JPH07298888A - サテライトｒｎａを用いたキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、その作出方法、キュウリモザイクウイルスの防除法及びキュウリモザイクウイルス抵抗性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 リンドウから単離された軽微なえそ症状しか
示さないキュウリモザイクウイルスから得られた特定の
配列を有するサテライトＲＮＡを組み込んでなるキュウ
リモザイクウイルスの弱毒ウイルス、及びそのサテライ
トＲＮＡ遺伝子を含むキュウリモザイクウイルス抵抗性
植物。 【効果】 ＣＭＶに対する弱毒ウイルスを作出すること
ができ、またその弱毒ウイルスを用いてＣＭＶを防除す
ることができ、さらにはＣＭＶに対して抵抗性を有する
植物が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、キュウリモザイクウイ
ルス（以下、ＣＭＶと省略する）に対する弱毒ウイル
ス、その弱毒ウイルスの作出方法、ＣＭＶの防除方法、
及びＣＭＶ抵抗性植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、キュウリモザイクウイルスは
広範囲な植物に感染して大きな被害を与え、作物の減収
要因となっている。このＣＭＶの防除に関しては、多く
の植物の栽培種あるいはその関連野生種に抵抗性品種が
見出されないために、農薬散布による媒介昆虫（アブラ
ムシ）の駆除、飛来防止、または栽培法などに頼ってい
るのが現状である。

【０００３】しかしながら、上記の方法はいずれもＣＭ
Ｖによる病害に対する防除効果が不十分であって、特に
経済性、環境汚染などの問題がある。このような環境汚
染の心配がなく、なおかつ防除効果が高く、経済的な方
法として、弱毒ウイルスを利用する防除方法が考えられ
る。弱毒ウイルスの人為的な作出方法としては、熱や亜
硝酸ソーダで処理する方法等が知られているが、いずれ
も大量のウイルス株の中から弱毒ウイルスが得られる確
率は極めて低く、また、弱毒ウイルスが得られたとして
も不安定なものが多く、強毒ウイルスに変異してしまう
ものもある。

【０００４】ところで、ＣＭＶの分離株の中には、サテ
ライトＲＮＡと呼ばれるＲＮＡを含んでいるものがあ
る。このサテライトＲＮＡは、罹病植物の病徴を変化さ
せるという重要な性質を有する。最近、ＣＭＶのサテラ
イトＲＮＡをＣＭＶに組み込んで、弱毒ウイルスを作出
し、ＣＭＶ防除に利用する方法が報告された（特公昭62
-37956号公報参照）。しかし、この報告にはサテライト
ＲＮＡの塩基配列が示されていなかった。

【０００５】これに対し、特開平5-3789号公報には、サ
テライトＲＮＡの具体的な塩基配列の一例が記載されて
いる。この報告では、トマトに軽微なモザイク症を示す
多数のＣＭＶから多数のＲＮＡを分離し、その中から病
徴軽減効果を示すサテライトＲＮＡを５種単離した後、
ＣＭＶ弱毒ウイルスを作出し、これを幼苗に接種すれ
ば、ＣＭＶ防除効果が得られることを認めており、サテ
ライトＲＮＡの中には植物の病徴を軽減するものと、逆
に病徴を悪化させるものとがある旨を開示している。

【０００６】この報告から、サテライトＲＮＡ全てが病
徴軽減効果を示すわけではなく、特異的なサテライトＲ
ＮＡのみが病徴軽減効果を示すと考えられる。このよう
に、ＣＭＶの病徴はサテライトＲＮＡの種類によって大
きく左右されるため、ＣＭＶ防除には、病徴を軽減する
サテライトＲＮＡを見出して用いる必要がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、病徴
を軽減する新規なサテライトＲＮＡ、並びにそれを用い
た弱毒ウイルス及びＣＭＶ抵抗性植物を提供することで
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規なサ
テライトＲＮＡを見出すために、これまでＣＭＶの採取
対象として取り上げられていなかった植物に着眼したと
ころ、多くのリンドウにＣＭＶが感染していることを発
見し、このリンドウを採取対象とすることとし、各種検
討を重ねた結果、リンドウに軽微な病徴しか示さないＣ
ＭＶから新規なサテライトＲＮＡを単離することに成功
し、これを用いた弱毒ウイルスを使用することにより、
ＣＭＶの感染防除が可能となることを発見するととも
に、そのサテライトＲＮＡ遺伝子を導入した植物は、Ｃ
ＭＶに対して抵抗性を有することを発見し、本発明を完
成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、配列番号１の塩基配
列を含んでなることを特徴とするサテライトＲＮＡであ
る。また、本発明は、リンドウから単離された軽微なえ
そ症状しか示さないキュウリモザイクウイルスから得ら
れた配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを組
み込んでなることを特徴とするキュウリモザイクウイル
スの弱毒ウイルスである。

【００１０】さらに、本発明は、サテライトＲＮＡを含
まないキュウリモザイクウイルス又はキュウリモザイク
ウイルスのＲＮＡと、配列番号１の塩基配列を含むサテ
ライトＲＮＡとを植物に接種せしめ、しかる後、前記植
物の汁液から弱毒ウイルスを得ることを特徴とするキュ
ウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスの作出方法であ
る。

【００１１】さらに、本発明は、前記弱毒ウイルスを、
予め対象植物の幼苗に接種することを特徴とするキュウ
リモザイクウイルスの防除法である。さらに、本発明
は、前記サテライトＲＮＡ遺伝子を含むキュウリモザイ
クウイルス抵抗性植物である。以下、本発明を詳細に説
明する。

【００１２】ＣＭＶの核酸はＲＮＡからなるが、このウ
イルス核酸をポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で
分離すると、ＣＭＶは４成分のＲＮＡ（ＲＮＡ１〜４）
を有する系統と、小さい塩基数からなるサテライトＲＮ
Ａ（ＲＮＡ５）を含む５成分のＲＮＡ（ＲＮＡ１〜５）
を有する系統に大別することができる。本発明において
は、リンドウに軽微な病徴しか示さないＣＭＶからサテ
ライトＲＮＡを単離し、それを用いて弱毒ウイルスを作
出する。サテライトＲＮＡの分離方法としては、ウイル
スから核酸成分を分離する従来公知のいかなる方法を適
用してもよい。例えば、ウイルスの蛋白質を適宜試剤に
よって変性させ、電気泳動を数回繰り返すことによっ
て、サテライトＲＮＡを精製することができる。

【００１３】このようにして得られる本発明のサテライ
トＲＮＡは、配列番号１の塩基配列を含む新規なＲＮＡ
であり、これをサテライトＲＮＡC7と名付けた。このサ
テライトＲＮＡC7について、トマトを用いてマスタらの
方法（Ann. Phytopath. Soc.Japan 56: 207-212, (199
0)）によって病徴軽減の効果を評価したところ、優れた
効果が認められた。

【００１４】上記サテライトＲＮＡC7を安定的に製造す
るには、クローニングしたサテライトＲＮＡのｃＤＮＡ
を組み込んだ大腸菌を用いるのが好ましい。即ち、サテ
ライトＲＮＡを従来公知植物で継代接種すると、その塩
基配列の構造が置換挿入、欠失し易く不安定であり、変
異しやすい。それゆえ、より安定なＤＮＡの形に変換
し、大腸菌に保存するのが有利である。更に、クローニ
ング操作によって、サテライトＲＮＡを純化することが
可能である。そして、この大腸菌から取り出したプラス
ミドにＲＮＡポリメラーゼを作用させれば目的とするサ
テライトＲＮＡを容易に取り出すことができる。

【００１５】大腸菌の中にサテライトＲＮＡを導入する
には、サテライトＲＮＡを一旦ｃＤＮＡに変換する必要
がある。それには、サテライトＲＮＡを鋳型としてＡＭ
Ｖ（ライフサイエンス社製）等の逆転写酵素を使用し、
常法に従いｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡにＴ
７、ＳＰ６（文献J. D. Watsonら、In MolecularBiolog
y of the Gene (1987) ) などの適切なプロモーターを
連結した後、pUC118 (pUC119) （宝酒造社製）などのプ
ラスミドに導入し、得られる組換えプラスミドで大腸菌
ＪＭ101、ＪＭ109等の宿生微生物を形質転換してクロー
ニングする。このサテライトＲＮＡのｃＤＮＡを含む組
換えプラスミドにＲＮＡポリメラーゼを作用させること
により、サテライトＲＮＡC7を生産することができる。

【００１６】また場合によっては、得られたサテライト
ＲＮＡC7をＰＣＲ法等によってさらに増幅してもよい。
本発明では、このように生産したサテライトＲＮＡC7
と、ＲＮＡ５成分系のＣＭＶ又はサテライトＲＮＡを含
まないＲＮＡ４成分系のＣＭＶとを混合して、常法によ
り植物に接種し、ＲＮＡ４成分系のＣＭＶにサテライト
ＲＮＡC7が組み込まれた弱毒ウイルスを植物体内で作出
・増殖させる。

【００１７】ＣＭＶは、ＲＮＡ４成分系のものであれば
いかなる系統のものを使用してもよいが、好ましくはＣ
ＭＶE5株を使用する。弱毒ウイルスを接種する植物とし
ては、例えばトマト、ピーマン、ナス、ホオズキ、オウ
レンソウ、キュウリ、メロン、ツルナ、ダイズ、インゲ
ン、ササゲ、百日草、千日草、アカザ、あるいはタバコ
等が挙げられるが、弱毒ウイルスの増殖率を考慮する
と、トマトを用いるのが好ましい。

【００１８】弱毒ウイルスを接種する方法としては種々
あるが、一例として、精製したＣＭＶ0.02mg/ml に、サ
テライトＲＮＡ0.005 〜0.01mg/ml 程度を混合し、0.02
Ｍ程度のリン酸緩衝液（pH7.0 程度）で約10倍に希釈し
た後、植物の表面にカーボランダム、セライト、ベント
ナイト等（400 〜600 メッシュ）を少量加えて塗り付け
る方法が挙げられる。

【００１９】植物体内では、通常２〜４週間程度、弱毒
ウイルスの増殖が行われるため、この後当該植物の感染
葉から汁液を採取する。採取された汁液中には、そのま
ま植物に接種するだけでも十分なＣＭＶ防除効果が得ら
れる程の弱毒ウイルスが含有されているため、当該汁液
を特に濃縮する必要はないが、例えばクロロホルム抽出
後、0.1 Ｍ塩化ナトリウムを含むポリエチレングリコー
ル（６％）を用いて65,000Ｇで２時間遠心分離をし、そ
の沈殿画分を0.02Ｍリン酸緩衝液で懸濁して濃縮しても
よい。

【００２０】このようにして得られた弱毒ウイルスを、
所望の植物に接種することにより、ＣＭＶによるウイル
ス病を有効に防除することができる。この場合における
接種は、弱毒ウイルスをそのまま用いてもよいし、ある
いは0.02Ｍ程度のリン酸緩衝液（pH7.0 程度）で約10〜
100 倍に希釈し、少量のカーボランダム、セライト、ベ
ントナイト等（400 〜600 メッシュ）を加えて用いても
よい。

【００２１】当該弱毒ウイルスの濃度は特に制限されな
いが、ＣＭＶによるウイルス病を確実に防除するには、
0.01〜0.02mg/ml とするのが好ましい。また、接種部位
は、特に限定されないが、子葉期など若いものほど感染
率が高く好ましい。弱毒ウイルスを接種する植物は、い
かなる生育期に達しているものでもよいが、好ましくは
幼苗に接種する。

【００２２】本発明の弱毒ウイルスを接種して約10〜15
日程度経過すれば、ＣＭＶ強毒ウイルスを接種しても激
しい病徴は発現しない。また、強毒ウイルスを接種した
植物を畑に植え、病徴が発現する前に本発明の弱毒ウイ
ルスを接種すれば、軽微な病徴が発現するに過ぎない。
さらに、本発明の弱毒ウイルスを接種した植物を栽培し
た場合、その収量は、健全な株と比較してもほとんど差
異がない。

【００２３】本発明では、また上記サテライトＲＮＡ遺
伝子を導入することにより、ＣＭＶに抵抗性を有する植
物を得ることができる。以下、一例としてＣＭＶ抵抗性
タバコを作出する方法を説明するが、本発明ではこれに
限定されず、ＣＭＶに抵抗性を有する種々の植物を作出
することができる。まず、本発明のサテライトＲＮＡか
ら、前述した方法と同様の方法によりｃＤＮＡを合成
し、ＰＣＲ法で増幅後、クローニングする。このｃＤＮ
Ａクローンを、植物導入用ベクターに導入できるように
処理する。この処理は、使用するベクターによって適宜
選択すればよいが、ｃＤＮＡクローンを適当な制限酵素
で消化したのち、例えば１％アガロースゲル電気泳動を
行い、β−アガラーゼ処理を施してサテライトＲＮＡの
ｃＤＮＡ（これをサテライトＲＮＡ遺伝子という。）を
精製すればよい。

【００２４】一方、植物導入用のベクターとしては、抗
生物質耐性遺伝子を選択マーカーとして含むpBI121系の
ベクターから作製することができる。ここで、選択マー
カーとしての抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性
遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性
遺伝子等が挙げられる。ベクターの対応するサイトに常
法によってサテライトＲＮＡのｃＤＮＡ（サテライトＲ
ＮＡ遺伝子）を導入することにより、モノマーのサテラ
イトＲＮＡ遺伝子を含む植物導入用ベクターが得られ
る。本発明では、上記pBI121由来のベクターにサテライ
トＲＮＡ遺伝子を導入したものをpBISATと名付けた。

【００２５】ＣＭＶに抵抗性を有する種々の植物を作出
するための植物導入用ベクターとしては、モノマーのサ
テライトＲＮＡ遺伝子を含むものに限らず、ダイマーの
サテライトＲＮＡ遺伝子を含むものをも使用することが
できる。ダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を含むベク
ターを作製するには、例えばモノマーのサテライトＲＮ
Ａ遺伝子を含む植物導入用ベクターに、さらにサテライ
トＲＮＡ遺伝子を導入すればよい。上記の例で説明する
と、適当な制限酵素で処理したpBISATに、前述の精製し
たサテライトＲＮＡ遺伝子断片を挿入することにより、
ダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を含む植物導入用ベ
クターpBISAT² を得る。

【００２６】得られたモノマーのサテライトＲＮＡ遺伝
子を含む植物導入用ベクター及び／又はダイマーのサテ
ライトＲＮＡ遺伝子を含む植物導入用ベクターを、所望
の植物に導入して形質転換することにより、ＣＭＶに抵
抗性を有する植物を作出することができる。上記の例で
は、pBISAT及び／又はpBISAT² を、それぞれ凍結融解法
により導入したAgrobacterium tumefaciens を接種する
ことにより、タバコ(Nicotiana benthamiana) を形質転
換することができる。このようにして作出した形質転換
植物は、ＣＭＶに対して優れた抵抗性を示す。

【００２７】

【実施例】以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。 (1) ＣＭＶの採取と純化 リンドウ圃場から採取したウイルス病罹病リンドウ葉を
用いて、ＣＭＶの分離を行った。まず、リンドウ供試葉
を乳鉢内で磨砕し、0.1 Ｍリン酸緩衝液（PB,pH7.2）で
懸濁後、アカザ(Chenopodium amaranticolor) と、ツル
ナ(Tetragoniaexpansa)と、タバコ(Nicotiana benthami
ana) 品種White Burley及びSamsun N.N. に接種し、約
１週間後、接種葉の局部病斑をカミソリを用いて切り取
り、ツルナに繰り返し接種して、ＣＭＶを分離した。

【００２８】分離後、ＣＭＶの純化を行った。この純化
は、汁液接種後１〜２週間目の明瞭なモザイク病状が認
められたタバコを用いて、Takanamiら（Virology 109:1
20-126 (1981) ）の方法に従って行った。具体的には、
まず罹病葉の磨砕液をクロロホルム抽出し、ガーゼで濾
過した。この液を9000rpm 、10分間、４℃で遠心分離
し、上清を28,000rpm で150 分間、４℃で遠心分離し
た。得られた沈殿画分を、0.01ＭEDTA含有の0.01Ｍリン
酸緩衝液に一晩懸濁した後、同様の遠心分離を２回行
い、沈殿（ウイルス画分）を得た。

【００２９】次いで、ELISA 検定、外被蛋白の電気泳動
及びＲＮＡの電気泳動によりＣＭＶの同定を行った。EL
ISA 検定は、間接ELISA 法によって行った。外被蛋白の
電気泳動は、SDS-PAGE法（12.5％ポリアクリルアミドゲ
ル）によって行った。また、ＲＮＡの電気泳動は、変成
ゲル（７Ｍ尿素を含む3.5 ％ポリアクリルアミドゲル）
を用いて行った。この結果、ＣＭＶE5株とＣＭＶC7株と
が採取された。採取された各ＣＭＶ株を、0.1 Ｍリン酸
緩衝液で0.01mg/ml に調整してツルナに接種したとこ
ろ、ＣＭＶE5株接種葉には全体に病徴が認められ、ＣＭ
ＶC7株接種葉にはごく軽い病徴が認められた。

【００３０】(2) サテライトＲＮＡの単離 ＣＭＶE5株とＣＭＶC7株のそれぞれに含まれるＲＮＡ
を、フェノール抽出とフェノール／クロロホルム抽出と
を行った後、エタノール沈殿を行い、７Ｍ尿素を含む3.
5 ％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した
ところ、両株とも、ＲＮＡ１、２、３及び４を有し、そ
の分子量は標準株と同様であった。この分析によって、
ＣＭＶC7株にはサテライトＲＮＡの存在が確認された
が、ＣＭＶE5株の構成ＲＮＡにはサテライトＲＮＡは含
まれていなかった（図１）。一方、ＣＭＶC7株のサテラ
イトＲＮＡC7は、対応するバンドをゲルから切り出し、
ＤＮＡ−cell^TM（ニッポンジーン社製）を用いて回収し
た。

【００３１】(3) サテライトＲＮＡC7のクローニングと
シークエンシング 回収されたサテライトＲＮＡC7から、ｃＤＮＡを合成し
た。具体的には、−鎖ｃＤＮＡを合成するために、単離
したサテライトＲＮＡ（約３μｇ）と3'末端塩基配列に
相補的なＤＮＡプライマー（18塩基、約200pMol）を90
℃に加熱した後、除冷してサテライトＲＮＡとＤＮＡプ
ライマーをアニーリング（会合）させた。−鎖のｃＤＮ
Ａ合成反応は以下の緩衝液中で１時間、42℃に放置する
ことによって行なった。［−鎖ｃＤＮＡ合成緩衝液；50
mMトリス塩酸、10mM MgCl₂、140mM KCl 、30mMβ−メル
カプトエタノール、500μM dNTP、50μCi［α-³²P］dCT
P、１50ユニットRNasin (Promega)、105 units RAV-II
逆転写酵素（宝酒造社製）］

【００３２】次に、得られたｃＤＮＡをＰＣＲ法によっ
て増幅した。具体的には、＋鎖サテライトＲＮＡの5'末
端に相同的なＤＮＡプライマー、3'末端に相補的なＤＮ
Ａプライマー、TaqＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）
および得られたサテライトＲＮＡのｃＤＮＡ合成液の1/
10量を混ぜ、93℃−１分間、55℃−２分間及び73℃−３
分間を１サイクルとして、これを25サイクル行い、ｃＤ
ＮＡを増幅した。このｃＤＮＡをフェノール／クロロホ
ルム抽出した後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿
画分を滅菌水に溶解して、PstI/EcoRI制限酵素で切断し
た。CHROMA SPIN ^TMカラムNo.100（CLONTECH社製）を用
いて回収後、ライゲーションを行って当該ｃＤＮＡをpU
C118ベクター（宝酒造社製）に導入した。

【００３３】得られたクローンをPstI/EcoRI制限酵素で
切断したところ、サテライトＲＮＡC7の存在が確認され
た。DNA SEQUENCER (Applied Bio System 社製) と、Ta
qDye Primer Cycle Sequencing kit (Applied Bio Syst
em 社製) とを用いて、このサテライトＲＮＡC7の塩基
配列を決定したところ、配列番号１に示す334 塩基で構
成されていた。本塩基配列は、これまで知られているい
かなるサテライトＲＮＡとも塩基数及び塩基配列が異な
っていた。この配列番号１に示す塩基配列からなるサテ
ライトＲＮＡに相同的なＤＮＡの塩基配列を有するプラ
スミドを大腸菌に導入し、大腸菌．Escherichia coliIB
RC-PP-94-1 として、工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託した。この寄託番号は、FERM P-14223である。

【００３４】(4) 弱毒ウイルスの調製 ＣＭＶE5株の核酸成分（ＲＮＡ１−４）を含む接種緩衝
液（0.02Ｍリン酸二ナトリウム、カーボランダム）にサ
テライトＲＮＡC7を溶解した。綿棒を用いてサテライト
ＲＮＡC7含有溶液を子葉期のトマト（桃太郎）に接種
し、４週間後に感染葉を採取し、前述した方法と同様に
純化して弱毒ウイルスを得た。この弱毒ウイルスを弱毒
ウイルスSC7 と名付けた。また、前述した方法と同様の
ELISA 検定、外被蛋白の電気泳動及びＲＮＡの電気泳動
によって調べたところ、得られた弱毒ウイルスSC7 は、
サテライトＲＮＡC7を有していた。

【００３５】(5) トマトにおける弱毒ウイルスSC7 のＣ
ＭＶ防除効果 子葉期のトマト（品種：レッドペア）10個に上記弱毒ウ
イルスSC7 又はＣＭＶC7株を接種し、18日後に同じトマ
トに強毒ＣＭＶ（ＣＭＶE5）又は弱毒ＣＭＶ（ＣＭＶC
7）を接種し、防除効果を調べた。また、同様にして弱
毒ウイルスSC7 及びＣＭＶC7株を接種しなかった場合に
ついても調べた。結果を表１に示す。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１から明らかなように、弱毒ウイルスSC
7 には強毒ＣＭＶに対する防除効果が認められた。 (6) リンドウにおける弱毒ウイルスSC7 のＣＭＶ防除効
果 幼苗期のリンドウ（品種：イーハトーヴォ）10個に弱毒
ウイルスSC7 又はＣＭＶC7株を接種し、20日後に、同じ
リンドウに強毒ＣＭＶ（ＣＭＶE5）又は弱毒ＣＭＶ（Ｃ
ＭＶC7）を接種し、防除効果を調べた。また、同様にし
て弱毒ウイルスSC7 及びＣＭＶC7株を接種しなかった場
合についても調べた。結果を表２に示す。

【００３８】

【表２】

【００３９】表２から明らかなように、リンドウにおい
ても弱毒ウイルスSC7 には強毒ＣＭＶに対する防除効果
が認められた。 (7) サテライトＲＮＡ遺伝子を含む植物導入用ベクター
の構築 上記(3) と同様にして、サテライトＲＮＡC7からｃＤＮ
Ａを合成し、ＰＣＲ法で増幅した後、クローニングし
た。このｃＤＮＡクローンをPstIで処理し、T4ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造製）で平滑末端とした後、EcoRIで
消化した。

【００４０】上記のように処理したサテライトＲＮＡの
ｃＤＮＡ（サテライトＲＮＡ遺伝子）を、１％アガロー
スゲル電気泳動及びβ−アガラーゼ処理で精製した。次
いで、抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン）を選択マー
カーとして含むpBI121由来の植物導入用ベクターの対応
するサイトにサテライトＲＮＡ遺伝子を導入し、モノマ
ーのサテライトＲＮＡ遺伝子を含む植物導入用ベクター
pBISATを得た。さらに、pBISATをSmaI及びEcoRIで処理
したpBISATに、前述の精製したサテライトＲＮＡ遺伝子
断片を挿入し、ダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を含
む植物導入用ベクターpBISAT² を得た。

【００４１】(8) タバコの形質転換及び導入遺伝子の発
現 得られたpBISAT及びpBISAT² を、それぞれ凍結融解法に
よりAgrobacterium tumefaciens LB4404株に導入し、タ
バコ(Nicotiana benthamiana) へ接種して形質転換し
た。得られた形質転換体を、カナマイシン（100ppm）で
選抜し、いくつかの再分化個体を得た。

【００４２】形質転換タバコの葉からのサテライトＲＮ
Ａ遺伝子の検出は、以下のようにして行った。形質転換
タバコ葉及び非形質転換タバコ葉から常法によりＤＮＡ
を抽出し、前述したＰＣＲ法で増幅した後、3.5 ％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行った。得られたＤＮＡ
をHybondＮ⁺ メンブレン（アマシャム社製）へ転写し、
ニックトランスレーションキット（ＢＲＬ社製）を用い
たニックトランスレーションによって調製したプローブ
を用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、オート
ラジオグラフィーによりサテライトＲＮＡ遺伝子を検出
した。結果を図２に示す。

【００４３】上記の方法によりサテライトＲＮＡ遺伝子
の導入が確認された数個体の形質転換タバコ葉から常法
によりＲＮＡを抽出し、HybondＮ⁺ メンブレン上にブロ
ッティングした。上記と同様のプローブを使用してノー
ザンハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラ
フィーによりサテライトＲＮＡを検出した。結果を図３
に示す。なお、発現レベルは個体によって差異が認めら
れた。

【００４４】(9) 形質転換タバコのＣＭＶ抵抗性 上記(8) で形質転換したタバコ及び非形質転換のタバコ
（いずれも５葉期）の葉に強毒ＣＭＶE5（50μｇ／ml）
を接種し、防除効果を調べた。非形質転換タバコでは、
接種１週間後に接種葉に、接種２週間後に上位葉に著し
いモザイク症状が現れ、生育が阻害された。一方、モノ
マー及びダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を発現して
いる形質転換タバコでは、ともに接種葉での病徴発現が
遅れ、さらに上位葉では病徴がほとんど認められなかっ
た（図４）。

【００４５】また、上位葉のウイルス粒子の蓄積量をEL
ISA 法により調べたところ、モノマー及びダイマーのサ
テライトＲＮＡ遺伝子を導入した形質転換タバコでは、
非形質転換タバコに比較して、ともにＣＭＶ粒子の蓄積
量が10〜20％に減少していた（図５）。以上のように、
混合接種及び遺伝子の導入・発現により、本発明で分離
されたサテライトＲＮＡがＣＭＶによる病徴を抑制する
作用があることが明らかとなった。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、ＣＭＶに対する弱毒ウ
イルスを作出することができ、またその弱毒ウイルスを
用いてＣＭＶを防除することができ、さらにはＣＭＶに
対して抵抗性を有する植物が得られる。

【００４７】

【配列表】

１．配列番号：１ （１）配列の長さ：３３４ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：一本鎖 （４）トポロジー： （５）配列の種類：サテライトＲＮＡ （６）起源 （ａ）生物名：キュウリ・モザイク・ウイルス (Cucumber mosaic virus) （ｂ）株名：ＣＭＶC7株 （７）配列： GUUUUGUUUG AUAGAGAAUU GCGUAGAGGG GUUAUAUCUA 40 CGUGAGGAUC UGUCACUCGG CGGUGUGGGU UACCUCCCUG 80 CUACGGCGGG UUGAGUCGAC GCACCUCGGA CUGGGGACCG 120 CUGGCUUGCG AGCUAUGUCC GCUACUCUCA GCACUACGCG 160 CUCAUUUGAG CCCCCGCUCA GUUUGCUAGC AGAACCCGGC 200 ACAUGGUUUG CCGUUACCAU GGAAAAUCGA AAGAAACACU 240 GCUAGGUGGU AUCGUGGAUG ACGCACGCAG GGAGAGGCUA 280 AGACUUAUGU UAUGCUGAUC UCCAUGAAUG UCUACACAUU 320 CCUUUACAGG ACCC 334

【図面の簡単な説明】

【図１】精製したＣＭＶのＲＮＡをポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離した結果を示す図である。 Ａ：ＣＭＶC7株・・・ＲＮＡ１〜４のほかサテライトＲ
ＮＡ（ＲＮＡ５）を含み、５成分の核酸で構成されてい
る。 Ｂ：ＣＭＶE5株・・・サテライトＲＮＡは含まれていな
い。 Ｃ：ＣＭＶ Y株（標準株）・・・サテライトＲＮＡを含
んでいる。

【図２】形質転換タバコの葉からＰＣＲ及びサザンハイ
ブリダイゼーションによりサテライトＲＮＡ遺伝子を検
出した電気泳動写真である。 レーン１〜４：モノマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を導
入したタバコ レーン５〜８：ダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を導
入したタバコ レーン９ ：非形質転換タバコ レーン10 ：サテライトＲＮＡのｃＤＮＡを含むクロ
ーン

【図３】形質転換タバコの葉からノーザンドットブロッ
ティングによりサテライトＲＮＡを検出した電気泳動写
真である。 ＋：陽性対照区（サテライトＲＮＡ） −：対照区（ＤＷ） Ｍ：モノマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を導入したタバ
コ Ｄ：ダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を導入したタバ
コ

【図４】強毒ＣＭＶを接種したタバコの状態を示す写真
である。（生物の形態を示す写真） Ａ：接種２週間後のタバコの状態 Ｂ：接種２週間後の上位葉の状態 １：非形質転換タバコ ２：モノマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を導入したタバ
コ ３：ダイマーのサテライトＲＮＡ遺伝子を導入したタバ
コ

【図５】タバコ中におけるＣＭＶ蓄積量を示すグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/04 8931−4Ｂ (72)発明者 佐々木 由紀子 岩手県花巻市鍛冶町９−７ コーポかじま ち203 (72)発明者 斉藤 光 岩手県花巻市西大通１丁目32−14 パーク ハイツはこざきＩ−106 (72)発明者 奥村 亜子 岩手県北上市村崎野15−11 サンコーポ沼 田Ｂ−106号

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の塩基配列を含んでなること
   を特徴とするサテライトＲＮＡ。
2. 【請求項２】 リンドウから単離された軽微なえそ症状
   しか示さないキュウリモザイクウイルスから得られた配
   列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡを組み込ん
   でなることを特徴とするキュウリモザイクウイルスの弱
   毒ウイルス。
3. 【請求項３】 サテライトＲＮＡを含まないキュウリモ
   ザイクウイルス又はキュウリモザイクウイルスのＲＮＡ
   と、配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡとを
   植物に接種せしめ、しかる後、前記植物の汁液から弱毒
   ウイルスを得ることを特徴とするキュウリモザイクウイ
   ルスの弱毒ウイルスの作出方法。
4. 【請求項４】 前記植物が、トマト、アカザ、ツルナ及
   びタバコからなる群から選ばれたキュウリモザイクウイ
   ルス宿主植物であることを特徴とする請求項３記載のキ
   ュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスの作出方法。
5. 【請求項５】 請求項２記載の弱毒ウイルスを、予め対
   象植物の幼苗に接種することを特徴とするキュウリモザ
   イクウイルスの防除法。
6. 【請求項６】 請求項１記載のサテライトＲＮＡ遺伝子
   を含むキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
7. 【請求項７】 植物がタバコであることを特徴とする請
   求項６記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。