JPH07318784A - 顕微鏡自動焦点検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、画像の位置探索を高速化し、画像探
索時間の短縮化を図り、誤認識を防ぎ高速で焦点調整が
可能な顕微鏡自動焦点検出方法を提供することを目的と
する。 【構成】本発明は、第１ステップとして、ＣＰＵ９は評
価関数演算器８に評価関数を明るさを示す関数を指定
し、評価関数演算器８から出力する画像の明るさ情報を
くり返し入力しつつ、ステージ駆動装置１４を制御し、
試料２から発する画像の明るさの最大位置までステージ
１を上下移動して自動合焦動作を行い、第２ステップと
して、ＣＰＵ９は評価関数演算器８に評価関数をコント
ラストレベルを示す関数に指定し、ＣＰＵ９が評価関数
演算器８から出力される合焦度を示す情報をくり返し入
力しつつステージ駆動装置１４に制御信号を送り、ステ
ージ１を上下動させて合焦を得る位置に調整する顕微鏡
自動焦点検出方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、顕微用鏡自動焦点検出
装置に係り、特に蛍光観察のような暗い画像の観察に好
適する顕微鏡自動焦点検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、顕微鏡で試料を観察する場合、
画像が見える範囲が狭いので、顕微用鏡自動焦点検出装
置では、通常第１ステップとしてステージを上下にスキ
ャンしてある規定値以上のコントラストが得られる位置
を探し、その後、第２ステップとして、コントラスト等
の合焦度評価値を検出しながら焦点位置までステージを
調整するという制御が行われている。

【０００３】例えば、特開昭６４−５４４０８号公報に
よれば、載置台（ステージ）を所定回数を限度として予
め定めた一定距離ずつ、移動させるとともに各位置での
コントラストを検出して、コントラストが予め定めた閾
値以上となる位置を探索し、該検索結果を基に載置台を
予め定めた一定距離ずつ移動してコントラストが上記閾
値以上となる範囲で、その中間位置でのコントラストが
最大となる連続した３位置を求め、それぞれの位置のコ
ントラストの値を用い加重平均演算により得られる位置
を焦点位置として位置合わせ行う自動焦点方法が開示さ
れている。

【０００４】また特開平４−１７７２１１号公報で、顕
微鏡の自動合焦装置において、蛍光観察等の対象物が暗
い観察を行う場合には、画素ピッチを広くして十分な感
度を確保した状態で粗い自動合焦を行い、その後最適ピ
ッチに切換えて高精度な合焦を行う方法を提案してい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前述した顕微鏡用自動
焦点方法を蛍光検鏡に適用する場合には、蛍光検鏡によ
る画像は、非常に暗いことが多く、また、焦点から外れ
ると画像は全くなく暗黒状態になってしまうため、これ
を蓄積型のイメージセンサでとらえるために、イメージ
センサの蓄積時間を非常に長くしなければならない。

【０００６】また、蓄積時間を長くすることにより、画
像状態を認識するサイクルも遅くなるため、画像を探す
ために移動させるステージの駆動速度もかなり遅くしな
ければならない。

【０００７】従って、画像を見出だすまでの時間が非常
に長くなってしまう。また蛍光検鏡の特徴として励起光
を試料へ照射する時間が長くなると、画像の明るさが低
くなってしまう褪色があるので、焦点検出に長く時間を
かけると、画像が見えなくなってしまう。蛍光検鏡以外
でも、顕微鏡による試料の観察をする際画像が非常に暗
くなってしまう場合が多い。

【０００８】また、特開昭６４−５４４０８号公報にお
いては、載置台（ステージ）を移動させながらコントラ
ストを検出して、予め定めた閾値以上となる位置を探索
しているが、画像が見えていなくても常にコントラスト
レベルを演算するといった複雑な処理を行うため、ステ
ージの移動とコントラスト演算とのサイクルが長くな
り、またコントラストを演算できる程度の信号のＳ／Ｎ
を得るために、暗い画像の場合には蓄積時間を長くしな
ければならないなど、焦点調整のスピードアップを阻害
する要因が多い。

【０００９】さらに特開平４−１７７２１１号公報にお
いては、蛍光観察等の対象物が暗い観察を行う場合に
は、画素ピッチを広くして十分な感度を確保した状態で
粗い自動合焦を行う方法を提案しているが、合焦を得る
ためには、対象物の明暗の特徴を失うほど画素ピッチを
広げることはできず、高感度化するのにも限りがあり、
合焦を粗く得るためにも、コントラスト等の合焦度演算
を行わなければならない点が、特開昭６４−５４４０８
号公報で提案されていることと同じである。

【００１０】そこで本発明は、画像の位置探索を高速化
し、画像探索時間の短縮化を図り、誤認識を防ぎ高速で
焦点調整が可能な顕微鏡自動焦点検出方法を提供するこ
とを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するために、試料を観察するための対物光学系を備え、
該対物光学系によって形成された前記試料からの光像を
少なくとも１つのＣＣＤイメージセンサにより電気信号
に変換し、得られた電気信号を所定の評価関数に従って
演算し、その演算結果に基づいて、焦点状態を検出しつ
つ、前記試料と対物レンズの相対的距離を調整すること
により焦点調整を行う顕微鏡自動焦点検出装置であっ
て、第１のステップは、前記評価関数を光像の明るさを
示す関数とし、試料と対物レンズの相対的距離を変化さ
せながら試料の明るさを検出し最も明るくなるような位
置に調整を行い、第２のステップは、前記評価関数を光
像のコントラスト等の合焦度を示す関数に切換えて、合
焦度が所定の値になるように試料と対物レンズの相対的
距離を調整する顕微鏡自動焦点検出方法を提供する。

【００１２】またこのような顕微鏡自動焦点検出方法に
より、前記第１のステップでは、ＣＣＤイメージセンサ
へのリセットパルスを間引くことによって、疑似的に画
素サイズを大きくし、感度を高くして、短時間の電荷蓄
積でも、明るさ検出が可能とする。若しくは第１のステ
ップでは、ＣＣＤイメージセンサ上に投影される光像が
暗黒になっても、それに追従してＣＣＤイメージセンサ
の電荷蓄積時間を長くせず、所定の電荷蓄積時間より短
い範囲で電荷蓄積時間を制御することによって明るさ検
出を行う。前記第１のステップでは、明るさ検出を開始
する前に、試料を照明する照明光または蛍光検鏡の場合
の励起光をシャッターにより無くし、その状態で試料か
らの光像以外の光による明るさをバックデータとして検
出する。

【００１３】さらに、試料を観察するための対物光学系
と、この対物光学系によって形成された前記試料からの
光像を光電変換するイメージセンサと、前記光像の明る
さをモニタする照度モニタを備え、前記イメージセンサ
から得られた画像信号または照度モニタから得られた照
度信号により焦点状態をくり返し検出し、前記試料と対
物レンズの相対的距離を調整することにより焦点調整を
行う顕微鏡自動焦点検出装置であって、第１のステップ
は、照度モニタによりくり返し光像の明るさを検出しな
がら試料と対物レンズの相対的距離を調整し、光像が最
も明るくなる位置へ移動し、第２のステップは、イメー
ジセンサから得られた画像信号からコントラスト等の合
焦度をくり返し検出し試料と対物レンズの相対的距離を
調整して合焦を得る顕微鏡自動焦点検出方法を提供す
る。

【００１４】

【作用】以上のような構成の顕微鏡自動焦点検出方法
は、自動合焦を得るための第１のステップとして、コン
トラスト等の合焦度を示すような評価関数により画像の
有無を検出するのではなく、画像の明るさ情報を基に画
像の有無を検出する。

【００１５】また、ＣＣＤリセットパルスを間引いて画
素サイズを疑似的に大きくし、高感度化され、短い電荷
蓄積時間で画像探索の高速化される。前記ＣＣＤイメー
ジセンサの蓄積時間が所定時間を経過してもで、ある定
められた明るさ以下の場合にはその画像データを無視
し、不要な画像探索時間を削除する。また、画像の誤認
識を防ぐために、明るい画像を探索する前に試料への照
明光や励起光をシャッターで閉じ、その状態でＣＣＤイ
メージセンサ上に入射する光をバックデータとして記憶
する。

【００１６】

【実施例】以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細
に説明する。図１には、本発明の第１実施例として、落
射蛍光観察用顕微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を
示し説明する。

【００１７】この落射蛍光観察用顕微鏡においては、光
源となる水銀灯１３から放射された励起光は、落射蛍光
投光管１１，対物レンズ３を通過して試料２へ照射さ
る。その照射に伴い試料２から発した蛍光画像が、対物
レンズ３を通過し、一部は接眼レンズ４を介して、検鏡
者が観察し、一部は焦点調整のためのイメージセンサ５
へ投影される。

【００１８】そしてイメージセンサ駆動回路６は、ＣＰ
Ｕ９からの制御により、常に適正なタイミングで前記イ
メージセンサ５へ駆動パルスを出力し、該イメージセン
サ５は、入力された駆動パルスに従ったタイミングで受
光した画像を電気信号に変換する。そして前記イメージ
センサ５により電気信号に変換された画像信号は、アナ
ログ信号処理回路７に入力され、ここで所定の処理を受
けて、さらに評価関数演算器８に送られる。

【００１９】前記評価関数演算器８では、ＣＰＵ９から
指定された演算式に従って評価演算を行い、その結果を
ＣＰＵ９に送る。前記ＣＰＵ９は、評価演算の結果に基
づき、ステージ駆動装置１４へ制御信号を送り、ステー
ジ１を上下方向に移動させることにより、試料２と対物
レンズ３との相対的距離を調整して、自動合焦を得るよ
うに構成されている。

【００２０】また、前記ＣＰＵ９は、必要に応じてシャ
ッタ駆動回路１０に対して、シャッター開閉制御信号を
出力し、シャッター１２を開閉できるようになってい
る。外部コントローラ１５は観察者が顕微鏡の電動部位
を制御するために使用するスイッチやジョグダイヤルを
有する装置で、自動合焦動作の開始、中断、シャッター
１２の開閉などの操作を観察者が外部コントローラ１５
を用いて行うと、その情報をＣＰＵ９に送るので、ＣＰ
Ｕ９が操作に対応した動作を行うようになっている。

【００２１】この第１実施例では、自動合焦動作の第１
ステップとして、ＣＰＵ９は評価関数演算器８に対し
て、評価関数を明るさを示す関数に指定をする。そして
ＣＰＵ９は、評価関数演算器８から出力される画像の明
るさ情報をくり返し入力しながらステージ駆動装置１４
に制御信号を送り、ステージ１を上下動させ、試料２か
ら発する画像の明るさが最大となる位置までステージ１
を移動させる。

【００２２】次に、第２ステップとして、ＣＰＵ９は評
価関数演算器８に対して、評価関数をコントラストレベ
ルを示す関数に指定をする。そして、前記ＣＰＵ９は、
評価関数演算器８から出力される合焦度を示す情報をく
り返し入力しながらステージ駆動装置１４に制御信号を
送り、ステージ１を上下動させて合焦を得る位置に調整
する。

【００２３】通常、蛍光観察においては、基本的に試料
から発する蛍光画像以外の光は、観察できないようにな
っており、最も明るく見える位置は焦点位置にかなり近
い。従って、本第１実施例のように、第１のステップで
は、時間のかかる複雑な演算を省き、短時間でできる明
るさ演算を行って、明るい位置を検出し、自動合焦にか
かる時間を短くしている。

【００２４】また第１実施例では、落射蛍光観察におけ
る例を示したが、他の観察方法、たとえば暗視野観察に
おいてもこの方法を応用することにより同様の効果が得
られる。

【００２５】次に、本発明による第２実施例として落射
蛍光観察用顕微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を示
し説明する。この第２実施例は、前述した第１実施例と
基本的な構成を同じくした図１に示すような構成であ
り、基本的な自動合焦動作も第１実施例と同じである
が、第１実施例におけるイメージセンサ５の駆動方法が
異なる。

【００２６】この第２実施例において、イメージセンサ
５にはＣＣＤイメージセンサを用い、自動合焦動作の第
１のステップでは、ＣＯＵ９はイメージセンサ駆動回路
６に対して、ＣＣＤイメージセンサのリセットパルスを
間引いて、通常の周期よりも長い周期となるような信号
を出力する。

【００２７】そしてイメージセンサ駆動回路６が、この
信号に従ってイメージセンサ５を駆動すると、イメージ
センサ５の出力部で複数の画素の信号が加算され、見か
け上画素サイズが大きくなり画素数が減ったような信号
が得られる。

【００２８】従って、リセットパルスの間隔を長くする
と画像として認識できなくなるものの信号のレベルが大
きくできるため、イメージセンサの高感度化ができ、蓄
積時間を短くしても明るさを知る上では充分な信号が得
られるようになる。

【００２９】よって、この第２実施例は、前述した第１
実施例よりもさらに高速に画像の探索が行える。また、
第２実施例においても第１実施例と同様、暗視野観察等
他の観察方法に応用可能である。

【００３０】次に、本発明による第３実施例として落射
蛍光観察用顕微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を示
し説明する。この第３実施例は、前述した第１実施例と
基本的な構成を同じくした図１に示すような構成であ
り、基本的な自動合焦動作も第１実施例と同じである
が、第１実施例におけるイメージセンサ５の駆動方法が
異なる。

【００３１】この第３実施例では、前述した第１実施例
の第１のステップにおいて、ＣＰＵ９がイメージセンサ
駆動回路６に対して、蓄積時間の上限を指示する。イメ
ージセンサ駆動回路６は、イメージセンサ５に投影され
る光量が小さくても指示された値以上に蓄積時間を長く
せず、指示された蓄積時間で検出できない微弱な光は画
像以外の光と判断して無視し、必要以上に蓄積時間を長
くして画像探索時間が長くなるのを防ぐ。また第３実施
例においても第１実施例と同様、暗視野観察等他の観察
方法に応用可能である。

【００３２】次に、本発明による第４実施例として落射
蛍光観察用顕微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を示
し説明する。この第４実施例は、前述した第１実施例と
基本的な構成を同じくした図１に示すような構成であ
り、基本的な自動合焦動作も第１実施例と同じである。

【００３３】この第４実施例では、第１実施例における
第１のステップにおいて、最も明るい位置を探索する前
にＣＰＵ９がシャッター駆動回路１０に指示信号を発し
てシャッター１２を閉じ、その状態で１回イメージセン
サ５に投影される光量をバックデータとして検出記憶す
る。そして検出した光量は、試料２からの光以外の室内
照明などの漏光として認識する。再び、ＣＰＵ９がシャ
ッター駆動回路１０に指示信号を発してシャッター１２
を開いてから最も明るくなる位置を探索する動作を開始
する。この時、常に記憶したバックデータと比較しなが
ら、イメージセンサ５上に投影される光量を検出する。
従って、試料２から発する光が微弱であっても、試料２
以外の光量と比べることによって区別して検出でき、室
内照明などの漏光を試料と誤認識するのを防ぐことがで
きる。また、第４実施例においても、第１実施例と同様
に他の観察方法たとえば暗視野観察に応用可能である。

【００３４】図２には、本発明の第５実施例として、落
射蛍光観察用顕微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を
示し説明する。この落射蛍光観察用顕微鏡において、光
源である水銀灯３３から放射された励起光は、落射蛍光
投光管３２，対物レンズ２３を通過して試料２へ照射さ
れ、試料２から発した蛍光像は、対物レンズ２３を通過
し、その部は接眼レンズ２４を介して検鏡者が観察し、
その一部は焦点調整のためイメージセンサ２５，照度モ
ニタ２６へ投影される。

【００３５】前記イメージセンサ駆動回路２７は、ＣＰ
Ｕ３０からの制御により、常に適正なタイミングでイメ
ージセンサ２５へ駆動パルスを出力する。前記イメージ
センサ２５は、入力された駆動パルスに従ったタイミン
グで受光した画像を電気信号に変換する。また照度モニ
タ２６は、イメージセンサ２５に入射する光量をリアル
タイムにモニタしている。そしてイメージセンサ２５に
より電気信号に変換された画像信号及び、照度モニタ２
６によりモニタされた照度信号は、アナログ信号処理回
路２８により所定の処理を受けた後、評価関数演算器２
９に送られる。

【００３６】前記評価関数演算器２９は、ＣＰＵ３０か
ら指定された演算式に従って、評価演算を行い、その結
果をＣＰＵ３０へ送る。前記ＣＰＵ３０は評価演算の結
果に基づき、ステージ駆動装置３５へ制御信号を送り、
ステージ２１を上下方向に移動されることにより自動合
焦を得るように構成されている。

【００３７】また、ＣＰＵ３０は必要に応じてシャッタ
ー駆動回路３１に対してシャッター開閉制御信号を出力
し、シャッター３４を開閉できるようになっている。外
部コントローラ３６は、検鏡者が顕微鏡の電動部位を制
御するためのスイッチやジョグダイヤルを有する装置で
ある。

【００３８】この第５実施例では、自動合焦を得るため
の第１のステップとして、ＣＰＵ３０は、照度モニタ２
６の出力を検出しながらステージ２１を上下動させ照度
モニタ２６から得られた照度を示す値が最も大きくなる
位置へステージ２１を移動する。

【００３９】そして第２のステップとして、ＣＰＵ３０
は、イメージセンサ２５から得た画像の信号をアナログ
信号処理回路２８，評価演算器２９を介してコントラス
ト等の合焦度レベルを検出し、合焦度レベルに応じてス
テージ２１を移動して合焦を得る。このように、第１の
ステップで照度モニタ２６により、リアルタイムでモニ
タすることにより、かなり高速でステージ２１を上下動
させても最も明るくなる位置を検出でき、自動合焦の動
作時間を短縮できる。

【００４０】以上のことから本発明による顕微鏡自動焦
点検出方法により、自動合焦を得るための第１のステッ
プとして、コントラスト等の合焦度を示すような評価関
数により画像の有無を検出するのではなく、画像の明る
さ情報を基に画像の有無を検出するような方法を用いる
ことで、コントラスト等の合焦度を示す複雑な評価関数
演算をなくし明るさを検出するといった演算の簡略化に
より画像情報を検出するサイクルの高速化が可能とな
り、画像探索が高速に行える。

【００４１】さらには、ＣＣＤリセットパルスを間引い
て画素サイズを疑似的に大きくすることで、高感度化
し、ＣＣＤの電荷蓄積時間を短くでき、さらに画像探索
の高速化ができる。

【００４２】前記ＣＣＤイメージセンサの蓄積時間をあ
る定めた値以上には長くしないことで、ある定められた
明るさ以下の場合には、無視して、蓄積時間を明るさに
追従させないので、画像探索に余計な時間をかけなくて
すむ。

【００４３】また、明るい画像を探索する前に、試料へ
の照明光や励起光をシャッターで閉じ、その状態でＣＣ
Ｄイメージセンサ上に入射する光をバックデータとして
記憶することで、試料からの光とそれ以外の光とを区別
でき、微少な光でも試料からの光かどうか認識でき、画
像の誤認識を防ぐこどかできる。

【００４４】また、照度モニタを設け、リアルタイムで
試料からの光量をモニタできるようにすることで、かな
り高速で試料と対物レンズの相対的距離を変化させて
も、試料からの光が最も大きくなった位置を認識できる
ので画像探索がさらに高速化できる。

【００４５】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、第１のス
テップでコントラスト演算等の複雑な演算をせずに、明
るさのみを検出するような簡単な方法をとることで、演
算時間を短縮し、画像情報を入力するサイクルを速くで
きるので自動合焦の時間が高速にできる。この自動合焦
の高速化により蛍光観察においては、試料に励起光を照
射する時間も短くでき、褪色も防ぐことができる。

【００４６】さらに、ＣＣＤイメージセンサの感度を高
めた状態で明るさを検出できるのでＣＣＤイメージセン
サの蓄積時間を短くでき、さらに自動合焦の高速化が可
能となる。

【００４７】また、試料から発する光以外の光量をバッ
クデータとして検出することで、試料から発する光が微
弱であっても試料以外の光と区別することができ、試料
から発する光の微少な変化も検出できるとともに、試料
以外の光を試料として誤認識することを防ぐことができ
る。

【００４８】そして、明るさの検出に照度モニタを設け
ることで、明るさ情報をリアルタイムで認識できるた
め、最も明るい位置を探索する際、かなり高速でステー
ジをスキャンしても光量の変化が確認でき、自動合焦動
作がさらに高速化できる。

【００４９】以上詳述したように本発明によれば、画像
の位置探索を高速化し、画像探索時間の短縮化を図り、
誤認識を防ぎ高速で焦点調整が可能な顕微鏡自動焦点検
出方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施例として、落射蛍光観察用顕
微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を示す図である。

【図２】本発明の第５実施例として、落射蛍光観察用顕
微鏡に応用した自動合焦装置の構成例を示す図である。

【符号の説明】

１…ステージ、２…試料、３…対物レンズ、４…接眼レ
ンズ、５…イメージセンサ、６…イメージセンサ駆動回
路、７…アナログ信号処理回路、８…評価関数演算器、
９…ＣＰＵ、１０…シャッタ駆動回路、１１…落射蛍光
投光管、１２…シャッター、１３…水銀灯、１４…ステ
ージ駆動装置、１５…外部コントローラ。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料を観察するための対物光学系を備
   え、該対物光学系によって形成された前記試料からの光
   像を少なくとも１つのＣＣＤイメージセンサにより電気
   信号に変換し、得られた電気信号を所定の評価関数に従
   って演算し、その演算結果に基づいて、焦点状態を検出
   しつつ、前記試料と対物レンズの相対的距離を調整する
   ことにより焦点調整を行う顕微鏡自動焦点検出装置であ
   って、 第１のステップは、前記評価関数を前記光像の明るさを
   示す関数とし、試料と対物レンズの相対的距離を変化さ
   せながら試料の明るさを検出し最も明るくなる位置に調
   整を行い、 第２のステップは、前記評価関数を前記光像のコントラ
   スト等の合焦度を示す関数に切換えて、合焦度が所定の
   値になるように試料と対物レンズの相対的距離を調整す
   ることを特徴とする顕微鏡自動焦点検出方法。
2. 【請求項２】 前記第１のステップでは、ＣＣＤイメー
   ジセンサへのリセットパルスを間引くことによって、疑
   似的に画素サイズを大きくし、感度を高くして、短時間
   の電荷蓄積でも、明るさ検出が可能としたことを特徴と
   する請求項１記載の顕微鏡自動焦点検出方法。
3. 【請求項３】 前記第１のステップでは、ＣＣＤイメー
   ジセンサ上に投影される光像が暗黒になっても、それに
   追従してＣＣＤイメージセンサの電荷蓄積時間を長くせ
   ず、所定の電荷蓄積時間より短い範囲で電荷蓄積時間を
   制御することによって明るさ検出を行うことを特徴とす
   る請求項１記載の顕微鏡自動焦点検出方法。
4. 【請求項４】 前記第１のステップでは、明るさ検出を
   開始する前に、試料を照明する照明光または蛍光検鏡の
   場合の励起光をシャッターにより無くし、その状態で試
   料からの光像以外の光による明るさをバックデータとし
   て検出することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡自動
   焦点検出方法。
5. 【請求項５】 試料を観察するための対物光学系と、こ
   の対物光学系によって形成された前記試料からの光像を
   光電変換するイメージセンサと、前記光像の明るさをモ
   ニタする照度モニタを備え、前記イメージセンサから得
   られた画像信号または照度モニタから得られた照度信号
   により焦点状態をくり返し検出し、前記試料と対物レン
   ズの相対的距離を調整することにより焦点調整を行う顕
   微鏡自動焦点検出装置であって、 第１のステップは、照度モニタによりくり返し光像の明
   るさを検出しながら試料と対物レンズの相対的距離を調
   整し、光像が最も明るくなる位置へ移動し、 第２のステップは、イメージセンサから得られた画像信
   号からコントラスト等の合焦度をくり返し検出し試料と
   対物レンズの相対的距離を調整して合焦を得ることを特
   徴とする顕微鏡自動焦点調整方法。