JPH0718882B2 - ペプチドの逐次配列認定用試薬及び方法 - Google Patents
ペプチドの逐次配列認定用試薬及び方法Info
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- JPH0718882B2 JPH0718882B2 JP61227905A JP22790586A JPH0718882B2 JP H0718882 B2 JPH0718882 B2 JP H0718882B2 JP 61227905 A JP61227905 A JP 61227905A JP 22790586 A JP22790586 A JP 22790586A JP H0718882 B2 JPH0718882 B2 JP H0718882B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、個々のアミノ酸の同定のため、ペプチドのカ
ルボキシル基末端部で段階を追つてアミノ酸を分離する
ためのペプチドの逐次配列認定方法に関する。本発明は
上記の逐次配列認定するのに使用される物質にも関す
る。
ルボキシル基末端部で段階を追つてアミノ酸を分離する
ためのペプチドの逐次配列認定方法に関する。本発明は
上記の逐次配列認定するのに使用される物質にも関す
る。
ペプチドを形成しているアミノ酸の誘導体を逐次分離
し、同定することによつて、ペプチドを順に配列認定す
ることがしばしば望ましい。例えば、ペプチド類を順に
合成することができるように、ペプチド類中のアミノ酸
が配列されている順序の確認のための研究に、このよう
な逐次配列認定することは望ましい。このような知識
は、適切な精査の計画を可能にし、組換DNA技術を使用
して順にペプチドの生成を可能にする遺伝子配列を得る
こともできる。したがつて、このような逐次配列認定
は、病気と閾う物質の開発をもたらすことができる。
し、同定することによつて、ペプチドを順に配列認定す
ることがしばしば望ましい。例えば、ペプチド類を順に
合成することができるように、ペプチド類中のアミノ酸
が配列されている順序の確認のための研究に、このよう
な逐次配列認定することは望ましい。このような知識
は、適切な精査の計画を可能にし、組換DNA技術を使用
して順にペプチドの生成を可能にする遺伝子配列を得る
こともできる。したがつて、このような逐次配列認定
は、病気と閾う物質の開発をもたらすことができる。
今、ペプチド類のカルボキシル基末端部とＮ−末端部か
らアミノ酸を逐次配列認定するためのいくつかの方法が
用いられている。Ｎ−末端部から逐次配列認定する方法
は、操作の容易性、信頼性、逐次配列速度、感度及び逐
次配列認定測定の範囲において比較的簡潔である。逆
に、ペプチド類のカルボキシル基末端部からアミノ酸を
逐次配列認定する現在のいくつかの方法はほとんど進展
していない。例えば、配列中の各アミノ酸の全てはペプ
チドから開裂されない。その結果、連続アミノ酸の開裂
に利用できるペプチドの量は、次第に減少する。ペプチ
ド配列認定における連続アミノ酸の同定は、したがつ
て、ますます難しくなる。これはペプチド中で逐次配列
認定されそして正確に同定されることのできるアミノ酸
の数を制限する。
らアミノ酸を逐次配列認定するためのいくつかの方法が
用いられている。Ｎ−末端部から逐次配列認定する方法
は、操作の容易性、信頼性、逐次配列速度、感度及び逐
次配列認定測定の範囲において比較的簡潔である。逆
に、ペプチド類のカルボキシル基末端部からアミノ酸を
逐次配列認定する現在のいくつかの方法はほとんど進展
していない。例えば、配列中の各アミノ酸の全てはペプ
チドから開裂されない。その結果、連続アミノ酸の開裂
に利用できるペプチドの量は、次第に減少する。ペプチ
ド配列認定における連続アミノ酸の同定は、したがつ
て、ますます難しくなる。これはペプチド中で逐次配列
認定されそして正確に同定されることのできるアミノ酸
の数を制限する。
ペプチド類のカルボキシル基末端部からアミノ酸を逐次
配列認定する現在の方法に、その他の重大な欠点があ
る。例えば、イオン性のチオシアネートは、ペプチド類
をペプチジルチオヒダントイン等の中間体に変換するの
に一般に使用され、この中間体は、アミノ酸を開裂する
ために処理されうる。このようなチオシアネート反応物
は、室温で自己反応しがちであり、急速にペプチドに作
用する能力を失う。更に、チオシアネートがペプチドに
作用できる時でも、反応温度を約90℃のような比較的高
温にしなければならず、反応時間も比較的長時間にしな
ければならない。
配列認定する現在の方法に、その他の重大な欠点があ
る。例えば、イオン性のチオシアネートは、ペプチド類
をペプチジルチオヒダントイン等の中間体に変換するの
に一般に使用され、この中間体は、アミノ酸を開裂する
ために処理されうる。このようなチオシアネート反応物
は、室温で自己反応しがちであり、急速にペプチドに作
用する能力を失う。更に、チオシアネートがペプチドに
作用できる時でも、反応温度を約90℃のような比較的高
温にしなければならず、反応時間も比較的長時間にしな
ければならない。
ペプチド類のカルボキシル基末端部からアミノ酸を逐次
配列認定することの問題点が、相当長い間知られてい
る。上記の問題点を克服するための方法及び化学物質を
開発するためにかなりの努力がなされてきた。このよう
な努力にもかかわらず、これらの問題点は今だに残つて
いる。
配列認定することの問題点が、相当長い間知られてい
る。上記の問題点を克服するための方法及び化学物質を
開発するためにかなりの努力がなされてきた。このよう
な努力にもかかわらず、これらの問題点は今だに残つて
いる。
本発明は、上記で特定された問題点を克服するための方
法及び化学物質を提供する。ペプチジルチオヒダントイ
ン誘導体を生成するために、本発明では室温で安定な化
学物質を使用する。したがつて、この化学物質は有効性
を失わないで比較的長期間貯蔵されうる。該化学物質
は、ペプチドをペプチジルチオヒダントイン誘導体へ実
質的に完全に変換する各段階で有効であり、したがつ
て、ペプチドの各カルボキシル基の部位で、アミノ酸の
チオヒダントイン誘導体の実質的に完全な開裂をもたら
す。これは各々のチオヒダントイン誘導体中のアミノ酸
の同定を容易にし、感度良く且つ信頼性が高く順次同定
されることのできるペプチド中のアミノ酸の数をも増加
させる。本発明はペプチジルチオヒダントイン誘導体を
生成させるための反応温度及び反応時間を減少させるの
にも有効であり、したがつて、目的の情報を得るのに必
要な実験時間を減少させる。
法及び化学物質を提供する。ペプチジルチオヒダントイ
ン誘導体を生成するために、本発明では室温で安定な化
学物質を使用する。したがつて、この化学物質は有効性
を失わないで比較的長期間貯蔵されうる。該化学物質
は、ペプチドをペプチジルチオヒダントイン誘導体へ実
質的に完全に変換する各段階で有効であり、したがつ
て、ペプチドの各カルボキシル基の部位で、アミノ酸の
チオヒダントイン誘導体の実質的に完全な開裂をもたら
す。これは各々のチオヒダントイン誘導体中のアミノ酸
の同定を容易にし、感度良く且つ信頼性が高く順次同定
されることのできるペプチド中のアミノ酸の数をも増加
させる。本発明はペプチジルチオヒダントイン誘導体を
生成させるための反応温度及び反応時間を減少させるの
にも有効であり、したがつて、目的の情報を得るのに必
要な実験時間を減少させる。
本発明を構成する方法では、ペプチド類に化学式Ｒ
（ｘ）Si（NCS）ｙ（式中ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４であ
りＲはアルキル置換基又はアリール置換基で構成され
る。）を有するイソチオシアネートを作用させることに
よつて、カルボキシル基末端部においてペプチド類を逐
次配列認定する。ペプチドへのイソチオシアネートの作
用は、約50℃〜90℃で約60分もしくはそれ未満で好適に
起こる。
（ｘ）Si（NCS）ｙ（式中ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４であ
りＲはアルキル置換基又はアリール置換基で構成され
る。）を有するイソチオシアネートを作用させることに
よつて、カルボキシル基末端部においてペプチド類を逐
次配列認定する。ペプチドへのイソチオシアネートの作
用は、約50℃〜90℃で約60分もしくはそれ未満で好適に
起こる。
弱酸の無水物、好ましくはカルボン酸無水物又は弱酸の
塩化物、好ましくはカルボン酸クロリドを、イソチオシ
アネートと混合してもよい。触媒には有機塩基があり、
ピリジン等の芳香族アミン類を包含する第３級アミン類
からなる群から選択できる。ここで、チオヒダントイン
置換基が、ペプチドのカルボキシル基末端部でアミノ酸
から生成される。次いで過剰の試薬を適切な溶剤で抽出
することによつて除去する。ペプチドが固体担体への固
着により、例えばポリブレン（Polybrene:商品名）のよ
うなマトリツクスないし保持物質内への閉じ込めによ
り、最初に固定化された場合には、この除去は促進され
る。
塩化物、好ましくはカルボン酸クロリドを、イソチオシ
アネートと混合してもよい。触媒には有機塩基があり、
ピリジン等の芳香族アミン類を包含する第３級アミン類
からなる群から選択できる。ここで、チオヒダントイン
置換基が、ペプチドのカルボキシル基末端部でアミノ酸
から生成される。次いで過剰の試薬を適切な溶剤で抽出
することによつて除去する。ペプチドが固体担体への固
着により、例えばポリブレン（Polybrene:商品名）のよ
うなマトリツクスないし保持物質内への閉じ込めによ
り、最初に固定化された場合には、この除去は促進され
る。
次いで、ペプチジルチオヒダントイン誘導体を開裂し、
当初のペプチドのカルボキシル基末端部で、アミノ酸の
チオヒダントイン誘導体及びペプチジル残基を別々に与
える。上記で特定した方法を、次々に繰返してペプチジ
ル残基の新たなカルボキシル基末端部でアミノ酸のペプ
チジルチオヒダントイン誘導体を得てもよく、そしてこ
のペプチジルチオヒダントイン誘導体を開裂し、同定の
ために逐次配列した次のアミノ酸を分離してもよい。ペ
プチドのカルボキシル基末端部から逐次分離されたアミ
ノ酸を個々に同定できる。
当初のペプチドのカルボキシル基末端部で、アミノ酸の
チオヒダントイン誘導体及びペプチジル残基を別々に与
える。上記で特定した方法を、次々に繰返してペプチジ
ル残基の新たなカルボキシル基末端部でアミノ酸のペプ
チジルチオヒダントイン誘導体を得てもよく、そしてこ
のペプチジルチオヒダントイン誘導体を開裂し、同定の
ために逐次配列した次のアミノ酸を分離してもよい。ペ
プチドのカルボキシル基末端部から逐次分離されたアミ
ノ酸を個々に同定できる。
式１は、触媒の存在下で、本発明を構成する方法の１工
程における、無水酢酸中でのペプチドとイソチオシアネ
ートとの反応によるペプチジルチオヒダントインの形成
を例示する。
程における、無水酢酸中でのペプチドとイソチオシアネ
ートとの反応によるペプチジルチオヒダントインの形成
を例示する。
式２は、本発明を構成する方法のもう一つの工程におい
て、例えば塩酸によつて、ペプチジルチオヒダントイン
誘導体を開裂し、ペプチジル残基と最初のペプチドのカ
ルボキシル基末端部におけるアミノ酸チオヒダントイン
誘導体とを得ることを図示する。
て、例えば塩酸によつて、ペプチジルチオヒダントイン
誘導体を開裂し、ペプチジル残基と最初のペプチドのカ
ルボキシル基末端部におけるアミノ酸チオヒダントイン
誘導体とを得ることを図示する。
本発明の１実施態様で、ペプチドは、そのカルボキシル
基末端部位で逐次配列認定され、ペプチドのアミノ酸を
分離する結果、アミノ酸は個々に同定されうる。ペプチ
ド類は相当大分子になりうる。例えば、50個のアミノ酸
程度もしくはそれ以上をもつペプチドが逐次配列認定さ
れ、アミノ酸を順次同定する。
基末端部位で逐次配列認定され、ペプチドのアミノ酸を
分離する結果、アミノ酸は個々に同定されうる。ペプチ
ド類は相当大分子になりうる。例えば、50個のアミノ酸
程度もしくはそれ以上をもつペプチドが逐次配列認定さ
れ、アミノ酸を順次同定する。
ペプチド類はイソチオシアネートで処理される。好まし
くは、イソチオシアネートは、トリメチルシリルイソチ
オシアネート（TMS−NCS）である。イソチオシアネート
をRxSi（NCS）ｙ（式中、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４であ
り、Ｒはアルキル基、アリール基、置換アルキル基、置
換アリール基、或はこれらの組合せである。）として定
義できる。トリメチルシリルイソチオシアネートは室温
で安定であるので有利である。その結果、ほとんど劣化
しないで長期間貯蔵できる。しかし、トリメチルシリル
イソチオシアネートは水と反応するので、水又は水蒸気
から離しておかなければならない。
くは、イソチオシアネートは、トリメチルシリルイソチ
オシアネート（TMS−NCS）である。イソチオシアネート
をRxSi（NCS）ｙ（式中、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４であ
り、Ｒはアルキル基、アリール基、置換アルキル基、置
換アリール基、或はこれらの組合せである。）として定
義できる。トリメチルシリルイソチオシアネートは室温
で安定であるので有利である。その結果、ほとんど劣化
しないで長期間貯蔵できる。しかし、トリメチルシリル
イソチオシアネートは水と反応するので、水又は水蒸気
から離しておかなければならない。
前述したイソチオシアネートでのペプチドの処理は、混
合物中に弱酸の無水物又は弱酸の塩化物を包含させると
促進される。無水酢酸が好適であるが、塩化アセチルの
使用も望ましい。
合物中に弱酸の無水物又は弱酸の塩化物を包含させると
促進される。無水酢酸が好適であるが、塩化アセチルの
使用も望ましい。
トリメチルシリルイソチオシアネート等の試薬とペプチ
ドとの反応は、混合物中にピリジン等の触媒を包含させ
ると促進される。混合物中にピリジンを包含すること
は、イソチオシアネートへペプチドをカツプリングさせ
るのに役立つ。好ましくは、混合物中で約２重量％のピ
リジン濃度が使用される。しかし、混合物中のピリジン
の量は、混合物中で約80重量％までの範囲で、有利な結
果を伴つて使用できる。ジメチルアミノピリジン（DMA
P）、トリエチルアミン及びジメチルエチルアミン等の
その他の触媒も使用できる。これらの触媒の全てが有機
塩基である。触媒は、ピリジン等の芳香族アミン類を包
含する第３級アミン類からなる群から選択される。
ドとの反応は、混合物中にピリジン等の触媒を包含させ
ると促進される。混合物中にピリジンを包含すること
は、イソチオシアネートへペプチドをカツプリングさせ
るのに役立つ。好ましくは、混合物中で約２重量％のピ
リジン濃度が使用される。しかし、混合物中のピリジン
の量は、混合物中で約80重量％までの範囲で、有利な結
果を伴つて使用できる。ジメチルアミノピリジン（DMA
P）、トリエチルアミン及びジメチルエチルアミン等の
その他の触媒も使用できる。これらの触媒の全てが有機
塩基である。触媒は、ピリジン等の芳香族アミン類を包
含する第３級アミン類からなる群から選択される。
典型的な例では、２〜20ナノモルのペプチドを含有する
10μのペプチド溶液を、50μの無水酢酸と混合し
た。混合物を約10分間加熱し、次いで大過剰のカツプリ
ング試薬（５μのトリメチルシリルイソチオシアネー
ト）を添加した。得られた溶液は、カツプリング試薬に
関して0.54Mであつた。ペプチド濃度は２及び20ナノモ
ルのとき各々31μＭ及び310μＭであつた。
10μのペプチド溶液を、50μの無水酢酸と混合し
た。混合物を約10分間加熱し、次いで大過剰のカツプリ
ング試薬（５μのトリメチルシリルイソチオシアネー
ト）を添加した。得られた溶液は、カツプリング試薬に
関して0.54Mであつた。ペプチド濃度は２及び20ナノモ
ルのとき各々31μＭ及び310μＭであつた。
試料を真空乾燥し、次いで、50μの12N塩酸に溶解さ
せた。室温で約30分後、再び試料を乾燥し、次いで高速
液体クロマトグラフ（HPLC）分析のために水に溶解させ
た。モデルペプチドにブラジキニンを使用しそして上記
で特定した物質を使用した実験から得られたデータを次
表で報告する。
せた。室温で約30分後、再び試料を乾燥し、次いで高速
液体クロマトグラフ（HPLC）分析のために水に溶解させ
た。モデルペプチドにブラジキニンを使用しそして上記
で特定した物質を使用した実験から得られたデータを次
表で報告する。
好ましくは、約２ナノモルのペプチドを、イソチオシア
ネートを含む10マイクロリツトルの溶液に包含させる
と、高収率のペプチジルチオヒダントイン誘導体を生成
する反応が得られる。これは、従来の技術では、満足な
結果を得るためにマイクロモル範囲の量を使用しなけれ
ばならなかつたので、従来技術を越えた別個の利点を構
成する。
ネートを含む10マイクロリツトルの溶液に包含させる
と、高収率のペプチジルチオヒダントイン誘導体を生成
する反応が得られる。これは、従来の技術では、満足な
結果を得るためにマイクロモル範囲の量を使用しなけれ
ばならなかつたので、従来技術を越えた別個の利点を構
成する。
ペプチドを、液相又は固相のどちらの状態でも溶液中に
包含できる。ペプチドが固相状態で溶液中に包含される
場合、固相保持体は溶液中で沈澱するが、固相保持体に
付着したペプチドは溶液中のイソチオシアネートと反応
する位置に配置されるように固相保持体から溶液中に拡
散するので、溶液に有効に溶解されると考えられる。ペ
プチドのための固相保持体の使用は公知である。
包含できる。ペプチドが固相状態で溶液中に包含される
場合、固相保持体は溶液中で沈澱するが、固相保持体に
付着したペプチドは溶液中のイソチオシアネートと反応
する位置に配置されるように固相保持体から溶液中に拡
散するので、溶液に有効に溶解されると考えられる。ペ
プチドのための固相保持体の使用は公知である。
ペプチドとイソチオシアネートとの反応は、好ましくは
約50℃〜約90℃で起こる。例えば、反応が約90℃で起こ
る場合、ペプチドをペプチジルチオヒダントインに完全
に変換させるのに、30分程度の短さである。ペプチジル
チオヒダントイン誘導体を得るためのペプチドとチオシ
アネート基の無水酢酸の存在下での反応が式１に示され
ている。
約50℃〜約90℃で起こる。例えば、反応が約90℃で起こ
る場合、ペプチドをペプチジルチオヒダントインに完全
に変換させるのに、30分程度の短さである。ペプチジル
チオヒダントイン誘導体を得るためのペプチドとチオシ
アネート基の無水酢酸の存在下での反応が式１に示され
ている。
ペプチドのペプチジルチオヒダントイン誘導体への完全
な変換は、約70℃と50℃でも得られる。しかし、変換を
完了するのに必要な時間は、溶液の温度が低くなるにつ
れ延長する。例えば、下の表に示す速度定数が、下表の
特定した温度で得られた。温度 速度定数 触媒の有無 70℃ ５×10-4 無 70℃ ２×10-3 有 50℃ ７×10-5 無 50℃ ６×10-4 有 触媒の存在下で、約90℃で起こる反応の場合の速度定数
は４×10-3である。速度定数とは、ペプチドが上記の溶
液中でペプチジルチオヒダントインに変換される時間に
反比例する数として定義される。
な変換は、約70℃と50℃でも得られる。しかし、変換を
完了するのに必要な時間は、溶液の温度が低くなるにつ
れ延長する。例えば、下の表に示す速度定数が、下表の
特定した温度で得られた。温度 速度定数 触媒の有無 70℃ ５×10-4 無 70℃ ２×10-3 有 50℃ ７×10-5 無 50℃ ６×10-4 有 触媒の存在下で、約90℃で起こる反応の場合の速度定数
は４×10-3である。速度定数とは、ペプチドが上記の溶
液中でペプチジルチオヒダントインに変換される時間に
反比例する数として定義される。
上述したように、ペプチドのペプチジルチオヒダントイ
ン誘導体への変換の完了後、過剰の試薬（例えば、トリ
メチルシリルイソチオシアネート）を適当な溶剤で抽出
する等の従来の方法で溶液から除去する。この除去は、
ペプチドが固体担体への固着により、例えばポリブレン
のようなマトリツクスないし保持物質内への閉じ込めに
より、最初に固定化された場合には、促進される。
ン誘導体への変換の完了後、過剰の試薬（例えば、トリ
メチルシリルイソチオシアネート）を適当な溶剤で抽出
する等の従来の方法で溶液から除去する。この除去は、
ペプチドが固体担体への固着により、例えばポリブレン
のようなマトリツクスないし保持物質内への閉じ込めに
より、最初に固定化された場合には、促進される。
次いで、塩酸等の適切な物質をペプチジルチオヒダント
イン誘導体を含有する溶液に添加し、この誘導体を開裂
する。塩酸が約12Nのような濃度のとき、反応は室温で
起こる。開裂させる化学反応を図式的に式２に示してい
る。これからわかるように、この化学反応はペプチジル
チオヒダントイン誘導体のカルボキシル基末端部で起こ
り、アミノ酸のチオヒダントイン誘導体を遊離させる。
分離されたアミノ酸を差し引いたペプチドを構成するペ
プチド残基も生じる。チオヒダントインを誘導するアミ
ノ酸は次いで従来の方法によつて同定されうる。
イン誘導体を含有する溶液に添加し、この誘導体を開裂
する。塩酸が約12Nのような濃度のとき、反応は室温で
起こる。開裂させる化学反応を図式的に式２に示してい
る。これからわかるように、この化学反応はペプチジル
チオヒダントイン誘導体のカルボキシル基末端部で起こ
り、アミノ酸のチオヒダントイン誘導体を遊離させる。
分離されたアミノ酸を差し引いたペプチドを構成するペ
プチド残基も生じる。チオヒダントインを誘導するアミ
ノ酸は次いで従来の方法によつて同定されうる。
上記の方法の工程を繰返し、ペプチド又はペプチジル残
基のカルボキシル基末端部の相次ぐ位置でアミノ酸を開
裂し、同定できる。この方法で開裂され且つ同定された
アミノ酸の数は、ペプチドを構成するアミノ酸の性質に
依存するが、25個又はそれ以上である。50個を越えるア
ミノ酸を含むペプチドのアミノ酸を開裂し、同定するこ
とが望まれる場合、ヘキサフルオロアセトン等の追加の
物質をトリメチルシリルイソチオシアネートを含有する
溶液に包含させ、このようなアミノ酸の長い配列をもつ
ペプチドの逐次配列認定を促進させてもよい。
基のカルボキシル基末端部の相次ぐ位置でアミノ酸を開
裂し、同定できる。この方法で開裂され且つ同定された
アミノ酸の数は、ペプチドを構成するアミノ酸の性質に
依存するが、25個又はそれ以上である。50個を越えるア
ミノ酸を含むペプチドのアミノ酸を開裂し、同定するこ
とが望まれる場合、ヘキサフルオロアセトン等の追加の
物質をトリメチルシリルイソチオシアネートを含有する
溶液に包含させ、このようなアミノ酸の長い配列をもつ
ペプチドの逐次配列認定を促進させてもよい。
上記した本発明の方法は重要な利点を有する。１つの利
点はペプチドのペプチジルチオヒダントインへの完全変
換が得られることである。これはペプチジルチオヒダン
トイン誘導体の完全開裂を順に与え、ペプチドのカルボ
キシル基末端部で最初アミノ酸のチオヒダントイン誘導
体を得、そしてペプチジル残基を得る。これはチオヒダ
ントイン誘導体のアミノ酸の同定を促進する。又、当初
のペプチドと同じ相対モル濃度のペプチジル残基を実質
的に維持する。その結果、ペプチジル残基の次の序列位
置のアミノ酸の同定の容易性を増す。これは、ペプチジ
ル残基部を分析のため取り出し、取り除いたアミノ酸を
確認する従来法と対照的である。このような従来の方法
では、次第にカルボキシル基末端部からアミノ酸の各々
の逐次除去に伴い、後続工程に利用できる残留ペプチド
の量を減少させる。更に、本発明の方法では、ペプチジ
ル残基のカルボキシル基末端部位置でアミノ酸の逐次配
列認定が進行してもペプチジル残基のモル濃度を実質的
に一定に維持させることによつて、逐次配列認定できる
アミノ酸の数は、従来法の逐次配列認定できるアミノ酸
の数と比較して相当に増加する。
点はペプチドのペプチジルチオヒダントインへの完全変
換が得られることである。これはペプチジルチオヒダン
トイン誘導体の完全開裂を順に与え、ペプチドのカルボ
キシル基末端部で最初アミノ酸のチオヒダントイン誘導
体を得、そしてペプチジル残基を得る。これはチオヒダ
ントイン誘導体のアミノ酸の同定を促進する。又、当初
のペプチドと同じ相対モル濃度のペプチジル残基を実質
的に維持する。その結果、ペプチジル残基の次の序列位
置のアミノ酸の同定の容易性を増す。これは、ペプチジ
ル残基部を分析のため取り出し、取り除いたアミノ酸を
確認する従来法と対照的である。このような従来の方法
では、次第にカルボキシル基末端部からアミノ酸の各々
の逐次除去に伴い、後続工程に利用できる残留ペプチド
の量を減少させる。更に、本発明の方法では、ペプチジ
ル残基のカルボキシル基末端部位置でアミノ酸の逐次配
列認定が進行してもペプチジル残基のモル濃度を実質的
に一定に維持させることによつて、逐次配列認定できる
アミノ酸の数は、従来法の逐次配列認定できるアミノ酸
の数と比較して相当に増加する。
上記した本発明の方法はその他の重要な利点も有する。
本方法は、ペプチド類と顕著に反応するが、室温条件下
で従来使用されている物質と比較して非常に安定な化学
物質（特にトリメチルシリルイソチオシアネート）を使
用することによつて、ペプチドのペプチジルチオヒダン
トイン誘導体への完全変換を提供する。しかし、トリメ
チルシリルイソチオシアネートが水との反応性に富んで
いるため、水及び水蒸気からそれを離しておくことが望
ましい。本発明を構成する方法は、ペプチドをペプチジ
ルチオヒダントインに実質的に完全に変更させるのに必
要とされる時間と温度を可及的に少なくしているので、
この利点もある。
本方法は、ペプチド類と顕著に反応するが、室温条件下
で従来使用されている物質と比較して非常に安定な化学
物質（特にトリメチルシリルイソチオシアネート）を使
用することによつて、ペプチドのペプチジルチオヒダン
トイン誘導体への完全変換を提供する。しかし、トリメ
チルシリルイソチオシアネートが水との反応性に富んで
いるため、水及び水蒸気からそれを離しておくことが望
ましい。本発明を構成する方法は、ペプチドをペプチジ
ルチオヒダントインに実質的に完全に変更させるのに必
要とされる時間と温度を可及的に少なくしているので、
この利点もある。
Claims (9)
- 【請求項１】シリルイソチオシアネートを含むことを特
徴とする、カルボキシル基末端部減成によるペプチドの
逐次配列認定用試薬。 - 【請求項２】ペプチドとチオシアネートとをカップリン
グさせる工程を含み、カップリング試薬としてシリルイ
ソチオシアネートを使用することを特徴とする、カルボ
キシル基末端部減成によるペプチドの逐次配列認定方
法。 - 【請求項３】イソチオシアネートが式Ｒ（ｘ）Si（NC
S）ｙ（式中、ｘは０〜３であり、ｙは１〜４であり、
Ｒはアルキル置換基又はアリール置換基である。）を有
する特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】イソチオシアネートがトリメチルシリルイ
ソチオシアネートである特許請求の範囲第３項記載の方
法。 - 【請求項５】カップリング試薬中に触媒も含む特許請求
の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項６】触媒が第３級アミンである特許請求の範囲
第５項記載の方法。 - 【請求項７】触媒がピリジンである特許請求の範囲第５
項記載の方法。 - 【請求項８】カップリング試薬中に有機の弱酸の無水物
を含む特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項９】有機の弱酸の無水物が無水酢酸である特許
請求の範囲第８項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US78026485A | 1985-09-26 | 1985-09-26 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62156562A JPS62156562A (ja) | 1987-07-11 |
| JPH0718882B2 true JPH0718882B2 (ja) | 1995-03-06 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP61227905A Expired - Fee Related JPH0718882B2 (ja) | 1985-09-26 | 1986-09-26 | ペプチドの逐次配列認定用試薬及び方法 |
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| JP (1) | JPH0718882B2 (ja) |
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| CN101035802A (zh) * | 2004-07-02 | 2007-09-12 | 健泰科生物技术公司 | Iap抑制剂 |
| KR20120127754A (ko) | 2004-12-20 | 2012-11-23 | 제넨테크, 인크. | Ｉａｐ의 피롤리딘 억제제 |
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| CN101605786A (zh) * | 2006-12-19 | 2009-12-16 | 健泰科生物技术公司 | 细胞凋亡抑制剂的咪唑并吡啶抑制剂 |
| TWI432212B (zh) * | 2007-04-30 | 2014-04-01 | Genentech Inc | Ｉａｐ抑制劑 |
| RU2010133548A (ru) * | 2008-01-11 | 2012-02-20 | Дженентек, Инк. (Us) | Ингибиторы iap |
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| US20120122889A1 (en) | 2008-12-23 | 2012-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Small molecule inhibitors of necroptosis |
| EP2968276A4 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-15 | President and Fellows of Harvard College | Hybrid necroptosis inhibitors |
| MX2017007607A (es) | 2014-12-11 | 2018-05-28 | Harvard College | Inhibidores de necrosis celular y metodos relacionados. |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3725010A (en) | 1971-08-23 | 1973-04-03 | Beckman Instruments Inc | Apparatus for automatically performing chemical processes |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4065412A (en) * | 1976-05-07 | 1977-12-27 | Durrum Instrument Corporation | Peptide or protein sequencing method and apparatus |
-
1986
- 1986-09-25 EP EP86307356A patent/EP0217634B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-25 CA CA000519119A patent/CA1292840C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-25 DE DE8686307356T patent/DE3685626T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-26 JP JP61227905A patent/JPH0718882B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-04-20 US US07/186,667 patent/US4837165A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3725010A (en) | 1971-08-23 | 1973-04-03 | Beckman Instruments Inc | Apparatus for automatically performing chemical processes |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0217634A2 (en) | 1987-04-08 |
| CA1292840C (en) | 1991-12-03 |
| US4837165A (en) | 1989-06-06 |
| JPS62156562A (ja) | 1987-07-11 |
| DE3685626D1 (de) | 1992-07-16 |
| EP0217634A3 (en) | 1988-08-31 |
| EP0217634B1 (en) | 1992-06-10 |
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