EP1397485A2 - Zellpopulationen zur auffindung neuronaler targets und potentieller wirkstoffe - Google Patents

Zellpopulationen zur auffindung neuronaler targets und potentieller wirkstoffe

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EP1397485A2
EP1397485A2 EP02754603A EP02754603A EP1397485A2 EP 1397485 A2 EP1397485 A2 EP 1397485A2 EP 02754603 A EP02754603 A EP 02754603A EP 02754603 A EP02754603 A EP 02754603A EP 1397485 A2 EP1397485 A2 EP 1397485A2
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EP
European Patent Office
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cells
neuronal
receptors
population
substance
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02754603A
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English (en)
French (fr)
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Thomas Rohrmeier
Rosemarie Daig
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the invention relates to novel cell populations which are suitable for finding neuronal targets for the investigation of neuronal diseases and potential pharmaceutical active substances, in particular against neuronal diseases, and to methods for finding such targets and active substances.
  • the brain is a precisely regulated network of more than 10 billion individual nerve cells.
  • Disorders of the complex regulatory mechanisms manifest themselves in neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's disease or in neuropsychiatric diseases such as depression, schizophrenia and manic-depressive psychoses.
  • the causes of Alzheimer's and Parkinson's are still largely unknown.
  • Parkinson's dopaminergic neurons in the substantia nigra die and the formation of Lewybodies is observed.
  • the death of cholinergic neurons, the deposition of the amyloid-ß protein (Aß) and the hyperphosphorylation of the tau protein can be observed.
  • the drugs available so far cannot prevent the progression of these diseases and only temporarily alleviate the symptoms.
  • Neuropsychiatric disorders are believed to be due to neurotransmitter metabolic disorders such as dopamine and serotonin, glutamate, noradrenaline, and ⁇ -amino-butyric acid.
  • Known drugs are limited to the levels of the receptor blockade, the control of the tumor over rate and the resumption of the neurotransmitter into the cell.
  • Alternative concepts aim to protect nerve cells (nerve growth factors, neuroimmunophylline, antioxidants) or to replace them (cell transplantation).
  • New approaches include cell transplantation in Parkinson's and APP processing interventions, the use of anti-inflammatories and immunotherapy directed against ß-amyloid for Alzheimer's treatment.
  • New concepts in neuropsychiatric diseases are e.g. B. the administration of melatonin, CRF blockers, substance P antagonists, sigma receptor blockers, regulators of cannabinoid receptors and AMPAkinen. All previously known pharmaceutical agents against depression and schizophrenia influence the frequency of neurotransmitters in the brain. However, the success rates in treating these diseases with the known medications are low.
  • Patient material from post-mortem brain tissue is often used for target identification. Relevant genes are to be identified by comparing the gene expression in brains of healthy and diseased people.
  • the use of brain tissue as a basis for examination is also limited by degradation processes in post-mortem tissue and by adaptation processes that are caused in the brain by drug therapy.
  • the object of the present invention is to provide a cellular test system which is simple to manufacture and handle and at the same time is suitable for identifying and validating neural targets or active substances for the investigation or treatment of neuronal diseases.
  • the object is achieved with neuronal cell populations containing differentiated CNS neurons, which contain receptors from the group of the dopamine and serotonin receptors and the adrenergic receptors and which produce at least one neurotransmitter which does not bind to one of these receptors or does not produce them in undetectable amounts.
  • Such cell populations have proven to be a suitable cellular test system, with the identification or the investigation of target genes or target proteins with the controlled addition of the neurotransmitters that are not produced by the cell population or are produced in undetectable amounts.
  • the neuronal cell populations preferably contain further receptors from the group of GABA, acetylcholine, adenosine and glutamate receptors, in which case the cell populations do not produce at least one neurotransmitter that binds to one of these receptors or only produce them in undetectable amounts.
  • cell populations are suitable which have an increased surface density of the receptors, the neurotransmitters of which they bind do not produce them.
  • Preferred neuronal cell populations do not themselves produce neurotransmitters whose effects are to be investigated. However, undetectable amounts of neurotransmitters produced by the cell population can be tolerated.
  • the detection limits when checking the neurotransmitter content using ELISA are e.g. B. for dopamine at a concentration of 3.3 X 10 "10 M, for serotonin at 3.5 X 10 " 8 M and for norepinephrine at 3.5 X 10 "9 M. If these values are not exceeded, the reliability of the Gene induction experiments are not endangered if the respective neurotransmitter is added in a concentration that is above these limits by a factor of 10.
  • neurotransmitter concentrations produced by the cell populations are above the respective detection limits, it is recommended to inhibit the neurotransmitter production of the cell population by adding inhibitors Examples described here were cell culture samples containing 3 X 10 4 cells the production of dopamine, serotonin and noradrenaline tested by ELISA. After 24 hours, none of the neurotransmitters mentioned could be detected in the cell populations tested.
  • Neuronal cells are preferred for the receptors from the group dopamine D2-, serotonin (5HT-2A) -, -2-adrenergic, adenosine A2A-receptor are characteristic.
  • Cell populations which are obtained from neuronal primary cell cultures, from immortalized neuronal cell cultures or from neuronal cell lines are preferred, provided that they carry dopamine and serotonin receptors and adrenergic receptors.
  • Particularly preferred cell populations contain cells of the hNT type (NT-2 cells differentiated into neurons, for example described in Andrews, Dev. Biol., 103; 285-293, 1984; Andrews et al.: J. Lab.
  • Preferred cell populations furthermore consist of cells which can be generated and selected from one of the cell lines NT-2, SK-N-SH, SK-N-MC or SH-SY5Y. Neuronal cell populations which contain a high proportion of postmitotic differentiated CNS neurons are particularly preferred.
  • neurotransmitters are understood to be naturally occurring messenger substances which can trigger a receptor-bound signal cascade. In particular fall under the concept of
  • Neurotransmitters dopamine, serotonin, noradrenaline, glutamate, GABA, adenosine or acetylcholine. It should be noted that the invention neuronal cell populations may not only produce those neurotransmitters whose effects or whose signal cascade is to be investigated.
  • the neuronal cell populations according to the invention are added with the addition of substances having a differentiating action by culturing neuronal precursor cells, such as, for. B. by culturing NT-2 progenitor cells using retinoic acid.
  • Differentiating substances are e.g. B. phorbol esters, di-butyryl-cAMP, 1-isobutyl-3-methylxanthine, growth factors such as TGF-alpha, EGF, FGF2 or IGF-I or neurotrophins such as NT-3, BDNF or NGF.
  • Suitable differentiated CNS neurons are then selected on the basis of neuron-typical markers and on the basis of differentiation markers, preferably on the basis of the dopamine, serotonin and adrenergic receptors.
  • specific antibodies that recognize these receptors are used, which can be fluorescence-labeled or magnetically labeled.
  • Suitable CNS neurons are then selected using FACS or immunomagnetic
  • a typical neuron marker z. B. dopamine, serotonin, noradrenaline, glutamate, GABA, adenosine or acetylcholine receptors or a mixture of these receptors can be used.
  • the dopamine and serotonin receptors are suitable as differentiation markers.
  • the neural cell populations can then be cultivated in a serum-free or neurotransmitter-free medium. Cultures that do not produce neurotransmitters or only produce undetectable amounts of neurotransmitters are then checked by detecting any secreted neurotransmitters in the culture medium, e.g. B. by analytical methods such as HPLC, GC, MS or immunological methods such as ELISA or RIA.
  • tyrosine hydroxylase inhibitors such as ⁇ -methyl-DL-p-tyrosine to inhibit dopamine or norepinephrine biosynthesis or tryptophan hydroxylase inhibitors such as p-chlorophenylalanine and p-ethynylphenylalanine to inhibit serotonin biosynthesis, can be prevented efficiently.
  • the populations generated in this way with a high proportion of differentiated CNS neurons offer many advantages.
  • a cell culture system that is close to healthy nerve cells is available, which can be used to clarify the most important neuron-specific signaling pathways and their control with added chemical substances.
  • suitable target genes and target proteins can be identified that are involved in the development of neuronal diseases.
  • the effect of added potential active substances on the target genes and target proteins can be tested with the help of the cell populations.
  • the screening results obtained with the claimed neuronal cell populations are reproducible. This is also due to the fact that work is carried out in precisely defined cell populations, with false signals or interfering effects of undifferentiated neuronal cells or neuronal cells of another type being excluded.
  • the test conditions can still be precisely regulated.
  • the effect of an added neurotransmitter or another neuroactive substance can be enhanced due to the increased receptor density on the cell surfaces.
  • the claimed cell cultures are easy to cultivate.
  • the neuronal cell populations enable the investigation of pathological processes starting with healthy neurons. It can be advantageous to grow the neuronal cell populations in a coculture with other cells of the nervous system in order to create a cellular environment that is as natural as possible.
  • Cells of the nervous system that are suitable for such cocultivation are neurons or glial cells, such as B. astrocytes, oligodendrocytes, microglial cells, or a combination of these cell types.
  • the present invention further relates to methods for finding target genes or target proteins.
  • a population according to the invention of differentiated neuronal cells or differentiated hNT, SK-N-SH, SK-N-MC or SH-SY5Y cell populations is cultivated in a serum-free or neurotransmitter-free medium.
  • the serum-free cultivation of neuronal cells is e.g. B. described in US 6 180 404 or in US 6 040 180.
  • the cell populations according to the invention can be cultivated in simple media made from Dulbecco's MEM / Nutrient Mixture F-12 (Ham) (DMEM / F12), insulin transferrin and selenium.
  • Target genes can then be identified by determining the change in the transcription rate of the total cell transcript, that is to say the entire mRNA isolated from the cell population, or one or more defined genes.
  • the mRNA of the neuronal cell population is isolated and, if desired, converted into cDNA.
  • the mRNAs or cDNAs can then be separated and determined quantitatively, it being advantageous to also determine the mRNA or cDNA of a reference population that was not exposed to a potentially neuroactive substance and to use it for comparison.
  • Potential target genes can also be determined by forming a subtractive cDNA library, the transcription rate of the neuronal population being compared with that of the reference population.
  • Target proteins can be identified by determining the change in the expression rate of the entire proteome or one or more defined proteins.
  • the determination can also be determined here in relation to the protein content in a reference population.
  • the determination of the protein content by means of 2D gel electrophoresis is particularly suitable, the proteins from the neuronal population being able to be separated electrophoretically together with differently labeled proteins, isolated from the reference population.
  • this method can also be used to investigate the effect of potentially neuroactive substances on a target gene or on a target protein.
  • the change in the transcription of the target gene or the change in protein expression is determined depending on the potentially neuroactive substance or mixture of substances.
  • neuroactive substances in particular neurotransmitters, such as. B. dopamine, serotonin, noradrenaline, glutamate, GABA, adenosine or acetylcholine, their agonists or antagonists understood.
  • the term also includes synthetic derivatives or analogues of these substances that are to be examined for their neuroactive effects.
  • Neuroactive substances can also oxidizing or reducing substances, such as. B. H 2 O 2 , vitamin C, vitamin E or estrogens. Mixtures of neuroactive substances can also be examined.
  • the neuroactive substances are usually added in a concentration of 1 X 10 "10 M to 1 X 10 " 3 M. Typical induction times are between one minute and 4 weeks, preferably at a temperature between 35 ° C and 38 ° C, in an incubator with a carbon dioxide content between 2.5% and 15%.
  • Typical induction times are between one minute and 4 weeks, preferably at a temperature between 35 ° C and 38 ° C, in an incubator with a carbon dioxide content between 2.5% and 15%.
  • the present invention furthermore relates to mixtures comprising neuronal cell populations according to the invention and the neuroactive substances or substance mixtures to be tested or cells which secrete such substances or substance mixtures.
  • Mixtures are preferred which have at least one neurotransmitter, such as. B. Contain dopamine, serotonin, noradrenaline, GABA, acetylcholine, adenosine, glutamate or a mixture of these neurotransmitters.
  • Mixtures which also contain a neurotransmitter agonist or antagonist are also preferred.
  • the mixtures are advantageously prepared in a serum-free or neurotransmitter-free medium.
  • heterologous genes which can be transcribed with vectors on the cell population according to the invention can also be investigated.
  • Another object of the present invention is a cellular
  • Screening system e.g. B. in the form of a kit, in which the claimed neural cell populations are contained.
  • Such cellular screening systems preferably contain a set of neurotransmitters which bind specifically to the selected receptors and can thus induce a neuron-typical signal in a controlled manner.
  • serum-free or neurotransmitter-free media can be added to the cellular screening system for the cultivation of the claimed neuronal cell populations.
  • Example 1 Production of the differentiated, neuronal cell population
  • NT precursor cells (Ntera2 / clone D1) (Stratagene) were induced for five weeks with 10 ⁇ M all-trans retinoic acid in DMEM / F12, supplemented with 10% FCS and 1% penicillin streptomycin (Andrews, PW, Dev. Biol ., 103, 285-293, 1984; Andrews et al, J. Lab. Invest, 50; 147-162, 1984).
  • the differentiation was checked by the presence of ⁇ -intemexin (Neurofilament 66), a type IV intermediate filament specific for mature CNS neurons, by means of Western blot.
  • 10 ⁇ g protein from differentiated NT neurons were separated on a 10% SDS gel, transferred to a PVDF membrane and incubated with an anti- ⁇ -internexin antibody.
  • the cells were treated with verse (1: 5000), trypsinized (0.05% trypsin / 0.53 mM EDTA) and mechanically separated from each other (pipetting up and down).
  • the cells were spurted 1: 6 and cultured in DMEM / F12, with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin for 2 days.
  • Morphological assessment 5% of the cells are round, glowing cells and correspond to the neuron phenotype. By trypsinizing for one minute (0.05% trypsin / 0.53 mM EDTA), mainly differentiated cells were detached.
  • an immunomagnetic selection method (Dynabeads) was used.
  • the cells were selected with antibodies against the differentiation markers dopamine D2 receptor and against serotonin receptor 5-HT2A and with the neuron-typical antibodies against the ⁇ 2-adrenergic receptors and against the adenosine receptor A2A.
  • the Eppendorf Cup with the suspension of cells and bead-coupled antibodies was positioned during the immunomagnetic selection process 1 cm from the Dynal magnet with a field strength of 1, 220 mTesla and waited for one minute until the Cells with the highest receptor density, ie cells with the most bead-coupled antibodies, have placed on the cup wall.
  • the suspension in the cup with the cells with a low receptor density was aspirated and discarded.
  • the cells with high receptor density are the differentiated neurons that are used for the gene induction experiments.
  • the vitality of the cells is> 95%. This cell population was sown on poly-D-lysine and Matrigel (1:30) coated cell culture dishes (1 - 2 x 10 4 per cm 2 ).
  • This population of differentiated neurons was first exposed to DMEM / F12 + 10% FCS + mitosis inhibitors (10 ⁇ M 5-fluoro-2-deoxyuridine, 10 ⁇ M uridine, 1 ⁇ M cytosine- ⁇ -D-arabinofuranoside) for 10 days and then for 1 day each cultivated in DMEM / F12 with 2% FCS or 0.5% FCS.
  • the lines were checked morphologically on day 13 after sowing: over 99% of the cells formed the neuron-typical offshoots.
  • the cell culture medium used did not contain any neurotransmitters and that the neuronal cell population itself did not produce any neurotransmitters.
  • the neuronal cell population was kept in serum-free medium from day 13 after sowing, to exclude effects from neurotransmitters in the serum.
  • the serum-free medium consists of DMEM / F12, 2.5 ⁇ g / ml insulin, 2.5 ⁇ g / ml transferrin and 2.5 ng / ml selenium. Since neurotransmitters max. 1000 Da are large, alternatively the serum was dialyzed with a dialysis tube with an exclusion volume of 1000 Da and 0.5% added to the medium.
  • the cell population is adapted in the above-mentioned serum-free or neurotransmitter-free medium for 3 days and kept in this medium during the gene expression experiment. In order to ensure constant concentrations of the neuroactive substances, the medium was changed daily and the neuroactive substances were added freshly.
  • control cells were treated identically, but without adding the
  • RNA isolation is carried out according to P. Chomzynski and N. Sacchi (Anal. Biochemistry 162, 156-159, 1987). The isolated RNA is dissolved in H 2 0 and its amount determined spectrophotometrically.
  • Total RNA was used to determine differences in the abundance of specific m-RNAs that were regulated by the neuroactive substances. For this, the total RNA (1 mg / ml) was first treated with DNase I (50 U / ml) at 37 ° C. for 30 min, then 10 ⁇ DNase termination mix was added, the same volume of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24: 1) added, mixed, centrifuged for 10 min to separate the phases (14000 rpm microcentrifuge) and the supernatant extracted again with chloroform. By adding 1/10 volume The RNA was precipitated on ice for 2 min with 2 M Na acetate (pH 4.5) and 2.5 volumes of ethanol. The DNase I-treated RNA was centrifuged at 14,000 rpm for 15 min, washed with 70% ethanol, dried and dissolved in H 2 O.
  • the first strand of cDNA is synthesized with oligo-dT ⁇ 2- ⁇ 8 , MMLV reverse transcriptase (20 U / ⁇ l) (1 hour, 37 ° C.).
  • This cDNA first strand was used according to Gubler & Hofmann (Gene, 25, 263, 1983) for the cDNA second strand synthesis.
  • a cDNA library was then synthesized, which was subjected to differential hybridization.
  • the MAP kinase-activated protein kinase-2 (Accession number U 12779) was found as a regulated gene in a macroarray experiment.
  • the neuronal cell population was incubated in serum-free medium with 50 ⁇ M dopamine (dissolved in PBS w / o Ca 2+ Mg 2+ ).
  • Control cells were treated with PBS in serum-free medium.
  • the total RNAs were prepared and in each case> 15 ⁇ g of them were used in the production of the gene-specific hybridization probe radioactively labeled with ⁇ - 32 P-dATP.
  • a dopamine-induced reduction in the expression of the MAP kinase-activated protein kinase-2 by 30% was found.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Populationen neuronaler Zellen, die Rezeptoren aus der Gruppe der Dopamin-Rezeptoren, der Serotonin-Rezeptoren und der adrenergen Rezeptoren enthalten und mindestens einen, an diese Rezeptoren bindenden, Neurotransmitter nicht produzieren. Die Zellpopulationen sind zum Auffinden neuronaler Targets zur Untersuchung neuronaler Erkrankungen und potentieller pharmazeutischer Wirkstoffe, insbesondere gegen neuronale Erkrankungen, geeignet. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Auffinden solcher Targets und Wirkstoffe.

Description

Zellpopulationen zur Auffindung neuronaler Targets und potentieller Wirkstoffe
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft neuartige Zellpopulationen, die zum Auffinden neuronaler Targets zur Untersuchung neuronaler Erkrankungen und potentieller pharmazeutischer Wirkstoffe, insbesondere gegen neuronale Erkrankungen, geeignet sind sowie Verfahren zum Auffinden solcher Targets und Wirkstoffe.
Das Gehirn ist ein präzise reguliertes Netzwerk aus mehr als 10 Milliarden einzelner Nervenzellen. Störungen der komplexen Regulationsmechanismen äußern sich in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson bzw. in neuropsychiatrischen Erkrankungen, wie Depression, Schizophrenie und manisch-depressiven Psychosen. Die Ursachen für Alzheimer und Parkinson sind noch größtenteils unbekannt. Beobachtet wird bei Parkinson ein Absterben der dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra und die Bildung von Lewybodies. Bei Alzheimer ist unter anderem das Absterben cholinerger Neurone sowie die Ablagerung des Amyloid-ß-Proteins (Aß) und die Hyperphosphorylierung des Tau- Proteins zu beobachten. Die bisher verfügbaren Medikamente können das Fortschreiten dieser Erkrankungen nicht verhindern und lindern nur vorübergehend die Symptome. Neuropsychiatrische Erkrankungen beruhen vermutlich auf Stoffwechselstörungen der Neurotransmitter, wie Dopamin und Serotonin, Glutamat, Noradrenalin und γ-Amino-buttersäure. Bekannte Medikamente beschränken sich auf die Ebenen der Rezeptor-Blockade, der Kontrolle der Tum-over-Rate und der Wiederaufnahme des Neurotransmitter in die Zelle.
Insgesamt haben pharmazeutisch wirksame Substanzen für neurodegenerative und neuropsychiatrische Erkrankungen folgende Limitierungen: Sie haben z. T. erhebliche Nebenwirkungen; bei manchen Patienten ist jedoch eine lebenslange Einnahme erforderlich.
Das Fortschreiten der neurodegenerativen Erkrankungen wird nicht verhindert. Die Wirkung der Psychopharmaka setzt erst mit einer Verzögerung von 2-6 Wochen ein.
Weiterhin werden im psychiatrischen Bereich für therapieresistente Patienten dringend neue Medikamente benötigt. Bei 30-50 % schizophrener Patienten wirken die verabreichten Medikamente nicht. Außerdem klagen zweidrittel der medikamentös therapierbaren Patienten wiederum über z. T. erhebliche
Nebenwirkungen. Bei depressiven Patienten sprechen 20 % auf die Medikamente nicht an. Darüber hinaus sind auch hier erhebliche Nebenwirkungen häufig.
Alternative Konzepte zielen darauf ab, Nervenzellen zu schützen (Nervenwachstumsfaktoren, Neuroimmunophylline, Antioxidantien) oder zu ersetzen (Zelltransplantation). Neue Ansätze sind Zelltransplantationen bei Parkinson bzw. APP-Prozessierungs-Interventionen, der Einsatz von Entzündungshemmern und die Immuntherapie gerichtet gegen ß-Amyloid zur Alzheimerbehandlung. Neue Konzepte bei neuropsychiatrischen Erkrankungen sind z. B. die Gabe von Melatonin, CRF-Blockern, Substanz P Antagonisten, Sigma-Rezeptoren-Blockern, Regulatoren der Cannabinoid-Rezeptoren und AMPAkinen. Alle bisher bekannten pharmazeutischen Wirkstoffe gegen Depression und Schizophrenie beeinflussen die Häufigkeit der Neurotransmitter im Gehirn. Die Erfolgsquoten bei der Behandlung dieser Krankheiten mit den bekannten Medikamente sind jedoch gering.
Demnach besteht großer Bedarf nach Medikamenten mit höherer Effizienz, Spezifität und Verträglichkeit. Die bisherigen ZNS-Medikamente wurden nur anhand weniger und vor allem altbekannter Targets entwickelt. Somit kommt der Identifizierung neuer potentieller Targets zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen eine Schlüsselrolle in der Zukunft zu.
Bei einem physiologischen Ansatz zur Target-Identifizierung wird häufig Patientenmaterial verwendet. Krankheitsassoziierte Gene werden unter anderem durch „linkage-Analysen" identifiziert. Nachteil dieser Strategie ist, dass neurodegenerative oder psychiatrische Erkrankungen in Ihrer Komplexität kaum erfasst werden können. So wird angenommen, dass bei psychiatrischen Erkrankungen bis zu 50 oder mehr krankheitsassoziierte Gene existieren, die nicht unbedingt immer in der gleichen Anzahl und Kombination an der Entstehung dieser Krankheiten beteiligt sind. Für die „linkage-Analyse" müssen zudem sehr genau definierte Patientenkollektive verwendet werden, was bei gegenwärtigem Wissenstand für psychiatrische Erkrankungen nicht befriedigend er üllt werden kann. Diese Strategien können darüber hinaus keine Erkenntnisse über die Entstehung und den Krankheitsverlauf liefern, es werden vor allem statistische Merkmale ermittelt.
Zur Targetidentifizierung wird häufig auch Patientenmaterial aus post-mortem Gehirngewebe verwendet. Durch Vergleiche der Genexpression in Gehirnen gesunder und erkrankter Menschen sollen relevante Gene identifiziert werden. Die Verwendung von Gehirngewebe als Untersuchungsgrundlage ist durch Abbauvorgänge im post-mortem Gewebe und durch Adaptionsprozesse, die im Gehirn durch die medikamentöse Therapie hervorgerufen werden, ebenfalls limitiert.
In dieser Hinsicht wäre es vorteilhaft ein Screeningsystem zur Auffindung und Untersuchung von neuronalen Targets zu etablieren, das nicht auf spezifischem post-mortem Gewebeproben basiert. Entsprechende Screeningsysteme, insbesondere im Hinblick auf Testsysteme, die auf neuronalen Zellkulturen basieren, sind bisher nicht bekannt und dies obwohl neuronale Zellkulturen seit längerem bekannt sind (z. B. NT-2-Zellkulturen US 5 175 103) und zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen anderweitig, z. B. zu Transplantationszwecken (z. B. US 5 792 900), genutzt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein zelluläres Testsystem zur Verfügung zu stellen, das einfach herstellbar und handhabbar ist und gleichzeitig geeignet ist, neuronale Targets oder Wirkstoffe zu Untersuchung oder Behandlung neuronaler Erkrankungen zu identifizieren und zu validieren. Die Aufgabe wird mit neuronalen Zellpopulationen enthaltend differenzierte ZNS- Neurone gelöst, die Rezeptoren aus der Gruppe der Dopamin- und Serotonin- Rezeptoren und der adrenergen Rezeptoren enthalten und mindestens einen Neurotransmitter der an einen dieser Rezeptoren bindet nicht oder in nicht nachweisbaren Mengen produzieren. Solche Zellpopulationen haben sich als geeignetes zelluläres Testsystem erwiesen, wobei die Identifizierung oder die Untersuchung von Zielgenen oder Zielproteinen unter kontrolliertem Zusatz der von der Zellpopulation nicht oder in nicht nachweisbaren Mengen selbst produzierten Neurotransmitter erfolgt.
Die neuronalen Zellpopulationen enthalten vorzugsweise weitere Rezeptoren aus der Gruppe der GABA-, Acetylcholin-, Adenosin- und Glutamat-Rezeptoren, wobei die Zellpopulationen in diesen Fällen mindestens einen Neurotransmitter, der an einen dieser Rezeptoren bindet, nicht oder nur in nicht nachweisbaren Mengen produzieren.
Insbesondere sind Zellpopulationen geeignet, die eine erhöhte Oberflächendichte der Rezeptoren tragen, deren daran bindende Neurotransmitter sie nicht produzieren.
Bevorzugte neuronale Zellpopulationen produzieren selbst keine Neurotransmitter, deren Wirkung untersucht werden soll. Von der Zellpopulation produzierte, nicht nachweisbare Mengen an Neurotransmittem können allerdings toleriert werden. Die Nachweisgrenzen, bei einer Überprüfung des Neurotransmittergehalts mittels ELISA liegen z. B. für Dopamin bei einer Konzentration von 3,3 X 10"10M, für Serotonin bei 3,5 X 10"8M und für Noradrenalin bei 3,5 X 10"9M. Werden diese Werte nicht überschritten ist die Zuverlässigkeit der Geninduktionsexperimente nicht gefährdet, wenn die Zugabe des jeweiligen Neurotransmitters in einer um den Faktor zehn über diesen Grenzen liegenden Konzentration erfolgt. Liegen die von den Zellpopulationen produzierten Neurotransmitterkonzentrationen oberhalb der jeweiligen Nachweisgrenzen ist es empfehlenswert die Neurotransmitterproduktions der Zellpopulation durch Zusatz von Hemmstoffen zu unterbinden. In den hier beschriebenen Beispielen wurden Zellkulturproben, die 3 X 104 Zellen enthielten auf die Produktion von Dopamin, Serotonin und Noradrenalin mittels ELISA getestet. Nach 24 h konnte keiner der genannten Neurotransmitter in den getesteten Zellpopulationen nachgewiesen werden.
Bevorzugt sind Populationen aus neuronalen Zellen für die Rezeptoren aus der Gruppe Dopamin D2-, Serotonin (5HT-2A)-, -2-adrenerger, Adenosin A2A- Rezeptor kennzeichnend sind.
Bevorzugt sind Zellpopulationen die aus neuronalen Primärzellkulturen, aus immortalisierten neuronalen Zellkulturen oder aus neuronalen Zelllinien gewonnen werden, sofern sie Dopamin- und Serotoninrezeptoren und adrenerge-Rezeptoren tragen. Besonders bevorzugte Zellpopulationen enthalten Zellen des Typs hNT (zu Neuronen differenzierte NT-2 Zellen, z.B. beschrieben in Andrews, Dev. Biol., 103; 285 - 293, 1984; Andrews et al,: J. Lab. Invest., 50; 147-162, 1984), SK-N-SH (Biedler et al.: Cancer Res., 33, 2643-2652, 1973; Spengler et al., In Vitro, 8, 410, 1973; Seeger et al., Cancer Res., 37, 1364-1371 , 1977), SK-N-MC (Biedler et al.: Cancer Res., 33, 2643-2652, 1973; Spengler et al., In Vitro, 8, 410, 1973; Seeger et al., Cancer Res., 37, 1364-1371 , 1977) oder SH-SY5Y (Biedler et al.: Cancer Res., 33, 2643-2652, 1973; Biedler et al., Cancer Res., 38, 3751-3757, 1978; Ross et al., J. Natl. Cancer Inst., 71 , 741-747, 1983). Bevorzugte Zellpopulationen bestehen weiterhin aus Zellen, die aus einer der Zelllinien NT-2, SK-N-SH, SK-N-MC oder SH- SY5Y erzeugt und selektiert werden können. Besonders bevorzugt sind neuronale Zellpopulationen die einen hohen Anteil an postmitotischen differenzierten ZNS- Neuronen enthalten.
Die beanspruchten differenzierten neuronalen Zellpopulationen dürfen weiterhin die zur Untersuchung verwendeten Neurotransmitter nur in nicht nachweisbaren Mengen selbst produzieren. Als Neurotransmitter im Sinne dieser Erfindung werden natürlich vorkommende Botenstoffe verstanden, die eine rezeptorgebundene Signalkaskade auslösen können. Insbesondere fallen unter den Begriff des
Neurotransmitters Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, Glutamat, GABA, Adenosin oder Acetylcholin. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die erfindungsgemäßen neuronalen Zellpopulationen nur solche Neurotransmitter nicht selbst produzieren dürfen, deren Wirkung bzw. deren Signalkaskade untersucht werden soll.
Die erfindungsgemäßen neuronalen Zellpopulationen sind unter Zusatz von differenzierend wirkenden Substanzen durch Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen, wie z. B. durch Kultivierung von NT-2-Vorläuferzellen unter Verwendung von Retinsäure, erhältlich. Differenzierend wirkende Substanzen sind z. B. Phorbolester, Di-butyryl-cAMP, 1-lsobutyl-3-methylxanthin, Wachstumsfaktoren, wie TGF-alpha, EGF, FGF2 oder IGF-I oder Neurotrophine, wie NT-3, BDNF oder NGF. Die Selektion geeigneter differenzierter ZNS-Neuronen erfolgt dann anhand von neuronentypischen Markern und anhand von Differenzierungsmarkern, bevorzugt anhand der Dopamin-, Serotonin- und adrenergen Rezeptoren. Dazu werden spezifisch, diese Rezeptoren erkennende Antikörper verwendet, die fluoreszenzmarkiert oder magnetisch markiert sein können. Die Auslese geeigneter ZNS-Neurone erfolgt dann mittels FACS oder mittels immunomagnetischer
Verfahren, wobei solche Neuronen stark bevorzugt ausselektiert werden, die eine hohe Dichte an den Marker-Rezeptoren aufweisen. Dabei kann z. B. Stärke und Entfernung des für die immunomagnetische Trennung verwendeten Magneten oder die Intensität des Fluoreszenzlichtes beim FACS genutzt werden. Die so selektierten Zellpopulationen enthalten einen Anteil von über 99% an differenzierten neuronalen Zellen mit den selektierten Rezeptoren in der gewünschten Oberflächenhäufigkeit. So können z. B. mit einem Magneten mit einer Feldstärke von 1 bis 1,5 mTesla bei kurzem Einwirken von 0,5 bis 2 Min. aus einer Entfernung von 0 bis 1 ,5 cm immunomagnetisch Zellen angereichert werden, die eine hohe Oberflächendichte an den selektierten Rezeptoren besitzen. Für die Selektion wurde das Pan-Cellection- System (Dynal) angewandt.
Als neuronentypische Marker können z. B. Dopamin-, Serotonin-, Noradrenalin-, Glutamat-, GABA-, Adenosin- oder Acetylcholin-Rezeptoren oder einer Mischung dieser Rezeptoren genutzt werden. Als Differenzierungsmarker sind die Dopamin- und Serotonin-Rezeptoren geeignet. Im Anschluss können die neuronalen Zellpopulationen in serumfreiem bzw. neurotransmitterfreiem Medium kultiviert werden. Die Überprüfung von Kulturen, die keine Neurotransmitter oder nur in nicht nachweisbaren Mengen an Neurotransmittern produzieren, erfolgt dann durch Nachweis etwaiger sezernierter Neurotransmitter im Kulturmedium, z. B. durch analytische Methoden, wie HPLC, GC, MS oder immunologische Methoden, wie ELISA oder RIA. Falls die selektierte Zellpopulation zu große Mengen eines bestimmten Neurotransmitters sezerniert, kann dessen Produktion durch Zusatz von spezifischen Hemmstoffen, wie z. B. von Tyrosinhydroxylase-Hemmern wie α-Methyl-DL-p-tyrosin zur Hemmung der Dopamin- oder Noradrenalin-Biosynthese oder Tryptophan-Hydroxylase-Hemmer wie p-Chlorophenylalanin und p-Ethynylphenylalanin zur Hemmung der Serotonin- Biosynthese, effizient unterbunden werden.
Die so erzeugten Populationen mit einem hohen Anteil an differenzierten ZNS- Neuronen bieten vielfältige Vorteile. So steht erstmals ein gesunden Nervenzellen nahekommendes Zellkultursystem zur Verfügung, anhand dem die wichtigsten neuronenspezifischen Signalwege und deren Kontrolle mit zugeführten chemischen Substanzen aufgeklärt werden kann. Dadurch lassen sich geeignete Zielgene und Zielproteine identifizieren, die an der Entstehung neuronaler Erkrankungen beteiligt sind. Darüber hinaus können mit Hilfe der Zellpopulationen die Wirkung von zugeführten potentiellen Wirkstoffen auf die Zielgene und Zielproteine getestet werden. Dabei sind die Screeningergebnisse, die mit den beanspruchten neuronalen Zellpopulationen gewonnen werden gut reproduzierbar. Dies liegt auch daran, dass in genau definierten Zellpopulationen gearbeitet wird, wobei Fehlsignale oder störende Effekte nichtdifferenzierter neuronaler Zellen oder neuronaler Zellen eines anderen Typs ausgeschlossen werden. Da in Zellkultur gearbeitet wird sind weiterhin die Versuchsbedingungen präzise regulierbar. Dabei kann aufgrund der erhöhten Rezeptordichte an den Zelloberflächen die Wirkung eines zugesetzten Neurotransmitters oder einer anderen neuroaktiven Substanz verstärkt werden. Darüber hinaus sind die beanspruchten Zellkulturen einfach kultivierbar. Einer der größten Vorteile ist jedoch, dass die neuronalen Zellpopulationen die Untersuchung von pathologischen Prozessen beginnend bei gesunden Neuronen ermöglichen. Dabei kann es vorteilhaft sein, die neuronalen Zellpopulationen in einer Kokultur mit anderen Zellen des Nervensystems zu züchten, um ein möglichst natürliches zelluläres Umfeld zu erzeugen. Zellen des Nervensystems, die für eine solche Kokultivierung in Frage kommen sind Neuronen oder Gliazellen, wie z. B. Astrocyten, Oligodendrocyten, Mikrogliazellen, oder eine Kombination dieser Zelltypen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Auffindung von Zielgenen oder Zielproteinen. Dazu wird eine erfindungsgemäße Population differenzierter neuronaler Zellen oder differenzierte hNT-, SK-N-SH-, SK-N-MC- oder SH-SY5Y- Zellpopulationen in serumfreiem oder neurotransmitterfreiem Medium kultiviert. Die serumfreie Kultivierung von neuronalen Zellen ist z. B. in US 6 180 404 oder in US 6 040 180 beschrieben. Darüber hinaus ist eine Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellpopulationen in einfachen Medien aus Dulbeccos MEM / Nutrient Mixture F-12 (Ham) (DMEM/F12), Insulin Transferrin und Selen möglich.
Danach erfolgt die Zugabe eines potentiellen neuroaktiven Stoffes oder eines potentiellen neuroaktiven Stoffgemisches oder von potentiell neuroaktive Stoffe oder Stoffgemische sezernierenden Zellen.
Die Identifizierung von Zielgenen kann dann durch die Bestimmung der Änderung der Transkriptionsrate des Gesamtzelltranskripts, also der gesamten aus der Zellpopulation isolierten mRNA, oder eines oder mehrerer definierter Gene erfolgen. Dazu wird die mRNA der neuronalen Zellpopulation isoliert und falls gewünscht in cDNA überführt. Die mRNAs oder cDNAs können dann aufgetrennt und quantitativ bestimmt werden, wobei es vorteilhaft ist, die mRNA oder cDNA einer Referenzpopulation, die keinem potentiell neuroaktiven Stoff ausgesetzt war, ebenfalls zu bestimmen und zum Vergleich heranzuziehen. Potentielle Zielgene können auch durch Bildung einer subtraktiven cDNA-Bank ermittelt werden, wobei die Transkriptionsrate der neuronalen Population mit der der Referenzpopulation verglichen wird. Die Identifizierung von Zielproteinen kann durch die Bestimmung der Änderung der Expressionsrate des Gesamtproteoms oder eines oder mehrerer definierter Proteine erfolgen. Die Bestimmung kann hier ebenfalls gegenüber dem Proteingehalt in einer Referenzpopulation bestimmt werden. Besonders geeignet ist die Bestimmung des Proteingehalts mittels 2D-Gelelektrophorese, wobei die Proteine aus der neuronalen Population zusammen mit unterschiedlich markierten Proteinen, isoliert aus der Referenzpopulation, elektrophoretisch getrennt werden können.
Dieses Verfahren kann in einer erweiterten Ausführungsform auch zur Untersuchung der Wirkung von potentiell neuroaktiven Stoffen auf ein Zielgen oder auf ein Zielprotein eingesetzt werden. Dazu wird die Änderung der Transkription des Zielgens oder die Änderung der Proteinexpression in Abhängigkeit des potentiell neuroaktiven Stoffes oder Stoffgemisches bestimmt.
Als neuroaktive Stoffe werden insbesondere Neurotransmitter, wie z. B. Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, Glutamat, GABA, Adenosin oder Acetylcholin, deren Agonisten oder Antagonisten verstanden. Unter den Begriff fallen aber auch synthetische Derivate oder Analoga dieser Stoffe, die auf ihre neuroaktive Wirkung hin untersucht werden sollen. Neuroaktive Stoffe können auch oxidierend oder reduzierend wirkende Stoffe, wie z. B. H2O2, Vitamin C, Vitamin E oder Ostrogene, sein. Auch Mischungen der neuroaktiven Stoffe können untersucht werden.
Die neuroaktiven Stoffe werden in der Regel in einer Konzentration von 1 X 10"10 M bis 1 X 10"3 M zugegeben. Typische Induktionszeiten liegen zwischen einer Minute und 4 Wochen bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 35°C und 38°C, in einem Brutschrank bei einem Kohlendioxidgehalt zwischen 2,5% und 15%. Zum Auffinden und zur Untersuchung neuronaler Targets haben sich z. B. mit obigem Verfahren selektierte hNT-Zellen als geeignet erwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Mischungen umfassend erfindungsgemäße neuronale Zellpopulationen und die zu testenden neuroaktiven Stoffe oder Stoffgemische oder solche Stoffe oder Stoffgemische sezernierenden Zellen. Bevorzugt sind Mischungen die zumindest einen Neurotransmitter, wie z. B. Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, GABA, Acetylcholin, Adenosin, Glutamat oder eine Mischung dieser Neurotransmitter enthalten. Ebenso sind Mischungen bevorzugt, die darüber hinaus einen Neurotransmitter-Agonisten oder -Antagonisten enthalten. Die Mischungen werden vorteilhaft in serumfreien bzw. neurotransmitterfreiem Medium angesetzt.
Weiterhin kann auch der Effekt von mit Vektoren transkribierbar eingebrachten heterologen Genen auf die erfindungsgemäße Zellpopulation untersucht werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein zelluläres
Screeningsystem, z. B. in Form eines Kits, in dem die beanspruchten neuronalen Zellpopulationen enthalten sind. Bevorzugt enthalten solche zellulären Screeningsysteme einen Satz an Neurotransmittern, die gezielt an die selektierten Rezeptoren binden und damit ein neuronentypisches Signal kontrolliert induzieren können. Weiterhin können dem zellulären Screeningsystem serumfreie bzw. neurotransmitterfreie Medien zur Kultivierung der beanspruchten neuronalen Zellpopulationen beigefügt werden.
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1 : Herstellung der differenzierten, neuronalen Zellpopulation
Zur Differenzierung wurden NT-Vorläuferzellen (Ntera2/Klon D1) (Stratagene) fünf Wochen mit 10 μM all-trans Retinsäure in DMEM/F12, supplementiert mit 10 % FCS und 1 % Penicillin-Streptomycin, induziert (Andrews, P.W., Dev. Biol., 103, 285-293, 1984; Andrews et al, J. Lab. Invest, 50; 147-162, 1984). Die Differenzierung wurde über die Anwesenheit von α-lntemexin (Neurofilament 66), einem für reife ZNS- Neurone spezifisches Typ IV-intermediäres Filament, mittels Western Blot überprüft. Dazu wurden 10 μg Protein von differenzierten NT-Neuronen über ein 10 % SDS- Gel aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert und mit einem anti-α- Internexin-Antikörper inkubiert.
Nach der 5-wöchigen Differenzierung wurden die Zellen mit Versen (1 :5000) behandelt, trypsiniert (0.05 % Trypsin/ 0.53 mM EDTA) und mechanisch voneinander getrennt (Auf-und Abpipettieren). Die Zellen wurden 1 :6 gespurtet und in DMEM/F12, mit 10 % FCS und 1 % Penicillin-Streptomycin 2 Tage kultiviert. Morphologische Beurteilung: 5% der Zellen sind runde, leuchtende Zellen und entsprechen dem Neuronen-Phänotyp. Durch einminütiges Trypsinieren (0,05% Trypsin / 0,53 mM EDTA) wurden hauptsächlich differenzierte Zellen abgelöst. Um eine hochreine (> 99%) Zellpopulation differenzierter Neurone zu erhalten, wurde ein immunomagnetisches Selektionsverfahren (Dynabeads) angewandt. Dazu wurden die Zellen mit Antikörpern gegen die Differenzierungsmarker Dopamin D2 Rezeptor und gegen Serotonin-Rezeptor 5-HT2A und mit den neuronentypischen Antikörpern gegen den α2-adrenergen Rezeptoren und gegen den Adenosinrezeptor A2A selektioniert. Um Zellen mit hoher Rezeptordichte anzureichern, wurde das Eppendorf-Cup mit der Suspension aus Zellen und bead-gekoppelte Antikörpern während des immunomagnetischen Selektionsprozesses 1 cm vom Magnet der Firma Dynal mit einer Feldstärke von 1 ,220 mTesla entfernt positioniert und eine Minute gewartet bis sich die Zellen mit der höchsten Rezeptordichte, d.h. Zellen mit den meisten bead- gekoppelten Antikörpern, an die Cupwand angelegt haben. Die Suspension im Cup mit den Zellen mit einer niedrigen Rezeptordichte wurde abgesaugt und verworfen. Die Zellen mit hoher Rezeptordichte sind die differenzierten Neurone, die für die Geninduktions-Experimente eingesetzt werden. Die Vitalität der Zellen beträgt > 95 %. Diese Zellpopulation wurden auf Poly-D-Lysin und Matrigel (1 :30) beschichtete Zellkulturschalen ausgesät (1 - 2 x 104 pro cm2).
Zunächst wurde diese Population differenzierter Neurone 10 Tage in DMEM/F12 + 10% FCS + Mitose-Hemmer (10 μM 5-Fluor-2-deoxyuridin,10 μM Uridin, 1 μM Cytosin-ß-D-Arabinofuranosid) und dann jeweils 1 Tag in DMEM/F12 mit 2% FCS bzw. 0,5 % FCS kultiviert. Am Tag 13 nach Aussaat wurden die Zeilen morphologisch kontrolliert: Über 99 % der Zellen bildeten die neuronen-typischen Ausläufer aus. Damit die Zugabe von Neurotransmittem in den nachfolgenden Geninduktions- Experimenten aussagekräftige Ergebnisse liefert, wurde sichergestellt, dass das verwendete Zellkulturmedium keine Neurotransmitter enthält und die neuronale Zellpopulation selbst keine Neurotransmitter produziert. Deshalb wurde die neuronale Zellpopulation ab Tag 13 nach Aussaat in serumfreiem Medium gehalten, um Effekte durch im Serum befindliche Neurotransmitter auszuschließen. Das serumfreie Medium besteht aus DMEM/F12, 2,5 μg/ml Insulin, 2,5 μg/ml Transferrin und 2,5 ng/ml Selen. Da Neurotransmitter max. 1000 Da groß sind, wurde alternativ das Serum mit einem Dialyseschlauch mit dem Ausschlussvolumen von 1000 Da dialysiert und zu 0,5 % dem Medium zugesetzt.
Dass die neuronale Zellpopulation selbst keine Neurotransmitter sezemieren, wurde in Zellkulturüberständen (24 h) mittels ELISA bzw. RIA überprüft. 3 X 104 Zellen sezemieren kein Dopamin (Dopamin-RIA von IBL, Hamburg, Nachweisgrenze <50 pg/ml), Serotonin (Serotonin-ELISA von IBL, Nachweisgrenze <6,2 ng/ml) und Noradrenalin (Noradrenalin-ELISA von IBL, Nachweisgrenze <0,6 ng/ml).
Beispiel 2: Identifizierung regulierter Gene
Die Zellpopulation wird in oben genanntem serumfreien bzw. neurotransmitterfreien Medium 3 Tage adaptiert und während des Genexpressions-Experiments in diesem Medium gehalten. Um gleichbleibende Konzentrationen der neuroaktiven Stoffe zu gewährleisten, wurde täglich das Medium gewechselt und die neuroaktiven Stoffe frisch hinzugegeben.
Die Kontrollzellen wurden identisch behandelt, jedoch ohne Zugabe des
Neurotransmitters. Nach der Induktion wird das Medium abgesaugt und die Zellen sofort in einer Denaturierungslösung aus 4 M Guanidinium-Thiocyanat, 25 mM Na- Citrat pH 7.0, 0.5 % Sarkosyl und 0.1 M 2-Mercaptoethanol lysiert. Die RNA- Isolierung erfolgt gemäß P. Chomzynski und N. Sacchi (Anal. Biochemistry 162, 156-159, 1987). Die isolierte RNA wird in H20 gelöst und ihre Menge spektrophotometrisch bestimmt.
Die Gesamt-RNA wurde verwendet, um Unterschiede in den Häufigkeiten spezifischer m-RNAs zu ermitteln, die durch die neuroaktiven Stoffe reguliert wurden. Dazu wurde die Gesamt-RNA (1 mg/ml) zunächst 30 min mit DNase I (50 U/ml) bei 37°C behandelt, anschließend 10 X DNase-Terminationsmix zugegeben, gleiches Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben, gemixt, 10 Min zur Phasentrennung zentrifugiert (14000 Upm Microzentrifuge) und der Überstand nochmals mit Chloroform extrahiert. Durch Zugabe von 1/10 Volumen 2 M Na-Acetat (pH 4.5) und 2,5 Volumen Ethanol wurde die RNA 10 min auf Eis gefällt. Die DNase I behandelte RNA wurde 15 min bei 14000 Upm zentrifugiert, mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in H20 gelöst.
Ausgehend von 1 - 10 μg Gesamt-RNA wird der cDNA-Erststrang mit Oligo-dTι2-ι8, MMLV-Reverse Transcriptase (20 U/μl) (1 Stunde, 37 °C) synthetisiert. Dieser cDNA-Erststrang wurde gemäß Gubler & Hofmann (Gene, 25, 263, 1983) zur cDNA- Zweitstrang Synthese verwendet. Anschließend wurde eine cDNA-Genbank synthetisiert, die einer differentiellen Hybridisierung unterzogen wurde. Die Gesamt-RNA wurde ebenfalls zu analytischen Methoden wie Differential Display, SAGE (= Serial Analysis of Gene Expression) bzw. zur Analyse von Macro- oder Microarrays verwendet.
Mit dieser vorgenannten Prozedur wurde in einem Macroarray-Experiment die MAP- Kinase-activted protein kinase-2 (Accession number U 12779) als reguliertes Gen gefunden. Dazu wurde die neuronale Zellpopulation in serumfreiem Medium mit 50 μM Dopamin (in PBS w/o Ca2+ Mg2+ gelöst) inkubiert. Kontrollzellen wurden in serumfreiem Medium mit PBS behandelt. Nach 6 h wurden die Gesamt-RNAs präpariert und jeweils > 15 μg davon in die Herstellung der genspezifischen mit α-32P-dATP radioaktiv markierten Hybridisierungssonde eingesetzt. Nach Hybridisierung der Sonden mit Clontech Atlas 1.2 II Array bzw. Atlas Neurobiology Array wurde eine Dopamin-induzierte Reduktion der Expression der MAP-Kinase- activted protein kinase-2 um 30 % festgestellt.
Beispiel 3: Identifizierung regulierter Proteine
Mit der Variation der Parameter wie in Beispiel 2 beschrieben wurde nach differentiell regulierten Proteinen gesucht. Dazu wurden die Zellen nach Induktion zweimal mit PBS (w/o Ca2+ Mg2+ ) gewaschen und in Proteinaufschluss-Puffer abgekratzt. Anschließend wurde 5 X 10 Sekunden mit Ultraschall behandelt (Sonicator Branson) und die Rohlysate differentiell zentrifugiert. Die unterschiedlichen Fraktionen werden für 2D-Gelelektrophorese mit anschließender Detektion verwendet. Unterschiedliche Häufigkeiten einzelner Proteine werden densitometrisch ermittelt.

Claims

Patentansprüche:
1. Populationen neuronaler Zellen enthaltend differenzierte ZNS-Neuronen, die Rezeptoren aus der Gruppe der Dopamin-, Serotonin-Rezeptoren und der adrenergen Rezeptoren enthalten und mindestens einen an diese Rezeptoren bindenden Neurotransmitter nicht oder in nicht nachweisbaren Mengen produziert.
2. Population neuronaler Zellen gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die differenzierten ZNS-Neuronen humane Neuronen sind.
3. Populationen gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die differenzierten ZNS-Neuronen zusätzlich GABA-, Acetylcholin-, Adenosin-, und/oder Glutamat- Rezeptoren enthalten.
4. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Population eine erhöhte Oberflächendichte mindestens eines Rezeptors aufweist, dessen Neurotransmitter von der
Population nicht oder in nicht nachweisbarer Menge produziert wird.
5. Population gemäß Anspruch 4 erhältlich durch immunomagnetische Selektion mit bead-markierten Antikörpern gegen einen Rezeptor, dessen Neurotransmitter nicht oder in nicht nachweisbaren Mengen von der
Population produziert wird, wobei die Selektion durch magnetische Trennung mit einem Magneten mit einer Feldstärke von 1 bis 1 ,5 mTesla bei 0,5- bis zweiminütigem einwirken des Magnetfelds aus 0 bis 1 ,5 cm Entfernung erfolgt.
6. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Population zu über 99% differenzierte neuronale Zellen enthält.
7. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren aus der Gruppe der Dopamin D2-, Serotonin (5HT-2A)-, α-2-adrenergen, Adenosin A2A-Rezeptoren ausgewählt ist.
8. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Population aus neuronalen Primärzellen, aus immortalisierten neuronalen Zellen oder aus neuronalen Zelllinien die zumindest Rezeptoren aus der Gruppe der Dopamin-Rezeptoren und der
Serotonin-Rezeptoren und der adrenergenen Rezeptoren enthalten, selektioniert sind.
9. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Population aus einer NT-2-, SK-N-SH-, SK-N-MC- oder SH-SY5Y- Zelllinie selektioniert ist.
10. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Population postmitotische differenzierte ZNS- Neuronen enthalten.
11. Populationen gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die neuronalen Zellen mit Vektoren, enthaltend transkribierbare heterologe Gene, transformiert sind.
12. Kokulturen enthaltend Populationen aus neuronalen Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und anderen Zellen des Nervensystems.
13. Kokulturen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die anderen Zellen des Nervensystems Neuronen oder Gliazellen oder eine Kombination solcher Zellen sind.
14. Mischungen enthaltend eine Population neuronaler Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und mindestens einem potentiellen neuroaktiven Stoff oder Stoffgemisch oder mindestens einem potentielle neuroaktive Stoffe oder Stoffgemische sezernierenden Zelltyp.
15. Mischung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiellen neuroaktiven Stoffe Neurotransmitter sind oder die potentiellen neuroaktiven Stoffgemische mindestens einen Neurotransmitter enthalten.
16. Mischung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiell neuroaktiven Stoffe oder Stoffgemische natürlich vorkommende oder synthetische Neurotransmitter-Agonisten oder -Antagonisten enthalten.
17. Mischung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiellen neuroaktiven Stoffgemische eine Mischung aus Neurotransmitter und Neurotransmitter-Agonisten oder -Antagonisten enthalten.
18. Mischung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die potentiellen neuroaktiven Stoffe oder Stoffgemische ausgewählt aus der Gruppe Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, GABA, Acetylcholin, Adenosin, Glutamat oder einer Mischung daraus enthalten.
19. Mischung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der neuroaktive Stoff eine oxidativ oder reduktiv wirkende Substanz ist oder das neuroaktive Stoffgemisch mindestens eine oxidativ oder reduktiv wirkende Substanz enthält.
20. Mischung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19 mit einem serumfreiem oder neurotransmitterfreiem Medium.
21. Mischungen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20 enthaltend einen Hemmstoff zur Hemmung der Biosynthese eines Neurotransmitters.
22. Verfahren zur Herstellung von Zellpopulationen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , umfassend folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung differenzierter ZNS-Neurone, b) Selektion der Zellpopulation anhand der Häufigkeit von neuronentypischen Markern und anhand der Häufigkeit von Differenzierungmarkem mittels FACS oder immunomagnetischer Verfahren.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Zellkulturen, die mindestens einen Neurotransmitter nicht oder nur in nicht nachweisbaren Mengen sezemiem, identifiziert werden oder dass Hemmstoffe zur Hemmung der Biosynthese dieser Neurotransmitter der neuronalen Zellpopulation zugesetzt werden.
24. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Selektion neuronentypische Rezeptoren als Differenzierungsmarker genutzt werden.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion anhand neuronentypischer Marker aus der Gruppe Dopamin-, Serotonin-, Noradrenalin-, Glutamat-, GABA-, Adenosin- oder Acetylcholin-Rezeptoren oder einer Kombination dieser Rezeptoren erfolgt.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion anhand eines Dopamin- oder Serotonin-Rezeptors als Differenzierungsmarker erfolgt.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass als differenzierte ZNS-Neurone neuronale Primärzellen, neuronale Zelllinien oder immortalisierte neuronale Zellen eingesetzt werden.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die differenzierten ZNS-Neuronen hNT-, SK-N-SH-, SK-N-MC- oder SH- SY5Y -Zellen sind.
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die differenzierten ZNS-Neuronen aus neuronalen Vorläuferzellen aus der Gruppe der neuronalen Primärzellen, der neuronalen Zelllinien, der NT-2-, SK-N-SH-, SK-N-MC- oder SH-SY5Y -Zellen oder der immortalisierten neuronalen Zellen unter Zugabe eines Differenzierungsfaktors erhältlich sind.
30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass mit Retinsäure differenzierte NT-2-Zellen selektioniert werden.
31. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion immunomagnetisch mit bead-markierten Antikörpern, gerichtet gegen mindestens einen Rezeptor durch 0, 5-minütiges bis zweiminütiges Einwirken eines Magnetfeldes mit einem Magneten mit einer Feldstärke von 1 bis 1 ,5 mTesla aus einer Entfernung von 0 bis 2 cm erfolgt.
32. Verfahren zur Auffindung und Untersuchung regulierter neuronaler Zielgene und Zielproteine umfassend folgende Verfahrensschritte: a) Kultivierung einer Popuplation neuronaler Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 1 1 oder von hNT-2-, SK-N-SH-, SK-N-MC- oder SH- SY5Y- Zellpopulationen in serumfreiem oder neurotransmitterfreiem Medium, b) Zugabe eines potentiellen neuroaktiven Stoffes oder eines potentiellen neuroaktiven Stoffgemisches oder potentiell neuroaktive Stoffe oder Stoffgemische sezernierende Zellen, c) Bestimmung der Änderung der Transkriptionsrate des Gesamtzeiltranskripts oder eines oder mehrerer definierter Zielgene oder Bestimmung der Änderung der Expressionsrate des Gesamtproteoms oder eines oder mehrerer definierter Zielproteine.
33. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das serumfreie Medium aus DMEM/F12, Insulin, Transferin und Selen besteht.
34. Verfahren gemäß Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Transkriptionsänderung durch differenzielle mRNA- oder cDNA-Bestimmung einer Population aus neuronalen Zellen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 , die mindestens einem potentiell neuroaktiven Stoff oder potentiell neuroaktiven Stoffgemisches oder potentiell neuroaktive Stoffe oder Stoffgemische sezernierenden Zellen ausgesetzt waren mit einer Population aus diesen neuronalen Zellen, die nicht diesem potentiell neuroaktiven Stoff oder diesem potentiell neuroaktivem Stoffgemisch ausgesetzt waren, erfolgt.
35. Verfahren gemäß Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Expressionsänderung durch Proteomanalyse, einer Population aus neuronalen Zellen gemäß den Ansprüchen 1 bis 1 1 , die mindestens einem potentiell neuroaktiven Stoff oder eines potentiell neuroaktiven Stoffgemisches oder potentiell neuroaktive Stoffe oder Stoffgemische sezernierenden Zellen ausgesetzt waren mit einer Population aus diesen neuronalen Zellen, die nicht diesem potentiell neuroaktiven Stoff oder diesem potentiell neuroaktivem Stoffgemisch ausgesetzt waren, erfolgt.
36. Zelluläres Screeningsystem für die Rezeptor-abhängige Modulation der Transkription und Expression enthaltend Populationen aus neuronalen Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 1 1.
37. Zelluläres Screeningsystem gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die neuronalen Zellen Rezeptoren zumindest aus der Gruppe der Dopamin-Rezeptoren, der Serotonin-Rezeptoren und der adrenergen Rezeptoren und einen Satz an diese Rezeptoren bindende Neurotransmitter enthalten.
8. Verwendung von Populationen neuronaler Zellen gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 11 zur Auffindung neuronaler Zielgene oder Zielproteine, zur Identifizierung und Untersuchung in neuronalen Zellen biologisch aktiver Substanzen oder zur Herstellung von Transplantaten zur Behandlung neu rodegenerativer Erkrankungen.
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