JPH07265098A - Ｒｎａの安定な検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 細胞含有被検液にアルカリを添加して細胞を
アルカリ変性させ、次いで２価以上の金属イオン及びポ
リリン酸イオンからなる群から選ばれる少なくとも１種
を含有する中和液で処理した後、被検液中のＲＮＡの存
在を検出することを特徴とするＲＮＡの検出方法；(イ)
バッファー及び(ロ) ２価以上の金属イオン及びポリリン
酸イオンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む
上記ＲＮＡの検出方法に使用するための中和液。 【効果】 被検液のＲＮＡ保存安定性がよく、またＲＮ
Ａを高感度で検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＲＮＡの検出方法に関
し、さらに詳しくは、ＲＮＡ分解酵素の活性を抑制する
ことによってＲＮＡをより安定な状態に保ち、被検ＲＮ
Ａを高感度で検出する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の検出
・同定による遺伝子発現の研究や、リボゾームＲＮＡ
（ｒＲＮＡ）の特異的検出による生物種の同定など、ハ
イブリダイゼーション法を利用するＲＮＡの検出方法は
きわめて重要な技術である。しかしながら、ＲＮＡは非
常に不安定な物質であり、その検出には高度な技術と細
心の注意が必要である。ＲＮＡが不安定になる原因とし
て主にＲＮＡ分解酵素（以下、ＲＮａｓｅという）の存
在がある。生物の細胞内には必ずＲＮａｓｅが存在し、
遺伝子発現システムで働いている。被検液を調製する工
程やその後の検出の工程において、ＲＮａｓｅが混入し
ていると一般に検出価が減少する。本発明者らは先に、
隣接するプローブを用いたＲＮＡの検出方法を開発し、
その方法により、ハイブリダイゼーション及びその後の
操作においてＲＮａｓｅの影響を減少させることが可能
となった。しかしながら、ＲＮａｓｅ活性が非常に高い
環境下では、上記の隣接するプローブを用いたハイブリ
ダイゼーション法でもＲＮＡが不安定になることがあ
り、例えばハイブリダイゼーションする前にＲＮＡが部
分的に分解してしまうことがある。ＲＮＡの検出効率を
高めるために、できる限りＲＮａｓｅの影響を除いて検
出操作を行う必要がある。ＲＮａｓｅ阻害剤として、ヒ
ト胎盤由来ＲＮａｓｅインヒビターといったタンパク質
性のＲＮａｓｅインヒビターや、バナジウム化したヌク
レオチドなどが広く用いられているが、これらは非常に
高価であり、かつ阻害活性を示す条件が限定されてお
り、実用的ではない。また、ヘパリンもＲＮａｓｅ阻害
活性を有することが知られているが、ハイブリダイゼー
ション法を利用するＲＮＡの検出方法においては有効で
ない。また、多くの培養細胞や特殊な微生物の培地には
血清が添加されているが、この中にも多量のＲＮａｓｅ
が存在している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＲＮ
ａｓｅの活性を抑制しＲＮＡをより安定な状態で保ち、
被検ＲＮＡを高感度で検出する方法を提供することであ
る。本発明の他の目的は、上記方法に使用するための中
和液を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために、安価で、かつ環境に左右されずに
ＲＮａｓｅ活性を阻害する物質を検索した。その結果、
細胞をアルカリ変性させ、次いで２価以上の金属イオン
及びポリリン酸イオンからなる群から選ばれる少なくと
も１種を含有する中和液で処理することにより、ＲＮａ
ｓｅ活性が阻害され、よって被検液中のＲＮＡを高感度
で検出することができることを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。従って、本発明は、細胞含有被検液にア
ルカリを添加して細胞をアルカリ変性させ、次いで２価
以上の金属イオン及びポリリン酸イオンからなる群から
選ばれる少なくとも１種を含有する中和液で処理した
後、被検液中のＲＮＡの存在を検出することを特徴とす
るＲＮＡの検出方法である。本発明の好ましい実施態様
によれば、検出がハイブリダイゼーション法によって行
われる。本発明はまた、ＲＮＡが細菌ＲＮＡである上記
ＲＮＡの検出方法に関する。本発明の方法で検出される
ＲＮＡとして、具体的にリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）
やメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられる。本
発明はさらに、下記の成分を含む上記ＲＮＡの検出方法
に使用するための中和液を提供する。(イ) バッファー；
及び(ロ) ２価以上の金属イオン及びポリリン酸イオンか
らなる群から選ばれる少なくとも１種 本発明の好ましい実施態様によれば、２価以上の金属イ
オンはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イ
オン、銅イオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、
コバルトイオン及び鉛イオンからなる群から選ばれる。

【０００５】本発明に使用される細胞含有被検液は特に
限定されるものではなく、例えば細菌の培養液などが挙
げられる。本発明において、細胞のアルカリ変性は常法
に従って行えばよく、また慣用的に用いられるアルカリ
を使用することができる。それらの例としてＮａＯＨ、
ＫＯＨなどが挙げられる。アルカリのみでは変性しにく
いときは、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（Ｍ
ＲＳＡ）などの場合にはリソスタフィン（Lysostaphin)
などの細胞壁溶解酵素で前処理を行ってもよい。本発明
で使用する中和液は、中和液に通常使用されるバッファ
ー、例えばリン酸バッファーやトリス塩酸バッファーな
どの中性バッファーを含む塩酸、硫酸、硝酸などに、２
価以上の金属イオンと酸の陰イオン成分からなる塩及び
／またはポリリン酸塩を添加し溶解させることによって
調製される。上記酸は無機酸でも有機酸でもよく、例え
ば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、炭酸や、酢酸、シュウ
酸、酒石酸、安息香酸などのカルボン酸、スルホン酸、
スルフィン酸などが挙げられる。また、ポリリン酸塩と
してはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などが挙
げられる。

【０００６】２価以上の金属イオンを含む塩の添加量
は、金属イオンによって異なり一概に限定されないが、
一般に被検液におけるその濃度が0.１〜５０mM程度にな
るのが適当であり、さらに好ましくは４〜３０mM程度が
適当である。マグネシウムイオン及びカルシウムイオン
については、上記範囲でも比較的高い濃度で添加される
ことが好ましい。またポリリン酸塩の添加量は、被検液
におけるその濃度が0.０１〜0.３重量％程度が適当であ
り、さらに好ましくは0.０５〜0.２重量％が適当であ
る。２価以上の金属イオンは、アルカリ溶菌処理前に添
加してもよいし、あるいはアルカリ溶菌処理時に添加し
てもよいが、一般に金属イオンの溶解性は酸性側で高い
ので、中和処理液に添加しておくのが最も効果的である
と考えられる。しかしながら、中和液中で溶解していて
もアルカリ処理液と混合した時に、沈殿が生じる場合が
ある。このような沈殿はハイブリダイゼーションを阻害
することがあるので、生じた沈殿を除去することが必要
となる。従って、ハイブリダイゼーションに影響を与え
ない限り、添加する２価以上の金属イオンの濃度は高い
ほど望ましいが、通常の操作において沈殿が生じない条
件で添加するのが好ましい。

【０００７】従来、細胞からＲＮＡを抽出しこれを検出
する方法としては、チオシアン酸グアニジンや尿素、フ
ェノールなどでタンパク質を変性させ、これを除去し、
エタノール沈殿などで得られたものを用いることが一般
的であるが、例えばｒＲＮＡなどの場合は、単純に細胞
をアルカリ変性することによって抽出し、これをサンプ
ルとして直接ハイブリダイゼーションを行う場合があ
る。これらのＲＮＡサンプルは、直接もしくは電気泳動
で分離したものをナイロンフィルターなどの担体に固定
化し、ハイブリダイゼーションを行う場合が多い。この
場合、ＲＮａｓｅの影響が少なくなるので、固定化した
後はＲＮａｓｅの影響をあまり考える必要はない。しか
しながらこのようなフィルターを用いるハイブリダイゼ
ーション法は、手間がかかり、定量が困難であるという
問題点を有する。一方、本発明者らが先に開発した隣接
プローブを用いるハイブリダイゼーション法は、溶液系
で実施される簡便・迅速な方法であって、フィルターを
用いる方法に比べてハイブリダイゼーションの効率が高
いが、ＲＮａｓｅの影響を受けやすく、このＲＮａｓｅ
の影響を除外する工夫をする必要がある。

【０００８】血清には高いＲＮａｓｅ活性があることが
知られている。下記実施例１に示すような高濃度の血清
を含む培地を利用して菌体を培養した場合、この培養液
を従来のようにアルカリ溶菌、中和処理し、ハイブリダ
イゼーションに供すると、血清中のＲＮａｓｅ活性がア
ルカリ処理後も残存しており、特定ＲＮＡの検出値が減
少してしまう。このような場合、本発明のＲＮＡの検出
方法を採用することにより、サンプルの保存性も良好
で、ハイブリダイゼーション法による検出値も安定し増
加する。また、ｍＲＮＡは、ｒＲＮＡよりもさらに分解
されやすく、ｒＲＮＡでは問題にならないような微量の
ＲＮａｓｅの影響を受ける。従って、本発明の方法によ
りｍＲＮＡの検出感度を顕著に上昇させることができ
る。本発明のＲＮＡの検出方法において、被検液中のＲ
ＮＡの検出には慣用の方法を利用することができる。中
でもハイブリダイゼーション法が好ましく、慣用の任意
のハイブリダイゼーション法を使用することができる。

【０００９】本発明に使用されるハイブリダイゼーショ
ン法の一具体例として、隣接する２種の核酸プローブを
用いるＲＮＡの検出方法（以下、隣接ハイブリダイゼー
ション法という）を下記に説明する。この方法は、被検
ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分
配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ
上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部
分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一
方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質
で標識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及
び標識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接
触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハ
イブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブ
の標識物質を検出することにより被検ＲＮＡの存在を検
出することを特徴とする。この検出方法では、２種の核
酸プローブを用いることでＲＮＡ分子の切断の影響を極
力防ぎ、またＲＮＡを迅速・簡便に検出することができ
る。使用する第１の核酸プローブは、被検ＲＮＡの塩基
配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の
逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。この第１の核酸プロ
ーブは１０塩基以上、好ましくは１５〜５０塩基のもの
が適当である。使用する第２の核酸プローブは、被検Ｒ
ＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以
上、好ましくは１５〜５０塩基の部分配列（Ｂ）の逆相
補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。

【００１０】部分配列（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に
存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’
側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の
３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列
（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接
していることが好ましい。配列（Ｂ）の３’末端配列と
配列（Ａ）の５’末端配列、あるいは配列（Ｂ）の５’
末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複してもよい
が、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブ
リダイズする際に、その重複部分で被検ＲＮＡに対して
競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そ
のような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未
満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣
接していることがより好ましい。一方、配列（Ａ）と配
列（Ｂ）が重複も隣接もせず、すなわち離れていてもよ
いが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズ
した結果、被検ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間
に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくな
り、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）
と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’
末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の
５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ
短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこ
と、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。

【００１１】配列（Ａ）の逆相補鎖である特異配列ＤＮ
Ａ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮ
Ａである隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一
方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質
で標識して標識プローブとする。特異配列と隣接配列は
いずれを捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよ
い。標識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン（Ｄｉ
ｇ）、ビオチン、臭化デオキシウリジン、フルオロエス
セイン等が挙げられる。この検出方法ではこの捕捉プロ
ーブを適当な担体に固定する。担体としては、例えば、
核酸との結合性が高い有機ポリマーを素材とするマイク
ロタイタープレートなどを用いることができる。捕捉プ
ローブの固定法は、特に限定されるものではないが、例
えば、上記のプレートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ
溶液を入れ、乾燥後、紫外線照射などにより固定する方
法や、あるいはグルタルアルデヒド法などの共有結合法
を用いてもよい。次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プロ
ーブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて被
検ＲＮＡと捕捉プローブ及び標識プローブをハイブリダ
イズさせる。次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プロー
ブの標識物質を検出することにより被検ＲＮＡを検出す
る。

【００１２】被検ＲＮＡ液を、標識プローブとともに捕
捉プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で３
分〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切な
溶液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質
に酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標
識化合物と結合する物質は特定されるものではないが、
例えば標識プローブがビオチンで標識されている場合に
はビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジン
の混合物、また、Ｄｉｇで標識されている場合には抗Ｄ
ｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結
合体を用いることができる。適切な溶液（洗浄液２）で
洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵素基質は特定され
るものではないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ
を用いた場合には、テトラメチルベンジジンと過酸化水
素を基質とすることによって青色の反応産物を得ること
ができる。勿論、蛍光基質や発光基質などを用いること
もでき、この場合にはより高い検出感度を得ることがで
きる。洗浄液１、２は、特定されるものではないが、例
えば0.05%程度の界面活性剤を含む生理食塩水等を用い
ることができる。

【００１３】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例１】 マイコプラズマ・ハイオニューモニエのｒＲＮＡの検出 〔隣接プローブを用いるハリブリダイゼーション法に使
用する捕捉プローブと標識プローブの調製〕マイコプラ
ズマ・ハイオニューモニエを検出するためのプローブセ
ットを作成した。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ
ST-11株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列から２つの部分配列
を選択し、それぞれ配列番号１、配列番号２で表される
２本の逆相補鎖ＤＮＡを合成した。配列番号１と配列番
号２のＤＮＡは、それぞれ隣接してマイコプラズマ・ハ
イオニューモニエ ST-11株の１６ＳｒＲＮＡにハイブリ
ダイズする。 配列番号１：5'-TATTC AAAGG AGCCT TCAAG CTTCA CCAAG 配列番号２：5'-TAACT AATGT TGCGC ACCCC CATTT 標識プローブには配列番号１、捕捉プローブには配列番
号２のＤＮＡを用いた。各ＤＮＡはＤＮＡ合成装置（Ｐ
ＣＲ−ＭＡＴＥモデル３９１、ＡＢＩ社）を用いて合成
した。捕捉プローブを0.02μg/μl になるように50mMリ
ン酸ナトリウムバッファー、pH8.0 に溶解した。これを
マイクロタイタープレート（住友ベークライト製、MS-3
608FA)の各ウェルに50μl 加え、80℃で乾燥させた。紫
外線を120mJ/cm² 照射した後、30mMクエン酸ナトリウム
/300mM塩化ナトリウム（２×ＳＳＣ）200 μlで３、４
回洗浄し乾燥させた。標識プローブは下記表１の組成の
反応液でジゴキシゲニン(Dig) 標識を行った。

【００１４】

【表１】 ──────────────────────────────── カコジル酸カリウム 0.1M 塩化コバルト 2mM ジチオスレイトール 0.2mM dATP 1mM ジゴキシゲニン-dUTP 0.2mM プローブ用DNA 1 μg ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 50-100U 反応液量 20μl ────────────────────────────────

【００１５】標識反応後、1/10容の0.2M EDTA 、1/10容
の4M LiCl 、３μｇのグリコーゲン及び2.5 倍容のエタ
ノールを加え−80℃で、一晩放置した。遠心分離により
沈殿を集め、70% エタノールで洗浄し乾燥させた後、0.
２mlの10mM Tris-HCl,pH8/1mM EDTAに溶解した。得られ
た標識プローブの４μl を下記表２に示すハイブリダイ
ゼーションバッファーと混合した（標識プローブ液）。
なお、標識プローブ液は４℃で１ヵ月以上の保存が可能
である。

【００１６】

【表２】ハイブリダイゼーションバッファー ＳＳＣ(*) 2x ホルムアミド 30% ブロッキング剤（ベーリンガーマンハイム社製） 1% ドデシル硫酸ナトリウム 0.2% イーストtRNA 100μg/ml 鮭精子 DNA(**) 100 μg/ml 標識プローブ 適量 ─────────────────────────────── * 0.15M 塩化ナトリウム/0.015M クエン酸ナトリウム ** あらかじめ100 ℃、10分の変性処理を行った。

【００１７】〔被検液の調製〕マイコプラズマ・ハイオ
ニューモニエ ST-11株を表３に示す組成の培地で３日
間、３７℃で培養した。培養液を0.８mlとり、0.１mlの
１N ＮａＯＨを加え、３７℃、１０分放置後、表４に示
す濃度で各種物質を含む中和液0.１ml（１N ＨＣｌ／0.
２Ｍリン酸バッファー、pH7.2)を加えて、被検液を得
た。

【００１８】

【表３】 マイコプラズマ・ハイオニューモニエの培養液の組成 （２リットルの培養液中） ───────────────────────── ハンクス液 １リットル ブルセラブロス 11.6 ｇ ラクトアルブミン水解物 ４ｇ ウマ血清 400ml 25% 新鮮酵母エキス 100ml メチシリン 0.2ｇ ─────────────────────────

【００１９】上記で得た各種被検液を放置せずに、また
は室温（約２０℃）で３時間放置した後、下記の隣接ハ
イブリダイゼーション法に供し、検出を行った。その結
果を表４に併せて示す。被検液50μl と標識プローブ液
50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロタイタープ
レートに入れ、37℃、１時間振盪する。0.05%Tween20を
含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗浄した後、１％ブロ
ッキング剤（20mM Tris-HCl, pH7.5/0.15M NaCl)で1000
0 倍希釈した抗Dig ヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ、ベーリンガーマンハイム社製）を加え
30分放置後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：
0.12% 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/0.1M 酢酸ナ
トリウム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.03%
過酸化水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１
で混合）100 μlを加え５〜１５分放置する。得られた
青色液の吸光度を660nm の波長で測定した。

【００２０】

【表４】 ─────────────────────────────────── 吸光度（660nm) 中和液中の 放置時間 試験No. 各種添加物 濃度^*) ０時間 ３時間 ─────────────────────────────────── １（比較） − − 1.399 0.421 ２（〃 ） フェノール 0.05% 1.421 0.523 ３（〃 ） ヘパリン 625U/ml 1.515 0.612 ４（〃 ） ポリアクリル酸ナトリウム 0.1% 1.398 0.588 （重合度22000-70000) ５（〃 ） ポリアクリル酸ナトリウム 0.1% 1.621 0.787 (重合度2700-7500) ６（本発明） 塩化マグネシウム 200mM 2.593 1.455 ７（ 〃 ） 塩化カルシウム 100mM 2.671 1.793 ８（ 〃 ） 塩化第一鉄 100mM 2.452 0.643 ９（ 〃 ） 塩化第二鉄 20mM 1.851 1.237 10（ 〃 ） 塩化第二銅 4mM >3 2.221 11（ 〃 ） 塩化亜鉛 20mM >3 2.231 12（ 〃 ） 酢酸カドミウム 20mM >3 2.245 13（ 〃 ） 酢酸ニッケル 4mM >3 2.115 14（ 〃 ） 塩化マンガン 100mM 1.812 1.353 15（ 〃 ） 塩化モリブデン(V) 20mM 1.652 1.605 16（ 〃 ） 塩化コバルト(II) 100mM 2.349 1.619 17（ 〃 ） 塩化鉛(II) 4mM 1.997 1.002 18（ 〃 ） ポリリン酸ナトリウム 1% 2.666 2.171 19（ 〃 ） 塩化亜鉛＋ 20mM >3 >3 ポリリン酸ナトリウム 1% 20（ 〃 ） 塩化第二銅＋ 4mM >3 >3 ポリリン酸ナトリウム 1% ─────────────────────────────────── *) 最終濃度（被検液における濃度）は、これらの1/10
となる。

【００２１】表４の結果から、種々の２価以上の金属イ
オンにより、検出値が向上しＲＮＡの安定価効果が発揮
されていることがわかる。中でも亜鉛イオン、銅イオン
の効果が顕著である。一方、ポリ陰イオンでも、ヘパリ
ンやポリアクリル酸ナトリウムなどはほとんど効果を示
さないが、ポリリン酸イオンは顕著な効果を示す。さら
に、ポリリン酸イオンと亜鉛イオンあるいは銅イオンを
併用することによって、検体液を３時間室温に放置して
も検出値はほとんど変化せず、相乗効果が示されること
がわかる。

【００２２】

【実施例２】 〔大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写産物（ｍＲ
ＮＡ）の検出〕大腸菌菌株は、JM109 株及び本株をプラ
スミドpUC118で形質転換したものを用いた。検出する遺
伝子は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、
その一部がpUC118に含まれているが、この領域から配列
番号３で表されるＤＮＡをマイクロタイタープレートに
固定し、配列番号４で表されるＤＮＡをジゴキシゲニン
で標識し、ハイブリダイゼーションに供した。ＬＢ培地
で一晩培養した培養液を、新しいＬＢ培地に1/100 容加
え、37℃、１時間培養した。これにイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終２mMに
なるように加えβ−ガラクトシダーゼを誘導、さらに37
℃、１時間培養を続けた。培養液に１N ＮａＯＨを1/8
容加え、37℃、10分処理後、中和液（１N ＨＣｌ／0.２
Ｍリン酸バッファー(pH7.2) あるいはこのバッファーに
20mM ZnCl₂及び１％ポリリン酸ナトリウムを含むもの）
を加え、実施例１に示した方法に従って検出を行った。
結果を表５に示す。 配列番号３：5'-GGGAT GTGCT GCAAG GCGAT 配列番号４：5'-TAAGT TGGGT AACGC CAGGG T

【００２３】

【表５】 β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写産物
（ｍＲＮＡ）の検出 ─────────────────────────────────── 菌株 試験No. IPTG 亜鉛＋ポリリン酸 吸光度(A655) ─────────────────────────────────── JM109 1 − − 0.011 2 − ＋ 0.012 3 ＋ − 0.021 4 ＋ ＋ 0.017 ─────────────────────────────────── JM109 の 5 − − 0.018 pUC118形質転換株 6 − ＋ 0.011 7 ＋ − 0.177 8 ＋ ＋ 0.312 ───────────────────────────────────

【００２４】pUC118は細胞内のコピー数が1,000 以上と
非常に多コピーであり、転写産物も単一遺伝子の場合に
比べ、大量に生産されているものと思われる、また、転
写誘導をかけない状態では検出値がバックグラウンドレ
ベルであることから、これらの検出試験ではプラスミド
ＤＮＡは検出されていないことがわかる。従って、誘導
をかけた形質転換株で得られた検出値は細胞内のｍＲＮ
Ａレベルを反映しているものと考えられる。

【００２５】

【発明の効果】被検液のＲＮＡ保存安定性がよく、また
ＲＮＡを高感度で検出することができる。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATTC AAAGG AGCCT TCAAG CTTCA CCAAG 30

【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAACT AATGT TGCGC ACCCC CATTT 25

【００２８】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAT GTGCT GCAAG GCGAT 20

【００２９】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAAGT TGGGT AACGC CAGGG T 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三瀬 静男 神奈川県厚木市森の里４−25−８ (72)発明者 種田 貴至 千葉県山武郡山武町椎崎968−18 (72)発明者 並松 孝憲 千葉県市川市若宮２−11−11 全農中山寮

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞含有被検液にアルカリを添加して細
   胞をアルカリ変性させ、次いで２価以上の金属イオン及
   びポリリン酸イオンからなる群から選ばれる少なくとも
   １種を含有する中和液で処理した後、被検液中のＲＮＡ
   の存在を検出することを特徴とするＲＮＡの検出方法。
2. 【請求項２】 検出がハイブリダイゼーション法によっ
   て行われる請求項１記載のＲＮＡの検出方法。
3. 【請求項３】 金属イオンがマグネシウムイオン、カル
   シウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオ
   ン、モリブデンイオン、コバルトイオン及び鉛イオンか
   らなる群から選ばれる請求項１または２記載のＲＮＡの
   検出方法。
4. 【請求項４】 ＲＮＡが細菌ＲＮＡである請求項１〜３
   のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法。
5. 【請求項５】 ＲＮＡがリボゾームＲＮＡである請求項
   １〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法。
6. 【請求項６】 ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである請
   求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡの検出方法。
7. 【請求項７】 下記成分を含む請求項１〜６のいずれか
   １項に記載のＲＮＡの検出方法に使用するための中和
   液。 (イ) バッファー；及び(ロ) ２価以上の金属イオン及びポ
   リリン酸イオンからなる群から選ばれる少なくとも１種
8. 【請求項８】 金属イオンがマグネシウムイオン、カル
   シウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、マンガンイオ
   ン、モリブデンイオン、コバルトイオン及び鉛イオンか
   らなる群から選ばれる請求項７記載の中和液。