JPH07502121A - 血小板ＧＰＩＩＩａＰ１▲Ａ１▼およびＰ１▲Ａ２▼エピトープ、その調製並びに使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板ＣＰＩ　Ｉ　ＩａＰｌ”およびＰＩ”エピトープ、その調製並びに使用技 術分野 本発明は、ＧＰＩＪＪａと呼ばれる血小板表面の糖蛋白に関し、より具体的には 、ＧＰＩＩＩａ分子の部分であるＰＩＡと呼ばれる三次構造依存性抗原、その調 製および使用に関する。

従来技術 血小板抗原系、ＰＩＡは、２種の臨床的症候群、新生児免疫異常血小板減少症（ ＮＡＩＴ）および輸血後紫斑病（ＦＴＰ）と深く関わっている（Ａｓｔｅｒ、免 疫性血小板減少症、Ｋｕｎｉｃｋｉ　＆　Ｇｅｏｒｇｅ編、血小板の免疫学、３ ８７、フィラデルフィア、ペンシルバニア（＋９８９））　ｏＮＡ　Ｊ　Ｔは、 胎盤を通って移行した母体の血小板特異的抗体による血小板破壊の増加を伴う新 生児の出血性疾患で、新生児１０００人に１人の頻度で発生すると算定される（ Ｂｌａｎｃｈｅｔ　ｔｅら、Ｃｕｒｒ、　５ｔｕｄ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、Ｂｌｏ ｏｄ　Ｔｒａｎｆ、、　５２：８７　（＋９８６））　。ＦＴＰは、輸血後の血 小板不適合に対する抗体介在性血小板減少症である。白色人種ではＮＡＩＴおよ びＰＴＰの最も一般的な原因はＰＩ”変態抗原（アロアンチゲン）である。

抗ＰＩ”抗体誘発の原因であるアロアンチゲン決定基は、血小板膜ＧＰＩＩＩａ 上に存在するＣＫｕｎｉｃｋｉら、Ｍｏ１．１ｎｎｕｎｏ１．１６：３５３　（ ＋９７９））　、　Ｐ　Ｉ”およびＰＩ”表現型は、ＧＰＩＴＩａのｃＤＮＡ配 列の塩基＋９６にそれぞれチミジン（Ｔ）またはンチジン（Ｃ）が存在するかど うかによるＣＮｅＷｍａｎら、Ｊ、　ＣＨｒ＋、　１ｎｍｖｅｓ、、　８３：１ ７７８　（１９８９））。

Ｔ→Ｃの塩基変更は、成熟ＧＰＩＩ］ａの残基３３におけるロイシン／プロリン 多形性を生しる。ＧＰＩＩＩａのアミノ末端におけるロイシンからプロリンへの 多形性が、Ｐ　Ｉ　”／Ｐ　Ｉ　Ａ′血血止変態盟（アロタイプ）の原因で（Ｇ ｏｌｄｂｅｒｇら、Ｂｌｏｏｄ、７８：６８１　（１９８９））　、この多形性 を存する合成直線状ペプチドは抗ＰＩ”抗体と反応しなかったＣＦｌｕｇら、Ｂ ｌｏｏｄ、’７７：１９６４　（１９９１））。このことは、ロイシン３３／プ ロリン３３多形性は、全体的な折りたたみまたはＰＩ”エピトープの組み立での ための翻訳後プロセッシングに影響を及ぼしうることを提唱する。

要約 一つの特徴として、本発明は、ＰＩ”決定基を含むＧＰＩＩＩａアミノ酸残基配 列をコードする、約１９５から８００ヌクレオチド塩基対を含む単離されたＤＮ Ａ分子に関する。好ましくは、該ＤＮＡ分子は、配列番号：２、配列番号−６、 配列番号：１０、配列番号二１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配 列番号：１８を存する。

本発明はまた、ＰＩＡ２決定基を含むＧＰＩＩＩａアミノ酸配列をコードする、 約１９５から８００ヌクレオチド塩基対を含む単離されたＤＮＡ分子に関する。

該ＤＮＡ分子は、配列番号　４、配列番号、８、配列番号：２０、配列番号：２ ２、配列番号＝２４、配列番号＝２６、または配列番号＝２８を育する。

また別の特徴として、本発明は、血小板ＧＰＩＩＩａのｐｌＡ＋またはＰＩ”決 定基のアミノ酸残基配列をコードする外来ＤＮＡセグメントに機能しうるように 連結された発現ベクターを含む組換え分子に関し、該組換え分子は、宿主細胞を 形質転換させたとき、天然の血止ｔＦｉＧＰＴ　Ｅ　ＩａＰｌ”またはｐｌＡ！ 決定基のいずれかを発現させる。組換え分子で使用する外来ＤＮＡは、好ましく は、上記で説明した単離されたＤＮＡ分子である。好ましい発現ベクターはλｇ ｔ２２である。

更に別の特徴として、本発明は、天然の血小板ＧＰＩＴＩａのＰＩ”またはＰＩ Ａ′決定基を含むポリペプチドの調製方法に関し、該方法は、配列番号：１に示 した約残基ｌから約残基６５のアミノ酸残基配列をコードする外来ＤＮＡに機能 しつるように連結させた発現ベクターを含む組換え分子で形質転換した宿主細胞 を培養し、さらに、該ポリペプチドを発現させるために十分な時間、培養条件下 で該形質転換宿主細胞を維持することを含む。好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）である。好ましいベクターはλｇｔ２２で、好ましい外来ＤＮＡセグ メントは、配列番号：２．４．６．８、！０．１２．１４．１６．１８．２０． ２２．２４．２６および２８を含む群から選ばれる。該ポリペプチドは融合ポリ ペプチドとして発現させてもよい。

さらにまた、本発明は、配列番号・】のアミノ酸残基配列を含み、血小板ＧＰＩ ＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残基を含み、該ポリペプチドか血小板ＧＰＩ ＩＩａＰＩ”またはＰＩ”決定基を示す単離されたポリペプチドに関する。

好ましくは、該単離されたポリペプチドは、配列番号：３．５．７．９．１１． １５．１７．１９．２１．２３．２５．２７および２９から成る群から選ばれる アミノ酸残基配列を有する。

本発明はまた、第二のポリペプチドに機能しうるように連結した第一のポリペプ チドを含む、天然の血小板ＧＰ１１１ａＰ１に１またはＰＩＡ″決定基を免疫学 的に模倣した融合ポリペプチドに関する。第一のポリペプチドは、第二のポリペ プチドにペプチド結合させた、免疫学的に不活性なポリペプチドまたは蛋白のア ミノ酸残基配列である。第二のポリペプチドは、血小板ＧＰ（Ｉｌａの約６５か ら２６６アミノ酸残基（配列番号、ｌのアミノ酸残基配列を含む）を含み、天然 の血小板ＧＰＩＩＩａのＰＩ”またはＰＩ”決定基を表わしている。好ましい具 体例では、第一のポリペプチドは、β−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を有し 、第二のポリペプチドは、配列番号・３．５．７．９．１ＬＩ３．１５．１７． １９．２１．２３．２５．２７および２９から成る群から選ばれるアミノ酸残基 配列を有する。

さらにまた別の局面ては、本発明は、天然のＧＰＴＩＩａＰＩ＾１またはＰＩＡ ２決定基と免疫的に反応するヒトの抗体の存在について、ヒトの抗体含有身体サ ンプルを分析する方法に関する。該方法は以下の工程を含む：（ａ）以下の（ｉ ）または（１１）の抗原と人体サンプルを混合することによって免疫反応混合物 水溶液を作成し、 （ｉ）ＧＰＩｒｌａの配列を育し、約６５から２６６アミノ酸残基を含有する単 離ポリペプチド（該アミノ酸残基は、天然のＰＩ”またはＰＩＡ２決定基を表わ し、さらに配列番号＝１のアミノ酸残基配列を含む）または、（ｉ　ｉ）天然の ＰＩＡ′またはＰＩ”決定基を表すＧＰＩＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残 基のアミノ酸残基配列を含み、さらに配列番号・ｌのアミノ酸残基配列を含む融 合ポリペプチド。

（ｂ）該免疫反応混合物水溶液を、存在する抗体か該抗原と免疫反応を起こして 免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的分析条件下で維持し、さ らに （ｃ）形成された免疫反応生成物の存在を検出し、それによって該抗体の存在を 検出する。

該決定基が天然のＧＰＩＩＴａＰＩ”決定基である場合は、該抗原は、配列番号 ＝３、配列番号ニア、配列番号：ｌＩ、配列番号＝１３、配列番号＝１５、配列 番号：１７、配列番号・１９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機 能しつるように連結された配列番号：１１から成る群から選ばれる。

該決定基が天然のＧＰＩＩＴａＰｌ”決定基である場合は、該抗原は、配列番号 ：５、配列番号、９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列 番号：２７、配列番号、２９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機 能しうるように連結された配列番号２１から成る群から選ばれる。

好ましい具体例では、検出は以下によって遂行される：（ｉ）免疫反応生成物を ヒト抗体と免疫反応を起こす第二の抗体（この第二の抗体は機能しうるようにマ ーカーに連結されている）と混合して第二の混合物を形成し： （ｉｉ）該第二の抗体がヒト抗体と免疫反応を起こして第二の免疫反応生成物を 形成するために十分な時間、生物学的分析条件下で該第二の混合物を維持し；さ らに （ｉ　ｉ　ｉ）該第二の免疫反応生成物に結合したマーカー量をめ、それによっ て、天然のＧＰＩＩＩａＰＩ”またはＰＩ”決定基と反応するヒト抗体の存在を 決定する。好ましくは、該マーカーは、放射性、酵素、ビオチン、蛍光および化 学ルミネッセンス標識から成る群から選ばれ、該抗原は、ヒト体液サンプルと抗 原を混合する前に固形支持体に結合されている。

更に別の特徴として、本発明は、以下の工程を含む血小板の型分けの方法に関す る： （ａ）供与者からの血小板を水溶液中で抗体と混合（この抗体はＧＰＩＩＩａの ＰＩ”およびＰｌ”の両方とは結合しないが、いずれか一方と免疫反応を生じる ）し、免疫反応混合物水溶液を形成し： （ｂ）該免疫反応混合物水溶液を、該抗体が免疫反応を起こし免疫反応生成物を 形成するために十分な時間、生物学的反応条件下で維持し：さらに、（Ｃ）−切 の免疫反応生成物の存在を検出し、それによって、当該ＧＰ１１１ａＰ＋”また はｐｔ”決定基の一方または他方の存在および該血小板の型を検出する。

また別の好ましい具体例では、該抗体（ａ）はＧＰＩＴＩａＰｌ”決定基と免疫 的に反応するが、ＧＰＩＩＩａＰＩ”決定基と反応しないか、または、（ｂ）Ｇ ＰＩＩＩａＰ］Ａ′決定基とは免疫的に反応するが、ＧＰ　Ｔ　Ｉ　ＩａＰ　ｌ ”決定基とは反応しない。好ましくは該抗体は単クローン抗体である。

また別の特徴として、本発明は、以下のものを含む容器を含む血小板ＧＰＩＩＩ 　ａ　Ｐ　Ｉ　”決定基の型分けのためのキット形をした診断用分析系に関する 。該容器は、血小板ＧＰ　１１１　ａ（７）Ｐ　］”またはｐｌＡｔ決定基の１ つと免疫的に反応するか両方の決定基とは反応しない抗体の少な（とも１回の分 析に十分な量、および当該抗体と血小板の免疫反応を検出するための標識を含む 。該診断系はさらに第二の容器を含むことができ、これは、血止ｆＦｊ、ＧＰ　 Ｉ　Ｉ　１ａＰ　＋”またはＰＩ”決定基の他方と免疫的に反応するが両決定基 とは反応しない抗体を、少なくとも１回の分析に十分な員で含む。好ましくは、 該標識は該抗体に連結されてし）る。

さらにまた、本発明は、以下を含む、血小板ＧＰ　Ｔ　Ｉ　ＴａＰ　Ｉ”または ＰＩ”決定基に対するヒト抗体の存在を調べるキット形の診断分析系に関する： （ａ）以下の（１）または（２）の抗原を、少なくとも１回の分析を実施するた めに十分な量で含む容器： （ｉ）ＧＰＩＩＩａの配列を有しており、さらに、天然のＰＩ”またはｐ１Ａ２ 決定基を有し配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む６５から２６６アミノ酸残 基を含んている単離されたポリペプチド。

（ｉ　ｉ）天然のＰＩ”またはＰ門決定基を有するＧＰＩＩＩａの約６５から２ ６６アミノ酸残基のアミノ酸残基配列含み、さらに配列番号１゜のアミノ酸残基 配列を含む融合ポリペプチド：（ｂ）ヒト抗体と該抗原との免疫反応を検出する ための手段。

好ましくは、該抗原は、配列番号：３．５．７．９．１１．１３．１５．１７． １９．２Ｌ２３．２５．２７．２９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末 端に機能しうるように連結された配列番号：１１または２１から成る群から選ば れるアミノ酸残基配列を有し、該抗原は固形支持体に結合されている。ヒト抗体 の免疫反応を検出する手段は、別の種から得られる標識に連結させた抗ヒト抗本 明細書の１部を成す図面において： 図１は、λｇｔ２２発現ライブラリーの構築に用いた完全な長さの血小板ＧＰ１ １１ａのｃＤＮＡ（−格上の黒棒線）およびコードされた蛋白（灰色の長四角） を模式的に表している。コード蛋白のシグナル配列（黒四角）および膜通過ドメ イン（白四角）も該灰色の長四角内に描かれている。抗ＰＩ”抗体を用いてλｇ ｔ２２発現ライブラリーから単離されたＧＰＴＴＩａｃＤＮＡの領域は、模式的 に描かれたコード蛋白の下に棒線として描きこんだ。各ｃＤＮＡによってコード される残基の数は、各棒線の右に示した。

図２は、抗ＰＩＡＩ抗体と反応する、単離した最小発現クローンによってコード されるアミノ酸残基を単一文字コードで表している（配列番号：ｌｌおよび１３ ）。

該蛋白のシグナル配列には下線を施し、システィン（Ｃ）は箱内に示し、ロイシ チドは、該配列の下に点線で示しである。

印 アミノ酸残基配列：隣接する残基間のペプチド結合を介して結合した２個または ２個以上の−続きのアミノ酸残基でペプチドまたはポリペプチドを形成する。

アミノ酸残基配列は、その構成アミノ酸について便宜的に１文字まｔこ（ま３文 字の略語によって表される。アミノ酸について本明細書で用（Ｘられる略語（ま 、３７Ｃ。

Ｆ、　Ｒ，＠１．　８２２　（ｂ）（２）で提供されたもので、以下の対照表で 再現する： 時開　アミノ酸 １文字　３文字 Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　メチオニン Ａ　Ａｈａ　アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　セリン Ｐ　Ｐｒｏ　プロリン Ｋ　Ｌｙｓ　リジン ＨＨｉｓ　ヒスチジン Ｑ　Ｇｌｎ　グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｚ　Ｇｌｘ　Ｇｌｕおよび／またはＧｉｎＷ　Ｔｒｐ　）リブトファン ＲＡｒｇ　アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　アスパラギン Ｂ　Ａｓｘ　Ａｓｎおよび／またはＡｓｐＣＣｙｓ　システィン Ｊ　Ｘａａ　未特定 本明細書中のアミノ酸残基配列を構成する個々の残基はＬ型異性体である。また 、アミノ酸残基配列は翻訳後修飾アミノ酸、例えばヒドロキシルイＬグリコジル 化アミノ酸残基、またはジスルフィド結合を介して連結された残基を含むことが できる。さらに、アミノ酸残基配列は、１つまたは２つ以上の修飾アミノ酸まタ ハ通常テナイアミノ酸、例えば３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，＠　１．８２２　（ｂ）（４） 　に挙げられたようなものを含むことができ、これらは、本明細書に参考文献と して含まれている。アミノ酸残基配列は、その構成アミノ酸に対応して略号によ って表されている。

匹体：リガンドに免疫学的に結合するポリペプチドまたは蛋白。抗体は（ここで 用いられているように）、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫 学的に活性なフラグメントである。Ｆａｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）！お よびＦ、として当該技術分野で既知の分子部分が含まれる。典型的には、抗体は 、サイズが約６から約３４人の範囲のリガンドと、約１０’から１０　”Ｍ−’ の範囲で、さらにＩＯＩＩＭ−１の高さの会合定数で結合する。抗体は広範囲の リガンドと結合する。リガンドは小分子（例えばステロイド、プロスタグランジ ン）、バイオポリマー（例えば核酸、蛋白および多糖体）および合成ポリマー（ 例えばポリプロピレン）を含む。°抗体結合部位”とは、抗原と特異的に結合す る（免疫的に反応する）重鎮および軽鎖の可変および超可変領域を構成する抗体 分子の構造部分である。゛免疫的に反応する”という用語は、抗原決定基含有分 子（抗原）と抗体結合部位を含む分子（例えば完全抗体分子またはその一部分） との間の結合を指すために本明細書では用いられている。”抗原決定基”とは、 抗体結合部位によって免疫学的に結合される抗原の構造部分である。この用語は また、“エピトープおよび“決定基”と互換的に用いられる。抗体は、抗原の単 一のエピトープ（単クローン性）または複数のエピトープ（多クローン性）と結 合することができる。ポリペプチドによって誘発される抗体は、しばしば、蛋白 免疫原で生じる多クローン抗体と反応するエピトープより少ない数のエピトープ と免疫的に反応する。そのようなポリペプチド誘発抗体は、ここではオリゴクロ ーン抗体と呼ぶ。

融合蛋白またはポリペプチド：２つの異なる蛋白の各々から由来するアミノ酸ま 　残基配列を含む蛋白またはポリペプチド；それは、２つのコード配列が、それ らの読み枠が読み枠にしたがった状態で結合した組換え遺伝子の発現によって形 成される。少なくとも１つの完全な蛋白配列が発現物質に含まれる場合に融合蛋 白は得られ、一方、融合ポリペプチドには蛋白の一部分のみが存在する。このタ イプのハイブリッド遺伝子は、例えば分析が容易な蛋白で特定の遺伝子生成物を 標はその部分配列をもつ融合蛋白またはポリペプチドを得ることができる。また 別に、細胞によってそれが分泌されるように、外来シグナルペプチドに蛋白を結 合させることができる。にもかかわらず、上記の融合蛋白と融合ペプチドとの区 別は、特定の融合蛋白が考察されている場合を除き、融合ポリペプチドという用 語は、両方の種類の分子について本明細書では通常用いられる。

リガンド：特異的に特定の受容体（レセプター）分子と、通常、静電気力および ／または水素結合を介して結合する構造領域を有する分子。具体的なレセプター 分子は抗体結合部位である。

オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド／ＤＮＡセグメントニー重鎖または二本 鎖ヌクレオチドポリマー。ここで用いられているように、これらの用語は、天然 に生しる核酸、例えば、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ） 、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、イノシン（１）の池、３７Ｃ，Ｆ、　Ｒ， ９１当該アミノ酸残基において、１つの残基のα−アミノ基と隣接する残基のα −カルボニル基との間のペプチド結合によって隣接する残基が連結されている。

ポリペプチドの一次構造は、該ポリマーの一方の末端に第一アミン基を、他方の 末端にカルボン酸基を有する。したがって、ポリペプチドは下記の式によって表 すことができる。

式中、Ｒは与えられたアミノ酸に特徴的な側鎖で、ｉはポリマーを構成するアミ ノ酸残基の数を示し、その数は２または２以上である。融合ポリペプチドの場合 のように、ポリペプチドは１つまたは１つ以上の異なるアミノ酸残基配列を含む ことができる。また、水溶液中のポリペプチドは、該溶液のｐＨにしたがい通常 １つまたは１つ以上の双性イオン形をしている。

蛋白：およそ５０アミノ酸残基を含む単一のポリペプチドまたは一組の架橋ポリ ペプチド。蛋白は、同一のポリペプチド内または隣接ポリペプチド間で、例えば ジスルフィド架橋を介する化学的架橋を有することができる。蛋白がグリコジル 化されているとき、本明細書で考察されるＧＰＩＩＩａの場合のように、それは 糖蛋白と呼ばれる。

レセプター：別の分子（リガンド）と特異的に結合する構造領域を有する、生物 学的に活性を有する蛋白性分子。抗体結合部位はレセプターの１つのタイプであ る。

ベクター：細胞内で自律的に増殖できるＤＮＡ分子であって、それに対してＤＮ Ａセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）を機能しつるように連結 でき、その結果結合されたセグメントの増殖を可能にする。発現ベクターは、該 ＤＮＡセグメントが該ベクターのプロモーター配列の制御下にあるとき、適切に 形質転換された宿主細胞中において、１つまたは１つ以上のポリペプチドをコー ドするＤＮＡセグメントの発現を指令することができる。

本発明に関する研究の結果は２つの重要な示唆を含んでいる。第一に、抗ＰＩ” およびＰｉＡ！抗体に対するアロアンチゲンエピトーブは、成熟ＣＰＩＩＩａの アミノ末端６５残基に位置することがここで示されている。以前の研究は、ロイ ツン”／プロリン３１アミノ酸多形性は２つのＰＩＡ表現形の原因であるとい法 的に問題となっているアロ抗体に対するエピトープは明らかでない。

蛋白分解法を用いることによってＰＩ”エピトープの位置についての矛盾する■ 四ら、Ｂ１ｏｏ東　’７７：１９６４　（１９９１））。これらの証拠は、Ｐ１ １１エピトープは該多形性近傍に位置することを提案しているけれども、該多形 性を含む合成ペプチドを利用する最近の研究では、該合成ペプチドは抗ＰＩ”抗 体と結合することができず、抗ペプチド抗体は２種の表現形を区別することがで きないということが示されたＣＦｌｕｇら、貼匹〔互：ｌ９６４　（１９９１） ）。ここに提示されたデータは、抗ＰＩＡＩおよびＰＩ”抗体に対するエピトー プは、ＧＰＩＩｒａのアミノ末端７ｋＤａに、さらに、ＰＩＡ表現形の原因であ る実際の多形性の３３残基内に存在することを示した。フラッグらのデータとと もに本明細書に示したデータは、ＰＩ”およびｐＨｌエピトープは、非直線状で ＧＰ１１１ａ分子の折り畳みおよびそのＰ１＾含有決定基に依存している：すな わちこれらのエピトープは三次構造依存性であることを示している。

本研究における第二の重要な発見は、ｐｌＡＩおよびＰＩＡ！エピトープは、原 核系で発現できるということである。ＰＩ’エピトープの特徴を調べるために原 核系を利用するということは、還元感受性エピトープの発現に必要なジスルフィ ド７つのシスティンが、本研究で同定された血小板ＧＰＩＩＩａの小フラグメン トに存在する（図２）が、これは、これら残基間の局在スルフヒドリル結合ＣＣ ａ１ｖｅｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、’、２７３：６３　（１９９１）　） は、エピトープの組み立てに大きく関与し、システィンゝ−システィン４″ジス ルフィド結合は必要ではないことを示している。これらの結果は、最近ニューマ ンらによって提唱された（Ｎｅｗｍａｎリコシル化に左右されないことを証明し た。ＰＩＡＩおよびＰＩ”エピトープの小さな組換え模造物の大量生産の可能性 は、これらエピトープに対するアロ抗体および血小板の盟分けのための簡単な検 出分析の開発を可能にする。

Ｂ、ＰＩ”およびＰＩ”エピトープを免疫学的に模倣するポリペプチド血小板は 、その原形質膜の表面に糖蛋白を発現している。これら糖蛋白の１つは、ＧＰＩ ＩＩａと呼ばれる８４．５キロダルトンの成熟糖蛋白である。

本発明は、天然のＧＰＩＩＩａのＰｌ”およびＰＩ”エピトープの結合領域（エ ピトープまたは決定基）を免疫学的に類似する単離ポリペプチドに関する。

ここて用いられているように、“天然”という用語は、血小板上で発現するＰｉ ”決定基の一次、二次および三次構造を指す。

ＧＰＩＩＩａはアロアンチゲンである；すなわち、それぞれの個体はＧＰＩＩＩ ａの異なる形態を発現する。ここで問題となっているアロアンチゲン決定基はＰ ＩＡと命名されている。

ＧＰｌｌＴａの１形態は、該成熟糖蛋白のアミノ末端からアミノ酸残基３３位に ロイシン（Ｌｅｕ）残基を有する。ＧＰＴＩＩａのこの形態の抗原決定基はＰＩ 　Ａｌ決定基と呼ばれる。

発現されるＧＰＩＴＩａの第二のアロアンチケン形は３３位のＬｅｕ残基の代わ りにプロリン（Ｐ　ｒ　ｏ）残基を存する。ＧＰＩＴＩａのこの第二の形態のア ロアンチゲン決定基はＰＩ”決定基と呼ばれる。

したがって、１つの具体例では、天然のＰＩＡｌまたはｐｌＡ！決定基を免疫学 的に模倣するポリペプチドカ泪的とされる。本発明のポリペプチドは、抗天然Ｐ ｉＡ１またはＰＩＡ２抗体と免疫的に反応するが両方とは反応しない。したがっ て、目的とするポリペプチドは、天然のＰＩ”エピトープのそれを十分に模倣す る一次、二次および三次構造を有し、免疫学的に天然のエピトープを模倣：すな わち天然のエピトープと免疫的に反応する抗体と免疫的に反応する。目的とされ る単離ポリペプチドは、したがって、天然のＰＩ’エピトープ（決定基）の一方 または他方を表わしていると判断される。適切なヒト抗体組成物の調製は以下で 考察する。

天然のＰＩＡｌまたはＰＩ”決定基を免疫学的に模倣する、目的とするポリペプ チドは、ヒト血止ｔｆｆＧＰＴＩＩａのアミノ酸残基配列のＰＩ’含有部分と同 一または（以下に述べるように）保存的に置換されたアミノ酸残基配列を含む。

目的とするポリペプチドは、アミノ酸残基の１位から約２６６位の、ＧＰＩＩＩ ａの”切り詰められた″アミノ酸残基配列を含み、天然のＰＩ”またはＰＩＡ″ 決定基の範囲であるアミノ酸残基配列を含む。目的とするポリペプチドは、ＧＰ ＩＴｒａ配列の約６５から約２６６アミノ酸残基を含む。特に好ましいポリペプ チドは、成熟ＧＰ７１１ａ配列のおよそ６５アミノ酸残基、すなわちＧＰＩＩＩ ａの１位から６５位を含むが、またアミノ末端の２６残基を含むＧＰｌｌｌａの シグナルペプチドの配列も含むことができる（すなわちポリペプチドはアミノ酸 残基−２６位で始まる残基を含むことができる）。

意図するポリペプチドはまた、免疫学的に不活性な間隙充填（連結）アミノ酸残 基配列、例えばβ−ガラクトシダーゼ配列（約１２００残基）、マルトース結合 蛋白（ＭＢＰ）配列（約１０５残基）または１ａｃＺα遺伝子産物のαペプチド （約１０５残基）を、当該免疫学的に不活性な配列が該ポリペプチドの免疫学的 結合特性を、本明細書で述べるように実質的に干渉しない限り（すなわち免疫学 的に不活性である限り）含むことができる。さらにまた、“ベクター誘導“アミ ノ酸残基も、本明細書で考察されるように、意図するポリペプチドの一方の端ま たは両端に含むことができる。

好ましいポリペプチドはＰＩＡ決定基を免疫学的に模倣し、ＧＰＴＩＩａの６５ 残基から２６６残基を含み、さらに、成熟蛋白のアミノ酸残基１位から６５位の 、ＧＰＩＴｌａに存在するＰＩ”またはｐｌＡｔ決定基のアミノ酸残基配列を含 む。

ＰＩ”決定基のアミノ酸残基配列を含む好ましいポリペプチドは、配列番号。

７に示されている。本発明はまた、配列番号＝７のアミノ酸残基配列を含む６５ から約２６６残基を存するポリペプチドで、その残りの残基はＧＰＩＩＩａのア ミノ酸残基配列であるポリペプチドを意図する。

そのような単離ポリペプチドの典型例は、配列番号：３、配列番号：１１．配列 番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７および配列番号：１９に示したア ミノ酸残基配列を含む。

ＰＩ”決定基のアミノ酸残基配列を含む好ましいポリペプチドは配列番号・９に 示されている。本発明はまた、配列番号：９のアミノ酸残基配列を含む、ＧＰｌ ｌｌａの６５から約２６６残基を有するポリペプチドを意図する。

そのような単離ポリペプチドの典型例は、配列番号：５、配列番号＝２１、配列 番号：２３、配列番号・２５、配列番号：２７および配列番号：２９に示したア ミノ酸残基配列を含む。

好ましくは、本発明で意図されるポリペプチドは、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ）のような原核宿主細胞で組換え体として発現される。したがって、天然のＰ Ｉ”またはＰＩＡ！決定基を免疫学的に模倣する好ましいポリペプチドは、該ポ リペプチドをコードするベクターで形質転換された大腸菌で発現される。この点 についての好ましいポリペプチドは、配列番号：６に示したＤＮＡセグメント（ これは配列番号＝７のポリペプチドをコードする）を含む発現ベクターで形質転 換された大腸菌で発現される。また別の好ましいポリペプチドは、配列番号二８ に示したＤＮＡセグメント（このＤＮＡセグメントは配列番号＝９のポリペプチ ドをコートする）を含む発現ベクターで形質転換された大腸菌で発現される。こ れらおよび他の発現ベクターを以下で極めて詳細に説明する。

本発明のまた別の局面は、天然のＰＩ”またはＰＩ”決定基を免疫学的に模倣す る融合ポリペプチドである。他の場所で考察するように、ＰＩ”またはＰＩ”決 定基を免疫学的に模倣する組換えポリペプチドはまた、また別の免疫学的に不活 性な蛋白（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはマルトース結合蛋白）のアミノ酸 配列の全体または一部に機能しつるように連結して、したがって融合ポリペプチ ドとして発現させることもできる。

ここで融合ポリペプチドと呼ぶ本題のポリペプチドは、免疫学的に不活性な蛋白 の全体または一部分のアミノ酸残基配列を含む第二のアミノ酸残基配列に機能し つるように連結された、天然のｐｌＡＩまたはＰＩＡ２決定基のアミノ酸残基配 列および三次構造を含む第一のアミノ酸残基配列を含む。アミノ酸残基配列は、 該配列が１つまたは１つ以上の共存結合によって（例えば直接的ペプチド結合ま たはペプチド結合させた連結アミノ酸配列を介在させることによって）結合され ているとき、第二のアミノ酸残基配列に“機能しつるように連結されている”と 言う。通常、第一および第二のアミノ酸残基配列は、ベクターによって導入され る１つまたはそれ以上の残基をもつペプチド結合させた第三のアミノ酸残基を介 して共に連結されている。

好ましいＰＩ”融合ポリペプチドは、免疫学的に不活性な蛋白の全部または一部 のアミノ酸残基配列のカルボキシ末端に機能しつるように連結したＰＩＡ′決定 基のアミノ酸残基配列を含む。融合ポリペプチドの長さは、ＰＩ”決定基、免疫 学的に不活性な蛋白、さらに場合によって存在する、付加的なベクター導入連結 アミノ酸残基配列のそれぞれの長さによって決定される。

好ましい融合ポリペプチドは、ＰＩ”抗原のアミノ末端にβ−ガラクトシダーゼ 蛋白の一部分を含む。意図される特定の融合ポリペプチドは、機能しうるように 読み枠にしたがってＰＩＡフードＤＮＡセグメントに繋ぎ合わせたλｇｔ２２フ ァージベクターを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換した大腸菌の発現産物である 。該発現ＤＮＡは上記で考察したような目的のポリペプチドをコードする。

また別の好ましい融合ポリペプチドは、マルトース融合蛋白（ＭＢＰ）が目的の ポリペプチドのアミノ末端に融合されている融合蛋白である。ＭＢＰ含有融合蛋 白は、機能しうるように読み枠にしたがってＭＡＬ”ｃ２またはＭＡＬ”ｐ２プ ラスミドベクターにューイングランドバイオラブより入手可能）に繋ぎ合わされ ているＰＩＡコードＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を用いて発現させること ができる。ベクターＭＡＬ”ｃ２またはＭＡＬ”ｐ２から発現させた融合蛋白は 、蛋白分解性血液因子Ｘａと反応させ、ＭＢＰ部分を除去し、本発明の低分子量 のＰＩＡ決定基含有ポリペプチドを提供することができる。

本明細書で考察する本発明のいずれの単離ＤＮ八へ列も、本明細書で考察する上 記のまたは他の発現ベクターの１つまたは他のものに、以下に述べるように連結 させ、続いて適切な宿主を形質転換して目的の融合ポリペプチドの発現を得る。

典型的なベクター導入連結配列は、目的の融合ポリペプチドを発現させる組換゛ 　え分子を構築させるために用いられるＤＮＡ分子のエンドヌクレアーゼ制限切 断に利用されるヌクレオチド配列の発現によって形成される。したがって、例え ば本明細書で考察する典型的なＰＩ”コードＤＮＡ配列は、５ａｌｌ制限酵素認 識部位に近接し、λｇｔ２２の５ａｌＴ部位でクローニングされる。この５ａ１ １部位は該ベクターにおいてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ１部位に近接している。し たがって、発現された融合ポリペプチドは、ＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基に加え 、これら制限部位から発現されるアミノ酸残基を含んでいた。

分子生物学において習熟した者なら誰でも、いずれのポリペプチドも、ここで述 べたように免疫学的に不活性である限り、さらに、発現物質の不溶化（ＳＤＳの 非存在下で非拡散性）をもたらす、例えばシスティンのような残基並びに例えば トリプトファンおよびフェニルアラニン等の残基を含まない限り、または他の方 法でその免疫反応性を抑制しない限り、実質的にいずれのポリペプチドも連結配 列として用いることができることは明白であろう。連結配列（本明細書では時に スペーシング配列ともいう）は、ｌ残基からおよそ１２００残基を含むことがで きるが、後者は、融合ポリペプチドまたは融合蛋白がβ−ガラクトシダーゼのカ ルボキシ末端に連結されて発現される場合である。

典型的には、融合ポリペプチドを含む本題のポリペプチドは、大腸菌のような原 核宿主によって発現されるときにはグリコジル化されない。しかしながら、本発 明のポリペプチドは真核細胞によって製造することができ、その場合にはそれは グリコジル化されうる。また、本題のポリペプチドは、結果として得られる分子 が所望の特性を表す限り、種々の変ｆＬ例えば挿入、欠失、対立遺伝子変種にお いて存在しつるようなアミノ酸の保存的置換を含むことができる。本明細書でい う°所望の特性”とは、ここで述べたように、未変更ポリペプチドのそれと同一 または類似の免疫反応特性を修飾ポリペプチドが有することを含む。

このポリペプチドがアミノ酸残基配列に保存的置換を含む場合は、該置換アミノ 酸残基は、また別の生物学的に類似のアミノ酸残基によって置き換えられ、その 結果、生じたポリペプチドは未置換のアミノ酸残基配列と組成的に異なるアミノ 酸残基配列を有する。保存的置換の幾つかの具体例は、イソロイシン、バリン、 ロイシンまたはメチオニンのような親水性残基の別の親水性残基への置換を含む 。

また、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アス パラギン等の極性残基は、この群のまた別の種類と保存的に置換することができ る。

また別の局面の保存的置換を含むポリペプチドは、置換アミノ酸残基が未置換の 元のアミノ酸残基に置き換えられる場合に生じる。置換アミノ酸の例は３７Ｃ。

Ｆ、Ｒ，＠１．　８２２　（ｂ）　（４）で見出すことができるが、これらは参 考文献として本明細書に含まれている。本題のポリペプチドが、１つまたは１つ 以上の保存的置換を除いて天然のアポ蛋白の配列に対応するアミノ酸残基配列を 存するとき、好ましくは、天然のアポ蛋白のアミノ酸残基の約４０％未満、より 好ましくは約２０％未満か該ポリペプチドにおいて置換されている。

周知のように、蛋白またはポリペプチドにプロリン残基が存在するとき、配列に 捩れを生じ、これは−次構造だけでなく二次および三次構造の相違に繋がる。

実際ＧＰ１１１ａのロイシン”／プロリン１３置換は、ＰＩ”およびＰＩ”アロ アンチゲン決定基の間の相違をもたらす。このように、別の残基のために置き換 えられたプロリン残基は保存的置換ではない。

本発明のポリペプチドは、当業者に既知のペプチド合成技術のいずれによっても 合成することができる。利用可能な該技術のいくつかの要旨は、スチュアードと ヤングの文献（Ｊ、　Ｍ、　５ｔｕａｒｄ　＆　Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ、　” ペプチド固相合成”（”　５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ’）　Ｗ、比Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｃｏ、、サンフランシスコ（１９６９ ））、マインホーファーの文ＭＯ，Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ、“ホルモン蛋白および ペプチド１（”Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ”　２巻、４６ページ、アカデミツクプレスにューヨーク’）　＋９８３）お よび米国特許１４６３１２１１号で見出すことができるが、これらは参考文献と して本明細書に含まれている。通常、これらの技術はメリフィールド（Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ、　ＪＡＣ３，８５：２１４９　（１９６３））が記載したような 固相技術を用いる。また別に、本題ポリペプチドは、２つの小さなポリペプチド を、例えばペプチド結合またはジスルフィド結合を介して直接共役反応によって 製造することができる。

しかしながら目的のポリペプチドにおける７つのシスティンの存在のために、本 題ポリペプチドは、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって合成される。そのよ うな組換え技術は、所望のポリペプチドが本例の場合のように比較的大きい場合 （例えば長さが約５０残基より大）は特に好ましい。本題ポリペプチドを製造す るために組換え技術が用いられる場合、所望のポリペプチドまたは該ポリペプチ ドの前駆体をコートするＤＮＡセグメントは、その後の発現のために予め選ばれ たベクターに繋ぎ合わされる。

好ましい本題ポリペプチドは大腸菌によって発現される。したがって、大腸菌細 胞によって行われる一切の翻訳後修飾を含む保存的に置換されたポリペプチドも また意図されている。したがって、本題のポリペプチドは、ファージλｇｔ２２ またはＭＡＬ”ｃ２もしくはＭＡＬ？１′ｐ２のようなベクターを含む組換え分 子で形質転換された大腸菌によって発現させることができる。

Ｃ，ＤＮＡセグメント 本発明のＤＮＡセグメント（目的のＤＮＡセグメント）は前述の本題ポリペプチ ドをコードする。ＤＮＡセグメントは、下記で述べるようにポリメラーゼ・チェ ーン・リアクション（ＰＣＲ）で作成した場合のように、高度な操作に利用可能 な分断され”単離された”化学的物質種であるべきである。ここで考察するすべ てのＤＮＡセグメントは、５゛および３°の両末端を育する。

また別に、単離された本題のＤＮＡセグメントは、クローニングし、または続い て適切な宿主で発現させる場合のように、ベクターに機能しつるように繋ぎ合わ せることができる。周知のように、該ＤＮＡセグメントは、本題ポリペプチドま たは本題融合ポリペプチドの発現のためにベクターに読み枠にしたがって共存結 合させるとき、ベクター（ご機能しつるように繋ぎ合わされる”。さらに、ＤＮ Ａセグメントが機能しうるように発現ベクターに繋ぎ合わされるとき、該ＤＮＡ セグメントの発現がプロモーター配列の制御下にあるように、該プロモーター配 列が存在する。機能しつるように繋ぎ合わされた本題ＤＮＡセグメントを含むベ クターは下記で極めて詳細に考察する。

好ましい単離ＤＮＡセグメントは、本題ポリペプチド（例えば配列番号ニアまた は配列番号−９のアミノ酸残基配列）をコードする少なくとも１９５塩基対（ｂ ｐ）のヌクレオチド配列を含む。ＰＩ”またはｐ＋Ａｔ決定基のアミノ酸残基配 列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２または配列番号＝４に示した ようにＧＰＩＩＩａの約８００ヌクレオチド塩基対までを含むことができる。

１つの具体例では、本発明の単離ＤＮＡ分子は、ＰＩＡＩ決定基を含むＧＰＩＩ Ｉａのアミノ酸残基配列をコードする約１９５から約８００ヌクレオチド塩基対 （ｂ　ｐ）を含む。好ましくは、このＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列は、配列 番号・３、配列番号、７、配列番号：ｌｌ、配列番号：１３、配列番号：１５、 配列番号：１７または配列番号：１９である。これらのアミノ酸残基配列をコー ドする単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：２、配列番号＝６、配列番号：１０ 、配列番号：１２、配列番号＝１４、配列番号：１６および配列番号：１８にそ れぞれ示されている。

また別の具体例では、本発明の単離ＤＮＡ分子は、ＰＩ〜決定基を含むＧＰＩＩ Ｔａのアミノ酸残基配列をコードする約１９５から約８００ヌクレオチド塩基対 を含む。好ましくは、このＧＰＩｌｌａのアミノ酸残基配列は、配列番号：５、 配列番号：９、配列番号＝２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号＝ ２７または配列番号：２９である。これらのアミノ酸残基配列をコードする単離 ＤＮＡ分子は、配列番号：４、配列番号二８、配列番号＝２０、配列番号＝２２ 、配列番号＝２４、配列番号：２６および配列番号：２８にそれぞれ示されてい る。

本題の単、ｌｌＤＮＡセグメントまたは、以下で考察する組換えＤＮＡ分子とし てベクターに繋ぎ合わされたそのセグメントは、ＰＩＡＩまたはｐｌＡ！決定基 のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基をコードするコドン、すなわちベクター導入 残基または配列もまた含むことができる。これらの他のコドンおよび発現ポリペ プチドのコードされたアミノ酸残基は、先に述べたスペーシング（連結）配列を 構成する。

したがって、目的のポリペプチドは、本題の単離ＤＮＡセグメントによってコー ドすることができる。発現された融合ポリペプチドの場合のように、しばしば目 的のポリペプチドの一部分はベクターによって与えられる。とはいえ、ベクター および制限部位の適切な選択によって、本発明の単離ＤＮＡセグメントは、スペ ーシングアミノ酸残基配列のない所望のポリペプチドをコードすることもできる 。

本発明の単離ＤＮＡセグメントの全長は、少なくとも前述のＰＩ”またはＰＩ” 決定基をコードする配列が存在する限り、殆どの場合選択の問題である。

例えば、千から数千の塩基対が発現終止コドンの下流に存在しつる。同じように 、Ｐｉ”またはＰＩ”決定基発現開始コドンの上流に千から数千またはそれ以上 の塩基対か存在しつる。ただし、本題ＤＮＡセグメントがＰＩ”またはＰＩ”決 定基を、β−ｇａ上遺伝子およびβ−１１上遺伝子の制御配列部分同様そこに含 まれている、該発現読み枠が維持されていなければならない。

上記に述べたＤＮＡセグメントに匹敵する（相補的な）ＲＮＡセグメントもまた 目的とされる。この具体例では、ＲＮＡセグメントはＲＮＡベクター（例えばウ ィルスＲＮＡ）に周知のように繋ぎ合わせることができる。

本題のＤＮＡセグメントは、化学的技術、例えば周知のホスホトリエステル法（ Ｍａｔｔｅｕｃｉら、ＪＡＣ３，１０３：３１８５　（１９８１）　）で容易に 合成することができる。

ＤＮＡセグメントを化学的に合成することによって、鋳型のポリペプチドのアミ ノ酸残基または配列のどのような所望の置換、挿入または欠失も、該当する変更 を該ＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列に施すことによって容易に提供するこ とができる。

化学合成技術に加え、酵素的技術によっても本発明のＤＮＡセグメントを製造す ることができる。したがって、予め限定された認識配列でＤＮＡ分子を切断する 制限酵素を、本題ポリペプチドをコードするより大きなりＮＡ分子からＤＮＡフ ラグメントを単離するために用いることができる。典型的には、この方法で産生 されるＤＮＡフラグメントは粘着“張り出し′末端を有し、それによって、−重 鎖のヌクレオチド配列は該分子の二本鎖領域を越えて伸長する。そのような粘着 末端の存在は平滑端ＤＮＡ分子よりしばしば好ましいが、平滑端ＤＮＡも、１つ の平滑端および１つの張り出し末端を有するフラグメントの場合のように用いる ことができる。典型的に平滑端を提供する、比較的特異性の少ない酵素（例えば ＤＮＡ分解酵素Ｉ　（ＤＮアーゼＩ）も用いることができ、ここでも実際に用い た。続いて、単離ＤＮＡフラグメントを適切なベクターに機能しうるように繋ぎ （クローニングし）、それによって、目的ＤＮＡセグメントをベクターに取り入 れることができる。

目的ポリペプチドをコードするＲＮＡセグメントを用いる場合はいつでも、該Ｒ ＮＡセグメントを含むＲＮＡ分子は、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ　（ｃＤ ＮＡ）に転写される。続いて該ｃＤＮＡ分子を発現ベクターに繋ぎ、これで適切 な宿主を形質転換し、所望の本題ポリペプチドを得ることができる。

上記のアミノ酸残基配列をコードするＤＮＡセグメントに開始コドンおよび終止 コドンを提供することができ、また開始および終止コドンの１つまたは両方をよ り大きなりＮＡ分子（例えば該ＤＮＡセグメントに機能しうるように繋いだベク ター）によって与えることができる。本発明の所望のポリペプチドは、開始およ び終止コドンを慎重に配置することによって生成することができる。例えば、ヌ クレオチド配列は該セグメントの３′および５′末端の１つまたは両方に付与す ることができ、その結果、Ｎ−末端またはＣ−末端のアミノ酸残基配列を含むこ とによって、前述のエピトープアミノ酸残基配列より大きいポリペプチドが発現 される。さらに、レギュレーター、プロモーターおよびオペレーター座位は、所 望の場合、目的ＤＮＡセグメントの５゛末端に与えられる。

標準的な化学的または酵素的合成技術に加え、このＤＮＡセグメントはポリメラ ーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いて生成することができる。

ＰＣＲでは、鋳型の核酸の特定部分に相補的なプライマー分子を用い、該標的に 相補的な核酸領域を含むプライマーの伸長生成物を形成する反応によって、特異 的なポリ核酸標的が転写される。鋳型と伸長プライマーを単離した後、各プライ マーの伸長生成物は鋳型として機能し、特異的に相補的プライマー分子とアニー リングする。生じた伸長が開始された鋳型はさらに進行する伸長反応のための基 質として機能する。これらの工程は繰り返され（好ましくは自動反復工程を用い て）、それによってプライマーがハイブリダイズする最初のポリ核酸標的は指数 関数的に増幅される。ＰＣＲを行う方法は既に詳しく記載されている（例えば米 国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号参照、これらの記述は参考文 献として本明細書に含まれている）。

標的ＤＮＡセグメントは、しばしば極めて少量しか存在しないので、ＰＣＲは標 的ＤＮＡセグメントの十分な増幅をもたらし、標的セグメントの効率的なりロー ニングおよび発現を可能にする。

ＰＣＲは、各増幅段階で重合反応を開始するために正方向および逆方向の一本鎖 オリゴヌクレオチドブライマー分子を用いるので、少なくとも標的ＤＮＡの一部 分に相補的な正方向および逆方向のプライマー分子が必要とされる。さらに必要 とされるものは、標的ＤＮＡセグメントに相補的なプライマー分子の領域に近接 する、予め選択した制限酵素の認識部位をもつヌクレオチド配列を有するプライ マー分子である。

該プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長生成物の合成を開始させるた めに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライ マーの由来を含む多くの因子に左右される。例えば、鋳型配列の複雑さにもよる が、ポリヌクレオチドブライマーは、典型的には１５から２５、またはそれより 多いヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドを含むことができる。

ポリヌクレオチドブライマーでは８ヌクレオチドでも有効に使用できることが報 告されたＣ３ｔｕｄｉｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ、　８６：６９１７−２１　（１９８９）　）。

短いプライマー分子では、十分に安定なハイブリダイゼーション複合体を形成し 、プライマー伸長を開始させるためにより低い温度が一般に必要である。

用いられるプライマーは、増幅させる各配列の鎖に対して実質的に相補的である ように選択される。したがって、プライマーは、その対応する鋳型配列と非恣意 的にハイブリダイズするために十分に相補的なヌクレオチドを含む。それゆえ、 プライマー配列のハイブリダイズする領域は鋳型と正確に相補的でないかもしれ ない。

例えば、非相補的ポリヌクレオチドは、実質的にそのポリヌクレオチドと相補的 なプライマー配列の残りの部分とともに、プライマーの５°末端に結合すること ができる。そのような非相補的なポリヌクレオチドは蛋白結合部位をコードする か、または該コドンの読み枠の調製を可能にする。また、プライマー配列が鋳型 の鎖の配列と十分な相補性を存することを条件として、非相補的塩基をプライマ ー内に点在させ、ハイブリダイズする条件下で非恣意的ハイブリダイゼーション （イノシン塩基が非特異的なコード化用いられる場合のように）が生じることを 可能にすることができる。プライマーの３′末端に正確に適合する３ヌクレオチ ドの小さなプライマーは、プライマー伸長生成物を特異的に開始させることがで きるＣ３ｏｎｗｎｅｒら、Ｎｕｃ、　ＡＣｉｄ　Ｒｅｓ、、１７：６７４９　（ ＋９８９））。

好ましくは、効率を最大にするため一本鎖で提供されるが、二本鎖であってもよ い。二本鎖のプライマーを用いる場合は、伸長生成物の調製に用いる前に、該プ ライマーをまず融解して鎖を単離する。好ましくは、プライマーはポリデオキシ リポヌクレオチドである。

プライマーは種々の方法によって調製できるが、これらの方法は、デノーブ化学 合成および天然の核酸配列（例えば遺伝子、対立形質遺伝子、イントロン、およ びゲノム、プラスミドまたはベクターのコドン）からの核酸フラグメントの誘導 を含む。フラグメントは、より大きな二本鎖核酸の制限エンドヌクレアーゼによ る制限消化およびポリメラーゼと核酸鋳型を用いる重合合成のような方法によっ て得ることかできる。ポリヌクレオチドのデノーブ化学合成は、一般に、本題ポ リペプチドをコードする天然のＤＮＡ配列が既知のときに好ましく、適切ないず れの方法（例えば周知のホスホトリエステル法またはホスホジエステル法）に述 は本明細書に参考文献として含まれている）。

核酸からのプライマー分子の誘導は、典型的には核酸をクローニングベクターと ともに適切な宿主に導入しくベクターの増殖はクローニングされる核酸の量を増 加させる）、続いてクローニングされた核酸のフラグメントまたはサブフラグメ ントを単離することを含む。核酸フラグメントのサブクローニング技術についト スブリングハーバ−研究所刊、３９０−４０１ページ、（１９８２）；米国特許 第４４１６９８８号および４４０３０３６号（これらの記述は本明細書に参考文 献として含まれている）。

本方法でハイブリダイズされる鋳型核酸配列はいずれの核酸含有サンプルにおい ても用いることができるが、ただしサンプルは、純度および濃度に関して核酸ハ イブリダイゼーション反応に適合する形態である必要がある。７％イブリダイゼ ーンヨンに適した程度に核酸を単離することは一般に既知で、穐々の手段で達成 できる（例えば次の文献を参照〔マニアーテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子 クローニング：実験車マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバ−研究所 刊、３９０−４０１ページ、（１９８２）；オースペル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、 分子生物学の今日のプロトコール（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、　ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ刊、（＋９８７ ））。

ハイブリダイゼーション反応は、プライマーがその相補的核酸鋳型にハイブリダ イズすることができる、予め限定した条件下で実施される。ここで用いられてい る“ハイブリダイゼーション条件′とは、プライマーが鋳型配列とアニールし核 酸二重合体を形成することかできる、インキュベーションの時間、温度およびｐ Ｈの指標の一組を指す。そのようなハイブリダイゼーシタン条件は、例えばハイ ブリダイズするプライマーの長さ、プライマーと鋳型との間の相補性の度合しＸ 、該ポリヌクレオチドのグアノシンおよびシチジン含量、所望するハイブリダイ ゼーションの厳密性およびハイブリダイゼーションの動態に影響を与えつる塩お よび付加的試薬の存在のような因子に左右される。与えられたハイブリダイゼー ション反応混合物についてのハイブリダイゼーション条件の最適化のための方法 は当業界て既知であるが、典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、ｐＨを ４から９の間に緩衝させた溶液、温度は１８°Ｃから７５“Ｃ１好ましくはおよ そ３７°Ｃからおよそ６５°Ｃ１より好ましくはおよそ５４℃、時間は０．５秒 から２４時間、好ましくはおよそ２分を含む。

ハイブリダイゼーションは、周知のように均質または非均質形式で実施される。

均質ハイブリダイゼーション反応は完全に溶液中て行われ、そに場合、ハイブリ ダイズされるべきプライマーおよび鋳型配列の両方が溶液中で溶解形で存在する 。

非均質反応は、反応媒体中で不溶性であるマトリックスの使用が必要で、該マト リックスにプライマーまたは鋳型のいずれかが結合されている。さらにまた、ｃ ＤＮＡ形成、ジデオキシ配列形成、およびブライマーハイブリダイゼーションが 最初の工程であるプライマー伸長反応を用いる他の工程のために、単離ｍＲＮＡ またはウィルスＲＮＡの逆転写が実施される均質ハイブリダイゼーション反応が 意図される。

核酸含有鋳型配列が二本鎖（ｄ　ｓ）形である場合、好ましくは、例えばハイブ リダイゼーション反応の前に熱またはアルカリ処理でそれを変性させる。ｄｓＤ ＮＡの変性は、ノゾブリダイズされるべきプライマーと混合する前に実施するか 、またはプライマーとｄｓＤＮＡを混合した後に実施することができる。プライ マー自体が二本鎖分子として提供される場合、混合前にそれを変性させるか、ま たは鋳型を含むｄｓＤＮＡと一緒に変性させることができる。

プライマー伸長反応は適切ないずれの方法を用いても実施できる。好ましくは、 プライマーの過剰分子（ゲノム核酸について、通常１０’：Ｉ（プライマー二鋳 型））を鋳型鎖を含む緩衝液に混合する。高いモル過剰がこの方法の効率を高め るために好ましい。長さが約２０から２５ヌクレオチドのポリヌクレオチドブラ イマーについては、典型的な割合は、哺乳類ゲノムＤＤＮＡ１００ｎから５００ ｎｇにつきまたはプラスミド１０から５０１ｇにつき、５０ｎｇから１μｇの範 囲、好ましくは２５０ｎｇである。

デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）もまたプライマー伸長反応混合物に、プライマー伸 長生成物の合成を支援するために適切な量で混合される。当業者は用いる量を容 易に決定できる。

典型的なプライマー伸長反応では、ハイブリダイゼーション混合物は、約９０− １００°Ｃ１約１から１０分、好ましくは約１から４分加熱される。この加熱時 間後、溶液を室温まで冷却し、プライマー自体壓のハイブリダイゼーションを可 能にする。該冷却混合物に、プライマー伸長反応を誘導または触媒する適切な試 薬を加える。合成反応は、室温から該誘導試薬がもはや効率よく機能できない温 度以上て行うことができる。したがって、例えば誘導試薬としてＤＮＡポリメラ ーゼが用いられる場合、ポリメラーゼが耐熱性でない限り、適切な温度は一般に 約４０°Ｃを越えない。

誘導試薬は、プライマー伸長生成物の合成を達成するいずれの化合物または系で もよい。この目的のための適切な試薬は、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、組換え修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、および他のＤ ＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、並びにプライマー伸長反応を促進する他の酵素 を含む。

耐熱性（熱好性）ＤＮＡポリメラーゼは、自動化温度サイクルのＰＣＲ形式でそ れらは熱に安定であるという点て特に好ましい。代表的な耐熱性ポリメラーゼｒ ｉｕｓ）（Ｂｕｋｈｒａｓｈｕ山ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ ｔａ、１００８：１０２　（＋９８９）；　Ｅｌｉｅ　らA Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔｚ、　９５１：２６１　（＋９８ ８））、テルムス・フイリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓラプス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　 ｆｌａｖｕｓＸＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ：　 ミルウォキー、ワイオミング）から単離されたポリメラーゼ、および“ベント” （”Ｖｅｎｔ“）ポリメラーゼにューイングランドバイオラブ、ビバリー、マサ チューセッツ）である。特に好ましいものはＴａｑＤＮＡポリメラーゼで、パー キンエルマーシータス（ノーウオーク、コネチカット）、プロメガ（マジソン、 ワイオミング）およびストラタジーン（ラホイヤ、カリフォルニア）を含む種々 のものから入手可能である。

さらに、組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼであるＡｍ１ｉＴａｑ慴ＤＮＡポリメ ラーゼ（バーキンエルマーシータスから入手可能）も特に好ましい。

ＰＣＲは、典型的には以下の工程を反応混合物について反復することによって実 施される：　（１）加熱して変性−重鎖鋳型およびプライマーを形成し、（２） 冷却して鋳型にプライマーをハイブリダイズさせ、（３）予め限定した条件を維 持してプライマー伸長生成物を形成させる＝特定の核酸配列をＰＣＨによって増 幅させる方法およびシステムは米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０ ２号（これらは参考文献として本明細書に含まれる）、並びにＰＣＲ技法（ＰＣ ＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、エルリッヒ（Ｅｒｌ　１ｃｈ）纒、ストックトンプ レス（＋９８９）、ファルーナ（Ｆａｌｏｏｎａ）ら、λＩｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　二３３５　（＋９８７）；ポリメラーゼ・チェーン・リア クション、エルリッヒら編、コールドスプリングハーバ−研究室出版（１９８９ ）に記載されている。

増幅核酸生成物の検出には、周知の種々の技術のいずれも用いることができる。

好ましい具体例では、増幅生成物は、分子量を基にゲル電気泳動によって単離さ れ、該単離生成物は核酸に特異的な染色で可視化される。種々の核酸特異的染色 が存在し、電気泳動で単離された核酸を可視化するに適しているが、臭化エチジ ウムが好ましい。

増幅核酸生成物を検出するまた別の方法は、ハイブリダイゼーションによる検出 手段を含むが、これは該増幅生成物にハイブリダイズすることができる標識オリ ゴヌクレオチドプローブを用いる。そのような検出手段の典型は、サザンプロッ ト分析、インビトロ標識ポリリボヌクレオチドプローブを用いるリボヌクレアー ゼ保護分析、および特定のヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法に類の 分子生物学のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　１ ９８７）。

特定の核酸配列の存在を検出するまた別の方法では、プライマー伸長反応で用い られたデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）が、プライマー伸長 生成物を検出させる標識または指示団を含む。典型的には、そのような標識は、 放射性原子、化学修飾ヌクレオチド塩基などである。適切な放射性標識は’Ｈ１ Ｉ′ＣＳ″Ｐおよび３ｓＳなどである。

放射性標識ｄＮＴＰに代わるものは、化学的に修飾され、金属錯塩化剤、ビオチ ン含有基、蛍光化合物などを含むｄＮＴＰである。有用な金属錯塩化剤は、蛍光 ランタニド金属およびβ−ジケトネートリガンドによって形成されるランタニド キレート化合物である。ランタニドは核酸に結合し、それによって蛍光ランタニ ド／核酸複合体が形成される（米国特許第４３７４１２０号、同４５６９７９０ 号、並びに国際特許出願公告公報ＥＰ１３９６７５号およｎ０８？１０２７０８ 号（これらの記述は本明細書に参考文献どして含まれている）を参照）。

ビオチンまたはアクリジンエステル標識オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオ チドとしてのそれらの使用は既に記載されている（米国特許第４７０７４０４号 、国際特許出願公告公報ｅｐ２１２９５１号および欧州特許出願公告公報８７６ ３６号参照）。オリゴヌクレオチドの有用な蛍光マーカーには、フルオレセイン 、ローダミン、テキサス赤、ＮＢＤなどが含まれる。

ハイブリダイズしたプローブからハイブリッド非形成標識プローブを単離する技 術は周知であり、典型的には、その化学的特性に基づく一本鎖核酸の二本鎖核酸 からの単離を含む。しばしば、非均質的単離形式が用いられ、その場合ノ）イブ リッド非形成プローブは、不溶性マトリックスに結合した標ｆｌＤＮＡ二重合体 から洗浄によって単離される。この技術の典型はサザンプロットで、この場合、 マ上記ＤＮＡセグメント（外来ＤＮＡセグメント）に機能しうるように連結され たベクターを含む組換えＤＮＡ分子もまた目的とされる。該組換えＤＮＡ分子（ ＤＮＡｔＭ築物）は、本発明のポリペプチドをコードする本題ＤＮＡセグメント の増幅および／または発現を促進することができる。

目的の組換えＤＮＡ分子は、天然のＰＩ”またはＰＩ”決定基のアミノ酸残基配 列をコードする前述の単離ＤＮＡセグメントを含んでいる。好ましくは、該ＤＮ Ａ−１＝グメントは、配列番号＝２．４．６．８、ｉｏ、１２．１４．１６．１ ８．２０．２２．２４．２６および２８から成る群から選ばれる。

特に好ましい組換えＤＮＡ分子（これは適切な宿主細胞内で形質転換により増殖 することができる）は、ＰＩ”決定基のアミノ酸残基配列をコードする配列番号 ：１０の本題ＤＮＡセグメントを含み、さらに、ＧＰＩＩＩａのリーダーアミノ 酸残基配列をコードするヌクレオチド塩基配列を含む。配列番号；２０に示すま た別の好ましいＤＮＡセグメントはＰＩＡ！決定基をコードする。好ましくは、 該ＤＮＡ構築物は、本題ポリペプチドをフードする約１９５から約８００塩基対 のヌクレオチド配列を含む。

典型的には、本発明の組換えＤＮＡ分子は、上記のＰＩ”またはｐＩＡ！決定基 と融合させた免疫学的（ご不活性な”連結ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列 を含む。この点に関して典型的な配列は、β−ガラクトシダーゼまたはＭＢＰ分 子部分をコードする。そのような組換えＤＮＡ分子は、読み枠にしたがって目的 ＤＮＡセグメントを、β−ガラクトシダーゼまたＭＢＰ蛋白もしくはペプチドを コードする遺伝子を含むベクターに挿入することによって得ることができる。

目的の組換えＤＮＡ分子（ベクター）は環状化しても直線状にしてもよい。

本発明のまた別の局面は、融合ポリペプチドをコードする前述のＤＮＡセグメン トに、機能しつるように連結された発現ベクターを含む組換えＤＮＡ分子に関す る。該ベクター分子は、前述の免疫学的に不活性な蛋白のアミノ酸残基配列に機 能しつるように連結された、前述の天然形ｐｌＡ＋またはＰＩ”のアミノ酸残基 配列を含む融合ポリペプチドの増幅および発現を可能にする。

したがって、本題融合ポリペプチドをコードする典型的なベクターは以下を含む ： （ａ）免疫学的に不活性な蛋白（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはＭＢＰ）の 全体または部分のアミノ酸残基配列を含むアミノ酸残基配列をコードするおよそ ３６００ヌクレオチドを含む第一のヌクレオチド配列（これは、この第一のヌク レオチド配列に機能しうるように連結された第二のヌクレオチドを伴う）、およ び： （ｂ）天然のｐｌＡＩまたはｐｌＡ！決定基のアミノ酸残基配列を含むＧＰＩＴ Ｉａのアミノ酸残基配列をコードする約１９５から約８００ヌクレオチドを含む 第二のヌクレオチド配列。

好ましくは、第二のヌクレオチド配列は約２７５ヌクレオチドを含む。天然のＰ Ｉ”決定基のアミ人酸残基配列を含む、ＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコー ドするヌクレオチド配列は配列番号：ｌＯに示される。天然のＰＩ”決定基のア ミノ酸残基配列を含む、ＧＰＴＩＩａのアミノ酸残基配列をコードするヌクレオ チド配列は配列番号＝２０に示される。

目的の組換えＤＮＡ分子を形成するために、本発明のＤＮＡセグメントが機能し つるように連結されるベクターの選択は、所望される機能的特性、例えば転写効 率、選択される形質転換宿主細胞内での発現効率、制限部位の位置（例えばＰＣ Ｒ生成物がベクターで直接クローニングされる場合）なとに左右される。しかし ながら、本発明のベクターは、少なくとも、本題のポリペプチドをコードするＤ ＮＡセグメントの複製を指令することができる。

好ましくは、選ばれるベクターは原核細胞レプリコン、すなわち自律的複製およ び形質転換原核宿主細胞内での染色体外組換えＤＮＡ分子の維持を指令する能力 を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなレプリコンは当該技術分野で周知である 。さらに、原核細胞レプリコンを含むベクターはまた、好ましくは、薬剤耐性遺 伝子を含み、それによって、ベクターて形質転換された宿主は容易にスクリーニ ングすることができる。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたは テトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。糖代謝に基づくスクリー ニング手段としてのβ−ガラクトシダーゼの使用もまた、本発明で意図されるも のである。

原核細胞レプリコンを含むベクターは、好ましくは、本題ポリペプチドの遺伝子 の転写を指令することができる原核細胞プロモーターを含む。プロモーターは、 ＲＮＡポリメラーゼの結合および、−重鎖ＤＮＡのメソセンジャーＲＮＡ（ｍＲ ＮＡ）分子への転写を促進するＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素（エ レメント）である。細菌宿主に適合したプロモーター配列（例えばｔａｃプロモ ーター）は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位 を有するプラスミドベクターで提供される。そのようなベクタープラスミドの輿 望は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９’（バイオラッド ラボラトリーズ（リッチモンド、カリフォルニア）より入手可能）；ｐＰＬ。

ｐＵＲＳｐＫＫ２２３　（ファルマシア（ビス力タウエー、ニュージャージ）よ り入手可能）；ＭＡＬ”ｃ２およびＭＡＬＴＩ１９２　にューイングランドバイ オラブ（ビバリー、マサチューセッツ）より入手可能）、およびλｇ　ｔ　２２ 　（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ、、　（マジソン、ライスコンシン）より入手可能 ）である。λｇｔ２２ベクターか好ましい。

真核細胞に適合する発現ベクター（好ましくはを椎動物細胞に適合するもの）も また、前述の組換えＤＮＡ分子を形成するために用いることができる。真核細胞 発現ベクターは当該技術分野で周知であり、幾つかの発売元から入手できる。

典型的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入のために好 都合な制限部位を有する。そのようなベクターの典型例は、ｐＳＶＬおよびｐＫ ＳＶ−１０（ファルマンア）、ｐＢＰＶ−１ｐＭＬ２ｄ　（インターナショナル バイオテクノロジー社）、およびｐＴＤＴｌ　（ＡＴＣＣ，ｆ！３１２５５）で ある。真核細胞に適合するベクターで使用する好ましい薬剤耐性マーカーは、ネ オマイシンホスホ本発明の組換えＤＮＡを発現するレトロウィルスベクターもま た本発明が意図するものである。所望のＤＮＡ分子を発現させるレトロウィルス ベクターの構築および使用は既に記載されている（ソーブら（Ｓｏｒｇｅら、Ｍ ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　４：１７３０−３７　（＋９８４））の文 献を参照）。

本ＤＮＡセグメントを相補的な粘着末端を介してベクターに機能しつるように連 結するために、多くの方法か利用可能である。例えば、相補的なホモポリマー鎖 を挿入されるへきＤＮＡセグメントおよびベクターＤＮＡに付加することができ る。続いて、ベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的なホモポリマー付加部の 間で水素結合によってハイブリダイズさせ、組換え二重合体ＤＮＡ分子を形成す る。また別に、１つまたは１つ以上の制限部位を含む合成リンカ−を用い、本Ｄ ＮＡセグメントをベクターに会合させることができる。

ＤＮＡセグメントをエンドヌクレアーゼ制限消化で調製するときは、突出３゜一 本鎖末端を除去し、さらに後退した３′末端を充填するＤＮＡポリメラーゼで処 理して、それによって平滑端を有するＤＮＡセグメントを生成することができる 。平滑端ＤＮＡセグメントを、例えばバタテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（ これは平ｔｆ！ｌ端ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる）のような酵素の 存在下で、極めて過剰モルのリンカ−分子とともにインキュベートする。したが って、この反応生成物は、その中に制限部位を有するリンカ−配列に末端で共有 結合したＤＮＡセグメントである。続いて、これらのＤＮＡセグメントの制限部 位は適切な制限酵素で切断さね、この切断されたＤＮＡセグメントの末端と適合 する末端を有する発現ベクターに該セグメントは連結される。種々の制限エンド ヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ−は、インターナショナルバイオテクノロジ ー社にューヘブン、コネチカット）を含む多数の発売元から市販されている。

Ｅ、形質転換および精製 また、本発明で意図するものは、前述のＤＮＡセグメントを含む前述の組換えＤ ＮＡ分子で安定的に形質転換された細胞である。宿主細胞は、原核細胞でも真核 細胞でもいずれでもよい。好ましい原核宿主細胞は大腸菌、例えば大腸菌Ｙ１０ ９０（ｒつ株、Ｙ１０８９（ｒ−）株またはＬＥ３９２株（プロメガより入手可 能）である。好ましい真核宿主細胞は、麦酒酵母菌（Ｓ、　ｃｅｒｉｖｉｓｉａ ｅ）のような酵母菌および哺乳類細胞、好ましくはを椎動物細胞（例えばマウス 、ラット、ヤギまたは霊長類細胞株からの細胞）、例えばチャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。

本発明の組換えＤＮＡ分子による適切な宿主細胞（例えば大腸菌Ｙ１０９０株） の形質転換は、用いられるベクターの種類に例によって依存する周知の方法によ って達成される。原核細胞の形質転換に関しては、マニアーティスらの文献バー バー、ニューヨーク（１９８２））を参照し、を椎動物細胞のレトロウィルス首 尾よ（形質転換された細胞（すなわち本発明の組換えＤＮＡ分子で安定的に形質 転換された細胞）は、周知の技術で同定することができる。例えば、安定的に形 質転換された細胞はクローニングさね、単クローン性のコロニーを生じる。

これらのコロニーからの細胞を採集して溶解し、そのＤＮＡ内容物を所望のＤＮ Ａセグメントの存在について、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　１Ｊｏ１． 　Ｂｉｏｌ、、　９８：５０３（１９７５））によって記載されたような方法を 用いて調べる。

所望のＤＮＡセグメントの存在の直接分析に加え、形質転換の成功は、形質転換 細胞が前述のポリペプチドを発現しているときは、周知の免疫学的方法で確認す ることができる。この方法では、形質転換されていると思われる細胞サンプルを 、該ポリペプチドを発現するために十分な時間、適切な栄養培地中で培養を続け る。これらの細胞を採集し、目的のポリペプチドと免疫的に反応する（特異的に 結合する）抗体を用い所望の抗原性について調べる。

本発明でまた意図されるものは、安定的に形質転換された宿主細胞培養である。

形質転換宿主細胞の培養に有用な栄養培地は当該技術分野で周知であり、幾つか の販売元から得ることができる。哺乳類宿主細胞を用いるときは、“血清非含有 ”培地を使用するのが好ましい。

一旦安定的に形質転換された宿主細胞が識別されると、これらの細胞は、該ポリ ペプチドを発現させるために十分な時間、適切な培養条件下でこれらの細胞を維 持（培養）することによって、目的のポリペプチドを発現（調製）するための方 法に使用することができる。発現されたポリペプチドは、好ましくは培養細胞か ら単離（回収）される。

培養から発現蛋白を回収する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ゲル ろ過、ゲルクロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、イオン交換、アフィニテ ィークロマトグラフィーおよび関連技術が、培養から発現蛋白を単離するために 用いることができる。さらに、免疫化学的方法（例えば免疫親和性、免疫吸着な ど）を、本明細書で述べる方法によって例証するように周知の方法を用いて実施 することができる。

Ｆ、抗体および接種物 本発明の単離ポリペプチドは、天然のＧＰＩＩＩａＰＩ”またはｐｌＡ！決定基 と免疫的に反応する抗体の調製のための免疫原として用いることができる。本発 明の単離ポリペプチドは、天然のＧＰＩＩＩａＰｌ”およびＰＩ”と実質的に同 じ一次、二次および三次構造を有するので、産生された抗体は、該単離抗体およ び天然のＰＩ”またはＰＩ”抗原決定基の１つの両方と反応する（ただし決定基 のもう一方とは反応しない）。

本発明の抗体は、典型的には本発明のポリペプチドを含む接種物で宿主哺乳動物 を免疫し、抗体が生じるために十分な期間該宿主を維持し、それによって天然の ＧＰＩＩＩａＰｌ”またはｐｌＡ！決定基について免疫特異性を有する哺乳類の 抗体分子を誘発することによって製造される。続いて、抗体分子を該哺乳類から 採集し、周知の技術、例えばＤＥＡＥセファデックスを用いてＩｇＧ分画を得る ことによって所望の程度まで単離する。

゛接種物”という言葉は、天然のＧＰＩＩＩａＰＩ”またはＰＩ”決定基と免疫 的に反応する抗体の調製のために用いる活性成分として、免疫原となりうる量の 本発明の単独ポリペプチドまたは融合ポリペプチドとして含有する組成物水溶液 を指すために本明細書では用いられている。接種物はしばしば抗体誘発促進のた めにアジュバントを含む。

天然のＧＰ　Ｔ　Ｉ　ＴａＰ　Ｉ”決定基に対して免疫特異性を有する抗体分子 を製造するために接種物に使用される、適切な本発明の単離ポリペプチドまたは 融合ポリペプチドは以下に記載するようなものであり、それらは配列番号：３． ７．１１．１３．１５．１７および１９のアミノ酸配列を含む。特に好ましい単 離ポリペプチドは、配列番号ニアおよび配列番号：１１のアミノ酸残基配列を含 む。

天然のＧＰＩＩＩａＰＩＡ２決定基に対して免疫特異性を有する抗体分子を製造 するために接種物に使用される、適切な本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポ リペプチドは以下に記載するようなものであり、それらは配列番号・５．９．２ １．２３．２５．２７および２９のアミノ酸配列を含む。特に好ましい単離ポリ ペプチドは、配列番号・９および配列番号＝２１のアミノ酸残基配列を含む。

上記の抗体組成物はオリゴクローン性である。

天然のＧＰＩＩＩａＰＩ”またはＰＩ”決定基の一方のみと免疫的に反応するが 、他のＧＰＩＩＩａまたは他の決定基、例えば融合ポリペプチドの他の部分の決 定基とは免疫的に反応しない抗体分子を製造するために、免疫吸着法を用い、望 ましくない免疫特異性を除去する。

免疫特異性を除去するための免疫吸着法は一般に周知で、典型的には先ず第一に 所望の抗体分子を含む組成物を、天然のＧＰＴＩＩａＰ１＾１またはＰ１＾雪決 定基含有ポリペプチドの一方または他方を結合させた固相と接触させ、免疫吸着 混合物を形成させることを含む。該ポリペプチドは、好ましくはＧＰＩＩＩａの １から６５のアミノ酸残基のただ１つを含み、その結果他のＧＰＩＩＩａエピト ープとの交叉反応を最小にする。

該免疫吸着混合物を免疫反応条件下で、免疫複合体が固相で形成される（すなわ ち固相結合免疫複合体が形成される）ために十分な時間維持する。その後、液相 と固相を単離し、固相に免疫吸着された所望の抗体分子を有する固相を保有する 。続いて、該免疫複合体の結合抗体を標準的な技術で該複合体から単離する。

固相に結合させた他方のＰＩＡ抗原を用いて上記の単離を繰り返せば、一方の決 定基と反応するが他方とは反応しない抗体が液相で提供される。

好ましい抗体分子はオリゴクローン抗体、すなわち抗原上の限定された数のエピ トープと免疫的に反応する抗体である。好ましいオリゴクローン抗体組成物は、 天然のＣＰＩＩＴａ分子のアミノ末端の６５アミノ酸のエピトープ、すなわちＰ Ｉ”またはｐｌＡ２決定基の一方または他方と免疫的に反応する。そのようなオ リゴクローン抗体は、上記の免疫吸着技術を用いて、または前述のＰＩＡ決定基 含有ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの１つで免疫することによって調製で きる。

天然のＰＩＡ決定基に対する単クローン抗体（Ｍａｂ）もまた本発明で意図され るものである。“単クローン抗体組成物”という言葉は、特定の抗原と免疫的に 反応することができるただ１種の抗体結合部位を存する抗体分子の集団をいう。

したがって本Ｍａ　ｂＭｉ成物は、典型的には、それが免疫的に反応するいずれ の抗原についてもただ１つの結合親和性を存する。本発明のＭａｂは、典型的に は、ただ１種の抗体分子を分泌（生成）する単一細胞クローン（ハイブリドーマ と呼ばれる）によって産生された抗体を含む。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生 細胞とミエローマまたは他の自律永続細胞株とを融合させることによって形成さ れる。

そのような抗体は、最初コーラ−とミルシュタインによって記載された（Ｋｏｈ ｌｅｒ＆　！Ｊｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、　２５６：４９５−４９７　（ ＋９７５）、その記述は本明細書に参考文献として含まれる）。単クローン抗体 調製についてのより最近の記載は米国特許第４８１８６７８号に見出されるが、 その記述はまた本明細書に参考文献として含まれる。

そのように調製したハイブリドーマまたは他の細胞（下記）上清を、天然のＧＰ ＩＩＩａＰＩ”およびＧＰＩＴＩａＰＩ”決定基の両方、例えば抗体産生宿主細 胞を誘発するために接種物において使用した単離ポリペプチドとの免疫反応性に ついてスクリーニングすることができる。一方の決定基とは免疫的に反応するが 他方とは反応しない抗体を分泌する１つまたは１つ以上のハイブリドーマまたは 他の細胞株を、例えばクローニングによって永続させる。

単クローン抗体はまた、キメラ抗体を製造する技術分野で習熟した者にとって周 知の方法によって製造できる。これらの方法は、免疫グロブリンの可変領域（免 疫グロブリン軽鎖の可変領域を構成する可変領域の一部分および免疫グロブリン 重鎮の可変領域を構成する可変領域の一部分の両方を含む）の全体または一部分 をコードする核酸の単離、高等操作および発現を含む。可変領域コード核酸の単 離、操作並びに原核細胞および真核細胞でのその発現は以下の文献に記載されて いる二口ビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、国際特許公開公報ＷＯ３９１００９ ９号：ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、欧州特許出願公告公報ＩＥ２３９４００ 号：リーディング（Ｒｅａｄｉｎｇ）米国特許第４７１４６８１号：キャビン− （Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、欧州特許出願公告公報第１２５０２３号３８３３−３８ ３７　（＋９８９）。典型的には、該核酸は、予め選択された抗原（リガンド） に結合する免疫グロブリンの可変領域の全体または一部分をコードする。そのよ うな核酸の起源は当業者にとって周知であるが、例えば、予め選択された抗原と 結合する単クローン抗体を産生ずるハイブリドーマから得ることができ、また予 め選択した抗原を複数の免疫グロブリン可変領域をコードする発現ライブラリー をスクリーニングするために、したがって核酸を単離するために用いることもで きる。

本発明でまた意図されるものは、本発明の単クローン抗体を産生ずるハイブリド ーマ細胞およびハイブリドーマ細胞を含む培養である。

そのように産生される抗体は、とりわけ、体サンプル中の血小板の型分けまたは 血液サンプルのスクリーニングのために本発明の方法およびシステムで用いるこ とができる。

活性成分としてペプチドを含む接種物の調製は当該技術分野でよく理解されてい る。典型的には、そのような接種物は、注射できるように（溶液または懸濁液の いずれかのような）調製される。注射の前にＩｌｌに溶解または懸濁させるため に適した固体形もまた調製できる。該調製物はまた乳化物であってもよい。

周知のように、免疫原活性成分は、医薬的に許容され、さらに該活性成分と適合 する水性賦形剤に溶解、懸濁または混合される。“医薬的に許容される”または “生理学的に耐えつる”という語は、宿主の哺乳類に投与したとき、典型的には アレルギーまたは同様な不利な反応を生じない分子物質および組成物を指す。

適切な賦形剤は、目的とする使用に左右されるが広範囲の形態をとることができ 、例えば食塩を含む水溶液、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリ セロール、エタノールおよびその組み合わせである。さらに所望の場合は、該接 種物は少量の補助物質、例えば湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、鉱物油、担体 または接種物の有効性を強化するアジュバントを含むことができる。好ましい具 体例は、活性成分として少なくともおよそ０．０１％からおよそ９９％の本発明 の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを、典型的には賦形剤１ミリリツト ル（ｍｌ）につき１０から２００μｇの活性成分の濃度で含む。

接種物はまた、免疫される哺乳動物の免疫反応の発生を促進させる抗原性担体に 連結させた本発明の単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含むことができ る。有用な担体は当該技術分野で周知で、一般には蛋白自体である。そのような 担体の典型例は、キーホールリンペットのヘモシアニン、エデスチン、チログロ ブリン、アルブミン（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アル ブミン（Ｈ３Ａ）　）、赤血球細胞（例えばヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ））　、破 傷風トキソイド、コレラトキソイドの他、ポリアミノ酸（例えばポリ（Ｄ−リジ ン・Ｄ−グルタミン酸））などである。

１つまたは１つ以上のアミノ酸残基を、それがポリペプチド上に予め存在しない 場合は、該ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に付加して、担体へのポ リペプチドの結合を助長させることができる。該ペプチドのアミノまたはカルボ キシ末端に付加されたシスティン残基は、ジスルフィド結合を介してポリマーを 形成するために特に有用である。しかしながら、結合物を調製するために当該技 術分野で周知の他の方法もまた用いることができる。典型的な付加連結方法は、 マイケル付加反応生成物、ゲルタールアルデヒドのようなジアルデヒドＣＫｌ　 １ｐｓｔｅｉｎら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、１４７：３１８−３２６ 　（１９８３））などの使用、または、担体にアミド結合を形成するために水溶 性カルボジイミドを使用する場合のようなカルボジイミド技術の使用を含む。

また当該技術分野で周知のように、単離ポリペプチドを仲介連結基の手段によっ てその担体に結合させることはしばしば利点を有する。上記に述べたように、ゲ ルタールアルデヒドはそのような連結基の１つである。しかしながら、システさ らに、ＭＢＳは、エステル−アミド交換反応によって担体にまず付加することが できる。その後、この付加に続いて、ブロックされたメルカプト基（例えばチオ ール酢酸、ＣＨ，Ｃ０３Ｈ）をマレイミドニ重結合を越えて付加させることかで きる。該アシル遮断基の切断後、ジスルフィド結合は脱遮断連結基メルカプタン と該蛋白のシスティン残基のメルカプタンとの間で形成される。

抗原性担体は、免疫反応を高めまたは支援するため（免疫相乗作用）、または担 体と一体となった接種物を使用することによって免疫反応のタイプを指令するた めに用いることができる。例えば以下の記載を参照のこと二ミリッヒ（Ｍｉｌｉ ｃｈ）ら、米国特許第４５９９２３１号、４５９９２３０号および４６８３１３ ６号並びにソーントン（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）ら、米国特許第４８１８５２７号お よび４８８２１４５号。

免疫相乗作用の他の手段は、リボゾームおよび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）粒 子の使用を含む。リボゾームの類のない多目的性はそのサイズ調整能、表面特性 、脂質組成およびそれらが抗原を収容する方法にある。リボゾーム形成方法は当 業界で既知である。例えば以下の文献を参照のことニブレスコツト（Ｐｒｅｓｃ ｏｔｔ）編、細胞生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ）、１４巻、アカデミツクプレ入ニューヨーク、（＋９７６）　３３ ページから）。ｌＳＣ０Ｍ粒子では、ケージ様マトリックスがＱｕ　ｉ　ＩＡ　 （南アメリカの樹木の樹皮より抽出）で構成される。このマトリックスの表面と の疎水性相互反応によって付加された抗原性蛋白またはペプチドによって強力な 免疫反応が惹起される。

担体の選択は、免疫原の決定基部分より該免疫原の全体的な使用により依存し、 さらに本発明に必ずしも含まれない基準に基づく。例えば、接種物は哺乳類宿主 に使用されるので、周知のように、特定の哺乳類で不利な反応を生じない担体が 選択される。

接種物は、慣用的に非経口的（注射による）に、例えば皮下または筋肉内に投与 される。他の投与態様に適したまた別の製剤は、座薬および、いくつかの事例で は経口製剤を含む。座薬については、慣用的な結合剤および担体は、例えばポリ アルキレングリコールまたはトリグリセリッドを含むことができ、そのような座 薬は、０．５％から１０％、好ましくは１−２％の範囲で活性成分を含む混合物 から形成できる。経口製剤は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース 、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸 マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。該組成物は、溶液、懸 濁物、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態をとり、１０−９５ ％、好ましくは２５−７０％の活性成分を含むことができる。

本発明の単離ポリペプチドは、中性形または塩として接種物に製剤化できる。

医薬的に許容できる塩は酸付加塩（該蛋白または抗原の遊離アミノ基とともに形 成される）を含むが、これらは、無機酸（例えば塩酸または燐酸）または酢酸、 蓚酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で生成される。遊離カルボキシル基とと もに生成される塩はまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム 、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）およびイソプロ ピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロケインなどの有機塩基から調 製できる。

該接種物は調剤形に適合した態様で、抗体産生免疫反応を誘発するために免疫原 性を有しさらに効果的であるような量で投与される。所望の結果を達成するため に投与されるべき接種物の分量は専門化の判定に左右され、さらに個々の哺乳類 宿主に特育であるが、実験的宿主（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギなど） については周知である。

接種物はまた、賦形剤の一部分として前述のようにアジュバントを含むことがで きる。実験動物で使用されるフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイ ントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）は、当該技術分野で周知である。明欝のよ うな医薬的に許容できるアジュバントもまた使用できる。したがって、典型的な 接種物は、約０．５ｍｇから約２．５ｍｇの明着、または０．　１％から１％の ＡＩ　（ＯＨ）３に吸着させた本発明の単離ポリペプチドの約５０から２００μ ｇを含む１ｍｌの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。好ましい接種物は、２．５ ｍｇの明容担体に吸着させた１００μｇのポリペプチドを含む１ｍＩＰＢＳを含 む。

該接種物の投与後、該接種物を与えられた哺乳類宿主は、該哺乳類の免疫系が免 疫学的に反応するために十分な時間、典型的には周知のように２から８週間のす 一ダーでＰＩＡ含有免疫原と免疫的に反応する抗体の産生まで維持される。

本発明の単離ポリペプチド、融合ポリペプチド、および本発明の天然のＣＰｌｌ ｌａＰｌ”またはＰＩ”決定基と免疫的に反応する抗体は、血小板の型分けおよ び天然のＧＰＩＩＴａＰＩ”またはＰＩ”決定基と免疫的に反応する抗体の検出 のための診断方法および系に、後述のように用いることができる。

Ｇ４診断方法 天然のＧＰＩＴＩａＰＩ”またはＰｉ”決定基の１つと免疫学的に反応するが他 方とは反応しない抗体を検出する方法、および血小板を型分けする方法も本発明 の目的である。

血小板摩分は方法は、天然のＧＰＩＩＩａＰＩ”またはＰＩ”決定基の一方また は他方を発現している血小板の性状を知るために用いられる。この方法は、供与 者および受容者の血液をスクリーニングし、したがって血小板不適合の問題が発 生する前にそれを明らかにするために（その結果ＦＴＰのような状態を避けるこ とができる）用いることができる。

さらに、血小板製分は方法および、天然のＧＰＩＩＩａＰｌ”またはｐｌＡｆｉ 決定基と免疫学的に反応する抗体を検出する方法は、ＮΔＩＴの場合のような出 生時および妊娠中の血小板不適合の可能性を明らかにするために、予想される両 親の血小板および血液を検査するために用いることができる。

したがって、ある具体例では、本発明は特異的ＧＰＩＩＩａＰＩＡの存在を検出 する方法を目的とする。天然のＣＰｌｌｌａＰｌ”決定基と免疫学的に反応する 抗体の存在を患者で検出するために、抗体を含存する体サンプル、好ましくは体 液サンプル（例えば患者の血液、血漿、血清、尿または唾液）を生物学的分析条 件下で、天然のＧＰＩＩＩａ蛋白ＰＩ”またはｐｌＡ！決定基を発現し、ＧＰＩ ＩＩａ蛋白配列の約６５から約２６６アミノ酸残基をその中に含み、さらに配列 番号：ｌのアミノ酸残基を包含する単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドで ある抗原と混合し、免疫反応混合物水溶液をつくる。この混合物を生物学的分析 条件下で、抗体および抗原との間の免疫反応生成物（免疫複合体）の生成を可能 にするために十分な時間維持する。続いて、複合体の存在、および好ましくは量 を本明細書で述べるように検出することができる。複合体の存在は、天然のＣＰ ｌｌｌａＰｌ”またはｐｌＡ１１決定基と免疫的に反応する抗体を示唆する。

好ましくは、ＰＩ”決定基に対する抗体の検出のために、この方法で用いられる 抗原は、配列番号＝３、配列番号＝７、配列番号：１１．配列番号：１３、配列 番号：１５、配列番号・１７、配列番号：１９および、β−ガラクトシダーゼの カルボキシ末端に機能しうるように連結された配列番号；７から成る群から選ば れる。上記の方法で天然のＣＰｌｌｌａＰｌ”決定基と免疫的に反応する抗体の 存在を検出するために、好ましく用いられる抗原は、配列番号：５、配列番号、 ９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号・２５、配列番号：２７、配列 番号：２９および、β−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に機能しつるように 連結された配列番号＝９から成る群から選ばれる。

好ましい具体例では、単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチドと患者の抗体と の間で形成される免疫反応生成物の存在は、下記に極めて詳細に考察する特異的 結合試薬を用いて検出される。標識した特異的結合試薬は、ここに記載するよう に特異的結合試薬および１ｍを含む。

例えば、まず免疫反応生成物を、標識した特異的結合試薬と混合して標識混合物 をつくる。続いてこの標識混合物を、存在する免疫反応生成物が、標識された特 異的結合試薬と結合し標識生成物を形成するために十分な時間、特異的結合に適 した条件下で維持する。続いて、形成された標識生成物の存在、および好ましく は量が検出され、免疫反応生成物の存在または量が示される。

好ましい具体例では、本発明の方法は、ここで開示される系のように、免疫複合 体が固相で形成され、検出される態様で実施される。

したがって、好ましい診断方法では、単離ポリペプチドまたは融合ポリペプチド は、固体マトリックスに結合され、固相を形成する。固体マトリックスへの固定 方法は、当該技術分野で周知である。そのような方法は、吸着（これが好ましい ）、該複合体に対する第二の抗体の使用（例えば該ポリペプチドに含まれるＧＰ ＴＩＩａのまた別の部分に対する抗体または、β−ガラクトシダーゼまたはその 一部分が目的のポリペプチドに融合されている場合は、β−ガラクトシダーゼに 対する抗体）を含む。共有結合による固定もまた意図される。特異的固体マトリ ックスは以下で極めて詳細に考察する。

特異的結合試薬が、該単離ポリペプチドと固相で免疫複合体を形成した抗体と複 合体を形成することができる蛋白Ａまたは抗ヒトＩｇ（例えばＩｇＧまたはＩｇ Ｍ）であることはさらに好ましい。最も好ましいものは、標識された特異的結合 試薬の使用で、この場合、ｆｆｔａは放射性同位元素、酵素、ビオチンまたは蛍 光マーカー（例えばランタニド）である。

この固相の具体例では、前述の組換え融合ポリペプチドを使用することが特に好 ましい。また別の好ましい診断方法では、本発明の単離ポリペプチドまたは融合 ポリペプチドを前述のように固体マトリックスに固定し、さらに、該生物学的サ ンプルの希釈物を免疫複合体形成工程に付すが、この工程では、該固形支持体と 生物学的サンプルの希釈物を接触させ、固相結合免疫複合体が形成されるために 十分な時間、生物学的分析条件下で該接触を維持し、該固相および液相を単離し て非結合物質を除去する。生物学的サンプルに存在する抗体は複数の結合手をも つので、続いて加えられる標識ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、固相ポ リペプチドと可溶性標識分子との間でブリッジとして作用するサンプルの抗体に よって該固相に付着する。固相における標識の存在は、サンプル中の特異的抗体 の存在、好ましくは量を示す。当業者は希釈の範囲を決定し、それによって固相 における標識抗原の濃度を決定することができる。

該生物学的サンプルを固相と接触させる前または同時に、生物学的サンプルおよ び本発明の単離ポリペプチドを混合し、二価または多価の特異的抗体の架橋特性 を利用して三重子複合体を固相上で形成させることができる。特に有用な標識と して、本発明のビオチン化ポリペプチドがｆｆ識抗原が可能である。これによっ て酵素−ストレプトアビジンまたは酵素−アビジン複合体の添加とそれに続く適 切な基質の添加によるその後の検出が可能になる。セイヨウワサビペルオキシダ ーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはウレアーゼのよう な酵素がしばしば用いられるが、これらおよび他のものは幾つかの適切な基質と ともに市販されている。形成された複合体の直接検出を可能にするマーカーを用 いる好ましい標識は、放射性同位元素（例えばヨウ素）またはユーロピウムのよ うなランタニドキレートを含む。別の具体例では、本発明は、以下の工程を含む 血小板の型分は方法を目的とする： （ａ）水溶液中で供与者の血小板を、ＧＰＩＩＩａＰｌ”およびＰＩ”決定基の 一方または他方と免疫的に反応するが両方とは反応しない抗体と前述のように混 合し、免疫反応混合物水溶液を形成し；（ｂ）これらの混合された抗体が免疫的 に反応し、免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学的分析条件下で 該免疫反応混合物を維持し；さらに；（Ｃ）当該免疫反応生成物の存在を検出し 、それによって、ＧＰＩＩＩａＰｌ”またはＰＩＡ′決定基の一方または他方の 存在並びに血小板型を検出する。　この分析で用いられる抗体は血小板供与者の 種板外の動物種由来であることが好ましい。したがって、例えば該抗体はマウス 、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマなどから産生ずることができる。このように、混 合された抗体と血小板との間の免疫反応の存在は、前述のように酵素または放射 性元素のような標識を含む種特異的抗−抗体とのさらに別の免疫反応によって検 出される。

より好ましくは、混合される抗ＧＰＴＩＩａＰ１”またはＰｉ”決定基抗体は、 ここで考察するようにそれ自体の標識を含み、それによって、また別の免疫反応 は必要とされない。最も好ましくは、これらの抗ＰＩＡ抗体は単クローン抗体で 、アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素 標識を含む。

好ましい具体例では、この方法で用いられる抗体は、ＧＰＩＴＩａＰｌ”決定基 と免疫的に反応し、ＧＰＴＩＩａＰｌ”決定基とは反応しない。

また別の好ましい具体例では、この方法で用いられる抗体は、ＧＰＩＩＴａＰＩ Ａ！と免疫的に反応し、ＧＰＩＩＩａＰｌ”決定基とは反応しない。

好ましくは、両方の具体例で用いられる抗体は単クローン抗体である。

血小板型分は方法もまた本発明内に含まれる。前述のように、この血小板型分は 方法では、種々の周知の非均質的および均質的なプロトコールを用いることがで きる。好ましくは、供与者からの血小板含有体サンプルは、抗ＰＩ”またはＰＩ Ａ′抗体と水性組成物中で混合され、免疫反応混合物を形成する。

上記で形成された免疫反応混合物は、該抗体が血小板上のそれらの抗原と免疫的 に反応するために十分な時間、生物学的分析条件下で維持される。免疫複合検察 されるいずれの手段によっても検出できる。

前述の免疫反応が生じる維持時間は、周知のように広範囲に変えることができる 。典型的には、維持時間は約１分から約２時間の範囲で、典型的に用いられるの は約３０から約９０分である。

抗体分子は、無傷の抗体またはその結合部位含有（パラトープ含有）部分を含む 。典型的なバラトープ含有部分は、周知のようにＦａｂ、　Ｆ　（ａｂ’　）＊ およびＦ、部分である。さらに、抗体のＦｅ部分が存在する場合は、この部分は 、バラーブ含有部分とは異なる動物に固存のアミノ酸残基配列を存する。例えば 、周知のようにヒトのＦ１部分は、遺伝子工学技術を施した場合のように、マウ スの結合部位を含む部分とともに存在させることが可能である。

本分析方法で用いられる“生物学的分析条件′は、分析されるサンプルの他、こ の分析で用いる抗体およびポリペプチドの生物学的活性を維持するために選択さ れる。典型的に許容される“生物学的分析条件”は、約４°Ｃから約４５°Ｃの 範囲、好ましくは約３７℃の温度：ｐＨ値は約５から約９の範囲、好ましくは約 ７、さらに、イオン強度は蒸留水のそれから約ＩＭの塩化ナトリウムのそわ、好 ましくは生理学的食塩水のそれを含む。そのような条件を最適化する方法は当業 者にとり既知である。

目的分析で形成される免疫複合体の存在または量を決定する態様は、該免疫複合 体を識別するために望ましい方法によって左右される。例えば、該分析で用いら れる抗体は血小板との免疫複合体の形成前または形成後に標識することができる 。該標識免疫複合体は、それぞれの標識の検出に適した方法、例えば放射性標識 が用いられているときは放射能検出によって、蛍光物が用いられているときは蛍 光検出によって、ビオチン標識が用いられているときはアビジンとの反応によっ て、酵素標識が用いられているときは酵素基質の検出生成物への変換によるなど して定量化できる。また別に、未標識免疫複合体は、該免疫複合体と標識された 物質（これは免疫複合体と特異的に反応するもので、例えば標識抗−抗体である ）との間の免疫反応生成物の形成によって検出することができる。それによって 標識は分析されるべき免疫複合体に付着し、これは検出を容易にすることができ る。

Ｈ０診断系 キット形の診断系は、ここに記載する方法にしたがって少なくとも１回の分析に 十分な量の中に、本発明の単離ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、または 天然のＧＰＩＴＩａＰＩ”もしくはＰＩＡｔ決定基と免疫的に反応する本発明の 抗体を別々に梱包した試薬として含む。典型的には梱包された試薬の使用につい ての指示もまた含まれる。

“使用についての指示”は典型的には試薬の濃度または少なくとも１種類の分析 方法のパラメーター（例えば、混合されるべき試薬およびサンプルの相対量、試 薬／サンプル混合物の維持時間、温度、緩衝液の条件など）を記載する重要な表 示を含む。

好ましい具体例では、本発明の診断系はさらに標識または、上記の方法で調製さ れた免疫反応生成物の形成を示すことができる表示手段を含む。

本明細書で用いられるように、“標識”および“表示手段“という用語は、複合 体の存在を示すための検出可能なシグナルの産生に直接的または間接的に含まれ る単一原子または分子を指す。いずれの標識または表示手段も抗体のような試薬 物質、ポリペプチドまたは融合ポリペプチドに連結または取り込ませることがで きるが、また別々に用いることもできる。さらにこれらの原子または分子はまた 別の試薬と連係させて用いてもよい。そのような標識は、それ自体臨床診断化学 の分野で周知であるが、それらが別に新規な蛋白、方法および／または系を利用 する限り本発明の部分を構成する。

該標識は、抗体または抗原を変性させることなくそれらと化学的に結合し、有用 な免疫蛍光トレーサーであるフルオロクロム（染料）を形成することができる蛍 光標識剤でもよい。適切な蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネーｈ（ＦＴ Ｃ）、フルオレセインイソチオシアナイト（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン− １−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイ ソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルク ロリド（ＲＢ２００ＳＣ）、キレート−ランタニド結合物（例えばＥｕ５Ｔｂ、 Ｓｍ）などである。免疫蛍光分析技術についての記載は以下の文献で見出される ：デルカ（ＤｅＬｕｃａ）、“免疫蛍光分析”　（’　［ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ”）、手段としての抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ 　ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ）より、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら纒、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ ｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｌｔｄ、、　１８９−２３１ページ（＋９８２）（本明細 書には参考文献として含まれる））。

好ましい具体例では、該標識は酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ ＨＲＰ）（本明細書で実例として用いられている）、グルコースオキシダーゼ、 アルカリホスファターゼなどである。主たる標識がＨＲＰまたはグルコースオキ シダーゼのような酵素である場合、さらに別の試薬が、抗体−抗原複合体（免疫 反応物）が形成された事実を可視化させるために要求される。ＨＲＰのためのそ のような付加試薬は過酸化水素および酸化染料前駆体（例えばジアミノベンジン ）を含む。ＨＲＰについて有用な付加試薬は、２，２゛　−アジノビス（３−エ チルベンゾチアプリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。

放射性元素はまた標識剤として有用である。典型的な放射性標識剤は、ガンマ線 放射を起こす放射性元素である。それ自体でガンマ線を放出する、例えばＨＡ　 ｌ、＋ｔ＄　１．　ＨＩ　Ｌ　４＋　１および＠ｌ　Ｃｒのような元素は、ガン マ線放射性元素表示群の１つの種類を代表する。特に好ましいものはＩ″ｓＩで ある。有用な標識手段のまた別の群は、それ自体陽電子を放出する、例えばＩＩ Ｃ，ＩｍＦ、　Ｉｓ□およびＩｆｆＮのような元素である。そのように放出され た陽電子は、動物の体内に存在する電子に衝突するときガンマ線を放出する。ま た有用なものは、ベータ線放出物質で、例えばＩＩ＋インジウム、ｔＨ，ｆｆ１ Ｓ、＋４０またはｌｌｐである。

また別の標識が当該技術分野で既に記載されており、本発明の診断系での使用に 適している。例えば、分子対の間で見出される特異的な親和性を用いることがで きるが、その場合１つは特異的な結合剤に固定された標識として、他方は標識の 存在を検出する手段として用いられる。典型的な分子対は、ビオチン：アビジン （この場合ビオチンは標識である）およびペルオキシダーゼ：抗ペルオキシダー ゼ（ＰＡＰ）（この場合ペルオキシダーゼは標識である）である。

標識の連結、すなわちポリペプチドおよび蛋白の標識は当該技術分野で周知であ る。例えば、ハイブリドーマによって産生される抗体分子は、培養液中の成分と して提供される、放射性同位元素を含有するアミノ酸の代謝的取り込みによって 標識される。例えばガルファーらの文献（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、、　７３：３−４６　（１９８１））を参照のこと。活性化官能基を 介する蛋白の共役またはカップリングの技術は特に応用できる。例えば以下の文 献を参照のこと：オーラメアス診断系はまた、好ましくは別々の容器として、特 異的な結合剤を含むことができる。゛特異的結合剤”は、試薬と選択的に結合す る分子物質で、本発明の生成物と順序にしたがって反応するが、それ自体は本発 明の蛋白発現生成物ではない。

典型的な特異的結合剤は抗体分子、例えば抗ヒトＩｇＧもしくは抗ヒトＩｇＭ、 補体蛋白もしくはそのフラグメント、蛋白Ａなどである。好ましくは、特異的結 合剤は、これらの抗体が免疫反応生成物または免疫複合体の一部分として存在す るとき、天然のＧＰＩＩＩａＰＩ”またはＰＩ”決定基と免疫的に反応する抗体 と結合することができる。

好ましい具体例では、該特異的結合剤は標識される。しがし、該診断系が標識さ れていない特異的結合剤を含む場合、典型的には、該結合剤は増幅手段または試 薬として用いられる。これらの具体例では、標識された特異的結合剤は、増幅手 段が試薬物質含有複合体と結合するとき、該増幅手段に特異的に結合する。

本発明の診断キットは、例えば、”ＥＬＩＳＡ”形式で前述の方法において用い られ、体液サンプル（例えば血清、血漿または唾液）中の抗体の存在または量を 検出することができる。”ＥＬＩＳＡ″は、サンプル中に存在する抗原または抗 体の量を検出または定量するために、固相に結合させた抗体または抗原および酵 素抗原または酵素抗体共役物を用いる酵素結合免疫吸着分析を指す。ＥＬＩＳメ ディカルパブリケーション、ロサンジェルス、カリフォルニア（１９８２））　 ；米国特許第３６５４０９０号、３８５０７５２号、４０１６０４３号（これら は全て本明細書に参考文献として含まれる）。

したがって好ましい具体例では、前述のように本発明の天然のＧＰＩＩＩａＰＩ ＡＩまたはＰＩ”決定基と免疫的に反応する目的の単離ポリペプチド、融合ポリ ペプチドまたは抗体は、固形支持体を形成するために固体マトリックスに固定す ることができ、これは本題診断系に別々に梱包される。

有用な固体マトリックスは当該技術分野で周知である。そのような物質は、架橋 デキストラン（ファルマシアファインケミカルズ（ビス力タウエー、ニューシャ ーシー）からセファデックスの商標名で市販）；アガロース：直径およそ１ミク ロンからおよそ５ミリメートルのポリスチレンビーズ（アボットラボラトリーズ （ノースジカゴ、イリノイ）から市販）；塩化ポリビニル、ポリスチレン、架橋 ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロン基材網状物（例えばシ ート、細片もしくはへら状物）、または、ポリスチレンもしくはポリビニルクロ リドから製造された管、プレート、もしくはマイクロリットルプレートのくぼみ を含む。

以下の実施例は本発明の特定の具体例を詳述するもので、いかなる場合にも本明 細書および請求の範囲を制限するものではない。

■、結果 無作為に切断したＧＰＩ　Ｉ　ＴａｃＤＮＡフラグメントを原核細胞発現ベクタ ーλｇｔ２２に挿入して、血小板ＧＰＩＩＩａエピトープライブラリーを構築し た。

このライブラリーは、長さが平均１００−２００アミノ酸残基である、β−ガラ クトシダーゼに融合させたＧＰＩＩＩａの無作為フラグメントを発現する。

このλｇｔ２２−ＧＰＩＩＩａエピトープライブラリーを、ｐｌＡｌｚビトーブ を発現しているクローンのために精製抗ｐｌＡ＋抗体を用いてスクリーニングし た。

患者番号１からの清製抗ＰＩ”抗体と反応する、それぞれ別個の５クローンを単 離し、この組換えファージの各々のＤＮＡの配列分析によって、ＧＰＩＩＩａの アミノ末端に対するＰＩ”エピトープの位置を決定した（図１）。

多クローン抗ＧＰＩＩＩａ抗体を用いてλｇｔ２２−ＧＰＩＩＩａエピトープラ イブラリーをスクリーニングして、全ＧＰＴＩＩａ配列からのフラグメントを単 離した。しかしながら、これらＧＰＴＩＩａの他の領域は、４人の患者の抗ＰＩ 　Ａｌ抗体と反応しなかった。

ＰＩ”抗原を含む最小フラグメントは、成熟ＧＰＩＴＩａのアミノ末端６５残基 および２７残基のシグナル配列を発現していた（図２）。得られた全てのクロー ンはこの領域が共通で、４人から得た精製抗Ｐｉ”抗体と反応したが、これはＰ Ｉ”エピトープはＧＰＴ目ａのアミノ末端６５残基に位置することを示唆しＣｌ １ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８３：ＩＴ７８　（１９８９）：　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｒら、里ｏｏｄ、　７８：６８１　（１９９１）　）@、　Ｔ →Ｃ，、、ｉｔ換によってＧＰＩＩＩａのアミノ末端６５残基を発現しているλ ｇｔ２２クローンで、ＰＩ”（プロリン■）表現形を構築した。

プロリンでロイシン■を置換した結果、抗ＰＩ”抗体反応性は消失したが、多ク ローン抗ＧＰＩＩＩａ抗体との反応性は、ファージプラークとの免疫反応によっ て証明されたようにそのままであった。したがって、残基３３は、この７ＫＤａ のＧＰＩＴＩａのアミノ末端フラグメントにおけるＰＩ”エピトープの形成に重 要であった。

Ｊ、方法および材料 ４人のＦＴＰ罹患者の血１　（Ｄｒ、　Ｓ、　５ｃｈｉｎｋｅ、　Ｓａｎ　Ｊａ ｃｉｎｔｏ（患者１）＋　Ｄｒ、　Ｇ、　Ｓｃｈｍｉｄｔ、シティオブホーブ・ メディカルセンター、　Ｄｕａｒｔｅ（患者２）：　Ｄｒ、　Ｖ、　Ｂｌａｎｃ ｈｅｔｔｅ、小児病院、トロント（患者３および４）の好意により提供された血 漿）由来の抗ＰＩ”アロ抗体を、ＣｎＢｒ−セファロース−４ＢＣＬ（ファルマ シア、ビス力タウエー、ニューシャーシー）に結合させた血小板糖蛋白複合体Ｃ ＰＩＩｂ−１１１ａを用いてアフィニティー精製を行った。

洗浄正常血小板を、１％のトリトンＸ−１００を含む等張のクエン酸緩衝液（ｐ Ｈ６，５）で３０分４°Ｃて溶解し、その後１１０００００Ｘで４°Ｃ６０分遠 心した。上清をＣｎＢｒ−セファロース−４ＢＣＬに結合させたマウス抗ＧＰＩ ｌｂ単クローン抗体（２Ａ９．　Ｄｒ、　Ｖ、　Ｗｏｏｄｓ、カリフォルニア大 学サンディエゴ分校により提供）とともに４°Ｃで一晩インキユベートした。Ｐ ＢＳで洗浄後、結合ＧＰＩＴｂ−ＩＴＩａをＰＢＳ　（ｐＨＩ　ｏ）中の１％オ クタグルコピラノシド（○ＰＧ）中のＯ，１Ｍジエチルアミンで溶出させ、直ち に１％ＯＰＧ含有０．１Ｍ燐酸緩衝液で透析した。この精製ＧＰＩｌｂ−ＴＩＩ ａ−セファロースを血漿とともに４°Ｃて一晩インキユベートし、洗浄し、結合 アロ抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２，５）で溶出させ、直ちに１Ｍトリス（ｐ Ｈ９）で中和し、さらにＰＢＳで透析した。この抗体溶出液を抗原捕捉分析（Ｗ ｏｏｄｓら、Ｂｌｏｏｄ、　６３：３６８　（１９８４））で測定した。

実施例２．エピトープライブラリーの構築およびスクリーニング完全な長さのＧ ＰＩＩＩａをコードする２、６ｋｂの二本鎖フラグメントを、制限酵素ｓｐｈ　 Ｔおよび５ｐｅｌてプラスミドＢ５３ａ　印’Ｔｏｏｌｅら、旺四東亙：１４　 （１９８９））を切断して単離し、続いてアガロースゲルから２．６ｋｂのノく ンドを精製した。続いてこの単離したバンドの５μｇを０．５ｎｇのＤＮアーゼ Ｉで３７°Ｃ３０分、２０ｍＭトリス−ＣＩ　（ｐＨ７，５）および１．５ｍＭ ＭｎＣ１ｚの０５ｍｌ中で消化した。該反応混合物のフェノール：クロロホルム 抽出によって反応を迅速に停止させる。

生したＧＰＴｌｌａＤＮＡをエタノールで沈澱させた後、フラグメントをＴ４Ｄ ＮＡポリメラーゼで二本鎖５ａｉｌリンカ−ＧＧＴＣＣ；ＡＣＣ（ここに示した 方向の配列のみ、配列番号：３０）に連結し、制限酵素５ａｌｌで切断し、さら に５ａｉｌ消化脱燐酸λｇｔ２２　（ブログマ社、マジソン、ライスコンシン） に連結した。続いて連結ＤＮＡのパッケージングを行い、未増幅ライブラリーの 力価を大腸菌Ｙ１０９０で調べたところ、２Ｘ１０’（８４％の組換え）の総フ ァージ数を含んでいることが分かった。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８０：１１９４　（＋９８３ ））にしたがって飽和させた濾紙で誘発した。続いてこの濾紙をウサギ抗ＧＰＩ ＴＩａ多クローン抗体（λｇｔ２２感染大腸菌ＹＩ０９０溶解物で前処理吸収、 正常ウサギ血清で前処理吸収）　ＣＬｏｆｔｕｓら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４訂 ９１５　（１９９０））または精製抗Ｐ１１１抗体（１：１００希釈）のいずれ かてスクリーニングした。

結合抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）または 抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用い、発色性基質、０−フェニレンジアミンで増幅して 検出した。この精製した抗ＧＰＩＴＩａおよび抗ＰＩ”陽性ファージを、λｇｔ ２２と組換えλｇｔ２２構築物のｌ＝１混合物の１００から２００プラークを大 腸菌Ｙ１０９０上に撒いてスクリーニングした。ＩａｃＺ遺伝子を誘発し、濾紙 を小片に切り、前処理吸収抗ＧＰＩＩＩａ抗体、正常ウサギ血清、抗ｐｌＡ＋抗 体およびヒト血清でスクリーニングした。

実施例４．ＧＰＩＴＩａ挿入物の配列決定組換えλｇｔ２２ＤＮＡを記載〔分子 クローニング：実験室マニュアル、第２版、サンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら纒、コールドスプリングハーバ−研究所出版部（１９８９））にしたがって単 離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔｌ制限酵素で切断し、標準的技術でプラスミドブ ルースクリプトＩ　ＩＳＫ＋／−（ストラタジーン、ラホイヤ、カリフォルニア ）でサブクローニングした。続いて、ジデオキシ配列決定Ｔ３プライマー（スト ラテジーン）を用いて両方の鎖の配列を決定し、該ＤＮＡフラグメントの境界を めた。最小の抗Ｐｌ”ｐＡ性ＧＰＩＩｌａフラグメント（２９２ｂｐ）のプラス ミドサブクローンの完全な配列を決定し、続いて突然変異誘発に用いた。

実施例５．インビトロ突然変異 オリゴヌクレオチド誘導突然変異は、プライマー伸長法（Ｚｏｌｌａｒら、Ｎｕ ｃ、　Ａｃ、ｉｄｓ　Ｒｅｓ、、ｌｏ：６４８７（１９８２））および鎖選別法 〔Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８２：４８８　（＋９８５））　（これは非変異鎖に対して強力な生物 学的選別を提供する）を組み合わせて実施した。ＧＰＩＩＩａの塩基＋９６のＴ ４Ｃ単一変異を、オリゴヌクレオチドＧＧＴＧＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧ ＣＣＴＣＡを用いて２９２ｂｐフラグメントに導入した。

期待の変異を有する挿入物をＮｃｉ１部位の出現（Ｎｅｗｍａｎら、Ｊ、　Ｃ１ １ｎ、　１ｎｖｅｓｔ、、　８３：１７７８　（＋９８９））でスクリーニング し、続いて、完全に配列決定を行った。

Ｔ→ＣｒＩＬ換をもつ挿入物を続いてλｇｔ２２にサブクローニングし、ＰＪ” エピトープ含有融合ポリペプチドを形成した。

実施例６．ＦｎフラグメントＭＢＰ融合蛋白の調製および単離２つのＭＢＰコー ドプラスミド、ｐＭＡＬ”ｐ２およびＩ）ＭＡＬ”ｃ２を、本融合蛋白を大腸菌 て発現するためのベクターとして使用する。融合蛋白のＭＢＰ領域は、池の細胞 性蛋白から該融合生成物を容易に精製することを可能にする。

これらのベクターは周知の技術〔分子クローニング：実験室マニュアル、第諏、 サンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら纒、コールドスプリングハーバ−研究所出 版部、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク（１９８９））とその後で以 下に記載する方法を行うことによって構築される。これらのベクターに先行する ものについての多くの考察（すなわちベクターｐＰＲ７３４およびｐｌＨ８２１ （制限地図、構築遺伝子およびコード配列、使用および使用手順を含む））は、 分子生物学の今日的手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏ（ｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ａｌｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら纒、ＧｒｅｅｎｅＰｕ ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　＆　Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉ ｅ口ｃｅ、ニューヨーク（１９８９）　１６．６．１−１６、６．１２ページ） で見出すことがてきる。

Ａ、ＭＢＰベクターの構築 典型的なＭＢＰベクターの構築は、前述のＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ　Ｔフラグメント に含まれる、ＰＩ”の６５アミノ酸残基エピトープをコードする配列番号：２の ＰＩ”フードＤＮＡを含むｃＤＮＡクローンを用いて以下の通りに行われる。こ のフラグメントは、所望のＰｌ”エピトープをコードするＤＮＡだけでなく、λ ｇｔ２２ポリリンカー領域のＤＮＡを含むが、それとともに５′末端にＥｃｏＲ １部位を、３゛末端にＮｏｔ１部位を、さらにそれらの間に５ａｌｌおよびｘｂ ａ１部位を育する。本明細書で考察されるＰｌ”またはＰＩ”エピトープをコー ドするまた別のｃＤＮＡクローンも同様に用いることができることは理解される ところであろう。

したがって、抗ＰＩ”陽性ＧＰＩＩＩａフラグメントを含む前述のλｇｔ２２ベ クターを５ａｌｌで消化する。マルトース結合蛋白融合蛋白ベクターｐＭＡＬｔ Ｍｃ２（＝ニーイングランドバイオラブ社、ビバーリー、マサチューセッツ）を ５ａｌｌで消化し、５ａｌｌ粘着末端を生成する。ｐｌＡ＋コード５ａｉｌ−３ ａ１１フラグメントをＤＮＡＴ４リガーゼを用いて該ベクターに繋ぎ、クローニ ングしたＰＩ”コード遺伝子フラグメントを機能しうるようにＭＢＰコード遺伝 子フラグメントに連結させた、融合ポリペプチド形成構築物を作成する。得られ た組換えＤＮＡ分子はＭＢＰ−ＰＩＡ＋融合ポリペプチドを発現させることがで きる。

上記の操作の結果、発現融合ポリペプチドのカルボキシ末端はいくつかの非ＧＰ １１１ａ残基配列を含んでいる。さらに、この後に詳しく考察するように、ｐＭ ＡＬ”ｃ２ベクターのＳｃｉ１部位はポリリンカー領域の３°末端近くに位置し ている。したがって、ファクターＸａで切断したあとですら、生じた組換えポリ ペプチドは、該分子のアミノ末端にいくつかのベクター誘導残基を含んでいる。

これらのベクター誘導残基は前述の５ａｌｌリンカ−付加によって導入されたも のにさらに付加される。

当業者には、ベクター誘導残基を排除するために該発現融合ポリペプチドを短く するまた別の周知の技術が利用できることは理解されよう。そのような操作の１ つは、読み枠にしたがった５′平滑端ＰＩ”エピトープコードＤＮＡフラグメン トを利用するもので、これをｐＭＡＬＴＭｃ２またはｐＭＡＬ”ｐ２ベクターの Ｘｍｎ１部位に挿入し、それによってファクターＸａでの切断後、ベクター誘導 アミノ酸残基は組換えポリペプチドには存在しなくなる。また別の操作はＧＰ１ １１ａコード配列の３′末端に連結した読み枠にしたがった終止コドンを利用す るもので、このコドン自体は、該ＤＮＡに挿入するために利用しつるさらに下流 の制限部位に連結される。この操作により、組換えポリペプチドのカルボキシ末 端からベクター誘導残基は除去される。

ベクターｐＭＡＬ”ｃ２およびｐＭＡＬ”ｐ２はニューイングランドバイオラへ の融合蛋白の輸送を促進する）力次失していることを除いて、ベクターｐＭＡβ −Ｄ−チオガラクトシド）が発現誘発に用いられるまで発現活性を抑制すること ができる。残余のベクターの骨格はｐＫＫ２３３−２　（ファルマシア、ピスヵ タウエー、ニューシャーシー）のＡｖａｌ（充填連結）からＥｃｏＲＩ　（充填 連結）まての部分である。

マルトース結合蛋白融合発現系（ＭＢＰ発現系）の重要な構成成分は、アマンよ びｐＭＡＬ’″ｐ２　（ｐＰＲ７３４）ベクターにューイングランドバイオラブ 、ビバリー、マサチューセッツ）並びにｐＫＫ２２３−３およびｐＫＫ２３３− ２（ファルマシア、ビス力タウエー、ニューシャーシー）で市販されている。

ＭＢＰ発現系は場合によって、先にファラボーによって報告された（Ｆａｒａｂ ａｕｇｈ。

ドする遺伝子を含んでいる。発現ベクターにＩａｃＴ遺伝子が存在しない場合、 ラムダリプレッサーを発現している細菌株、例えばＪＭＩＯＩ、ＪＭ１０５．５ Ｍ１０７、ＪＭ　Ｉ　０９　（ＡＴＣＣ＃３３３２３）およびＪＭ　１１０　（ ＡＴＣＣ＃４７０１３）　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ、　３ ３：１０３　（１９８５））を用いてトランス形式で提供することができる。

これらの細菌株はストラテジーン（ラホイヤ、カルフォルニア）から市販されて いる。

ングハーバー研究所出版部、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク（１９ ８９））に記載されているような標準的な分子生物学の技術を用いて、機能しつ るように一緒に繋ぎ合わせることができる。必要な場合には、種々の成分の読み 枠を合成リンカ−１種々の空白充填反応または種々のエキソヌクレオ−シスを用 いて調節することができる。さらに、読み枠における種々の欠失または調節を、 ループ削除による変異または市販の突然変異キット（例えばバイオラッドラボラ トリーズ（リッチモンド、カリフォルニア）製の突然変異キット）を用いて容易 に行うことができる。

この発現系の必要な成分の各々はこれから詳細に述べる。アマンらによって先に 報告された（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、　２５：１６７−１７８　（＋９８３） ）Ｐ　ｔ　ａ　ｃ　１１プロモーターは、多数の入手可能なベクター、例えばＰ ＫＫ２２３−３　（ファルマシア）、ＰＩＨ８２１およびｐＰＲ７３４にューイ ングランドバイオラブ、ビバリー、マ単離することができる。

ＨＢ　Ｉ　ＯＩ　（ＡＴＣＣ＃３３６９４）または野性壓大腸菌ＫＩ２）の染色 体から単離したＨｉｍａｌＥ遺伝子はデユーブレーらによって配列が決定され（ Ｄｕｐｌａｙら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｕ、、　２５艶１０６０６−１０６１３（１９８４））、したがってｍ ａｌＥ遺伝子に特異的なブローントとして化学的に合成することができ、これら のセグメントはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結さｔｔ、ｍａｌＥ遺伝子を製造 することができる。成熟マルトース結合蛋白（ｍａｌＥ遺伝子産物）は、デユブ レーらの報告のように（Ｄｕｐｌａｙら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２ ５訂＋０６０６−１０６１３（１９８４））、ｍａｌＥ遺伝子配列のコドン２８ −３４２によってコードされる。該発現ベクターは、マルトース結合蛋白リーダ ー配列および成熟マルトース結合蛋白をコードするコドンを含むか（例えばｐＭ ＡＬ”ｐ２の場合）、または成熟マルトース結合蛋白をコードするｍａｌＥ遺伝 子の１部分のみ（例えばｐＭＡＬ’″ｃ２の場合）を含む。

ら、と凹、競：ＩＯ３−１１９（１９８５））が報告したプラスミドベクターｐ ＵＣＩ９から単離できるが、さらに市販もされている。１ａｃＺα遺伝子および ｍａｌＥ遺伝子は、有用な制限エンドヌクレアーゼ認識配列（この部分へクロー ニングすることによって挿入のためのブルー／ホワイトスクリーニングか可能に なる）を含むポリリンカーを用いて繋ぎ合わせることができる。

ターは、入手可能なベクター（例えば、ＰＥＡ３００（ＡＴＣ（４３７１８１） ＰＫＫ２２３−３およびＰＫＫ２３３−２　（ファルマシア）並びにＰＩＨ８２ １およびＰＰＲ７３４にューイングランドバイオラブ））から容易に単離できる 。例えば、ｒｒｎＢリポソーム転写ターミネータ−は、Ｈ４ｎｄｌｌｌおよびＰ ｖｕ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼを用いてｐＫＫ２２３−３から単離できる。

（Ｐａｒａｂａｕｇｈ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７４ニア６５−７６９　（１９７ ８））によって配列が決定された。さらに、１ａｃｌ遺伝子は幾つかの入手可能 なベクター（例えばｐブルースクリプトＩＩＫＳおよびｐブルースクリプトＳＫ （ストラテジーン）並びにｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９（ファルマシア））に含 まれている。Ｉａｃｌ遺伝子は、これらのベクターから制限エンドヌクレアーゼ および標準的分子生物学技術を用いて単離できる。Ｉａｃｌ遺伝子は、該発現ベ クター内または該発現ベクターが増殖している細菌内に存在する。発現ベクター 内のｍａｌＥおよび１ａｃＺ遺伝子の間に存在する複数のクローニング部位（ポ リリンカー）を表１に示し、配列番号３２として配列リストに挙げた。

青土 発現系におけるポリリンカーの配列 ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣ’ｒ　ＡＧＡ　ＧＴＣＧＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ」は凪ＬＸｕ− ・ ＧＣＡ　ＡＧＣＴＴＧ　＋＋＋シ！− 制限エンドヌクレアーゼ切断部位は上の表のＤＮＡ配列の上に示され、各々の部 位には下線が引かれている。融合蛋白のファクターＸａ切断のための４残基の認 識部位は、表に示す最初の４つのコドンによってコードされる。１０個のアスパ ラギン残基をコードするＤＮＡがｍａｌＥ遺伝子および上記のポリリンカーを単 離する。

上に記したように、複数のクローニング部位（ポリリンカー）は、ｍａｌＥと１ ａｃＺ遺伝子との間に位置するファクターＸａ切断部位をコードする核酸セグメ ントを含む。このベクターによって産生されるマルトース結合蛋白融合蛋白はフ ァクターＸａ切断部位で切断することができ、それによって、所望の蛋白の精製 および究極の低分子量組換え体の産生を促進する。ここに述べるように、例えば ｐｌＡ＋またはｐｌｘｔをコードする外来遺伝子は表１に例示する１つまたはｌ っ以上の制限部位に挿入することができる。Ｘｍｎ１部位を用いられ、さらに発 現融合蛋白がファクターＸａで切断されるときは、該ベクターのために、ＰＩ” またはｐｉＡ！ポリペプチドに対して何も付加されない。また別の部位を用いる 場合は、およそ１５個までのベクター由来残基を付加することができるが、それ はどの部位か用いられるかによる。

上記のように目的のＰＩ”またはＰＩ”ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドベクター が一旦調製されると、このベクターは標準的な技術にしたがい大腸菌を形質転換 するために用いられる。形質転換可能ないずれの大腸菌も用いることができ、Ｐ Ｒ７２２またはＥＲ１４５１株にューイングランドバイオラブより入手可能）が 特に適切である。生じた形質転換大腸菌を続いて培養増殖させる。

Ｂ、ＭＢＰ融合蛋白の発現 特定のＭＢＰ融合蛋白の動態を知るための小規模実験にって述べる。このプロト コールにより３つの粗抽出分画が得られる；低浸透圧ショック工程によって調製 した全細胞粗抽出物、この粗抽出物からの不溶性物質およびペリプラズム分画で ある。

８０ｍ１の高栄養ブロス＋グルコースおよびアンピシリン（１リツトル当たり、 １０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、５ｇＮａＣｌ、１ｇグルコースを含み、高 圧蒸気滅菌しアンピシリンを１ｏｏμｇ／］で添加）に、上記のようにして作成 した融合プラスミドを含む形質転換大腸菌細胞を接種する。十分に通気して２× １０”細胞／ｍｌまで３７°Ｃて増殖させる。１ｍｌのサンプルをとり微量遠心 機で２分間遠心する（未誘発細胞）。上清を捨て、細胞を１００μｌの５ＤＳ− ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再浮遊させる。ヴオルテックスで攪拌し、氷上に静置 する。

ＴＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を残余の培養に加え、最終濃度を０ ．３ｍＭとする（例えばＨ，Ｏ中（１）０．　１Ｍノストック溶液０．２４ｍ１ ）。

３７°Ｃで２時間培養を継続する。１ｍｌのサンプルを取り、微量遠心機で２分 間遠心する（誘発細胞）。上清を捨て、細胞をＳＤＳ’−ＰＡＧＥサンプル緩衝 液１５０μｌに再浮遊させる。ヴオルテックスで攪拌し再浮遊させ、氷上に静置 する。

る。

培養を２つの部分標本に分番九細胞を４０００ＸｇｌＯ分遠心して採集する。

上清を捨て、５ｍｌの１０ｍＭ燐酸ナトリウム、３０ｍＭのＮａＣ１％０．２５ ％のトゥイーン２０、ｌ０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ　（ジグ７Ｅ４ ３７８）、ｐＨ７，０に一方のペレット（サンプルＡ）を再浮遊させる。他方の ペレット（サンプルＢ）を１０ｍ１の３０ｍＭ）リス−塩酸、２０％蔗糖、ｐ） ［８，０（各々０．１ｇの湿潤重量の細胞について９ｍ１）に再浮遊させる。

ドライアイス−エタノール浴でサンプルＡを凍結しくまたは２０”Ｃでおよそ１ ８時間）、続いて冷水中で融解させる。サンプルを超音波処理し、ブラッドフォ ードアッセーまたは２８０１ｍ　（Ａｔｓ。）での吸収によって、それが最大と なるまで蛋白の遊離を測定して細胞破壊をモニターする。９０００Ｘｇで２０分 遠心する。上清を捨て（粗抽出ｌ）氷上で保存する。ペレットを５ｍｌの１０ｍ Ｍ燐酸ナトリウム、０．２５％トウィーン２０，３０ｍＭＮａＣ１、ＩＯｍＭＥ ＤＴＡ、Ｉ　ＯｍＭＥＧＴＡ、　ｐＨ７，０に再浮遊させる。これは不溶性物質 の懸濁物である（粗抽出２）。

ＥＤＴＡを１ｍＭのサンプルＢに加え、震盪または攪拌しながら室温で５−１０ 分インキュベートする。４℃で遠心し、上清をすべて除去し、ペレットを１０ｍ １の水冷５ｍＭ硫酸マグネシウムに再浮遊させる。水浴で１０分震盪または攪拌 する。上清は冷浸透圧ショック液である。

５μｍの２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を５μｌの粗抽出物Ｉおよび２に 加え、さらに１０μｍの２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を１０μｍの冷浸 透圧ショック液に加える。これらのサンプルを、未誘発および誘発サンプルとと もに５分間煮沸する。微量遠心機で２分遠心する。２０μＩの未誘発および誘発 細胞サンプル並びに全抽出サンプルを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加する。

上記サンプルの１＝５希釈を用いる全く同じ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルもまた用いる ことができる。続いてウェスタンプロットを実施し、抗ＭＢＰ血清またはクロー ニングしたＧＰＩＩＩａ部分に特異的な血清で展開し、所望のエピトープを含む 抽出物を同定する。

Ｃ，ＭＢＰ融合蛋白の精製 ３００ｍ１の樹脂用には、ｉｏＨのアミロース（シグマ、カタログ番号Ａ−７０ ４３）、４０ｍ１のＨ，Ｏｌおよび１０１００Ｏビーカーに入れた攪拌バーを用 意し、攪拌しながら５０°Ｃに温める。換気フード中で６０ｍ１の５ＮＮａＯＨ を加え、続いて激しく攪拌しながら３０ｍ１のエピクロルヒドリン（シグマ、カ タログ番号Ｒ−４２５５）を加える。この懸濁物はゲル化に際して発熱するであ ろう。懸濁物が固体ゲルを形成し微かに黄色となるまで、約１０分攪拌を続ける 。室温まで冷却しく約４５分から１時間）、続いてゲルを切って細片にし、Ｉｏ ｏｏｍｌのＨ！。

で３回洗浄する。ゲルをウェアリングミキサーに移し、約３から５秒間ゲルを砕 く。１０１００Ｏの５０ｍＭグリセリン−塩酸、０．５ＭＮａＣｌ、Ｉ）Ｈ２， ０で２回洗浄し、洗浄の間に微粒子を排除する。

水で３回洗浄しく微粒子は排除し続ける）、続いてｌ０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐ Ｈ７，０で３回洗浄する。１０ｍＭの燐酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナト リウム、ｐＨ７，０にゲルを懸濁させ、４°Ｃで保存する。樹脂上の非特異的部 位をＩｏｏｏｍｌの３％無脂肪ドライミルクで４°Ｃで一晩ブロックする。

（２）アフィニティークロマトグラフィー以下はＭＢＰ融合蛋白の大規模精製の プロトコールである。

ｌリットルの高栄養ブロス、グルコースおよびアンピシリン（１リツトルにつき １０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキストラクト、５ｇＮａＣｌ、１ｇグルコース、 加圧滅菌しアンピシリンを１００μｇ／ｍ＋に加える）に、所望のＭＢＰ融合蛋 白を発現しているプラスミドを含む形質転換大腸菌細胞を接種する。２ＸＩＯ” 細胞／ｍｌ　（Ａｓ。。は０．　４）まで増殖させる。ＩＰＴＧを最終濃度０． ３ｍＭで加える（例えば０．１Ｍのストック水溶液の８５ｍｇまたは３ｍ１）。

形質転換大腸菌細胞を発現が生じるために十分な時間（例えばｌから３時間）３ ７°Ｃでインキュベートする。

４０００×ｇで遠心して細胞を採集し、５０ｍ１のｌ０ｍＭ燐酸ナトリウム、３ ０ｍＭＮａＣｌ、０，２％トウイーン２０、Ｉ　ＯｍＭＥＤＴ八、ｌｏｍＭＥＧ ＴＡ（シグマ、カタログ番号Ｅ−４３７８）　、ｐＨ７，０に再浮遊させる。こ の再浮遊サンプルをドライアイス−エタノール浴で凍結しくまたは約２０’Ｃで １８時間）、冷水で融解させる。超音波処理し、ブラッドフォード分析またはＡ □、を用いて蛋白遊離を測定し、それが最大に達するまで細胞破壊をモニターす る。９０００×ｇ３０分遠心し、上溝を採集し粗抽出物を形成する。

架橋アミロース樹脂をエーレンマイヤーフラスコに注ぎ入れ静置する。少なくと も等容量のカラム緩衝液＋０．２５％トウィーン２ｏて数分樹脂を洗浄する（カ ラム緩衝液３１０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７，０）。

培養１リツトルにつき約４０から２００ｍ１の樹脂をカラムに注ぎ入れ、カラム を同じ緩衝液の３カラム容量で洗浄する。

粗抽出物をカラム緩衝液＋０．２５％トウィーン２ｏでｌ：５に希釈する。希釈 粗抽出物を、　（］　ＯＸ　（カラム直径（ｃｍ））”）ｍｌ／時間の流速で添 加する。これは、２．５ｃｍカラムで約１ｍｌ／分である。粗抽出物の希釈は、 蛋白濃度を約２．５ｍｇ／ｍｌに減少させることを目的とする。大雑把には、細 胞湿潤重量１ｇは約１２０ｍｇ蛋白に当たる。

すべてのＭＢＰ融合ポリペプチドがカラムに結合したことを確信するために、粗 抽出物を２回カラムに通すが、殆どの場合、結合能力のあるＭＢＰ融合ポリペプ チドは全て第一回のカラム通過でカラムに結合する。融合ポリペプチドはまた、 粗抽出物と樹脂を４°Ｃで２から７６時時間中かに攪拌しながらインキュベート することによってバッチ式で樹脂に添加することができる。３カラム容量のカラ ム緩衝液＋０．２５％トウィーン２ｏで洗浄し、続いてトウィーン２ｏを含まな い５カラム容量のカラム緩衝液て洗浄する。

融合ポリペプチドを１０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ　１０ｍＭｖル トース、ｐＨ７，０で溶出させる。１ｏから２０分画（各々はカラム容量の１１ ５からｌ／１０である）を採集し、該分画を蛋白について、例えばブラッドフォ ード分析またはＡ□。を用いて分析する（ＭＢＰ融合ポリペプチドを含む分画は 容易に検出できる蛋白を有する）。ＭＢＰ融合ＰＩ”またはｐｌＡ！ポリペプチ ドは、カラムのボイドボリュームの後すぐに溶出する。蛋白含有分画をプールす る。４Ｘ１００容量のｌ０ｍＭトリス−塩酸、１００ｍＭＮａＣ］、ｐＨ８，０ に対して透析し、マルトースを除去する。アミコン・セントリコンもしくはセン トリブレツブ濃縮器、アミコン攪拌付き細胞濃縮器または同等物で濃縮する。

ＭＢＰドメインがファクターＸａでＰＩ”またはＰＩ”ポリペプチドから切断さ れる場合、さらにアミロースアフィニティークロマトグラフィーでＭＢＰを除去 する。その後、所望のｐｌＡ＋またはＰＩ”ポリペプチドを、例えばＤＥＡＥ− セファロースまたはモノーＱＨＰＬＣクロマトグラフィーのような標準的手段で 精製することがてきる。

本発明は明確さと理解のために実施例によって詳細に説明したが、ある種の明白 な修飾は添付の請求の範囲内で実施されつるであろう。

配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人：Ｒｏｎａｌｄ　Ｄ、　ＢｏｗｄｉｔｃｈＲｏｂｅｒｔ　ＭｃｌＪ ｉｌｌａｎ Ｍａｒｋ　Ｈ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ （ｉ　ｉ）発明の名称： 血小板ＧＰ　１１１ａＰ　Ｉ”およびＰＩ”エピトープ、その製造および使用（ ｉ　ｉ　ｉ）配列の総数：３２ （ｉｖ）郵便物の宛先： （Ａ）名宛人：Ｄｒｅｓｓｌｅｒ、　Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ、　５ｈａｒｅ、　５ ｕｔｋｅｒ　＆　Ｍｌｌｎａｍｏｗ、　Ｌｔｄ。

（Ｂ）丁名：　１８０　Ｎｏｒｔｈ　５ｔｅｔｓｏｎ　Ａｖｅｎｕｅ（Ｃ）町名 ：　Ｃｈｉｃａｇ。

（Ｄ）州名：イリノイ （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ジップコード＋６０６０１ （ｖ）コンピューター解読形式。

（Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター　ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）　演算システＬ：　ＰＣ −ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトＰａｊｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１ ．Ｏ，バージョン＃１．２５（ｖＤ現在の出願状況・ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日。

（Ｃ）分類： （ｖｉｊｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：　Ｅｄｗａｒｄ　Ｐ、　Ｇａｍ５ｏｎ（Ｂ）登録番号＋２９３８１ （Ｃ）リファレンス／トケット番号：５ＣＲＦ２７６．０（ｉｘ）通信に関する 情報： （Ａ）を話：　（３１２）６１６−５４１８（Ｂ）ファクシミリ：　（３１２） ６１６−５４６０（２）配列番号：ｌの情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ＝６５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類；ペプチド （ｉｘ）特性： （Ａ）名称／キー：修飾部位 （Ｂ）所在場所＝３３ （Ｄ）他の情報、／標識＝Ｘａａ ／註＝“Ｘａａはロイノンまたはプロリンである”。

（ｘｉ）実際の配列：配列番号：１ ＣＬｙ　Ｐｒｏ　Ａ＠ｎ　Ｉｌ＠　ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｃ１ｙ　 Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｗ{ ｌ　Ｓ　１０　１５ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　丁ｒｐ　 Ｃｙｓ　５ｅｒ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｘａａ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｅ　 Ｇｌｕ　八ｓｏ　Ｌａｕ　ＬａＩ３　Ｌｙｅ　入１ｐ　＾１■ コＳ　、　４０　４５ Ｃｙ１＾１ａ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｓａｔ　ｕｓ　ＧＬｕ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｖａｌ 　ｇ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｉ　Ｌｓｕ５ｏ　ｓｓ　６ａ ２（“ （２）配列番号、２の情報。

（ｉ）配列の性状。

（Ａ）長さニア９８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （１１）分子の種類＝ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴。

（Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．７９８ （ｘｉ）実際の配列：配列番号・２ （２）配列番号−３の情報・ （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ：２６６アミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線状 （１１）分子の種類、ペプチド （ｘｉ）実際の配列、配列番号−３ Ｍａｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　八ｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｌｌｕ　＾１■ Ｉ　Ｓ　１０　１５ Ｌ＠ｕ　にＩＶ　Ａｌａ　ｆ、ｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ 　Ｇｌｙ　ＣＬｙ　Ｐｒｏ　Ｍｎ　Ｘｌ＊　ｅｙｓ　Ｔｈｒ丁ｈｒ　入ｒｇ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｓｉｒ　ｃｙｓ　Ｇｌｒ＋　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　 Ａｌａ　Ｖａｌ　ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅ■ Ｃｙｓ　＾１畠　Ｔｒｐ　Ｃｙｍ　Ｓ＠ｒ　Ａｍｐ　Ｇｌｕ　ｋＬａ　Ｌ＠ｕ　 Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ｂ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ｃｙｓＳｏ　５５　６０ ＾＊ｐ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｅ　ＧＬｕ　Ａｇｎ　Ｌ＠ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　 Ａｇｎ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　５−ｒ　ｒｌｅＣ１ｕ　Ｐｈｅ　Ｐ ｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａ ｍｐ　ｋｒｑ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　５ｓｒＩＩ５　９０　９５ ＾ｕｐ　Ｌｙｍ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　 Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　（ｉｔ{ 人ｒ９１１１１　入１ａ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　ｋｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　 Ａｍｐ　Ｓｅｒ　ＬＹ＠　Ａｇｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅ１ユ５　１２ｏ　ユ ２５ ＣＬｎ　Ｖａｌ　ｋｒｑ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　Ａｓｐ　工ｉｓ　丁ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ１コ０　１コ５　１ ４０ Ａ＋＋ｐ　Ｌ＠ｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙ＠＾ｓｐ　Ａｍｐ　 Ｌ＠ｕ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　工１４１　Ｇｌｎ＾ｇｎ　ＬａｕＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌ ｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｍｓｔ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ’　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　５ａｒ　Ａｇｎ　Ｌａｕ　Ａｒ■ １６５　１７０　ニア５ ！ｌ＠　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　ＡＩＩＰ　Ｍｅｔ　Ｌｙ−τｈｒ丁ｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌ ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｔ　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｉｔ’ｓ　Ｖｌｌｌ 　Ｌ＠ＬＩ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　丁ｈｒ　O−ｐ ＧＬｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｃ１ｕ　Ｃ１ｕ　Ｖａｌ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｔ　八ｒ９（２）配列番号　４ の情報・ （ｉ）配列の性状； （Ａ）長さニア９８夷基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （１１）分子の種類・ＤＮＡ　（ゲノム性）（ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所＋１．．７９８ （ｘｌ）実際の配列、配列番号・４ Ａｍｐ　Ｌ４ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｕｒ　ｌ１ｅ６５　７０　フＳ　 ５Ｏ （２）配列番号：５の情報： （ｉ）配列の性状。

（Ａ）長さ：２６６アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類、蛋白 （ｘｉ）実際の配列、配列番号　５ Ｍ＠ｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌｓｕ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖｌｌｌ　Ｌ＠ＬＩ　ＡP１ｌ Ｉ　Ｓ　１０　ｉｓ Ｌ＠ｕ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｌ＊ｕ＾ｌａ　Ｇｌｙ　Ｖｍｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　触ｎ　Ｘｌｅ　Ｃｙｓ　ＴｈｒＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ 　Ｖｉｌ　Ｓ＠ｒ　５＊ｒ　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｍ　Ｌｅｕ　Ａｌａ 　Ｖａｌ　Ｓｓｒ　Ｐｒｏ　Ｈ＠ｔＣｙｓ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　ｃｙｓ　ｓ＠ｒ　 Ａｍｐ　（ｉｌｕ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ 　Ａｒｇ　Ｃｙ■ ｘ叩り、＠ｕ　ＬｙＩＩＧｌｕ　Ａｇｎ　Ｌ＠ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｊ ｖｎ　Ｃｙ＠Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｘｌ曽Ｖａｌ　Ｃｙｓ＾ｓｐ　 にｉｌｕ　Ｌ、ｙｓ　Ｘｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｎ（２）配列番号 ・６の情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ　＋９５塩基対 （Ｂ）型：１′！ｉ酸 （Ｃ）鎖の数・二本鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）所在場所　１．、＋９５ （ｘｉ）実際の配列、配列番号・６ （２）配列番号　７の情報： （ｉ）配列の性状 （Ａ）長さ二６５アミノ酸 （Ｂ）梨　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類、蛋白 （ｘｉ）実際の配列：配列番号・７ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ＣｙｓＩ　Ｓ　ｎｏ　１ｓ Ｌｅｕ　Ｃ１ｙ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｍｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　＾５ｎ（２）配列番号：８ の情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ：１９５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．１９５ （ｘｉ）実際の配列：配列番号：８ （２）配列番号：９の情報。

（ｉ）配列の性状。

（Ａ）長さ、６５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：蛋白 （ｘｉ）実際の配列・配列番号、９ Ｇｕｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＸＬｍ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　丁ｈ【　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　 ＶａＬ　Ｓｓｒ　５ＩＩｒ　Ｃｙｓ　ｃａｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙ■ ｌ　５　１０　ｉｓ ＣＹｍ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｓ＠ｒ　ＸＬｍ　Ｃ１ｕ　ｆ’ｈ＊　Ｐｒｏ 　Ｖａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　入ｒｇ　ＶａＬ　Ｌｓ■ Ｓｏ　５５　６０ （２）配列番号・１０の情報。

（ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ＝２７３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｊｌｌの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴・ （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．２７３ （ｘｉ）実際の配列：配列番号、１０ （２）配列番号＝１１の情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ：９１アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：蛋白 （ｘｉ）実際の配列：配列番号：１ｌ （２）配列番号用２のｔｎ報： （ｉ）配列の性状 （Ａ）長さ、４１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ＩＸ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．４１７ （Ｘｌ）実際の配列：配列番号・１２ （２）配列番号　１３の情報。

（ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ・１３９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉり分子の種類、蛋白 （ｘｉ）実際の配列・配列番号：１３ Ｎｅｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａｌ　１０　ｉｓ Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｈａ　Ｃｙｍ　τｈｒ２０　２ｓ　コ。

Ｔｈｒ　ｋｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｃ ｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌｍ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　ＭａｔＣｙｓ　Ａｌａ　Ｔｒ ｐ　ＣＹ＠　５ｅｒ　Ａ＠ｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｌ、＊ｕ　Ｇ ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙ■ ５０ｓ５６゜ Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙ−＾ｓｐ＾ａ ｎ　Ｃｙ＋＋　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　１１ｅＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒ ｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ａｒｇνａｌ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　５ｅｒＩｔｓ　９０　９５ Ａｓｐ　Ｌｙｅ　にＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ 　Ｖａｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉ■ ユ００　１０５　１ユＯ Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｍｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ＾ｓｐ　Ａ ｓｐ　Ｓｓｒ　Ｌｙｅ＾ＩＩｎ　Ｐｈｅ　Ｓｓｒ　Ｉｌｅユｉｓ　１２０　１２ ５ ｃｌｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　Ａｓｐ１３０　ユコ５ （２）配列番号：１４の情報。

（ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ・４４７塩基対 （Ｂ）繁・核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所＋１．．４４７ （ｘ　ｉ）実際の配列：配列番号：Ｉ４（２）配列番号−１５の情報− （ｉ）配列の性状。

（Ａ）長さ、１４９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：蛋白 （ｘｉ）実際の配列；配列番号−１５ Ｍｅｔ　＾ｒ９　＾１−　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌｅｕ　τｒｐＶａＬ　↑ｈｒ　ＶａＩ　Ｌ電ｕ　λ１ａ１５　１０　ｉｓ ｔ＠ｕ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　＾―ｎ　ＸＬ＠　ＣＹ−丁ｈｒτｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌ ａ　ＶａＬ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｔコＳ　４０　４５ Ｃｙｇ　Ａｌａ　丁ｒｐ　Ｃｙｓ　５＠ｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｅｌｙ　Ｓｓｉ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＣｙｓＳｏ　５５６０ ＾＊ｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　＾１ｐ＾ ａｎ　Ｃｙｓ　入ｌａ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　ｓｓｒ　ｌｌ−６Ｓ７０　７５　１１ ０ Ｇｌｕ　ＰＭ　Ｐｒｏ　Ｖｍｌ　５＠ｒ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌ ｅｕ　Ｃ１ｕ　＾＠ｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　５ｅｔ８５９０　９％ ＾−ｐ　ＬＹ＃　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ＾ｍｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖ ａｌτｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　＋１ｎ０Ａｒ　Ｚ１＠＾１ｍ− Ａｒｇ　Ｌ＠ｕ＾ｒｑ　Ｐｒｏ＾１ｐ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｍ　 Ｓｅｒ　ＩＬｅＧｉｎ　Ｖｉｌ　入ｒｇ　ＧＬｎ　Ｖａｉ　Ｇｌｕ　Ａ＋ｗｐ　 Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅ■ １コ０　１３Ｓ　１４０ ＾＠Ｐ　Ｌｅｕ　５＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ（２）配列番号、１６の情報 （１）配列の性状 （八）長さ・４５０１基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （１１）分子の種類、ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．４５０ （ｘｉ）実際の配列、配列番号、１６ （２）配列番号、１７の情報： （ｉ）配列の性状。

（Ａ）長さ　１５０アミノ酸 （Ｂ）型アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類、蛋白 （ｘｉ）実際の配列：配列番号・１７ Ｍ＠ｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｎ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌｌｌ　Ｓ　１０　１５ Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒτｈｒ　入ｒｑ　Ｇ ｌｙ　Ｖａｌ　５ｅｒ　５ｓｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｃ：ｙｓ　Ｌｅｕ　 Ａｉｍ　Ｖａｌ　Ｓｅｙ：　Ｐｒｏ　Ｍ■ Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌ、＠ｕ 　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒ口　Ａｒｇ　ＣＹ■ Ｓｏ　５５　６０ 人＠ｐＬ＊ｕＬｙｓＣ１ｕＡｓｎＬｅｕＬｅｕＬｙｅ＾−ｐＡｓｎＣｙｓ＾１ａ ＰｒｏｃｌｕＳｅｒＨａＧｌｕ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｉ ｍ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｍｕ　５ｉ ｒａＳ　９０　９５ ＡｗｐＬｙ１Ｇｌｙ５＠ｒＧｕｙ＾５ｐＳｅｒＳ＠ｒＧｉｎＶａｌＴｈｒＧｉｎ ＶａｔＳｍｔ：ＰｒｏＧＬＩ′ｌ＾ｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌ ｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　装置ｐ　Ａ＠ｐ　Ｓｕｒ　ＬｙＩＩ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　 ５ｔａｒ　Ｘ戟■ １１５　１２０　ユ２５ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　ＡＩＩＰ　Ｉｌｅ　丁ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｍａ■ １３０　、　１３５　１４０ ＾＠ｐ　Ｌｅｕ　ｓ＠ｒτｙｒ　ｓ＠ｒ　Ｍｅｔ（２）配列番号用８の情報・ （１）配列の性状・ （Ａ）長さ　４９２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー、直線状 （１１）分子の種類　ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴。

（Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所＝１１，４９２ （ｘｉ）実際の配列：配列番号・１８ （２）配列番号：１９の情報： （ｉ）配列の性状； （八）長さ：１６４アミノ酸 （Ｂ）型；アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：蛋白 （ｘｉ）実際の配列：配列番号＝１９ ＭＩＩＣＡｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　τｈｒ　ＶａＬ　Ｌｍｕ　＾１龜Ｉ　Ｓ　１０　ｉｓ Ｌ＠ｕＧｌｙＡｌａＬａｕＡｌａＣ１ｙＶａｔ（ｉｃｙＶａＬＧｌｙＧ４ｙＰｒ ｏ＾−ｎＸＬ＊ｃｙｓＴｈｒτｈｒ　Ａｒｇ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｓａｔ 　ＣＹ＠　Ｇｉｎ　Ｃ１ｎ　Ｃｙｍ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｔ　Ｐｒｏ 　１４ｅZ Ｃｙ−Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｃｙｍ　５ｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ｐ ｒｏ　Ｌｍｕ　ＧＬｙ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＣｙｓＳｏ　５５　６０ ＾會ｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ｇｉｕ　Ａｍｎ　Ｌｅｕ　Ｌ、ｅｕ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ 　Ａｓｎ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　（ｉｌｕ　Ｓｅｒ　Ｚ撃■ Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｅ　Ｖａｌ　５ＩＩｒ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　（Ｌｕλ１ｐ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　５ＩＩｒｋｍｐ　Ｌｙｓ　Ｃ１ ｙ　Ｓｉｒ　ＧＬｙ　八ｍｐ　Ｓｅｒ　５ＩＩｒ　ＧＬｎ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｇ ｉｎ　Ｖａｌ　５＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｇ１■ １ｏｏ　１０５　１１０ ＾ｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｍｐ　 Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＬＹ＠　入＠ｎ　Ｐｈｅ　Ｓｉｒ　Ｘ’ｈ■ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　（ｉｌｕ　Ａｍｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ 　Ｖａｌ　Ａｍｐ　Ｘｉ＠　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　５ｓ■ １３ｏ　１コ５　１４０ Ａ＠Ｐ　Ｌｅｕ　Ｓａｔ　Ｔｙｒ　Ｓａｔ　Ｍｅｔ　Ｌｙｅ＾ｍｐ　Ａｓｐ　Ｌ ａｕ　Ｔｒｐ　Ｓｉｒ　ＩＬｅ　Ｇｉｎ＾ａｎ　Ｌｅｕ１４５　１５０　１５！ ＋　１６０ （２）配列番号。２０の情報： （ｉ）配列の性状 （Δ）長さ：２７３塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直線状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．２７３ （ｘｉ）実際の配列：配列番号：２０ （２）配列番号＝２１の情報： （ｉ）配列の性状・ （Ａ）長さ：９１アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：蛋白 （Ｘｌ）実際の配列：配列番号：２１ ｓ＠ｔ　入ｒｇ　Ａｌａ　入’９　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｅ　 Ｌｔｕ　Ｔｒｐ　ＶａＬ　τｈｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　ＡｌａＩ　Ｓ　１０　１５ Ｌ＠ｕ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　ＶａＬ　 （ｉｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　工ｉ＠　Ｃｙｓ　Ｔｈ■ τｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｔ　Ｓａｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　 Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈａｔｃｙｓ　Ａｌａτｒｐ 　Ｃｙｓ　５ｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　 Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＣｙｓＳｏ　５５　６０ （２）配列番号＝２２の情報。

（ｉ）配列の性状。

（Ａ）長さ：４１７塩基対 （Ｂ）壓　核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴； （Ａ）名称／キー・ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．４１７ （ｘｉ）実際の配列：配列番号−２２ （２）配列番号：２３の情１： （Ｄ配列の性状： （Ａ）長さ　１３９アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー−直線状 （ｔ　ｉ）分子の種類：蛋白 （ｘｉ）実際の配列、配列番号＝２３ Ｍａｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ＪＬｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ 　Ｌａｕ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　τｈｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｌ■ Ｉ　Ｓ　１０　１５ Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｇｎ　Ｘ１＊　Ｃｙｍ　Ｔｈｒ２０　２５　コ〇 τｈｒ　入ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　５＠ｒ　Ｓａｔ　Ｃｙｍ　（Ｌｎ　Ｇｉｎ　 Ｃｙｓ　Ｌａｕ　＾１鳳　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　ＨａｔＡｓｐＬａｕＬｙｓ Ｃ１ｕＡｍｎＬ＠ｕＬ＊ｕＬｙｅＡｍｐＡ＊ｎＣＹ＠ＡｌａＰｒｅＧＬｕＳｅｒ ＸＬ＊６５　７ｏ　）ｓ　ｇ。

Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　！ｉｅｒ　（ｌｕ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｍｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｍｕ　Ｓ＠ｒａｓ　９０　９５ Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙ　ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５＊ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｒ＋ 　Ｖａｌ　？ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ｐｒ６　ＧＰ氏@−’ Ｚｏｏ　１０５　、　１ｌ１ ０Ａｒ　ｒｌｅ　Ａｌａ　Ｌｍｕ　Ａｒｇ　Ｌｅａｕ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｍｐ 　Ａｍｐ　ｓｓｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈ・　５ｅｒ　ｌ１■ １１５　１２０　ｕｓ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｇｌｕ、Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 ＶａＩ　Ａｓｐ１３０　１コ５ （２）配列番号：２４の情報。

（ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ：４４７１基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：１．．４４７ （ｘｉ）実際の配列・配列番号：２４ （２）配列番号＝２５の情ｎ （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ：１４９アミノ酸 （Ｂ）壓二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー−直線状 （１１）分子の種類・蛋白 （ｘ　ｉ）実際の配列：配列番号：２５Ｍ１ｌｔ　Ａｒ９　＾１１１　Ａｒｇ　 Ｐｒｏ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ｌ＠ｕ　＾P畠 ｌ　Ｓ　１０　１５ Ｌｍｕ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｘ１＊　Ｃｙ−丁ｈｒＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｓｉｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｗ　Ｌ＠ｕ　＾１ ｍ　Ｖｍｌ　５ＩＩｒ　Ｐｒｏ　Ｍ＠■ ３Ｓ　４０　４５ ＣＹ−Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｃｙｍ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ａｌａ　ｆ、＊ｕ　 １ｌｒａ　Ｐｔｏ　ＧＬｙ　Ｓｓｒ　１ｌｒｏ　入Ｘｑ　ｃ凾■ Ｓｏ　５５　６０ ＾ｍｐ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　（ｌｕ＾ａｎ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ＾ｍｐ　Ａｓ ｎ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｓｉｒ　ｆｆｌ・Ｇｌｕ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ 　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＧＬｕ　Ａｓｐ 　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　５ｉｒｘ＊ｐＬｙｍＧｌｙＳｅｒＧｌｙｘｓｐＳ＠ ｒＳｉｒｃｌｎＶａｎ丁ｈｒＧｉｎＶａ１５ｅｒＰｒｏＧｉｎＡｒｑ　１１ｅ　 Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｍｐ　Ａｍｐ　Ｓｉｒ　 Ｌｙｓ　八ａｎ　Ｐｈｅ　５ｅｒ　ＸＬ・ｘｘｓ　ｘ＞ｏ　ｘス５ Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　にｌｕ　＾嘗ｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　 Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌ＠　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｌ＠ｕ　Ｍｅｔ１３０　、　１３５ 　１４０ ＾＠ｐ　Ｌａｕ　５ｌｌｒ　Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ（２）配列番号：２６のｔＷ報 （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ　４５０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所用、、４５０ （ｘｉ）実際の配列：配列番号：２６ （２）配列番号：２７の情報 （１）配列の性状。

（八）長さ用５０アミノ酸 （Ｂ）撃　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直線状 （白）分子のｆｆ類・蛋白 （Ｘ夏）実際の配列　配列番号、２７ Ｍ＠ｔ　Ａｊ９＾藷＾ｒｑ　Ｐｒｏ、Ａｒ９　Ｐｒｏ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌ＊ｕ＾ｌａｌ　Ｓ　１０　１ｓ ＸＪｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　ＶａＩ　 Ｃ１ｙ　ｃｌｙ　Ｐｒｏ　Ａ１１ｌｌ　ｆｆｌ＊　Ｃｙｍ　sｈｒ Ｔｈｒ　ｋｘｑ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　５＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　 Ｃｙｍ　Ｌ＠ｕ　＾１ｍ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｐｒｏ　Ｍ・ｔＣＹｍ　Ａｌａ　’ ｒｆ　Ｃｙｍ　Ｓａｔ　Ａｍｐ　Ｇ’ｈｕ　＾１ｍ　１ａｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｃ１ｙ　Ｓ・ｒ　Ｐｒｏ　λｒｇ　ｃｙ■ Ｓｏ　５５　６０ （２）配列番号＝２８の情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ、４９２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ｊＪＩの数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｘ）特徴・ （Ａ）名称／キー：ＣＤ５ （Ｂ）所在場所：Ｉ、、４９２ （ｘｌ）実際の配列：配列番号・２８ （２）配列番号：２９の情報： （ｉ）配列の性状： （八）長さ：１６４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （１１）分子の種類；蛋白 （ｘｉ）実際の配列：配列番号＝２９ Ｍｅｔ　ｋｒｑ　Ａｉａ　入ｒｑ　Ｐｒｏ　Ａｒ＋２　Ｐｒｏ　＾ｘｑ　Ｐｒｏ 　Ｌｓｕ　丁Ｈｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｓｕ　ＡＬ■ Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　八ｌａ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｃ１ｙ　Ｖ畠Ｌ　 ＧＬｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｃ）＋＋ｌ　Ｔ■■ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　 Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＭｅｔコＳ　４０　４５ ＣＹ藝　入１ｍ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｓ＠ｒ　＾＠ｐ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　Ｌ＠ｕ　 Ｐｒｏ　Ｐｒａ　Ｇｌｙ　Ｓｅ＋＝　Ｐｒｏ　入ｆｑ　ＣＹ■ Ｓｏ　５５　６０ 人１ｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　ＬＹｍ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　０７口　Ａｌａ　Ｐ＋”ｏ　Ｇｌｕ　Ｓｕｒ　ｌ１■ Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　（Ｌｕ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌ ＠ｕＧｌｕ　Ａｓｐ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　５ｉｅｒＡｊＰ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　Ｓｓｒ　Ｇｌｙ　入−ｐ　５瞼ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ 　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　ＧｉｎＷｏｏ　ＩＱｓ　１１０ Ａｚｇ工１＠＾１ａＬａｕ＾ｒｇＬ＊ｕ八ｒｇＰｒｏＡｊＰＡＩＩＰＳｓｒＬ、 ｙｍＡｓｎｔｈｅＳｕｒＸｉ・Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ｋｒｑ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　（： ｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ＾−ｐ　ｍｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒし＋ｕ Ｎ・ｔ１］ｏ　１コＳ　１４０ Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｓ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ　Ｍｔ　Ｌｙｍ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌ ＊ｕτｒｐ　Ｓａｔ工ｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ｋｕ１４５　１５０　１ｓｓ　１ ６０ （２）配列番号：３０の情報： （ｉ）配列の性状４ （Ａ）長さ＝８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｘ　ｉ）実際の配列：配列番号＝ ３０ＧＧＴＣＧＡＣＣ （２）配列番号：３１の情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ＝２４塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）＊の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （目）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｘｉ）実際の配列：配列番号、３Ｉ ＣａπｋＣｃＣｃＧ　ＧｋＧＧＣＪｍＣｃ＋ｒ（Ｊ　２４（２）配列番号：３２ の情報： （ｉ）配列の性状： （Ａ）長さ・５７塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロノー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の種類　ＤＮＡ　（ゲノム性）（ｘｉ）実際の配列・配列番号、 ３３ ＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡ　ＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡ　ＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡ ＧＡＧＴＣＧ　ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧ　５７フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１９１００ Ｃ１２Ｑ　１／６８　Ａ　９４５３−４Ｂ（７２）発明者　マツクミラン　ロパ ートアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２０１４　デル　マー　トゥエルヴス　ストリート　２０３ Ｉ （７２）発明者　ギンズバーグ　マーク　エイチアメリカ合衆国　カリフォルニ ア州 ９２１２２　サン　ディエゴ　レシールド　ブレイス　２９４４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約１９５から８００ヌクレオチド塩基対を含む単離されたＤＮＡ分子であっ て、該ＤＮＡ分子がＰｌＡ１決定基を含むＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコ ードする単離されたＤＮＡ分子。 ２．配列番号：２、配列番号：６、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号 ：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８のヌクレオチド塩基配列を有す る、請求の範囲第１項の単離されたＤＮＡ分子。 ３．約１９５から８００ヌクレオチド塩基対を含む単離されたＤＮＡ分子であっ て、該ＤＮＡ分子がＰｌＡ２決定基を含むＧＰＩＩＩａのアミノ酸残基配列をコ ードする単離されたＤＮＡ分子。 ４配列番号：４、配列番号：８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号： ２４、配列番号：２６、または配列番号：２８のヌクレオチド塩基配列を有する 、請求の範囲第３項の単離されたＤＮＡ分子。 ５．外来ＤＮＡセグメントに機能しうるように連結された発現ベクターを含む組 換え分子であって、当該外来ＤＮＡセグメントが、配列番号：１に示した約残基 １から約残基６５の血小板ＧＰＩＩＩａのＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基のアミ ノ酸残基配列をコードし、当該組換え分子が、それで宿主細胞を形質転換したと きに、天然の血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基の何れかを発現 する組換え分子。 ６．前記外来ＤＮＡセグメントが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１ ４、１６、１８、２０、２２、２４、２６および２８から成る辞から選ばれる、 請求の範囲第５項に記載の組換え分子。 ７．前記発現ベクターがλｇｔ２２である、請求の範囲第５項に記載の組換え分 子。 ８．天然の血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基を含むポリペプチ ドの製造方法であって、該方法が、以下の工程：配列番号：１に示した約残基１ から約残基６５のアミノ酸残基をコードする外来ＤＮＡセグメントに機能しうる ように連結された発現ベクターを含む組換え分子で宿主細胞を形質転換する工程 ；さらに、該形質転換宿主細胞を前記ポリペプチドが発現するに十分な時間培養 条件下で維持す工程 を含むポリペプチド製造方法。 ９．前記宿主細胞が大腸菌である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．前記ベクターがλｇｔ２２である、請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．前記ＤＮＡセグメントが配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、 １６、１８、２０、２２、２４、２６および２８を有する群から選ばれる、請求 の範囲第１０項に記載の方法。 １２．前記ポリペプチドが融合ポリペプチドとして発現される、請求の範囲第８ 項に記載の方法。 １３．さらに前記発現ポリペプチドを回収する工程を含む、請求の範囲第８項に 記載の方法。 １４．配列番号：１のアミノ酸残基を含む血小板ＧＰＩＩＩａの約６５から約２ ６６アミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが 血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１，またはＰｌＡ２決定基を示す単離されたポリペプ チド。 １５．前記ポリペプチドが、配列番号：３、５、７、９、１１、１５、１７、１ ９、２１、２３、２５、２７および２９から成る群から選ばれるアミノ酸残基を 有する、請求の範囲第１４項に記載の単離されたポリペプチド。 １６．第二のポリペプチドに機能しうるように連結された第一のポリペプチドを 含む、天然の血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基を免疫学的に模 倣した融合ポリペプチドであって、 前記第一のポリペプチドは、前記第二のポリペプチドにペプチド結合した免疫学 的に不活性なポリペプチドまたは蛋白のアミノ酸残基配列を示し；前記第二のポ リペプチドは、血小板ＧＰＩＩＩａの約６５から約２６６アミノ酸残基を含み、 配列番号：１のアミノ酸残基を含み、さらに、血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１また はＰｌＡ２決定基を示す融合ポリペプチド。 １７．前記第一のポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列を有する 、請求の範囲第１６項に記載の融合ポリペプチド。 １８．前記第二のポリペプチドが配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５ 、１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９から成る群から選ばれる、請 求の範囲第１７項に記載の融合ポリペプチド。 １９．天然のＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基と免疫的に反応するヒ トの抗体の存在についてヒト抗体含有身体サンプルを分析する方法であって、以 下の工程： （ａ）前記体サンプルを以下の抗原： （ｉ）ＧＰＩＩＩａの配列を有し、天然のＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基を示し 、さらに配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む約６５から２６６アミノ酸残基 を含む単離されたポリペプチド、または（ｉｉ）ＧＰＩＩＩａの約６５から２６ ６アミノ酸残基のアミノ酸残基配列を含み、天然のＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定 基を示し、さらに、配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む融合蛋白；と混合す ることによって水性免疫反応混合物を形成する工程；（ｂ）前記水性免疫反応混 合物を、存在している抗体が前記抗原と免疫的に反応して免疫反応生成物を形成 するために十分な時間、生物学的な分析条件下で維持する工程；さらに （ｃ）前記形成した免疫反応生成物の存在を検出し、それによって前記抗体の存 在を検出する工程； を含む方法。 ２０．前記決定基が天然のＧＰＩＩＩａＰ１Ａ１決定基で、前記抗原が、配列番 号：３、配列番号：７、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配 列番号：１７、配列番号：１９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に 機能しうるように連結された配列番号：１１から成る詳から選ばれる、請求の範 囲第１９項に記載の方法。 ２１．前記決定基が天然のＧＰＩＩＩａＰｌＡ１決定基で、前記抗原が、配列番 号：５、配列番号：９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配 列番号：２７、配列番号：２９およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末端に 機能しうるように連結された配列番号：２１から成る群から選ばれる、請求の範 囲第１９項に記載の方法。 ２２．検出が以下の工程： （ｉ）前記免疫反応生成物を、ヒト抗体と免疫的に反応する第二の抗体と混合し て第二の混合物を形成する工程、この場合、前記第二の抗体は機能しうるように マーカーに連結されている； （ｉｉ）前記第二の混合物を、前記第二の抗体が該ヒト抗体と免疫的に反応して 第二の免疫反応生成物を形成するに十分な時間、生物学的分析条件下で維持する 工程：さらに、 （ｉｉｉ）前記第二の免疫反応生成物に固定されたマーカーの量を決定し、それ によって天然のＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基と免疫的に反応する ヒト抗体の存在を決定する工程； を含む、訴求の範囲第１９項の方法。 ２３．前記マーカーが、放射性、酵素、ビオチン、蛍光、および化学ルミネッセ ンス標註から成る群から選ばれる、請求の範囲第２２項の方法。 ２４．前記抗原が、ヒト体液サンプルと抗原とを混合する前に固体支持体に固定 される、請求の範囲第１９項の方法。 ２５．以下の工程： （ａ）水性媒体中で供与者からの血小板を、ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１およびＰｌＡ ２決定基の一方または他方と免疫的に反応するが両方とは反応しない抗体と混合 して、水性免疫反応混合物を形成する工程；（ｂ）該水性免疫反応混合物を、前 記抗体が免疫的に反応して免疫反応生成物を形成するために十分な時間、生物学 的反応条件下で維持する工程；（ｃ）前記免疫反応生成物の存在を検出し、それ によって当該ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基の一方または他方の存 在および血小板の型を検出する工程： を含む血小板の型分け方法。 ２６．前記抗体がＧＰＩＩＩａＰｌＡ１決定基と免疫的に反応し、ＧＰＩＩＩａ ＰｌＡ２決定基とは免疫的に反応しない、請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７．前記抗体がＧＰＩＩＩａＰｌＡ２決定基と免疫的に反応し、ＧＰＩＩＩａ ＰｌＡ１決定基とは免疫的に反応しない、請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２８．前記抗体が単クローン抗体である、請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２９．以下の要素： ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基の一方と免疫的に反応するが、両方 の決定基とは免疫的に反応しない抗体を、少なくとも１回の分析に十分な量で含 む容器；および 前記抗体と血小板との免疫反応を検出するための標識：を含む血小板ＧＰＩＩＩ ａＰｌＡの型分けのためのキット形の診断分析系。 ３０．当該標識が当該抗体に連結されている、請求の範囲第２９項に記載の系。 ３１．さらに、前記血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基の他方と 免疫的に反応するが、両方の決定基とは免疫的に反応しない抗体を、少なくとも １回の分析に十分な量で含む第二の容器を含む、請求の範囲第２９項に記載の系 。 ３２．以下の要素： （ａ）以下の抗原を少なくとも１回の分析を実施するために十分な量で含む容器 ； （ｉ）ＧＰＩＩＩａの配列を有する単離ポリペプチドで、さらに天然のＰｌＡ１ またはＰｌＡ２決定基を表し、配列番号：１のアミノ酸残基配列を含む約６５か ら２６６アミノ酸残基をその中に含んでいる単離されたポリペプチド、または （ｉｉ）ＧＰＩＩＩａの約６５から２６６アミノ酸残基のアミノ酸残基配列を含 み、天然のＰｌＡ１またはＰｌＡ２決定基を表し、さらに、配列番号：１のアミ ノ酸残基配列を含む融合ポリペプチド、（ｂ）前記ヒト抗体と前記抗原との免疫 反応を検出するための手段；を含む血小板ＧＰＩＩＩａＰｌＡ１またはＰｌＡ２ 決定基に対するヒト抗体の存在について分析するためのキット形の診断分析系。 ３３．前記抗原が固形支持体に固定されて存在する、請求の範囲第３２項に記載 の系。 ３４．前記抗原が、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９ 、２１、２３、２５、２７、２９、およびβ−ガラクトシダーゼのカルボキシ末 端に機能しうるように連結されている配列番号：１１又は２１から成る群から選 ばれるアミノ酸残基配列を有する、請求の範囲第３２項に記載の系。 ３５．前記ヒト抗体の免疫反応を検出するための前記手段が、別の種からの標識 結合坑ヒト抗体である、訴求の範囲第３２項に記載の系。