JPH0740921B2 - 非毒素産生性ビブリオ・コレラ変異株 - Google Patents
非毒素産生性ビブリオ・コレラ変異株Info
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- JPH0740921B2 JPH0740921B2 JP59087619A JP8761984A JPH0740921B2 JP H0740921 B2 JPH0740921 B2 JP H0740921B2 JP 59087619 A JP59087619 A JP 59087619A JP 8761984 A JP8761984 A JP 8761984A JP H0740921 B2 JPH0740921 B2 JP H0740921B2
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- plasmid
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/107—Vibrio
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、例えば、コレラおよび他の症状に対する免疫
学的防護のために有用なビブリオ・コレラ（Vibrio cho
lerae）の修飾株ならびにかかる株の調製に用いるプラ
スミドおよび方法に関する。
学的防護のために有用なビブリオ・コレラ（Vibrio cho
lerae）の修飾株ならびにかかる株の調製に用いるプラ
スミドおよび方法に関する。
発明の背景 コレラはグラム陰性細菌であるビブリオ・コレラによっ
て起る下痢症である。経口的に取り込まれると、ビブリ
オ・コレラはヒトの上部腸管で増殖し、該病気で観察さ
れる下痢の原因となる可溶性蛋白、コレラ・トキシンを
産生する。このトキシンはＡおよびＢの２つのタイプの
サブユニットで構成され、無傷のトキシンの活性はその
起源がＡサブユニットの蛋白分解性フラグメント、A1ペ
プチド中に見出される。これは標的細胞のアデニレート
・サイクラーゼ系を活性化する酵素である［Gill（197
5）,Proc.Nat′ l.Acad.Sci.USA,72:2064−2068］。そ
の結果、腸管細胞における環状AMPが増加し、該病気に
見られる下痢を生じさせる。Ｂサブユニットは非毒性で
はあるが、標的細胞に結合し、その細胞膜を通じるA1ペ
プチドの輸送を容易にする［Cuatrecases,Biochem.,12:
3577−3581（1973）］。Ｂサブユニットに対する抗体
は、トキシンの細胞表面への結合を遮断することによ
り、トキシンを効率よく不活化する［前記参照］。
て起る下痢症である。経口的に取り込まれると、ビブリ
オ・コレラはヒトの上部腸管で増殖し、該病気で観察さ
れる下痢の原因となる可溶性蛋白、コレラ・トキシンを
産生する。このトキシンはＡおよびＢの２つのタイプの
サブユニットで構成され、無傷のトキシンの活性はその
起源がＡサブユニットの蛋白分解性フラグメント、A1ペ
プチド中に見出される。これは標的細胞のアデニレート
・サイクラーゼ系を活性化する酵素である［Gill（197
5）,Proc.Nat′ l.Acad.Sci.USA,72:2064−2068］。そ
の結果、腸管細胞における環状AMPが増加し、該病気に
見られる下痢を生じさせる。Ｂサブユニットは非毒性で
はあるが、標的細胞に結合し、その細胞膜を通じるA1ペ
プチドの輸送を容易にする［Cuatrecases,Biochem.,12:
3577−3581（1973）］。Ｂサブユニットに対する抗体
は、トキシンの細胞表面への結合を遮断することによ
り、トキシンを効率よく不活化する［前記参照］。
コレラ・トキシンは腸管の病気のため、市販の死菌およ
びトキソイドワクチンは非経口投与した場合の免疫誘発
において比較的効果がない。症状自体が免疫を誘発する
ので、分泌IgAによって伝達される局所腸管免疫が、多
分、コレラに対する獲得免疫のもっとも重要な態様と結
論しなければならない。腸管における局所免疫を刺激す
るには、該細菌抗原は胃の酸および蛋白分解性障壁を通
して与えなければならない。このために、経口コレラ生
ワクチンが提案されている。
びトキソイドワクチンは非経口投与した場合の免疫誘発
において比較的効果がない。症状自体が免疫を誘発する
ので、分泌IgAによって伝達される局所腸管免疫が、多
分、コレラに対する獲得免疫のもっとも重要な態様と結
論しなければならない。腸管における局所免疫を刺激す
るには、該細菌抗原は胃の酸および蛋白分解性障壁を通
して与えなければならない。このために、経口コレラ生
ワクチンが提案されている。
全くトキシンを産生しないか、トキシンのＢサブユニッ
トのみを産生するビブリオ・コレラの変異株が単離され
ている［Finklestein et al.,（1974）,J.Infect.Dis.,
129:117〜123;Honda et al.,（1979）,Proc.Nat′ l.Ac
ad.Sci.USA,76:2052−2056;Mekalanos et al.,（198
2）,Proc.Nat′ l.Acad.Sci.USA,79:151−155］。しか
しながら、抗コレラ生ワクチン用の株として至適な株と
なるには、変異株は（１）よく特徴づけられ、遺伝的に
安定であること（すなわち、トキシン産生性の野生型に
復帰しないこと）、（２）腸管内でよくコロニー化する
こと、および（３）長命の広範な免疫を与えることが必
要である。これまでに得られた変異株、例えば、化学的
変異誘発処理で得られた変異株または至適コロニー化お
よび免疫産生能を有することの知られていない親株から
得られた変異株は、たとえ、ヒト有志における予備テス
トでそれらが比較的無毒で、有意な免疫を誘発すること
が示されても、前記３つの範疇のうちの１つに問題を起
すことがある［Woodward et al.,（1975）,Proc.11th
Jt.Conf.on Cholera NIH,p330;Holme et al.,Acute
Enteric Infections in Children,New Prospects fo
r Treatment and Prevention （1981）,Elsevier/nor
th−Holland Biomedical Press,Ch.26,pp443 etc.（Le
vine et al.）］。
トのみを産生するビブリオ・コレラの変異株が単離され
ている［Finklestein et al.,（1974）,J.Infect.Dis.,
129:117〜123;Honda et al.,（1979）,Proc.Nat′ l.Ac
ad.Sci.USA,76:2052−2056;Mekalanos et al.,（198
2）,Proc.Nat′ l.Acad.Sci.USA,79:151−155］。しか
しながら、抗コレラ生ワクチン用の株として至適な株と
なるには、変異株は（１）よく特徴づけられ、遺伝的に
安定であること（すなわち、トキシン産生性の野生型に
復帰しないこと）、（２）腸管内でよくコロニー化する
こと、および（３）長命の広範な免疫を与えることが必
要である。これまでに得られた変異株、例えば、化学的
変異誘発処理で得られた変異株または至適コロニー化お
よび免疫産生能を有することの知られていない親株から
得られた変異株は、たとえ、ヒト有志における予備テス
トでそれらが比較的無毒で、有意な免疫を誘発すること
が示されても、前記３つの範疇のうちの１つに問題を起
すことがある［Woodward et al.,（1975）,Proc.11th
Jt.Conf.on Cholera NIH,p330;Holme et al.,Acute
Enteric Infections in Children,New Prospects fo
r Treatment and Prevention （1981）,Elsevier/nor
th−Holland Biomedical Press,Ch.26,pp443 etc.（Le
vine et al.）］。
発明の概要 本発明は、その１つの態様において、A1ペプチド−コー
ド付け遺伝子（ctx A）の両方のコピーに欠失変異を有
し、そのため、毒性A1ペプチドを発現するのに必要な遺
伝子配列を失ったビブリオ・コレラ・オガワ395株の遺
伝的に安定な、非毒素産生形を提供するものである。
ド付け遺伝子（ctx A）の両方のコピーに欠失変異を有
し、そのため、毒性A1ペプチドを発現するのに必要な遺
伝子配列を失ったビブリオ・コレラ・オガワ395株の遺
伝的に安定な、非毒素産生形を提供するものである。
好ましい具体例においては、ctx A遺伝子配列の各コピ
ーは、少なくとも、A1サブユニットのアミノ酸41〜101
（もっとも好ましくは、アミノ酸10〜164）をコード付
けする遺伝子配列部分がなく、ctx B遺伝子配列が無傷
か、該欠失変異が有効Ｂ−サブユニットを発現するため
に必要なＢ−サブユニット・コード付け遺伝子部分も包
含している。該ビブリオ・コレラ細胞系はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されているAT
CC No.39346またはATCC No.39347の同定特性を有す
る。
ーは、少なくとも、A1サブユニットのアミノ酸41〜101
（もっとも好ましくは、アミノ酸10〜164）をコード付
けする遺伝子配列部分がなく、ctx B遺伝子配列が無傷
か、該欠失変異が有効Ｂ−サブユニットを発現するため
に必要なＢ−サブユニット・コード付け遺伝子部分も包
含している。該ビブリオ・コレラ細胞系はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されているAT
CC No.39346またはATCC No.39347の同定特性を有す
る。
他の態様において、本発明は毒性A1ペプチドを表現でき
ないブビリオ・コレラの遺伝的に安定な形の製法および
その方法で用いるプラスミドを提供する。
ないブビリオ・コレラの遺伝的に安定な形の製法および
その方法で用いるプラスミドを提供する。
好ましい具体例において、該方法は、ctx Aおよびctx B
遺伝子およびこれらの遺伝子の両側を囲む（bracket）D
NAセグメントを含有する第１のプラスミドを単離し、第
１のプラスミドから、A1ペプチド−コード付け遺伝子中
の毒素産生性A1ペプチドの発現のために必要な配列が欠
失した第２のプラスミドを作り、該囲まれた遺伝子セグ
メントを含む第２のプラスミドのセグメントを、腸管で
コロニー化し、免疫原性であることが公知のブビリオ・
コレラの染色体に組換えて、該染色体上のctx A遺伝子
の１つのコピーを欠失変異で置換し、得られた微生物を
数世代増殖させて、ctx A遺伝子のもう一方のコピーへ
該変異を自然に伝達させる工程を包含する。また、この
方法の好ましい具体例においては、第２のプラスミドが
該組換工程を確認するための遺伝的標識形質を含み、該
組換工程に用いる株がオガワ395株で、前記のような欠
失が包含される。
遺伝子およびこれらの遺伝子の両側を囲む（bracket）D
NAセグメントを含有する第１のプラスミドを単離し、第
１のプラスミドから、A1ペプチド−コード付け遺伝子中
の毒素産生性A1ペプチドの発現のために必要な配列が欠
失した第２のプラスミドを作り、該囲まれた遺伝子セグ
メントを含む第２のプラスミドのセグメントを、腸管で
コロニー化し、免疫原性であることが公知のブビリオ・
コレラの染色体に組換えて、該染色体上のctx A遺伝子
の１つのコピーを欠失変異で置換し、得られた微生物を
数世代増殖させて、ctx A遺伝子のもう一方のコピーへ
該変異を自然に伝達させる工程を包含する。また、この
方法の好ましい具体例においては、第２のプラスミドが
該組換工程を確認するための遺伝的標識形質を含み、該
組換工程に用いる株がオガワ395株で、前記のような欠
失が包含される。
該プラスミドは、ブビリオ・コレラの株のctx A−ctx B
遺伝子を囲む染色体セグメントに相当するDNA配列から
なり、該プラスミドは、少なくとも、毒性A1ペプチドを
発現するのに必要なctx A遺伝子のセグメントを欠く。
遺伝子を囲む染色体セグメントに相当するDNA配列から
なり、該プラスミドは、少なくとも、毒性A1ペプチドを
発現するのに必要なctx A遺伝子のセグメントを欠く。
本発明の他の特徴および利点を以下、さらに詳しく説明
する。
する。
好ましい具体例 まず、好ましい具体例を図面で簡単に説明する。
図面中、第１図は、ブビリオ・コレラの染色体に組換え
るべきプラスミドを作る方法の工程を示す図面である。
るべきプラスミドを作る方法の工程を示す図面である。
第２図ＡおよびＢは、第１図で得られたプラスミドをブ
ビリオ・コレラの染色体上に組換えるための工程を示す
図面である。
ビリオ・コレラの染色体上に組換えるための工程を示す
図面である。
第３図はサザン・ブロット（Southern blot）分析の結
果を示す図面代用写真である。
果を示す図面代用写真である。
第１図および第２図においてはつぎの略号を用いてい
る。
る。
遺伝子配列 ctxp＝トキシン・プロモーター A1＝A1サブユニット配列 A2＝A2サブユニット配列 Ｂ＝Ｂ配列 耐性標識 Gm＝ゲントマイシン Tc＝テトラサイクリン Km＝カナマイシン Rep＝プラスミド複製の起点 表示した制限酵素でのプラスミドの消化条件はその販売
者（New England Biolabs,Beverly,MA.）によって指
示されているものである。同様に、T4DNAポリメラーゼ
ヌクレアーゼ Bal−31,クレナウ（Klenow）フラグメン
トおよびDNAリガーゼもその製造者（Bethesda Research
Labs,Inc.,Bethesda,MD.）の指示に従って用いた。Xba
IおよびEcoR1リンカーは前記のNew England Biolabs
から購入した。A1、A2およびＢと表示した囲はctx Aお
よびctx B遺伝子の対応部位を示す。太い実線は該トキ
シン遺伝子に隣接するブビリオ・コレラDNAを示す。
者（New England Biolabs,Beverly,MA.）によって指
示されているものである。同様に、T4DNAポリメラーゼ
ヌクレアーゼ Bal−31,クレナウ（Klenow）フラグメン
トおよびDNAリガーゼもその製造者（Bethesda Research
Labs,Inc.,Bethesda,MD.）の指示に従って用いた。Xba
IおよびEcoR1リンカーは前記のNew England Biolabs
から購入した。A1、A2およびＢと表示した囲はctx Aお
よびctx B遺伝子の対応部位を示す。太い実線は該トキ
シン遺伝子に隣接するブビリオ・コレラDNAを示す。
I.親株の選択 生ワクチン用の変異株製造に用いるブビリオ・コレラの
親株は長期持続性の、広範囲の防護を誘発する必要があ
り、ヒトの腸管でよくコロニー化しなければならない。
オガワ395株は他の株の感染に対して一般的に有効な、
３年間持続する免疫を誘発することが証明されている
［Cash et al.,（1974）J.Infect.Dis.,129:45−52］。
また、該株は腸管でよくコロニー化する。
親株は長期持続性の、広範囲の防護を誘発する必要があ
り、ヒトの腸管でよくコロニー化しなければならない。
オガワ395株は他の株の感染に対して一般的に有効な、
３年間持続する免疫を誘発することが証明されている
［Cash et al.,（1974）J.Infect.Dis.,129:45−52］。
また、該株は腸管でよくコロニー化する。
II.プラスミドの製造 概略，ピアソンおよびメカラノスの方法［Pearsonおよ
びMekalanos,（1982）Proc.Natl.Sci.USA,79:2976−298
0］に従って、ブビリオ・コレラの野生型イナバ569B株
のDNAから調製されたプラスミド（pJM17）がＡトキシン
・サブユニットについての遺伝子（ctx A）およびＢト
キシン・サブユニットについての遺伝子（ctx B）なら
びにテトラサイクリン耐性に関する遺伝子（TcR）を含
有する。
びMekalanos,（1982）Proc.Natl.Sci.USA,79:2976−298
0］に従って、ブビリオ・コレラの野生型イナバ569B株
のDNAから調製されたプラスミド（pJM17）がＡトキシン
・サブユニットについての遺伝子（ctx A）およびＢト
キシン・サブユニットについての遺伝子（ctx B）なら
びにテトラサイクリン耐性に関する遺伝子（TcR）を含
有する。
第１図に示すごとく、pJM17プラスミドをXbaIで線形化
し、ついでBal31でエキソ核酸分解的に消化する。XbaI
部位がctx A遺伝子内にあるので、この操作でctx A配列
の欠失が生じる。Bal31消化物のXbaI DNAリンカーの存
在下における結紮により、プラスミド pJM17.23が生
じ、単離される。pJM17およびpJM17.23のPstI−XbaIフ
ラグメントの再集合によりpJM23が生じる。このプラス
ミドはctx A中に内部450塩基対欠失を含む。ctx A遺伝
子内のこの欠失の位置はA1ペプチドの産生に必要な配列
の80％以上が欠失したことを示すDNA配列によって確認
された。特に、pJM23によって担持されるctx A欠失はDN
Aコード付けアミノ酸残基10〜164を除く。酵素的に活性
なA1ペプチドは192のアミノ酸残基からなる長さを有す
るので、この欠失はA1についての必要な情報の80％以上
を除く。ctx A欠失のDNA配列を以下に示す。
し、ついでBal31でエキソ核酸分解的に消化する。XbaI
部位がctx A遺伝子内にあるので、この操作でctx A配列
の欠失が生じる。Bal31消化物のXbaI DNAリンカーの存
在下における結紮により、プラスミド pJM17.23が生
じ、単離される。pJM17およびpJM17.23のPstI−XbaIフ
ラグメントの再集合によりpJM23が生じる。このプラス
ミドはctx A中に内部450塩基対欠失を含む。ctx A遺伝
子内のこの欠失の位置はA1ペプチドの産生に必要な配列
の80％以上が欠失したことを示すDNA配列によって確認
された。特に、pJM23によって担持されるctx A欠失はDN
Aコード付けアミノ酸残基10〜164を除く。酵素的に活性
なA1ペプチドは192のアミノ酸残基からなる長さを有す
るので、この欠失はA1についての必要な情報の80％以上
を除く。ctx A欠失のDNA配列を以下に示す。
A1ペプチドの分子量12500ダルトン・フラグメントがMET
−41〜MET−101の部位を含有し、完全なA1ペプチドの酵
素活性の35％を保持していることが報告されている［La
i et al.,（1979）Abstracts of the 11th Internation
al Congress of Biochemistry,Tornto,Canada,p207,Abs
tract 03−45173］。したがって、A1ペプチドの活性サ
イトはこの12500ダルトン・フラグメント上に位置し、
たとえ、該サイトがMET−41〜MET−101間の6600ダルト
ン部位内にないとしても、MET−101を越えた、約54アミ
ノ酸（5900ダルトン）以上にはない。かくして、活性部
位はプラスミド pJM23のctx A欠失内に存在する。アミ
ノ酸41〜101間（または、より好ましくは、毒素産生性
の完全な不存在を保証するために、アミノ酸10〜164の
間）のアミノ酸の欠失がA1毒素産生性のないことを保証
する。
−41〜MET−101の部位を含有し、完全なA1ペプチドの酵
素活性の35％を保持していることが報告されている［La
i et al.,（1979）Abstracts of the 11th Internation
al Congress of Biochemistry,Tornto,Canada,p207,Abs
tract 03−45173］。したがって、A1ペプチドの活性サ
イトはこの12500ダルトン・フラグメント上に位置し、
たとえ、該サイトがMET−41〜MET−101間の6600ダルト
ン部位内にないとしても、MET−101を越えた、約54アミ
ノ酸（5900ダルトン）以上にはない。かくして、活性部
位はプラスミド pJM23のctx A欠失内に存在する。アミ
ノ酸41〜101間（または、より好ましくは、毒素産生性
の完全な不存在を保証するために、アミノ酸10〜164の
間）のアミノ酸の欠失がA1毒素産生性のないことを保証
する。
プラスミド pJM23が、イー・コリ（E.coli）およびブ
ビリオ・コレラの両方においてＢサブユニットの産生を
コード付けすること、すなわち、ctx Aにおける欠失変
異がctx Bの発現にほとんど影響を及ぼさないことが証
明された。つぎの第１表の結果は18HrCYE培養における
総Ｂサブユニット産生を酵素結合免疫吸着剤検定法によ
り分析して得られたものである。Ｂサブユニットの0.00
5μg/ml以下は検知できなかった。NDは実験が禁止され
ているために測定しなかったことを意味する。
ビリオ・コレラの両方においてＢサブユニットの産生を
コード付けすること、すなわち、ctx Aにおける欠失変
異がctx Bの発現にほとんど影響を及ぼさないことが証
明された。つぎの第１表の結果は18HrCYE培養における
総Ｂサブユニット産生を酵素結合免疫吸着剤検定法によ
り分析して得られたものである。Ｂサブユニットの0.00
5μg/ml以下は検知できなかった。NDは実験が禁止され
ているために測定しなかったことを意味する。
III.染色体の組換え 第１図に示すように、２つのプラスミド pJM23.2およ
びpJM23.211がpJM23から作られる。ついで、これらのプ
ラスミドのフラグメントを、第２図に示し、以下に説明
する標識交換において使用するために、もう１つ別のプ
ラスミド（RK290）［Runken et al.,（1981）Nature（L
ondon），289:85−88］へクローンする。
びpJM23.211がpJM23から作られる。ついで、これらのプ
ラスミドのフラグメントを、第２図に示し、以下に説明
する標識交換において使用するために、もう１つ別のプ
ラスミド（RK290）［Runken et al.,（1981）Nature（L
ondon），289:85−88］へクローンする。
A.プラスミド pJM23からの0395−N1株 第１図に示すように、pJM23を、PstIおよびT4ポリメラ
ーゼで消化し、ついで、EcoRIリンカーの存在下で結紮
して誘導体プラスミド pJM23.2に変える。pJM23.2はpJ
M23と同じであるが、PstIサイトがEcoRIサイトと置換し
ている。pJM23.2から当初pJM23上に存在するctx A−ctx
B欠失の接合点付近に挿入されたカナマイシン耐性をコ
ード付けするDNAフラグメント（KmR）でプラスミド pJ
M23.211を作る。
ーゼで消化し、ついで、EcoRIリンカーの存在下で結紮
して誘導体プラスミド pJM23.2に変える。pJM23.2はpJ
M23と同じであるが、PstIサイトがEcoRIサイトと置換し
ている。pJM23.2から当初pJM23上に存在するctx A−ctx
B欠失の接合点付近に挿入されたカナマイシン耐性をコ
ード付けするDNAフラグメント（KmR）でプラスミド pJ
M23.211を作る。
これは、XbaI/Hinc IIサイトが側面に位置するKmRを担
持するプラスミド pJM22のXbiI生成物の存在下、XbaI
でpJM23.2を消化することにより行なわれる。得られた
プラスミド pJM23.21をHinc IIで消化し、結紮して p
JM23.211を作る。これは、アミノ酸10から開始し、ctx
Bを通ってそのHinc IIサイトまで延長するctx A欠失を
有する。
持するプラスミド pJM22のXbiI生成物の存在下、XbaI
でpJM23.2を消化することにより行なわれる。得られた
プラスミド pJM23.21をHinc IIで消化し、結紮して p
JM23.211を作る。これは、アミノ酸10から開始し、ctx
Bを通ってそのHinc IIサイトまで延長するctx A欠失を
有する。
KmR遺伝子は両方のそれらに固有のctx A遺伝子が、pJM2
3.211の担持する欠失変異で置換された0395組換体を得
るための選択標識を与える。
3.211の担持する欠失変異で置換された0395組換体を得
るための選択標識を与える。
ついで、標識交換操作を用い、つぎのようにして染色体
へ組換えを行なう。まず、ストレプトマイシン100μg/m
lを含有する培地上でオガワ0395株を平板培養して約10
10個の細胞を得ることにより、0395株の自然ストレプト
マイシン耐性（SmR）誘導体を作る。この誘導体を後の
全ての実験に用いる。プラスミドRK2013［Ruvkin et a
l.,（1981）Nature（London），289:85−88］を移動剤
（mobilizer）として用いる接合により、プラスミド p
JM290.211を0395SmRへ移入させる。pJM290.211を担持す
る0395SmR細胞はSmRTcRKmRである。これらを、GmRであ
るもう１つ別のプラスミド pHI1［pHI1はベーリンガー
ら（Berlinger et al.,（1978）Nature276:633−634）
が報告しているpHI1J1と同じである］で重感染させ、Gm
RKmRコロニーを選択する。pHI1およびpJM290.211は不適
合障壁のために、同じ細胞内で安定に共存することがで
きない。したがって、細胞にKmRを残存させるには、こ
の耐性をコード付けするDNAを0395染色体上に組換えな
ければならない。
へ組換えを行なう。まず、ストレプトマイシン100μg/m
lを含有する培地上でオガワ0395株を平板培養して約10
10個の細胞を得ることにより、0395株の自然ストレプト
マイシン耐性（SmR）誘導体を作る。この誘導体を後の
全ての実験に用いる。プラスミドRK2013［Ruvkin et a
l.,（1981）Nature（London），289:85−88］を移動剤
（mobilizer）として用いる接合により、プラスミド p
JM290.211を0395SmRへ移入させる。pJM290.211を担持す
る0395SmR細胞はSmRTcRKmRである。これらを、GmRであ
るもう１つ別のプラスミド pHI1［pHI1はベーリンガー
ら（Berlinger et al.,（1978）Nature276:633−634）
が報告しているpHI1J1と同じである］で重感染させ、Gm
RKmRコロニーを選択する。pHI1およびpJM290.211は不適
合障壁のために、同じ細胞内で安定に共存することがで
きない。したがって、細胞にKmRを残存させるには、こ
の耐性をコード付けするDNAを0395染色体上に組換えな
ければならない。
第２図Ａはctx遺伝子の染色体コピーと、プラスミド p
JM290.211に担持される欠失誘導体の間の交差結果を示
す。適当な組換体を不適合プラスミド pHI1による重感
染およびGmRKmRの選択により回収する。かかる組換体、
0395−NTの構造を示す。KmRが終る0395染色体上のサイ
トはKmRフラグメントが側面に位置するDNA配列によって
決定される。この配列は、該染色体上の毒素遺伝子が側
面に位置するDNAから誘導されるので、第２図Ａに示す
結果となり、固有の遺伝子がKmRインサートを担持する
変異株遺伝子によって置換される。ctx Aおよびctx B遺
伝子サイトを囲み、野生型染色体DNA配列に対応するpJM
23.211上のDNAの大きさは、pJM23.21上のＡ遺伝子フラ
グメント中のEcoRIサイトとXbaIサイトの間の距離（2.7
キロベース）およびＢ遺伝子中のHinc IIサイトとTcR遺
伝子に隣接するEcoRIサイトの間の距離（1.4キロベー
ス）で表わすことができる。かくして、該欠失変異が染
色体上に組換えられ、ctx遺伝子座の１つの正常なコピ
ーと置換する。
JM290.211に担持される欠失誘導体の間の交差結果を示
す。適当な組換体を不適合プラスミド pHI1による重感
染およびGmRKmRの選択により回収する。かかる組換体、
0395−NTの構造を示す。KmRが終る0395染色体上のサイ
トはKmRフラグメントが側面に位置するDNA配列によって
決定される。この配列は、該染色体上の毒素遺伝子が側
面に位置するDNAから誘導されるので、第２図Ａに示す
結果となり、固有の遺伝子がKmRインサートを担持する
変異株遺伝子によって置換される。ctx Aおよびctx B遺
伝子サイトを囲み、野生型染色体DNA配列に対応するpJM
23.211上のDNAの大きさは、pJM23.21上のＡ遺伝子フラ
グメント中のEcoRIサイトとXbaIサイトの間の距離（2.7
キロベース）およびＢ遺伝子中のHinc IIサイトとTcR遺
伝子に隣接するEcoRIサイトの間の距離（1.4キロベー
ス）で表わすことができる。かくして、該欠失変異が染
色体上に組換えられ、ctx遺伝子座の１つの正常なコピ
ーと置換する。
0395は該トキシン遺伝子座２つのコピーを有しているの
で、該290.211欠失変異をこれらの両方と組換える必要
がある。驚くべきことに、１つの標識交換コピーを担持
する株を数世代増殖させ、この間に組換えにより、該変
異をもう一方のコピーへ自然に伝達させることにより、
これが簡単に行なえる。ついで、両方のコピーに欠失変
異を有する0395誘導体を、該欠失変異におけるDNA不存
在と特異的に雑種形成をするプローブ（pJM17の0.95KbX
baI/Hinc IIフラグメント）を用いるコロニー雑種形成
により確認する。このプローブと反応しないコロニーを
サザン（Souhern）雑種形成でチェックし、欠失により
除去された配列の欠損を確認する。バンドの移入によ
り、Ａ遺伝子の所望の大きさの欠失が0395の２つの固有
のctx遺伝子コピーの各々に導入され、0395−MT株が得
られたことが確認される。
で、該290.211欠失変異をこれらの両方と組換える必要
がある。驚くべきことに、１つの標識交換コピーを担持
する株を数世代増殖させ、この間に組換えにより、該変
異をもう一方のコピーへ自然に伝達させることにより、
これが簡単に行なえる。ついで、両方のコピーに欠失変
異を有する0395誘導体を、該欠失変異におけるDNA不存
在と特異的に雑種形成をするプローブ（pJM17の0.95KbX
baI/Hinc IIフラグメント）を用いるコロニー雑種形成
により確認する。このプローブと反応しないコロニーを
サザン（Souhern）雑種形成でチェックし、欠失により
除去された配列の欠損を確認する。バンドの移入によ
り、Ａ遺伝子の所望の大きさの欠失が0395の２つの固有
のctx遺伝子コピーの各々に導入され、0395−MT株が得
られたことが確認される。
ctx A−ctx B欠失から予想されるとおり、これら両方の
遺伝子部分がpJM290.211上で欠失されたので、0395−NT
株はＡサブユニットもＢサブユニットも産生しない。つ
ぎの第２表の結果は18HrCYE培養で産生され、酵素結合
免疫吸着剤検定により分析された総Ｂサブユニット抗原
を示す。0.005μg/ml以下のＢサブユニットは検出でき
なかった。総トキシン活性はμg/ml精製コレラ・トキシ
ンで表わした。同様に、Ｂサブユニットについて、同じ
培養上澄液を分析した。毒性の検定はゲラントら［Guer
rant et al.,（1974）Infect.Imm.,10:320−327］の記
載に従ってCHO−細胞分析によって行なった。
遺伝子部分がpJM290.211上で欠失されたので、0395−NT
株はＡサブユニットもＢサブユニットも産生しない。つ
ぎの第２表の結果は18HrCYE培養で産生され、酵素結合
免疫吸着剤検定により分析された総Ｂサブユニット抗原
を示す。0.005μg/ml以下のＢサブユニットは検出でき
なかった。総トキシン活性はμg/ml精製コレラ・トキシ
ンで表わした。同様に、Ｂサブユニットについて、同じ
培養上澄液を分析した。毒性の検定はゲラントら［Guer
rant et al.,（1974）Infect.Imm.,10:320−327］の記
載に従ってCHO−細胞分析によって行なった。
B.0395−N1株 pJM23.2上に存在する構造を修飾標識交換操作により染
色体へ交差させる。pJM23.2からの4.6キロベース対ラグ
メントをPK290へ移入させてプラスミド pJM290.2を形
成する。ついで、プラスミド pJM290.2を、KmRで標識
付けしたその２つのctxコピーの各々を有する0395−NT
株へ移入させる。この株へのpJM290.2の導入は交差を生
じさせ、ついで、KmR標識コピーのpJM290.2上の構造に
より置換を生じさせる。これらの組換体コロニーはその
Kmに対する完成によって確認できる。
色体へ交差させる。pJM23.2からの4.6キロベース対ラグ
メントをPK290へ移入させてプラスミド pJM290.2を形
成する。ついで、プラスミド pJM290.2を、KmRで標識
付けしたその２つのctxコピーの各々を有する0395−NT
株へ移入させる。この株へのpJM290.2の導入は交差を生
じさせ、ついで、KmR標識コピーのpJM290.2上の構造に
より置換を生じさせる。これらの組換体コロニーはその
Kmに対する完成によって確認できる。
さらに詳しくは、第２図Ｂに示すごとく、0395−NT株を
pHI1で処理し、ついで、該株にpJM290.2を移入する。約
50世代増殖させた後、平板反復法により、自然KmS組換
体を単離する。これらの１つをpJM290.2で処理したもの
が第２図Ｂに示す構造を有するもの（0395−N1）であ
る。これらの１つの構造を確認し、0395−N1株を得るた
めに、サザン雑種形成をつぎのとおり行なった。
pHI1で処理し、ついで、該株にpJM290.2を移入する。約
50世代増殖させた後、平板反復法により、自然KmS組換
体を単離する。これらの１つをpJM290.2で処理したもの
が第２図Ｂに示す構造を有するもの（0395−N1）であ
る。これらの１つの構造を確認し、0395−N1株を得るた
めに、サザン雑種形成をつぎのとおり行なった。
DNAを0395および0395−N1株から調製する。このDNAをXb
aIで消化し、A1プローブ［EWD299（Dallas,（1979）,J.
Bact.139:850−858）の580塩基対XbaI−Hind IIIフラグ
メント］またはＢプロープ（EWD299の590塩基対EcoRI−
Hind II〜フラグメント）を用い、サザンの方法［South
ern,（1975）,J.Molec.Biol.,98:503−517］で分析す
る。0395の２つのctx座は２つのバンドとして見え、両
方のプローブと反応する。しかし、0395−N1株はＢプロ
ーブとのみ反応し、反応するバンドはpJM23上にはじめ
に存在したctx A欠失により、大きさがより小さくな
る。第３図はかかるサザン雑種形成におけるブロットの
図面代用写真で、0395−N1はA1部位から由来するプロー
ブと相同の配列を欠き、プラスミド−pJM23のctx A1欠
失の大きさ（450塩基対）によってより小さくなった制
限フラクション上に位置するＢサブユニットについての
配列を保持していることを示している。この結果と一致
して、0395親株と比較した場合、0395−N1株はＢサブユ
ニットの正常な量を産生するが、CHO細胞中で何ら毒性
を示さない（前記第２表）。かくして、0395−N1株は、
はじめにpJM23上に存在したctx A欠失を除いて、親株で
ある0395株と同じである。
aIで消化し、A1プローブ［EWD299（Dallas,（1979）,J.
Bact.139:850−858）の580塩基対XbaI−Hind IIIフラグ
メント］またはＢプロープ（EWD299の590塩基対EcoRI−
Hind II〜フラグメント）を用い、サザンの方法［South
ern,（1975）,J.Molec.Biol.,98:503−517］で分析す
る。0395の２つのctx座は２つのバンドとして見え、両
方のプローブと反応する。しかし、0395−N1株はＢプロ
ーブとのみ反応し、反応するバンドはpJM23上にはじめ
に存在したctx A欠失により、大きさがより小さくな
る。第３図はかかるサザン雑種形成におけるブロットの
図面代用写真で、0395−N1はA1部位から由来するプロー
ブと相同の配列を欠き、プラスミド−pJM23のctx A1欠
失の大きさ（450塩基対）によってより小さくなった制
限フラクション上に位置するＢサブユニットについての
配列を保持していることを示している。この結果と一致
して、0395親株と比較した場合、0395−N1株はＢサブユ
ニットの正常な量を産生するが、CHO細胞中で何ら毒性
を示さない（前記第２表）。かくして、0395−N1株は、
はじめにpJM23上に存在したctx A欠失を除いて、親株で
ある0395株と同じである。
得られた菌株およびプラスミドは1983年４月29日より、
ブタペスト条約の下、つぎの寄託番号でアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されて
いる。
ブタペスト条約の下、つぎの寄託番号でアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されて
いる。
0395−N1株 ATCC 39346 0395−NT株 ATCC 39347 プラスミド pJM 290.2 ATCC 39348 プラスミド pJM 290.211 ATCC 39349 かかるATCC寄託サンプルは本願の公告により、また、本
願に対応する米国特許の発行、ヨーロッパ特許の公告に
より、あるいは、本願に対応する特許出願をなしたいず
れもの国の法制に従って自由に入手することができる。
願に対応する米国特許の発行、ヨーロッパ特許の公告に
より、あるいは、本願に対応する特許出願をなしたいず
れもの国の法制に従って自由に入手することができる。
IV.使用 0395−N1株および0395−N2株共にコレラ感染に対する免
疫学的防護源として有用である。これらは生ワクチンお
よび死菌ワクチンの両方に有用である。
疫学的防護源として有用である。これらは生ワクチンお
よび死菌ワクチンの両方に有用である。
0395−N1株は腸管内でよくコロニー化し、強い免疫反応
を誘発することが知られている公知の株から産生され
る。おの変異株は毒素産生性A1トキシン・サブユニット
の表現を防ぐ欠失変異を有する場合にのみ、遺伝的に改
造されることが証明された。この株は、とりわけ、ホル
ムら［Holme et al.,“Acute Enteric Infections in C
hildren,New Prospects for Treatment and Preventio
n,"（1981）Elsevier/North−Holland Biomedical Pres
s,Ch.26,pp.443 et seq.（Levine et al.）］の記載の
容量および条件で製造および投与されるワクチンとして
有用である。
を誘発することが知られている公知の株から産生され
る。おの変異株は毒素産生性A1トキシン・サブユニット
の表現を防ぐ欠失変異を有する場合にのみ、遺伝的に改
造されることが証明された。この株は、とりわけ、ホル
ムら［Holme et al.,“Acute Enteric Infections in C
hildren,New Prospects for Treatment and Preventio
n,"（1981）Elsevier/North−Holland Biomedical Pres
s,Ch.26,pp.443 et seq.（Levine et al.）］の記載の
容量および条件で製造および投与されるワクチンとして
有用である。
毒素産生性ビブリオ・コレラ・オガワ395に感染した各
人が有意な量の無傷の細胞を排泄しないという事実は抗
トキシン防護に加えて、細胞標的免疫防護が含まれるこ
とを示している。0395−NT株は、該トキシンのＢサブユ
ニット産生のための遺伝情報を欠いているが、該オガワ
395株の他の免疫原的特徴を有しており、前記のように
製造、投与されうワクチンとして有用である。
人が有意な量の無傷の細胞を排泄しないという事実は抗
トキシン防護に加えて、細胞標的免疫防護が含まれるこ
とを示している。0395−NT株は、該トキシンのＢサブユ
ニット産生のための遺伝情報を欠いているが、該オガワ
395株の他の免疫原的特徴を有しており、前記のように
製造、投与されうワクチンとして有用である。
本明細書に記載したプラスミドおよび方法は0395−NTお
よび0395−N1株の製造に有用であり、また、ある種の他
の抗原と共にＢサブユニットを発現する株を製造するの
に用いることもできる。かかる株は、ついで、抗原を該
Ｂサブユニットに付着させ、すなわち、該Ｂサブユニッ
トを細胞認識および付着ビヒクルとして用いることによ
り実現される改良された免疫原性を利用するワクチンに
使用できる。
よび0395−N1株の製造に有用であり、また、ある種の他
の抗原と共にＢサブユニットを発現する株を製造するの
に用いることもできる。かかる株は、ついで、抗原を該
Ｂサブユニットに付着させ、すなわち、該Ｂサブユニッ
トを細胞認識および付着ビヒクルとして用いることによ
り実現される改良された免疫原性を利用するワクチンに
使用できる。
第１図はビブリオ・コレラの染色体に組換えるべきプラ
スミドを作る工程を示す工程図、第２図のＡおよびＢは
第１図で得られたプラスミドのビブリオ・コレラ染色体
上への組換工程を示す工程図、第３図はN1株および0395
親株のサザン・ブロツト分析におけるブロツト・パター
ンの図面に代る写真である。
スミドを作る工程を示す工程図、第２図のＡおよびＢは
第１図で得られたプラスミドのビブリオ・コレラ染色体
上への組換工程を示す工程図、第３図はN1株および0395
親株のサザン・ブロツト分析におけるブロツト・パター
ンの図面に代る写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:63）
Claims (14)
- 【請求項１】A1ペプチド・コード付け遺伝子（ctx A1）
の両方のコピーに遺伝子操作された欠失変異を有し、そ
の結果、毒性A1ペプチドの発現に必要な遺伝子配列を欠
いている、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）・オ
ガワ395由来の非毒素産生性の遺伝的に安定な微生物。 - 【請求項２】ctx A1遺伝子の各コピーのそれぞれが、少
なくとも、アミノ酸残基41〜101をコード付けする遺伝
子配列部分を欠いている特許請求の範囲第（１）項記載
の微生物。 - 【請求項３】ctx A1遺伝子の各コピーのそれぞれが、少
なくとも、アミノ酸残基10〜164をコード付けする遺伝
子配列部分を欠いている特許請求の範囲第（１）項記載
の微生物。 - 【請求項４】ctx A1遺伝子の各コピーのそれぞれが、A1
ペプチドの発現に必要な配列の少なくとも80％を欠く特
許請求の範囲第（１）項記載の微生物。 - 【請求項５】ctx B遺伝子配列が無傷である特許請求の
範囲第（１）項記載の微生物。 - 【請求項６】該野生型遺伝的配列が、該欠失変異を除い
て他は無傷である特許請求の範囲第（１）項記載の微生
物。 - 【請求項７】該欠失変異が、有効Ｂサブユニットの発現
に必要な、Ｂサブユニット・コード付け遺伝子（ctx
B）の一部を包含する特許請求の範囲第（１）項記載の
微生物。 - 【請求項８】ATCC No.39346またはATCC No.39347であ
る特許請求の範囲第（１）項記載の微生物。 - 【請求項９】ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）・
オガワ395の野生型株を用意し、毒性A1ペプチドの発現
に必要な、該株のDNA配列のctx A遺伝子の１つのコピー
上に欠失変異を生じさせ、得られた改造ビブリオ・コレ
ラを数世代増殖させて、該改造を該染色体のctx A遺伝
子の第２のコピーに自然に伝達させることを特徴とする
毒性A1ペプチドを発現することのできない、ビブリオ・
コレラ・オガワ395由来の遺伝的に安定な微生物の製
法。 - 【請求項１０】該欠失工程が、ビブリオ・コレラ・オガ
ワ395の野生型株からDNAを用意し、該株からctx Aおよ
びctx B遺伝子と、それらの遺伝子の両側を囲むDNAセグ
メントを含有する第１のプラスミドを単離し、該第１の
プラスミドから、少なくとも、毒性A1ペプチドの発現に
必要なctx A遺伝子のセグメントが欠失するように改造
された第２のプラスミドを構築し、該両側を囲むDNAセ
グメントを含む第２のプラスミドのセグメントをビブリ
オ・コレラ・オガワ395株の染色体へ組換えて該染色体
上のctx A遺伝子の１つのコピーを置換することからな
る特許請求の範囲第（９）項記載の製法。 - 【請求項１１】該第２のプラスミドが該組換工程確認の
ための標識を含む特許請求の範囲第（10）項記載の製
法。 - 【請求項１２】該ctx A遺伝子から欠失されるセグメン
トが、少なくとも、アミノ酸残基41〜101をコード付け
する該遺伝子配列部分からなる特許請求の範囲第（10）
項記載の製法。 - 【請求項１３】該ctx A遺伝子から欠失されるセグメン
トが、少なくとも、アミノ酸残基10〜164をコード付け
する該遺伝子配列部分からなる特許請求の範囲第（10）
項記載の製法。 - 【請求項１４】該ctx A遺伝子から欠失されるセグメン
トがA1ペプチドの発現に必要な配列の少なくとも80％か
らなる特許請求の範囲第（10）項記載の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US489958 | 1983-04-29 | ||
| US06/489,958 US4882278A (en) | 1983-04-29 | 1983-04-29 | Non-toxinogenic vibrio cholerae mutants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6037980A JPS6037980A (ja) | 1985-02-27 |
| JPH0740921B2 true JPH0740921B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=23945983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59087619A Expired - Lifetime JPH0740921B2 (ja) | 1983-04-29 | 1984-04-27 | 非毒素産生性ビブリオ・コレラ変異株 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4882278A (ja) |
| EP (1) | EP0125228B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0740921B2 (ja) |
| AT (1) | ATE35152T1 (ja) |
| AU (1) | AU585481B2 (ja) |
| CA (1) | CA1326218C (ja) |
| DE (1) | DE3472114D1 (ja) |
| DK (1) | DK213784A (ja) |
| DZ (1) | DZ634A1 (ja) |
| EG (1) | EG17879A (ja) |
| ES (1) | ES8600649A1 (ja) |
| GR (1) | GR81986B (ja) |
| IE (1) | IE57266B1 (ja) |
| IL (1) | IL71652A (ja) |
| PH (1) | PH25301A (ja) |
| PT (1) | PT78478B (ja) |
| YU (1) | YU45616B (ja) |
| ZA (1) | ZA843142B (ja) |
| ZM (1) | ZM2884A1 (ja) |
| ZW (1) | ZW6884A1 (ja) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5882653A (en) * | 1983-03-04 | 1999-03-16 | The University Of Maryland System | Vibrio cholerae 01 (CVD111) and non-01 (CVD112 and CVD112RM) serogroup vaccine strains, methods of making same and products thereof |
| US5399494A (en) * | 1983-03-04 | 1995-03-21 | The University Of Maryland System | Vibrio cholerae strain CVD103Hgr, method of making same, and vaccines derived therefrom |
| US5470729A (en) * | 1983-03-04 | 1995-11-28 | University Of Maryland At Baltimore | Method of isolating restriction fragment deletions in Vibrio cholerae, and products thereof |
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