JPH0720128A - 生体試料中微量成分の測定方法 - Google Patents

生体試料中微量成分の測定方法

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JPH0720128A
JPH0720128A JP16668693A JP16668693A JPH0720128A JP H0720128 A JPH0720128 A JP H0720128A JP 16668693 A JP16668693 A JP 16668693A JP 16668693 A JP16668693 A JP 16668693A JP H0720128 A JPH0720128 A JP H0720128A
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JP
Japan
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heparin
fibrin
anticoagulant
trace component
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JP16668693A
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English (en)
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Hisao Tsukamoto
久雄 塚本
Satoshi Kamata
智 鎌田
Minoru Honma
穂 本間
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Tosoh Corp
Original Assignee
Tosoh Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 血液等の生体試料中の微量成分を測定するた
めの、例えば臨床検査の領域において用いられる免疫測
定法等において、フィブリノ−ゲンの妨害作用を阻止す
るための方法を提供する。 【構成】 フィブリノ−ゲンを含む生体試料中の微量成
分を、抗凝固作用を有する物質を共存させてフィブリン
の析出を阻止した状態で測定することを特徴とする、フ
ィブリノ−ゲンを含む生体試料中微量成分の測定方法に
より前記目的を達成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血液等の生体試料中の
微量成分を測定するための、例えば臨床検査の領域にお
いて用いられる免疫測定法等において、フィブリノ−ゲ
ンの妨害作用を阻止するための方法に関する。
【0002】
【従来の技術】生体試料中の微量成分を測定する方法に
は、種々の方法があるが、その一例として免疫測定法が
ある。免疫測定法も幾つかの方法に分類されるが、例え
ばサンドイッチ法では固定化抗体及び標識抗体を含む試
薬中に、血清、血漿、又は胸水などの生体試料を分注
し、抗原抗体反応によって、固定化抗体−生体試料中の
抗原性微量成分(抗原)−標識抗体、との複合体(免疫
複合体)が形成される。ここでB/F分離によって免疫
複合体を形成しなかった標識抗体及びその他の生体試料
中の成分を除去した後、標識物質を検出し、予め作成し
ておいた検量線から抗原の濃度を求める。
【0003】このような免疫測定法においては、抗原抗
体反応を迅速に、再現良く行うことが重要であり、種々
の工夫がなされている。例えば抗体を結合する担体に
は、磁性微粒子、ビーズ及びチューブなどがあり、これ
らの担体を振動させることにより反応液を撹拌し、反応
効率を上げるなどの方法も行われている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】生体試料中にフィブリ
ノーゲンが存在する場合には、測定中にフィブリンが析
出し、反応液の撹拌やB/F分離が正常に行われない場
合がある。フィブリノーゲンを含有する生体試料として
は例えば、血漿や血液凝固が不十分な状態で分離された
血清などがある。
【0005】血漿では十分量の抗凝固剤の添加により、
フィブリノーゲンを多く含んでいるにもかかわらず、フ
ィブリンの析出が阻止されている。抗凝固剤の例として
はEDTA、ヘパリン又はクエン酸塩等が使用されてい
るが、このうちEDTAを抗凝固剤として用いた血漿で
は、免疫測定等の際、反応試薬中にCaイオンやMgイ
オン等の2価の金属イオンが過剰に存在するとフィブリ
ンが析出することがある。これはEDTAがフィブリン
形成に必要なCaイオンとキレートを形成し、Caイオ
ンを実質的に除去することによって抗凝固作用を発揮す
るため、過剰の2価の金属イオンが存在する場合にはE
DTAが飽和されるためと考えられる。本来、血清中に
はフィブリノーゲンは存在しないから、フィブリンが析
出することはないはずであるが、実際の検査では、血清
として取り扱われている試料の中に、希にフィブリノー
ゲンを含む試料が混在している場合がある。例えば透析
患者では血液中のヘパリン濃度が健常人よりも高く、血
液凝固に長時間を要することが知られている。また、負
荷試験などで連続的な採血を必要とする場合に、留置針
を使用することがあり、この時、血液の凝固を阻止する
ためにヘパリン溶液などの抗凝固剤が充填される。そし
て、採血時には抗凝固剤の混入を避けるために血液の一
部を除去するなどの操作が行われる。しかし、抗凝固剤
が微量に混入することで、採血後の血液凝固が不十分と
なる場合がある。このような血液凝固が不十分な検体を
通常の操作で血清分離した場合、フィブリノーゲンが試
料中に残り、分離後にフィブリンとして析出してくるこ
とがある。
【0006】このように、抗凝固剤の作用が阻害される
条件での測定や、血液凝固が不十分な状態で血清分離さ
れた試料の測定では、試料中のフィブリノーゲンが測定
中にフィブリンとして析出する場合があり、例えば
(1)析出したフィブリンが担体の振動を妨害するなど
によって反応溶液の撹拌が妨害され、抗原抗体反応が十
分に行われず、信頼性のある測定値が得られない、
(2)B/F分離の際、洗浄液を吸引するノズルにフィ
ブリンが詰まり、B/F分離が正常に行われず、信頼性
のある測定値が得られない、また、(3)自動化装置を
使用している場合は洗浄液を吸引するノズルにフィブリ
ンが詰まることによって、洗浄液を十分に吸引すること
ができず、装置内に溢れ出してしまうなどの重大なトラ
ブルを引き起こし、検査業務に著しい支障をきたす、等
の改善すべき課題がある。
【0007】このような課題の回避方法として、血液凝
固が不十分な状態で血清分離された試料の測定では、事
前にそのような試料を抜き取り、血液凝固促進剤などを
添加して完全に凝固させて遠心分離するなどの再処理を
行ってから測定する方法が考えられている。しかしこの
ような試料は事前の判別が難しく、試料の抜き取りを完
全に行うことは不可能である。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、フィブリ
ノ−ゲンを含む生体試料中の微量成分をフィブリンを析
出させることなく測定する方法について鋭意検討した結
果、本発明を完成するに至った。
【0009】即ち本発明は、フィブリノ−ゲンを含む生
体試料中の微量成分を、抗凝固作用を有する物質を共存
させてフィブリンの析出を阻止した状態で測定すること
を特徴とする、フィブリノ−ゲンを含む生体試料中微量
成分の測定方法である。更に本発明は、フィブリノ−ゲ
ンを含む生体試料中の免疫原性物質を、アルカリ性フォ
スファタ−ゼで標識された該物質に対する抗体又はアル
カリ性フォスファタ−ゼで標識された該物質を用い、ヘ
パリンを共存させてフィブリンの析出を阻止した状態で
測定することを特徴とする、生体試料中前記抗原性微量
成分の測定方法である。以下本発明を詳細に説明する。
【0010】抗凝固作用を有する物質としては、例えば
ヘパリン、EDTA又はクエン酸塩などの抗凝固剤や、
アンチトロンビンIII及びα2 マクログロブリンなど
の凝固阻止作用をもつ物質が例示できる。これらのう
ち、抗凝固剤については安価であり、しかも容易に入手
できるという利点がある。抗凝固剤のうちEDTAは、
血液凝固が不十分な状態で血清分離された試料の測定で
は有効であるが、反応試薬中に2価の金属イオン(Ca
イオンやMgイオン等)が過剰に存在するような測定系
では効果は少なく、また、アルカリ性ホスファターゼ等
の酵素を標識酵素とする免疫測定法の場合、EDTAや
クエン酸塩はアルカリ性ホスファターゼを阻害する。以
上の観点から、本発明の抗凝固剤としてはヘパリンが最
も好ましい。ヘパリンには特に酵素阻害作用はなく、E
DTAのようにイオンを介して凝固調節作用を達成する
のでもないため、測定系に2価の金属イオンが存在して
も抗凝固作用が低下することはない。なおヘパリンとし
ては、具体的にヘパリン、ヘパリンNa、ヘパリンK等
が使用できるが、本明細書では特に記載しない限りこれ
らを総称してヘパリンと記載する。
【0011】反応に関する試薬中に抗凝固作用を有する
物質を添加する方法として、ヘテロジニアスなサンドイ
ッチ法による免疫測定を例に説明すれば、測定対象抗原
性物質毎に専用の試薬(例えば固相化抗体溶液、標識抗
体溶液、もしくはそれらの凍結乾燥品等)中に予め添加
しておく方法や、全測定対象抗原性物質に共通に使用さ
れる補助試薬(例えば生体試料と共に試薬に分注する溶
液等)に予め添加しておく方法がある。抗凝固作用を有
する物質を添加しておく溶液は、測定操作において、生
体試料分注後、フィブリンの析出をできるだけ早く抑制
するため生体試料が試薬(固相化抗体溶液、標識抗体溶
液など)に分注される以前、または同時もしくは直後に
分注されることが好ましい。
【0012】抗凝固作用を有する物質の添加濃度は、反
応時において抗凝固効果を示す濃度以上であれば良い。
ヘパリンNaの場合、反応時の濃度として1〜40U/
ml、好ましくは2〜15U/mlが良い。
【0013】本発明は、フィブリンの析出が測定結果に
影響を与える測定方法全てに有効であるが、中でも反応
時の攪拌やB/F分離の良否が測定に極めて重要な影響
を与えるヘテロジニアス系の免疫測定方法、即ちアルカ
リ性ホスファタ−ゼ等の酵素で標識された抗体等を使用
するサンドイッチ法や同酵素で標識された対象抗原性物
質を使用する競合法など種々の免疫測定法に特に有効で
ある。なお、前記競合法においてアルカリ性ホスファタ
−ゼ標識を担持するものは、対象抗原性物質以外に、該
物質と同一の免疫的活性を有する抗原決定基を少なくと
も一つ有する該物質類似物であれば良い。
【0014】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【0015】実施例1 以下の試薬を使用してヘテロジニアスサンドイッチ免疫
測定を行った。 (1)補助試薬(共通試薬) 分注水(ヘパリンNa添加 0〜40U/ml) 洗浄水(界面活性剤を含む) 基質液(4−メチルウンベリフェリルりん酸) (2)専用試薬(LH(黄体ホルモン)測定用) 免疫反応試薬:固相(抗LH抗体固定化磁性ビーズ) アルカリ性フォスファタ−ゼで標識した抗LH抗体 (3)生体試料 試料1 低濃度サンプル(フィブリノ−ゲンを含む血清
試料) 試料2 高濃度サンプル(フィブリノ−ゲンを含む血清
試料) なお、上記試薬中の試料1及び2は、連続採血によって
採取した血液由来のものであり、微量のヘパリンの混入
により血液凝固が不十分な状態で血清として分離したた
めにフィブリノ−ゲンを含有している。
【0016】補助試薬の分注水として、ヘパリンNa濃
度を変えた7種類の分注水を用い、試料1、2について
以下の手順に従ってそれぞれ10回測定を行った。 1 反応容器に、分注水75μlと試料1又は試料2の
75μlを同時に分注する。なお、反応容器には、専用
試薬が凍結乾燥された状態で封入されている。 2 37℃で40分間インキュベートする。インキュベ
ート中は磁性ビーズを磁石によって振動させ反応液を撹
拌する。 3 反応容器内で洗浄水(600μl)の吸引/吐出を
11回繰り返し、未反応の標識された抗体を除去する
(B/F分離)。 4 洗浄水を吸引後、基質液を220μl分注する。 5 酵素反応によって生成する4−メチルウンベリフェ
ロンの蛍光強度を100秒間測定し、4−メチルウンベ
リフェロンの生成速度を求める。
【0017】6 予め作成しておいた検量線から試料中
のLH濃度を求める。
【0018】試料1についての測定結果を表1に、試料
2についての測定結果を表2にそれぞれ示す。
【0019】
【表1】
【0020】
【表2】
【0021】表1及び表2から、ヘパリンNa濃度が1
〜40U/mlの範囲では良好な再現性が得られたが、
ヘパリンNa無添加の分注水を使用した場合は変動係数
(CV%)が大きいことが分かる。
【0022】
【発明の効果】生体試料中の微量成分を測定する際、フ
ィブリンの析出を阻止するため、抗凝固作用を有する物
質の共存下で該測定を行うことにより、信頼性のある測
定値が得られると同時に、検査業務の著しい障害となる
自動化装置のトラブルを防止することができる。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 フィブリノ−ゲンを含む生体試料中の微
    量成分を、抗凝固作用を有する物質を共存させてフィブ
    リンの析出を阻止した状態で測定することを特徴とす
    る、フィブリノ−ゲンを含む生体試料中微量成分の測定
    方法。
  2. 【請求項2】 抗凝固作用を有する物質がヘパリンであ
    る、請求項1の生体試料中微量成分の測定方法。
  3. 【請求項3】 フィブリノ−ゲンを含む生体試料中の免
    疫原性物質を、アルカリ性フォスファタ−ゼで標識され
    た該物質に対する抗体又はアルカリ性フォスファタ−ゼ
    で標識された該物質を用い、ヘパリンを共存させてフィ
    ブリンの析出を阻止した状態で測定することを特徴とす
    る、生体試料中前記抗原性微量成分の測定方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004046723A1 (ja) * 2002-11-18 2004-06-03 Denka Seiken Co., Ltd. 血清および血漿の測定値乖離を防止する免疫測定法
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JP4762153B2 (ja) * 2003-12-08 2011-08-31 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ホスファターゼ阻害剤試料収集システム
JP2015530560A (ja) * 2012-06-15 2015-10-15 エルビズ,エクレム Elisa法におけるゲルを含むedtaチューブ及び該チューブを使用する分析器

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