JPH07260791A - 抗リン脂質抗体測定用免疫診断薬およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 抗リン脂質抗体測定用免疫診断薬は、陰性に
荷電した不溶性担体にβ２−グリコプロテイン−１また
はその同族体もしくは類縁体を吸着させてなるものであ
る。 【効果】 自動化・測定の迅速化が可能な抗リン脂質抗
体測定用免疫診断薬およびその製造方法を提供すること
ができる。この診断薬を用いて、体内の抗リン脂質抗体
を測定ないしは検出することにより、血栓症、習慣流産
およびその他の臨床的に重要な症候群の診断を迅速かつ
簡便に行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗リン脂質抗体症候群
患者に特異的に出現するとされる抗リン脂質抗体を測定
ないしは検出することができる免疫診断薬の製造方法お
よびキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】抗リン脂質抗体は、抗原として陰性に荷
電したリン脂質、最も一般的にはカルジオライピンを用
いる酵素免疫測定法で血漿または血清中に検出できる自
己抗体である。

【０００３】全身性エリテマトーデスのような自己免疫
疾患患者の血清中に、カルジオライピンに直接反応する
抗体、すなわち、『抗カルジオライピン抗体』が出現す
ることが知られていた。また、この抗カルジオライピン
抗体を検出するための酵素免疫測定法は１９８０年代の
なかばに開発され、現在その測定試薬は多数のメーカー
から入手することが可能である（商品名：ＭＥＳＣＵＰ
カルジオリピンテスト、ＭＢＬ社製、および商品名：An
ticardiolipin Assay 、Medical Innovaion Limited 社
製）。

【０００４】近年、この種の抗体は、カルジオライピン
そのものではなく、カルジオライピンと血清蛋白である
β２−グリコプロテイン−１（以下、β２−ＧＰ−１と
略記する）との複合体を認識する抗体（抗カルジオライ
ピン・β２−ＧＰ−１抗体）であるという説が出てき
た。松浦らは、動・静脈血栓、習慣流産、血小板減少な
どの臨床像を有し、血清中に抗リン脂質抗体が検出され
る自己免疫疾患を『抗リン脂質抗体症候群』と定義し、
その診断、経過観察に上記複合体に対する抗体の測定が
有効であるとしている。本明細書においてもその全体を
通して、抗リン脂質抗体とは、上記の『抗リン脂質抗体
症候群』患者血清中に検出される抗体と定義づける。

【０００５】また、該抗体を測定する酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）キットも市販されている（商品名：抗ＣＬ・
β２ＧＰ１キット「ヤマサ」ＥＩＡ、ヤマサ醤油社
製）。

【０００６】しかし、β２−ＧＰ−１やその生理的意
義、複合体の機能などは現時点では十分に解明されてお
らず、多くの研究者の論議が別れるところである。いわ
ゆる、『抗リン脂質抗体症候群』の抗原本体について、
現在主流となっている説は以下の３つである。

【０００７】(1) β２−ＧＰ−１が抗原本体である（Ga
lli, Arvienxら）。

【０００８】(2) β２−ＧＰ−１とカルジオライピンの
複合体が抗原である（McNeil、Matsuuraら）。

【０００９】(3) カルジオライピンと抗体との反応をβ
２−ＧＰ−１が促進する（Chamlev, Sammaritanoら）。

【００１０】上記(2) 説に基づくリン脂質抗体の測定方
法としては、カルジオライピンなどのリン脂質とβ２−
ＧＰ−１との複合体を用いるに当たり、リン脂質として
陰性荷電を有するものを用いる方法が提案されている
（特開平４−２０４２５７号および特表平４−５０６４
１５号の各公報参照）。また、上記の抗ＣＬ・β２ＧＰ
１キット「ヤマサ」ＥＩＡは、(2) の説を基に試薬設計
および臨床評価が行われたものであり、該抗体の定量が
臨床上有効であるとされている。

【００１１】しかし、１９９１年には小池らにより、放
射線を照射したプラスチックプレートに単独でβ２−Ｇ
Ｐ−１を直接吸着させた(1) の場合にもβ２−ＧＰ−１
とカルジオライピンの複合体を抗原として用いた場合と
同等の試験成績が得られることが報告された。

【００１２】上記(1) 説および(2) 説に基づいた、臨床
上有用とされるキットは、いずれもプラスチックプレー
トを用いたＥＩＡ法によるものであり、測定の全工程に
長時間を要し、自動化が困難なものであった。また、製
造工程に放射線照射を含むなど、特別な装置が必要であ
った。

【００１３】また、β２−ＧＰ−１は陰性に荷電したリ
ン脂質と結合性を有することが知られており、(2) の原
理を利用したラテックス試薬などの凝集反応を利用した
試薬化は不可能であるとされていた。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の点に鑑み、測定時間を短縮できかつ自動化を達成でき
る抗リン脂質抗体測定用免疫診断薬およびその製造方法
を提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、β２−ＧＰ
−１の特性を調べ、自動化・測定の迅速化が可能な試薬
形態について鋭意研究した結果、陰性荷電を有する不溶
性担体に、β２−ＧＰ−１を直接物理吸着させ、そのの
ち不溶性担体の陰性荷電量を増加させることによりβ２
−ＧＰ−１の抗原活性が獲得できることを見い出した。

【００１６】すなわち、本発明による抗リン脂質抗体測
定用免疫診断薬は、陰性に荷電した不溶性担体にβ２−
グリコプロテイン−１またはその同族体もしくは類縁体
を吸着させてなるものである。

【００１７】本発明に使用する担体としては、不溶性の
担体物質（固相）が望ましい。このような担体物質の材
質としては、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン
−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン
酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリア
クリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレ
ン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子
化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、
アガロースゲル（セルファロース、バイオゲルなど）、
セルロース（ペーパーディスク、ろ紙など）の多糖類、
ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合
物などが挙げられる。

【００１８】不溶性担体に陰性荷電を付与する方法とし
て、カルボキシル基、水酸基、スルホン基などの官能基
を化学的に導入する方法、およびコンドロイチン硫酸
や、硫酸デキストランなどのポリアニオンの水溶液で担
体の表面を処理する方法などが挙げられるが、本発明は
これに限定されるものではない。

【００１９】不溶性の担体物質の形状としては、平板状
（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状
（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、
微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状などが例
示される。特に好適な担体は、自動分析装置に適用が可
能なラテックス粒子である。

【００２０】また、このような担体は、β２−ＧＰ−１
を吸着させる前もしくはその後に、必要に応じてTween
２０などの界面活性剤および／または精製血清アルブミ
ンなどで処理されたものであってもよい。

【００２１】陰性に荷電した不溶性担体にβ２−ＧＰ−
１を担持させるには、物理吸着法、イオン結合法、共有
結合法、包括法などの方法（たとえば、『固定化酵
素』、千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談
社発行、参照）を採用することができる。とりわけ、物
理吸着法は簡便である点で望ましい。

【００２２】本発明に用いるβ２−ＧＰ−１は、任意の
哺乳類に由来するものでよい。実質的に純粋なものが望
ましい。β２−ＧＰ−１は、血清または血漿から既知の
方法で、たとえば、リン脂質クロマトグラフィーにより
精製できる。また、組み換えＤＮＡ技術またはペプチド
合成で製造されたβ２−ＧＰ−１または抗原活性を示す
ペプチドも使用できる。

【００２３】本発明において、使用する緩衝液は通常の
生理化学的実験に用いるものでよい。その成分としては
リン酸など、既知のものが利用できる。また、緩衝液の
ｐＨおよびイオン強度は通常の生理化学的な条件であ
る。また、非特異反応を抑制する物質や、抗原抗体反応
を促進する物質についても既知の物質が併用できる。

【００２４】また、本発明により製造したラテックス試
薬などの液状試薬は、そのままで長時間安定に保存しう
るが、凍結乾燥状態で保存することもできる。後者の場
合、凍結乾燥時の安定剤として使用されている一般的な
薬剤との併用も可能である。

【００２５】抗リン脂質抗体のβ２−ＧＰ−１への結合
は当該技術分野でよく知られた任意の適当な方法で測定
できる。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）、免疫蛍光法、化学ルミネッセンス法および
比濁法などを使用できるが、測定方法はこれらに限定さ
れるものではない。特に好適な測定方法は、自動分析が
可能なラテックス試薬を用いた比濁法である。これは抗
原抗体反応に基づいた粒子の凝集度合を光学的に測定
し、該抗体を定量するものであるが、目的（高感度タイ
プの試薬による精密測定、あるいはマニュアルタイプに
よるスクリーニング用）などにより、ラテックス粒子の
大きさ、判定方法などは任意に選択できる。

【００２６】本発明による抗リン脂質抗体測定用免疫診
断薬を含む好ましいキットの形態としては、例えば、β
２−ＧＰ−１を担持した浮遊性微粒子、標準血清などを
構成成分として含むものが挙げられる。このようなキッ
トに用いられる上記の構成成分は、前述した通りであ
る。これらの構成成分に加えて、必要に応じて、担体に
結合した抗体を測定するための標準抗イムノグロブリン
抗体、標識物質を測定するための試薬などを更に添加す
ることができる。また、各反応などに用いる適当な緩衝
液を加えることもできる。

【００２７】

【作用】本発明によれば、陰性荷電を有する不溶性担体
に、同担体の荷電量が小さい条件下で、β２−ＧＰ−１
を物理吸着させ、そののち保存条件および／または反応
条件を荷電量が大きくなる条件に調節することによりβ
２−ＧＰ−１に靜電的作用をもたらし、その結果抗原活
性を変化させることにより、抗リン脂質抗体症候群患者
に特異的に出現する抗リン脂質抗体を測定する試薬を製
造することができる。

【００２８】

【実施例】以下に実施例により本発明の試薬の製造方法
およびキットをさらに詳細に説明する。

【００２９】実施例１ ラテックス凝集法による抗リン脂質抗体測定用診断薬
（全自動分析装置を用いた測定）

【００３０】(1) 試薬および血清 (a) １０％（Ｗ／Ｖ）カルボキシルタイプラテックス液 カルボキシル基を有するラテックス（積水化学社製、固
型分１０％（Ｗ／Ｖ）、平均粒径０．３３０μｍ）５ｍ
ｌを、透析チューブを用いて１リットルの５０ｍＭ酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で３回、計８時
間透析し、緩衝液置換を行った。こうして透析したラテ
ックス液をそのまま用いた。

【００３１】(b) 抗原液 β２−ＧＰ−１水溶液（生化学工業より購入・正常ヒト
血清由来、４．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液）０．
１ｍｌをそのまま用いた。

【００３２】(c) ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ （１２水和物）および１０
０ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰＯ ₄ （２水和物）を混合してｐＨを
７．４０に調整したリン酸緩衝液（以下１００ｍＭリン
酸緩衝液と略す）に、ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｅｓ
社製、FractionＶ、試薬特級、以下ＢＳＡと略す）を１
％（Ｗ／Ｖ）、アジ化ナトリウム（ナカライテスク社
製、試薬特級）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるようにそれ
ぞれ溶解したものをブロッキング用緩衝液とした。

【００３３】(d) ラテックス保存用緩衝液 １００ｍＭリン酸緩衝液にＢＳＡを０．２５％（Ｗ／
Ｖ）、アジ化ナトリウム（ナカライテスク社製、試薬特
級）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるようにそれぞれ溶解し
たものをラテックス保存用緩衝液とした。

【００３４】(e) 検体希釈用緩衝液 １００ｍＭリン酸緩衝液にグルコシルエチルメタクリレ
ートのホモポリマー（日本精化社製）、平均分子量２７
万、Clucosylethylmethacryrate ：以下ｐＧＥＭＡと略
す）を１％（Ｗ／Ｖ）、ＢＳＡを０．２５％（Ｗ／
Ｖ）、アジ化ナトリウムを０．１％（Ｗ／Ｖ）になるよ
うにそれぞれ溶解したものを検体希釈用緩衝液とした。

【００３５】(f) 抗リン脂質抗体測定用キット 抗ＣＬ・β２ＧＰ−１キット「ヤマサ」ＥＩＡ（ヤマサ
醤油社製、以下ヤマサキットと略す）を用いた。使用方
法は、キット添付の取扱い説明書に準じて行った。

【００３６】(g) 抗リン脂質抗体陰性血清 正常人より採取された血清で、ヤマサキットにより陰性
と判定された１０検体を用いた。

【００３７】(h) 抗リン脂質抗体陽性血清 抗リン脂質抗体症候群といわれる患者群より得られた陽
性血清１０検体を用いた。

【００３８】(i) 抗リン脂質抗体標準血清 ヤマサキット添付の標準血清７濃度（0, 1.3, 3.2, 8.
0, 20, 50, 125unit ／ml）をそのまま用いた。

【００３９】(j) 梅毒陽性血清 梅毒と診断された患者血清のうち、ＲＰＲ法（ＲＰＲカ
ードテスト法、化血研社製）、ＴＰＨＡ法（セロディア
−ＴＰ、富士レビオ社製）の両方で陽性と判定されたも
の１０検体を用いた。

【００４０】(2) 試薬の調製 １０％（Ｗ／Ｖ）カルボキシルタイプラテックス液０．
１ｍｌをポリカーボネートチューブ中で攪拌させなが
ら、抗原液０．１ｍｌを一気に添加した。引き続き室温
で１時間攪拌したのち、ブロッキング用緩衝液０．２ｍ
ｌを一気に添加し、１．５時間、室温で攪拌した。次
に、高速冷却遠心機（日立ＨＲ２６型）で、１９０００
×ｇ、１０℃で３０分遠心洗浄を行った。得られたラテ
ックスの沈渣にラテックス保存用緩衝液５．０ｍｌを添
加し、よく攪拌したのち、高速冷却遠心機で、１９００
０×ｇ、１０℃で３０分遠心洗浄を行った。この洗浄操
作を３回繰り返した。

【００４１】最終的に得られた沈渣にラテックス保存用
緩衝液２．０ｍｌを添加し、よく攪拌し、超音波破砕機
（アストラソン社製、マイクロチップ、出力目盛３、５
０％サイクル）にて氷浴中、１分間ソニケートし、分散
させた。こののち、さらにラテックス保存用緩衝液６．
０ｍｌを添加し、十分混合させた。こうして、固型分
０．１２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス懸濁液を調製し、
４℃にて保存した。

【００４２】(3) 検体の調製 (1) で得られた陽性血清１０検体をそのまま用いた。

【００４３】(4)自動分析装置による検体の測定 以下に、全自動生化学分析装置日立７１５０形（日立製
作所社製）により、検体中の抗リン脂質検体を測定する
方法を示す。

【００４４】 測定モード；Original Abs パラメータ；検体量 ２０μｌ ラテックス試薬量 ５０μｌ 検体希釈用緩衝液量 ３５０μｌ 測定波長；５７０ｎｍ 測定時間；検体分注後、ただちに検体希釈用緩衝液量が
添加、混合され、そののち、ラテックス試薬が添加、混
合された。ラテックス試薬の添加後８０秒後から３２０
秒後の吸光度の変化量を求め、これを反応量とした。

【００４５】検量線；ヤマサキット添付の標準血清７濃
度（0, 1.3, 3.2, 8.0, 20, 50, 125unit ／ml）の検体
の反応量を縦軸に、標準血清の濃度を横軸にプロットし
たものを検量線として用いた。

【００４６】検体；(3) で調製した各血清２０検体をそ
れぞれｎ＝２で測定した。得られた反応量を上記の検量
線に外挿し、抗体価を算出した。

【００４７】実施例２ 上記ラテックス試薬を用いて実施例１と同様に(1)(g)の
陰性血清１０検体を測定した。実施例３ 上記ラテックス試薬を用いて実施例１と同様に(1)(j)の
梅毒陽性血清１０検体を測定した。

【００４８】比較例１〜３ 「ヤマサ」ＥＩＡキットにより実施例１〜３に用いたの
と同一の検体を測定した。

【００４９】結果 実施例１〜３および比較例１〜３で得られた、検体の抗
リン脂質抗体抗体価を図１にまとめて示す。

【００５０】図１から明らかなように、本発明のラテッ
クス試薬では、抗リン脂質抗体陽性血清については、ヤ
マサキットと同様の反応性が得られ、偽陰性は見られな
かった。また、抗リン脂質抗体陰性血清１０検体および
梅毒陽性血清１０検体はいずれも３unit／ml以下を示
し、偽陽性は見られなかった。

【００５１】

【発明の効果】以上に詳述したように、本発明により自
動化・測定の迅速化が可能な抗リン脂質抗体測定用免疫
診断薬およびその製造方法を提供することができる。こ
の診断薬を用いて、体内の抗リン脂質抗体を測定ないし
は検出することにより、血栓症、習慣流産およびその他
の臨床的に重要な症候群の診断を迅速かつ簡便に行うこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１〜３および比較例１〜３で得られ
た、検体の抗リン脂質抗体抗体価を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 陰性に荷電した不溶性担体にβ２−グリ
   コプロテイン−１またはその同族体もしくは類縁体を吸
   着させてなる、抗リン脂質抗体測定用免疫診断薬。
2. 【請求項２】 陰性に荷電した官能基を有する不溶性担
   体、もしくはポリアニオンの水溶液で処理することによ
   り陰性荷電を付与した不溶性担体に、β２−グリコプロ
   テイン−１またはその同族体もしくは類縁体を吸着させ
   る、抗リン脂質抗体測定用免疫診断薬の製造方法。