後ヒトニューロン細胞を含む
上記細胞を提供する。
造された安定な有糸分裂後ヒトニューロン細胞であっ
て、制限されないが、実質的に全部が少なくとも１種類
のトランスフェクトされた外因性遺伝子を含む安定な有
糸分裂後ヒトニューロン細胞またはトランスフェクトさ
れていない安定な有糸分裂後ヒトニューロン細胞を含む
上記細胞を提供する。
本発明を、いずれにせよ制限するためのものではない
以下の実施例によって更に例証する。
以下の実施例によって更に例証する。
実施例 実施例１ 細胞培養： NT2細胞を、前に記載されたように（アンドルーズ、1
984年）10％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプ
トマイシンを含むDMEM HG中で維持した。分化に関し
て、細胞2x106個を75cm2フラスコ中に播種し且つ1x10-2
M RA（DMSO中に溶解した1x10-2M原液を毎月新しく調製
した）で１週間に２回４週間処理した。RA処理後、細胞
を1:6にリプレートした（リプレート＃1;図１を参照さ
れたい）。２日後に、細胞を機械的に除去し、すなわ
ち、培養フラスコをどちらの側にも10回打ちつけ、浮遊
した細胞を培地5mlで洗浄し且つ製造者の指示にしたが
って（マトリゲルに用いられら希釈度はロッドごとに多
少異なった）1:20（カバースリップ用）または1:60（皿
用）に希釈したマトリゲル（コラボレーティブ・リサー
チ（Collaborative Research））上で再度リプレート
した（リプレート＃2;図１を参照されたい）。細胞を、
細胞密度0.2x106個/12mmカバースリップまたは7.5x106
個/100mm皿で、１μＭシトシンアラビノシド、10μＭフ
ルオロデオキシウリジンおよび10μＭウリジンを補足し
た10％血清およびペニシリン／ストレプトマイシン含有
DMEM HG中に播種した。シトシンアラビノシドは培養の
最初の１週間継続し、フルオロデオキシウリジンおよび
ウリジンは最初の４週間継続した。神経突起再生実験に
関して、３週令培養物を0.025％ジスパーゼまたは0.025
％トリプシンによって酵素的に取出し且つマトリゲル、
ポリ−Ｄ−リシン（10μg/ml）または、ポリ−Ｄ−リシ
ン（10μg/ml）およびラミニン（10μg/ml）上でリプレ
ートした（リプレート＃3;図１を参照されたい）。マト
リゲルは、コラーゲン、ラミニンおよびニドジェン（ni
dogen）を含む基底膜抽出物である（クラインマン（Kle
inman）ら、1986年）。図１に概説され且つここで詳細
に記載のこの方法を、同様の結果を有する３種類の異な
るNTera2サブクローン（NT2/D1、NT2/O3およびNT2/B9）
に適用した。ここで示した結果はいずれもNT/D1から得
た。実験の途中で、NT2細胞は５％ウシ胎児血清（FBS）
含有Opti−MEM（ギブコ（GIBCO））を好むことが観察さ
れ、そして次に、未分化NT2細胞の維持用にこの培地を
用いた。
984年）10％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプ
トマイシンを含むDMEM HG中で維持した。分化に関し
て、細胞2x106個を75cm2フラスコ中に播種し且つ1x10-2
M RA（DMSO中に溶解した1x10-2M原液を毎月新しく調製
した）で１週間に２回４週間処理した。RA処理後、細胞
を1:6にリプレートした（リプレート＃1;図１を参照さ
れたい）。２日後に、細胞を機械的に除去し、すなわ
ち、培養フラスコをどちらの側にも10回打ちつけ、浮遊
した細胞を培地5mlで洗浄し且つ製造者の指示にしたが
って（マトリゲルに用いられら希釈度はロッドごとに多
少異なった）1:20（カバースリップ用）または1:60（皿
用）に希釈したマトリゲル（コラボレーティブ・リサー
チ（Collaborative Research））上で再度リプレート
した（リプレート＃2;図１を参照されたい）。細胞を、
細胞密度0.2x106個/12mmカバースリップまたは7.5x106
個/100mm皿で、１μＭシトシンアラビノシド、10μＭフ
ルオロデオキシウリジンおよび10μＭウリジンを補足し
た10％血清およびペニシリン／ストレプトマイシン含有
DMEM HG中に播種した。シトシンアラビノシドは培養の
最初の１週間継続し、フルオロデオキシウリジンおよび
ウリジンは最初の４週間継続した。神経突起再生実験に
関して、３週令培養物を0.025％ジスパーゼまたは0.025
％トリプシンによって酵素的に取出し且つマトリゲル、
ポリ−Ｄ−リシン（10μg/ml）または、ポリ−Ｄ−リシ
ン（10μg/ml）およびラミニン（10μg/ml）上でリプレ
ートした（リプレート＃3;図１を参照されたい）。マト
リゲルは、コラーゲン、ラミニンおよびニドジェン（ni
dogen）を含む基底膜抽出物である（クラインマン（Kle
inman）ら、1986年）。図１に概説され且つここで詳細
に記載のこの方法を、同様の結果を有する３種類の異な
るNTera2サブクローン（NT2/D1、NT2/O3およびNT2/B9）
に適用した。ここで示した結果はいずれもNT/D1から得
た。実験の途中で、NT2細胞は５％ウシ胎児血清（FBS）
含有Opti−MEM（ギブコ（GIBCO））を好むことが観察さ
れ、そして次に、未分化NT2細胞の維持用にこの培地を
用いた。
実施例２ BrDU標識： 未分化NT2細胞および分化したNT2−Ｎ細胞を有糸分裂
阻害剤不含で４日間増殖させた後、BrDU3mg/mlで３時間
（または若干の場合最大20時間まで）標識した。次に、
細胞を洗浄し、固定し、そして以下に記載したように、
変性することなくDNAに取込まれたBrDUを認識するmabで
あるBU−１を用いて間接免疫蛍光法のための処理をし
た。
阻害剤不含で４日間増殖させた後、BrDU3mg/mlで３時間
（または若干の場合最大20時間まで）標識した。次に、
細胞を洗浄し、固定し、そして以下に記載したように、
変性することなくDNAに取込まれたBrDUを認識するmabで
あるBU−１を用いて間接免疫蛍光法のための処理をし
た。
実施例３ 間接免疫蛍光法および同焦点顕微鏡検査： 細胞をハンクスの（Hank's）緩衝塩類溶液で洗浄し且
つ0.15M NaCl含有70％エタノールを用いて室温で10分
間固定した。細胞を一次抗体と一緒に室温で１時間イン
キュベートし、PBSで１時間に４回洗浄し、二次抗体
（ローダミンに結合したロバ抗マウスIgG、フルオレセ
インに結合したロバ抗ラットおよびフルオレセインに結
合したロバ抗ウサギ；ジャクソン・イムノリサーチ（Ja
ckson Immunoresearch））と一緒に１時間インキュベ
ートし、そして最後に、アクアマウント（Aquamount）
（レーナー・ラブズ（Lerner Labs））中に固定する前
に、PBS中において１時間に４回洗浄した。同焦点顕微
鏡検査に関して、その手順は、テキサス・レッド結合二
次抗体をローダミンの代わりに用い且つカバースリップ
を５％DABCOを用いて固定して漂白を防止したことを除
き、本質的に同様であった。カバースリップを、バイオ
・ラド（Bio−Rad）MRC−600レーザー走査同焦点顕微鏡
上においてクリプトンレーザーを用いて検査した。
つ0.15M NaCl含有70％エタノールを用いて室温で10分
間固定した。細胞を一次抗体と一緒に室温で１時間イン
キュベートし、PBSで１時間に４回洗浄し、二次抗体
（ローダミンに結合したロバ抗マウスIgG、フルオレセ
インに結合したロバ抗ラットおよびフルオレセインに結
合したロバ抗ウサギ；ジャクソン・イムノリサーチ（Ja
ckson Immunoresearch））と一緒に１時間インキュベ
ートし、そして最後に、アクアマウント（Aquamount）
（レーナー・ラブズ（Lerner Labs））中に固定する前
に、PBS中において１時間に４回洗浄した。同焦点顕微
鏡検査に関して、その手順は、テキサス・レッド結合二
次抗体をローダミンの代わりに用い且つカバースリップ
を５％DABCOを用いて固定して漂白を防止したことを除
き、本質的に同様であった。カバースリップを、バイオ
・ラド（Bio−Rad）MRC−600レーザー走査同焦点顕微鏡
上においてクリプトンレーザーを用いて検査した。
実施例４ ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（PAP）免疫細
胞化学： PAP免疫細胞化学を実施して、間接免疫蛍光法と比較
した場合のこの技術の大きな感受性によって低濃度の胎
児tauを可視化した。カバースリップを上記のように固
定し、そして２％仔ウシ血清および0.25％冷水魚ゼラチ
ン含有の0.1Mトリス pH7.0で30分間ブロックした。こ
の後、カバースリップを、本発明者の実験室においてPA
P免疫細胞化学に関して前に記載したように処理した
（ガーテン（Carden）ら、J.Neurosci.,7:3489〜3504
（1987））。
胞化学： PAP免疫細胞化学を実施して、間接免疫蛍光法と比較
した場合のこの技術の大きな感受性によって低濃度の胎
児tauを可視化した。カバースリップを上記のように固
定し、そして２％仔ウシ血清および0.25％冷水魚ゼラチ
ン含有の0.1Mトリス pH7.0で30分間ブロックした。こ
の後、カバースリップを、本発明者の実験室においてPA
P免疫細胞化学に関して前に記載したように処理した
（ガーテン（Carden）ら、J.Neurosci.,7:3489〜3504
（1987））。
実施例５ 免疫化学： MAPに富む細胞骨格資料を、0.5mM MgSO4、1mM EGT
A、2mM DTT、2mM GTP、20μＭ タキソール（Taxo
l）、１％トリトン（Triton）Ｘ−100およびプロテアー
ゼインヒビターの反応混液を含む0.1M MES pH6.8を用
いて細胞を室温で15分間抽出することによって調製し
た。ペレットを、TL100超遠心機において30,000rpmで30
分間の遠心分離によって回収し、染料不含の試料緩衝液
中に可溶化し、そして試料のタンパク質濃度をクーマシ
ーブルー染料結合検定（ピアス（Pierce））を用いて決
定した。これらの試料をSDS−PAGEゲル上に流した後、
本発明者の実験室において前に記載された方法（リー
ら、1987年）を用いて抗体でプローブするためにニトロ
セルロース膜に対してエレクトロブロットした。
A、2mM DTT、2mM GTP、20μＭ タキソール（Taxo
l）、１％トリトン（Triton）Ｘ−100およびプロテアー
ゼインヒビターの反応混液を含む0.1M MES pH6.8を用
いて細胞を室温で15分間抽出することによって調製し
た。ペレットを、TL100超遠心機において30,000rpmで30
分間の遠心分離によって回収し、染料不含の試料緩衝液
中に可溶化し、そして試料のタンパク質濃度をクーマシ
ーブルー染料結合検定（ピアス（Pierce））を用いて決
定した。これらの試料をSDS−PAGEゲル上に流した後、
本発明者の実験室において前に記載された方法（リー
ら、1987年）を用いて抗体でプローブするためにニトロ
セルロース膜に対してエレクトロブロットした。
実施例６ NT2−Ｎ細胞の3H−ウリジン標識： 60mm皿のNT2−Ｎ細胞を［5,6−3H］ウリジン（1.70TB
q/ミリモル）50μCiと一緒に16〜24時間インキュベート
した。次に、これらの皿を10μＭ非標識ウリジン含有PB
Sで洗浄し且つブワンの（Bouin's）固定液で固定した。
次に、水で1:1に希釈したNTB−２エマルジョンで皿を被
覆し、一晩中乾燥させ、そして４℃で４日間貯蔵した。
皿をコダック（Kodak）D19中で１分間現像し且つコダッ
ク・ラピッド・フィクス（Rapid−Fix）で定着させた。
q/ミリモル）50μCiと一緒に16〜24時間インキュベート
した。次に、これらの皿を10μＭ非標識ウリジン含有PB
Sで洗浄し且つブワンの（Bouin's）固定液で固定した。
次に、水で1:1に希釈したNTB−２エマルジョンで皿を被
覆し、一晩中乾燥させ、そして４℃で４日間貯蔵した。
皿をコダック（Kodak）D19中で１分間現像し且つコダッ
ク・ラピッド・フィクス（Rapid−Fix）で定着させた。
実施例７ β−ガラクトシダーゼのトランスフェクションおよび染
色： 未分化NT2細胞に、リポフェクチン（Lipofectin）
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Re
search Laboratorie））を用いるリポフェクションに
よってSPUD1を100μｇおよびpSV2neoを10μｇトランス
フェクトした。完全培地中において２日後に、G418（ギ
ブコ）200μg/mlを７日間用いてトランスフェクタント
を選択した。リン酸緩衝溶液pH7.4中の２％パラホムア
ルデヒド、0.2％グルタルアルデヒド中での固定後に、P
BS中においてＸ−galを1mg/ml、5mMフェロシアン化カリ
ウム、5mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2を用い
て細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。
β−gal陽性培養物を２回サブクローン化し、そのサブ
クローンを更に別の実験に用いた。SPUD1（C.セプコ（C
epko）博士によって快く提供された）は、SV40プロモー
ターを用い且つモロネーネズミ白血病ウイルス（Molone
y murine leukemia virus）長末端反復を上流および下
流に有するβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターである。
ホフマンモジュレーションコントラストを用いて細胞の
写真を撮り、青色反応生成物および突起の同時可視化を
可能にした。
色： 未分化NT2細胞に、リポフェクチン（Lipofectin）
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Re
search Laboratorie））を用いるリポフェクションに
よってSPUD1を100μｇおよびpSV2neoを10μｇトランス
フェクトした。完全培地中において２日後に、G418（ギ
ブコ）200μg/mlを７日間用いてトランスフェクタント
を選択した。リン酸緩衝溶液pH7.4中の２％パラホムア
ルデヒド、0.2％グルタルアルデヒド中での固定後に、P
BS中においてＸ−galを1mg/ml、5mMフェロシアン化カリ
ウム、5mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2を用い
て細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。
β−gal陽性培養物を２回サブクローン化し、そのサブ
クローンを更に別の実験に用いた。SPUD1（C.セプコ（C
epko）博士によって快く提供された）は、SV40プロモー
ターを用い且つモロネーネズミ白血病ウイルス（Molone
y murine leukemia virus）長末端反復を上流および下
流に有するβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターである。
ホフマンモジュレーションコントラストを用いて細胞の
写真を撮り、青色反応生成物および突起の同時可視化を
可能にした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 プレジャー，サミュエル アメリカ合衆国ペンシルバニア州19104, フィラデルフィア，セント・マークス・ スクウェア 211 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/06 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】有糸分裂後ヒトニューロンの純粋な培養物
を製造する方法であって、 未分化ヒト奇形癌細胞をレチノイン酸と一緒に培養して
多層培養物を得； 該培養細胞を分散させ；そして 該分散細胞を単一の有糸分裂阻害剤または複数の有糸分
裂阻害剤の組合せと一緒に培養すること からなる上記方法。 - 【請求項２】外因性遺伝子産物を発現する有糸分裂後ヒ
トニューロンの安定な集団を製造する方法であって、 選択しうるマーカーを含む少なくとも１種類のプラスミ
ドを、培養された未分化ヒト奇形癌細胞中にトランスフ
ェクトし； 該未分化ヒト奇形癌細胞をレチノイン酸と一緒に培養し
て多層培養物を得； 該培養細胞を分散させ；そして 該分散細胞を単一の有糸分裂阻害剤または複数の有糸分
裂阻害剤の組合せと一緒に培養すること からなる上記方法。 - 【請求項３】請求項１記載の方法にしたがって製造され
た安定な有糸分裂後ヒトニューロン細胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US780,715 | 1991-10-21 | ||
| US07/780,715 US5175103A (en) | 1991-10-21 | 1991-10-21 | Preparation of pure cultures of post-mitotic human neurons |
| PCT/US1992/006540 WO1993008266A1 (en) | 1991-10-21 | 1992-08-05 | Preparation of pure cultures of post-mitotic human neurons |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07502645A JPH07502645A (ja) | 1995-03-23 |
| JP3169611B2 true JP3169611B2 (ja) | 2001-05-28 |
Family
ID=25120453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50765893A Expired - Fee Related JP3169611B2 (ja) | 1991-10-21 | 1992-08-05 | 有糸分裂後ヒトニューロンの純粋培養物の製造 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5175103A (ja) |
| EP (1) | EP0620847B1 (ja) |
| JP (1) | JP3169611B2 (ja) |
| AT (1) | ATE165617T1 (ja) |
| CA (1) | CA2120730A1 (ja) |
| DE (1) | DE69225332T2 (ja) |
| DK (1) | DK0620847T3 (ja) |
| ES (1) | ES2117672T3 (ja) |
| WO (1) | WO1993008266A1 (ja) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5545522A (en) | 1989-09-22 | 1996-08-13 | Van Gelder; Russell N. | Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex |
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
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| US6497872B1 (en) * | 1991-07-08 | 2002-12-24 | Neurospheres Holdings Ltd. | Neural transplantation using proliferated multipotent neural stem cells and their progeny |
| US5750376A (en) * | 1991-07-08 | 1998-05-12 | Neurospheres Holdings Ltd. | In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny |
| US6294346B1 (en) | 1991-07-08 | 2001-09-25 | Neurospheres Holdings, Ltd. | Use of multipotent neural stem cells and their progeny for the screening of drugs and other biological agents |
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| US6399369B1 (en) | 1991-07-08 | 2002-06-04 | Neurospheres Holdings Ltd. | Multipotent neural stem cell cDNA libraries |
| US5980885A (en) * | 1991-07-08 | 1999-11-09 | Neurospheres Holdings Ltd. | Growth factor-induced proliferation of neural precursor cells in vivo |
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| US7166277B1 (en) | 1991-07-08 | 2007-01-23 | Neurospheres Holdings Ltd. | Remyelination of neurons using multipotent neural stem cell progeny |
| US5175103A (en) * | 1991-10-21 | 1992-12-29 | Trustees Of University Of Pennsylvania | Preparation of pure cultures of post-mitotic human neurons |
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