JPH07149655A - Ｎｏ合成酵素活性化剤 - Google Patents
Ｎｏ合成酵素活性化剤Info
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- JPH07149655A JPH07149655A JP29844693A JP29844693A JPH07149655A JP H07149655 A JPH07149655 A JP H07149655A JP 29844693 A JP29844693 A JP 29844693A JP 29844693 A JP29844693 A JP 29844693A JP H07149655 A JPH07149655 A JP H07149655A
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- synthase activator
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 フラビンアデニンジヌクレオチドを有効成分
とするＮＯ合成酵素活性化剤ならびに血圧降下剤および
抗血小板薬。 【効果】 新規なＮＯ合成酵素活性化剤ならびに血圧降
下剤および抗血小板薬の提供。
とするＮＯ合成酵素活性化剤ならびに血圧降下剤および
抗血小板薬。 【効果】 新規なＮＯ合成酵素活性化剤ならびに血圧降
下剤および抗血小板薬の提供。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フラビンアデニンジヌ
クレオチドを有効成分とするＮＯ合成酵素活性化剤なら
びに血圧降下剤および抗血小板薬に関する。
クレオチドを有効成分とするＮＯ合成酵素活性化剤なら
びに血圧降下剤および抗血小板薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】各種の疾患について、優れた新薬の開発
の望まれていることは言うまでもない。種々の生理的役
割を担うことが判明したＮＯの生合成の調節は、各種疾
患の新しい治療法を提供する。応答する細胞にもよる
が、ＮＯを活性化させるものとして、カルシウムイオノ
フォア、グルタミン酸、アセチルコリン、ブラジキニ
ン、ＡＤＰ、リポポリサッカライド、トロンビンなどが
挙げられるが、副作用を伴うことなく、効率よく効果を
発現するものは少ない。
の望まれていることは言うまでもない。種々の生理的役
割を担うことが判明したＮＯの生合成の調節は、各種疾
患の新しい治療法を提供する。応答する細胞にもよる
が、ＮＯを活性化させるものとして、カルシウムイオノ
フォア、グルタミン酸、アセチルコリン、ブラジキニ
ン、ＡＤＰ、リポポリサッカライド、トロンビンなどが
挙げられるが、副作用を伴うことなく、効率よく効果を
発現するものは少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前項記載の従来の技術
の背景下に、本発明は、ＮＯ合成酵素の新しい活性化剤
ならびにＮＯ合成酵素の活性化を介する薬理作用を利用
した新しい血圧降下剤および抗血小板薬の提供を目的と
する。
の背景下に、本発明は、ＮＯ合成酵素の新しい活性化剤
ならびにＮＯ合成酵素の活性化を介する薬理作用を利用
した新しい血圧降下剤および抗血小板薬の提供を目的と
する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、脳内で機能
する内因性ジギタリス様物質を精製する過程で、ラット
の脳、肝臓、副腎などの組織中に脳のＮＯ合成酵素(nit
ric oxide synthase、ＮＯＳ) を活性化し、中枢性及び
末梢性にラットに投与すると血圧を低下させる物質が存
在することを示す知見を得た。そこで、その物質をメン
ブレインカット（限外濾過）、ＦＰＬＣ（「ファルマシ
アＦＰＬＣシステム」）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマト
グラフィー）などを使用して分離、精製したところ、Ｆ
ＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）に極めて類似
した物質であることをが判明した。
する内因性ジギタリス様物質を精製する過程で、ラット
の脳、肝臓、副腎などの組織中に脳のＮＯ合成酵素(nit
ric oxide synthase、ＮＯＳ) を活性化し、中枢性及び
末梢性にラットに投与すると血圧を低下させる物質が存
在することを示す知見を得た。そこで、その物質をメン
ブレインカット（限外濾過）、ＦＰＬＣ（「ファルマシ
アＦＰＬＣシステム」）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマト
グラフィー）などを使用して分離、精製したところ、Ｆ
ＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）に極めて類似
した物質であることをが判明した。
【０００５】そこで、本発明者は、更に研究の結果、Ｆ
ＡＤにもＮＯＳ活性化作用があり、延いては血圧降下作
用および血小板凝集抑制作用のあることを見出し、この
ような知見に基いて本発明を完成した。
ＡＤにもＮＯＳ活性化作用があり、延いては血圧降下作
用および血小板凝集抑制作用のあることを見出し、この
ような知見に基いて本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、フラビンアデニンジ
ヌクレオチド（ＦＡＤ）を有効成分とすることを特徴と
するＮＯ合成酵素活性化剤、ならびにＦＡＤのＮＯＳ活
性化を介する薬理作用を活用した、フラビンアデニンジ
ヌクレオチドを有効成分とすることを特徴とする血圧降
下剤および抗血小板薬に関する。
ヌクレオチド（ＦＡＤ）を有効成分とすることを特徴と
するＮＯ合成酵素活性化剤、ならびにＦＡＤのＮＯＳ活
性化を介する薬理作用を活用した、フラビンアデニンジ
ヌクレオチドを有効成分とすることを特徴とする血圧降
下剤および抗血小板薬に関する。
【０００７】以下、本発明を逐次詳細に説明する。
【０００８】本発明のＮＯＳ活性化剤および血圧降下剤
の有効成分であるフラビンアデニンジヌクレオチド（Ｆ
ＡＤ）は、周知の如く、ビタミンＢ2 （リボフラビン）
の補酵素型の１つであり、フラビン酵素の多くはＦＡＤ
を補酵素としており、糖・アミノ酸・脂肪酸の中間代
謝、酸化的リン酸化などの生体内の酸化還元反応におい
て広範囲にわたって重要な働きをしている。また、ＦＡ
Ｄは、Ｏ．ＷａｒｂｕｒｇとＷ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ
（１９３８）によりＤ−アミノ酸オキシダーゼから初め
て単離された、黄色針状結晶の、水に易溶、アルコール
に微溶解、非極性溶媒に不溶の物質である。この物質の
紫外可視部での吸収は、リボフラビンよりやや長波長側
にずれるがほぼ同様である。また、蛍光は、そのイソア
ロキサジン核とアデニン間の分子内水素結合のためリボ
フラビンおよびＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の
１０％ほどである化合物であることも、これまた周知の
通りである。以上、「生化学辞典」（（株）東京化学同
人（１９８４））参照。
の有効成分であるフラビンアデニンジヌクレオチド（Ｆ
ＡＤ）は、周知の如く、ビタミンＢ2 （リボフラビン）
の補酵素型の１つであり、フラビン酵素の多くはＦＡＤ
を補酵素としており、糖・アミノ酸・脂肪酸の中間代
謝、酸化的リン酸化などの生体内の酸化還元反応におい
て広範囲にわたって重要な働きをしている。また、ＦＡ
Ｄは、Ｏ．ＷａｒｂｕｒｇとＷ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ
（１９３８）によりＤ−アミノ酸オキシダーゼから初め
て単離された、黄色針状結晶の、水に易溶、アルコール
に微溶解、非極性溶媒に不溶の物質である。この物質の
紫外可視部での吸収は、リボフラビンよりやや長波長側
にずれるがほぼ同様である。また、蛍光は、そのイソア
ロキサジン核とアデニン間の分子内水素結合のためリボ
フラビンおよびＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の
１０％ほどである化合物であることも、これまた周知の
通りである。以上、「生化学辞典」（（株）東京化学同
人（１９８４））参照。
【０００９】本発明のＮＯ合成酵素活性化剤は、生体外
においては（in vitro）、例えば、試薬などとして使用
することができる。
においては（in vitro）、例えば、試薬などとして使用
することができる。
【００１０】本発明のＮＯ合成酵素活性剤は、生体内
（in vovo ）においては、例えば、脳、肺、心筋、腎
臓、消化管、皮膚などの末梢循環改善によるこれらの器
官、組織での疾患治療効果、インポテンスの治療効果、
抗癌作用、抗微生物作用、免疫機能の活性化効果（エイ
ズ治療薬としての効果）、免疫抑制効果、糖尿病改善効
果、肝細胞毒性、腸障害、血管透過性などの改善作用、
インターフェロンによる抗癌作用の増強効果、マラリア
のような肝臓への感染及び敗血症時の肝機能不全の防御
効果、けいれん性便秘の改善効果、腸管のぜん動促進効
果、腎機能改善効果、脳機能の改善、記憶機能改善効
果、視覚機能の改善効果などの場合に使用できる他に、
特に血圧降下剤および抗血小板薬として使用することが
できる。
（in vovo ）においては、例えば、脳、肺、心筋、腎
臓、消化管、皮膚などの末梢循環改善によるこれらの器
官、組織での疾患治療効果、インポテンスの治療効果、
抗癌作用、抗微生物作用、免疫機能の活性化効果（エイ
ズ治療薬としての効果）、免疫抑制効果、糖尿病改善効
果、肝細胞毒性、腸障害、血管透過性などの改善作用、
インターフェロンによる抗癌作用の増強効果、マラリア
のような肝臓への感染及び敗血症時の肝機能不全の防御
効果、けいれん性便秘の改善効果、腸管のぜん動促進効
果、腎機能改善効果、脳機能の改善、記憶機能改善効
果、視覚機能の改善効果などの場合に使用できる他に、
特に血圧降下剤および抗血小板薬として使用することが
できる。
【００１１】ＦＡＤを有効成分とする本発明の両剤は、
経口または静注などの非経口で投与することができる。
すなわち、経口または非経口投与に適した有機もしくは
無機固体状又は液状賦形剤のような医薬として許容され
る担体と混合して慣用の医薬製剤の形で使用することが
できる。医薬製剤は錠剤、顆粒、粉剤、カプセルのよう
な固体状であってもよいし、溶液、懸濁液、シロップ、
エマルジョンのような液状であってもよい。必要に応じ
て、前記製剤中に助剤、安定剤、湿潤剤及びその他の通
常使用される添加剤が含まれていてもよい。
経口または静注などの非経口で投与することができる。
すなわち、経口または非経口投与に適した有機もしくは
無機固体状又は液状賦形剤のような医薬として許容され
る担体と混合して慣用の医薬製剤の形で使用することが
できる。医薬製剤は錠剤、顆粒、粉剤、カプセルのよう
な固体状であってもよいし、溶液、懸濁液、シロップ、
エマルジョンのような液状であってもよい。必要に応じ
て、前記製剤中に助剤、安定剤、湿潤剤及びその他の通
常使用される添加剤が含まれていてもよい。
【００１２】また、このような本発明の両剤の投与量
（有効量）は、上のような投与方法において、副作用を
伴うことなしに使用効果（投与効果）の奏される量とい
うことになる。この量は、患者の年齢、疾患の重篤度な
どにもよるが、非経口の場合、一般的に体重約６０ｋｇ
の成人患者につき１日当りの投与量として、有効成分の
ＦＡＤに換算して、例えば、１０〜１０００ｍｇ、好ま
しくは５０〜２００ｍｇである。経口の場合は、非経口
の場合に比べて増量されることは、言うまでもない。
（有効量）は、上のような投与方法において、副作用を
伴うことなしに使用効果（投与効果）の奏される量とい
うことになる。この量は、患者の年齢、疾患の重篤度な
どにもよるが、非経口の場合、一般的に体重約６０ｋｇ
の成人患者につき１日当りの投与量として、有効成分の
ＦＡＤに換算して、例えば、１０〜１０００ｍｇ、好ま
しくは５０〜２００ｍｇである。経口の場合は、非経口
の場合に比べて増量されることは、言うまでもない。
【００１３】なお、ＦＡＤについては、急性毒性など安
全性に問題のないことは、この物質の、先に言及した生
体内作用から明らかである。
全性に問題のないことは、この物質の、先に言及した生
体内作用から明らかである。
【００１４】また、本発明の両剤は、動物にも使用でき
ることはもちろんである。
ることはもちろんである。
【００１５】
【実施例】以下、試験例および実施例により本発明を更
に説明する。
に説明する。
【００１６】（試験例１）Ａ．方 法 （ａ）動物を用いた検討（ＮＯＳの調製） 実験動物には、１２時間毎に点灯消灯を繰り返す２４℃
の恒温動物室にて飼育するウィスター系雄性ラットを使
用した。
の恒温動物室にて飼育するウィスター系雄性ラットを使
用した。
【００１７】ＮＯＳは、ラット脳よりＨｏｐｅらの方法
（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.88, 2811〜2814(199
1)）の変法にて部分精製をおこなった。即ち、ラット脳
を断頭屠殺し、得られた脳を５倍量の緩衝液Ａ（Buffer
A、 25mM Tris、pH 7.4、0.5mM EDTA、1mM Dithiothre
itolおよび１０ｍｇ／Ｌロイペプチン含有）でホモジナ
イズし、30,000×ｇで３０分遠心後、上清を２′，５′
−ＡＤＰアガロースと混和した。３０分後、これをカラ
ムにつめ、緩衝液Ａで洗浄した後、10mM NADPH（ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型）含有緩
衝液Ａにて溶出した。ＮＯＳを含む画分をＦＰＬＣ「Ｍ
ｏｎｏＱ」陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにか
け、０〜０．４Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａの濃度勾配に
て溶出し、ＮＯＳ部分精製標品を得た。以上の操作は、
全て４℃にて行った。
（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.88, 2811〜2814(199
1)）の変法にて部分精製をおこなった。即ち、ラット脳
を断頭屠殺し、得られた脳を５倍量の緩衝液Ａ（Buffer
A、 25mM Tris、pH 7.4、0.5mM EDTA、1mM Dithiothre
itolおよび１０ｍｇ／Ｌロイペプチン含有）でホモジナ
イズし、30,000×ｇで３０分遠心後、上清を２′，５′
−ＡＤＰアガロースと混和した。３０分後、これをカラ
ムにつめ、緩衝液Ａで洗浄した後、10mM NADPH（ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型）含有緩
衝液Ａにて溶出した。ＮＯＳを含む画分をＦＰＬＣ「Ｍ
ｏｎｏＱ」陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにか
け、０〜０．４Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａの濃度勾配に
て溶出し、ＮＯＳ部分精製標品を得た。以上の操作は、
全て４℃にて行った。
【００１８】この酵素標品の比活性は、０．１μmol シ
トルリン／ｍｇ protein／min であった。このＮＯＳ標
品を用いてＦＡＤ、ＦＭＮ、リボフラビンなどの効果を
ｉｎｖｉｔｒｏにて検討した。
トルリン／ｍｇ protein／min であった。このＮＯＳ標
品を用いてＦＡＤ、ＦＭＮ、リボフラビンなどの効果を
ｉｎｖｉｔｒｏにて検討した。
【００１９】（ｂ）酵素活性測定 ＮＯＳの活性は、シトルリンの生成量を測定するＳｃｈ
ｍｉｄｔらの方法（Biochem. Biophys. Res. Comm., 1
65, 284〜291 (1989)）、ならびにＮＯ2 - とＮＯ3 -
の生成量を測定するＢｒｅｄｔらおよびＰｏｌｌｏｃｋ
らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 9030
〜9033(1989)およびProc. Natl. Acad.Sci., U.S.A., 8
8, 10480〜10484 (1991)）によって行った。
ｍｉｄｔらの方法（Biochem. Biophys. Res. Comm., 1
65, 284〜291 (1989)）、ならびにＮＯ2 - とＮＯ3 -
の生成量を測定するＢｒｅｄｔらおよびＰｏｌｌｏｃｋ
らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 9030
〜9033(1989)およびProc. Natl. Acad.Sci., U.S.A., 8
8, 10480〜10484 (1991)）によって行った。
【００２０】先ず、上記のＮＯＳ部分精製標品、1mM NA
DPH 、1.6mM CaCl2 、 6μg/mlカルモジュリン、1.3mM
L-アルギニン、50μM (6R)-5,6,7,8- テトラヒドロビオ
プテリン、50mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4) 及びＦＡ
Ｄ、ＦＭＮまたはリボフラビンのサンプルからなる反応
液３００μｌを３７℃で７分間インキュベーションした
後、１００℃で３０秒間煮沸してＮＯＳの反応を停止し
た。
DPH 、1.6mM CaCl2 、 6μg/mlカルモジュリン、1.3mM
L-アルギニン、50μM (6R)-5,6,7,8- テトラヒドロビオ
プテリン、50mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4) 及びＦＡ
Ｄ、ＦＭＮまたはリボフラビンのサンプルからなる反応
液３００μｌを３７℃で７分間インキュベーションした
後、１００℃で３０秒間煮沸してＮＯＳの反応を停止し
た。
【００２１】（ｉ）シトルリン生成量の測定 反応液３００μｌにウレアーゼ１５μｌ（１００ｍＵ）
を加えて、３７℃に３０分間保持した後、６００μｌの
酸溶液（ＨＣｌ：Ｈ3 ＰＯ4 ：Ｈ2 Ｏ＝25：20：55(v/
v) 、５００ml当り４１．７mgのＦｅＣｌ3 ・５Ｈ2 Ｏ
を含有）および３００μｌの試薬液（水１００ml当りチ
オセミカルバジド０．０１ｇおよびジアセチルモノオキ
シム０．５ｇ溶解したもの）を加えて１００℃で１５分
間煮沸し、5,000×ｇで５分間遠心後、上清を５４０nm
での吸光度の測定に付してシトルリンを定量した。
を加えて、３７℃に３０分間保持した後、６００μｌの
酸溶液（ＨＣｌ：Ｈ3 ＰＯ4 ：Ｈ2 Ｏ＝25：20：55(v/
v) 、５００ml当り４１．７mgのＦｅＣｌ3 ・５Ｈ2 Ｏ
を含有）および３００μｌの試薬液（水１００ml当りチ
オセミカルバジド０．０１ｇおよびジアセチルモノオキ
シム０．５ｇ溶解したもの）を加えて１００℃で１５分
間煮沸し、5,000×ｇで５分間遠心後、上清を５４０nm
での吸光度の測定に付してシトルリンを定量した。
【００２２】（ii）ＮＯ2 - およびＮＯ3 - の生成量の
測定 反応液を硝酸レダクターゼ（0.1 unit／ml）およびＦＡ
Ｄ（５μＭ）の存在下、３７℃で５分間インキュベート
し、ＮＯ3 - をＮＯ2 - に還元した後、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（１０unit／ml）およびピルビン酸ナトリウム
（１０ｍＭ）の存在下、３７℃で２０分インキュベート
し、残存するＮＡＤＰＨを酸化した。この反応液３００
μｌに３００μｌの Griess 試薬（５％(v/v) Ｈ3 Ｐ
Ｏ4 、１％(w/v) スルファニル酸および０．１％(w/v)
Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンを含有）を
加え、 5,000×ｇで５分間遠心した後、５５４ｎｍでの
吸光度を測定し、ＮＯ2 - を定量した。
測定 反応液を硝酸レダクターゼ（0.1 unit／ml）およびＦＡ
Ｄ（５μＭ）の存在下、３７℃で５分間インキュベート
し、ＮＯ3 - をＮＯ2 - に還元した後、乳酸デヒドロゲ
ナーゼ（１０unit／ml）およびピルビン酸ナトリウム
（１０ｍＭ）の存在下、３７℃で２０分インキュベート
し、残存するＮＡＤＰＨを酸化した。この反応液３００
μｌに３００μｌの Griess 試薬（５％(v/v) Ｈ3 Ｐ
Ｏ4 、１％(w/v) スルファニル酸および０．１％(w/v)
Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンを含有）を
加え、 5,000×ｇで５分間遠心した後、５５４ｎｍでの
吸光度を測定し、ＮＯ2 - を定量した。
【００２３】（ｃ）フローサイトメトリーによる検討
（ＦＡＤの付着性） まず、ＰＣ１２細胞（神経芽細胞腫、ＰＣ１２ｈ細胞、
大阪大学蛋白質研究所畠中寛教授より提供を受けたも
の）は、５％(v/v) 仔ウシ血清および５％(v/v)仔ウマ
血清含有のDulbecco’s modified Eagle’s medium
（ＤＭＥＭ培地）で培養した。次に、ＰＣ１２細胞をシ
ャーレからピペッティングではがし、５×１０5 cells
/ml の懸濁液を調製し、そのままあるいはＦＡＤ（最終
濃度５ｍＭ）を加えてフローサイトメーター「Ｃｙｔｏ
ＡＣＥ」（日本分光製）で 5,000個の細胞の５３０ｎｍ
での蛍光強度を測定した（励起波長は４８８ｎｍ）。
（ＦＡＤの付着性） まず、ＰＣ１２細胞（神経芽細胞腫、ＰＣ１２ｈ細胞、
大阪大学蛋白質研究所畠中寛教授より提供を受けたも
の）は、５％(v/v) 仔ウシ血清および５％(v/v)仔ウマ
血清含有のDulbecco’s modified Eagle’s medium
（ＤＭＥＭ培地）で培養した。次に、ＰＣ１２細胞をシ
ャーレからピペッティングではがし、５×１０5 cells
/ml の懸濁液を調製し、そのままあるいはＦＡＤ（最終
濃度５ｍＭ）を加えてフローサイトメーター「Ｃｙｔｏ
ＡＣＥ」（日本分光製）で 5,000個の細胞の５３０ｎｍ
での蛍光強度を測定した（励起波長は４８８ｎｍ）。
【００２４】ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ、 ATCC CC
L209）は、１０％(v/v) ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有の
最少必須培地（ＭＥＭ培地）で培養した。ＣＰＡＥを
０．２５％トリプシンではがし、 2,000×ｇで、５分間
遠心した後、沈渣を１０％ＦＢＳ・ＭＥＭ培地に懸濁
し、５×１０5 cells/ml とした。そのままあるいはＦ
ＡＤ（５ｍＭ）を加えて、フローサイトメーターで 5,0
00個の細胞の５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。
L209）は、１０％(v/v) ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有の
最少必須培地（ＭＥＭ培地）で培養した。ＣＰＡＥを
０．２５％トリプシンではがし、 2,000×ｇで、５分間
遠心した後、沈渣を１０％ＦＢＳ・ＭＥＭ培地に懸濁
し、５×１０5 cells/ml とした。そのままあるいはＦ
ＡＤ（５ｍＭ）を加えて、フローサイトメーターで 5,0
00個の細胞の５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。
【００２５】（ｄ）ＮＯ電極を用いたＮＯ産生量の測定 ＮＯ産生量は一酸化窒素測定装置（ＮＯモニター「Ｍｏ
ｄｅｌ ＮＯ−５０１」（インターメディカル社（東
京））を用いて測定した。１０ｃｍ2 の培養皿にて培養
したＰＣ１２細胞およびＣＰＡＥそれぞれの培養液を５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２００μＭ Ｌ−アルギニン
含有のハンクス液（ｐＨ７．４）に変えた。この培養皿
の培養液中にＮＯ電極をセットし、電極付近にＦＡＤを
４０μｌ添加し（ＰＣ１２細胞の場合には１８ｍＭ、そ
してＣＰＡＥの場合は２．５ｍＭの濃度のＦＡＤとし
た）、この時流れる電流値を測定した。
ｄｅｌ ＮＯ−５０１」（インターメディカル社（東
京））を用いて測定した。１０ｃｍ2 の培養皿にて培養
したＰＣ１２細胞およびＣＰＡＥそれぞれの培養液を５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２００μＭ Ｌ−アルギニン
含有のハンクス液（ｐＨ７．４）に変えた。この培養皿
の培養液中にＮＯ電極をセットし、電極付近にＦＡＤを
４０μｌ添加し（ＰＣ１２細胞の場合には１８ｍＭ、そ
してＣＰＡＥの場合は２．５ｍＭの濃度のＦＡＤとし
た）、この時流れる電流値を測定した。
【００２６】（ｅ）血圧に対する効果の検討 ウィスター系雄性ラットをウレタン（１ｇ／ｋｇ、ｉ
ｐ）で麻酔後、大腿動脈にカテーテルを留置し、トラン
スデューサー「Morse Manifold VTM system 」（Namic,
Hudson Falls, NY ）を用いる血圧測定装置「Model PA
S-401 」（Star Medical Co., Tokyo ）を用いて血圧お
よび心拍数を測定した。この際、予め側脳室あるいは大
腿静脈にカテーテルを留置し、それらのカテーテルを使
用してＦＡＤ、およびその他の物質を脳内および静脈内
に投与し、血圧および心拍数に対する効果を検討した。
ｐ）で麻酔後、大腿動脈にカテーテルを留置し、トラン
スデューサー「Morse Manifold VTM system 」（Namic,
Hudson Falls, NY ）を用いる血圧測定装置「Model PA
S-401 」（Star Medical Co., Tokyo ）を用いて血圧お
よび心拍数を測定した。この際、予め側脳室あるいは大
腿静脈にカテーテルを留置し、それらのカテーテルを使
用してＦＡＤ、およびその他の物質を脳内および静脈内
に投与し、血圧および心拍数に対する効果を検討した。
【００２７】Ｂ．結 果 （ａ）ＮＯＳ活性化効果について ＦＡＤは、ラット脳より調製した部分精製ＮＯＳ標品の
in vitroでの活性を上昇させた。ＦＡＤ １０μＭの存
在下に酵素活性は１８０％活性化し、それ以上加えると
その活性化はやや減少した。リボフラビンには殆ど活性
化作用はないが、ＦＭＮにはＦＡＤと同様の活性化作用
があることが明らかとなった。
in vitroでの活性を上昇させた。ＦＡＤ １０μＭの存
在下に酵素活性は１８０％活性化し、それ以上加えると
その活性化はやや減少した。リボフラビンには殆ど活性
化作用はないが、ＦＭＮにはＦＡＤと同様の活性化作用
があることが明らかとなった。
【００２８】（ｂ）培養血管内皮細胞（ＣＰＡＥ）およ
び神経芽細胞腫（ＰＣ１２）へのＦＡＤの付着について ウシ肺動脈内皮培養細胞（ＣＰＡＥ）をＦＡＤを５ｍＭ
含む培地中に置くと、培養細胞の蛍光強度が増加するこ
とがフローサイトメトリーにて認められた。この事実
は、ＦＡＤが培養血管内皮細胞に結合するか、付着する
か、または取り込まれることを示している。ＰＣ１２細
胞についても、同様の結果が得られた。
び神経芽細胞腫（ＰＣ１２）へのＦＡＤの付着について ウシ肺動脈内皮培養細胞（ＣＰＡＥ）をＦＡＤを５ｍＭ
含む培地中に置くと、培養細胞の蛍光強度が増加するこ
とがフローサイトメトリーにて認められた。この事実
は、ＦＡＤが培養血管内皮細胞に結合するか、付着する
か、または取り込まれることを示している。ＰＣ１２細
胞についても、同様の結果が得られた。
【００２９】（ｃ）培養細胞におけるＮＯ産生について ウシ肺動脈内皮培養細胞（ＣＰＡＥ）にＦＡＤを５０μ
Ｍ添加し、培地中でのＮＯ産生が増加するか否かを、前
記のように、インターメディカル社製のＮＯ測定装置
（ＮＯモニター「Model NO−50」）にて検討した。その
結果、培地のＮＯ含量がＦＡＤ添加後に増加することが
明らかとなった。神経芽細胞腫（ＰＣ１２）へのＦＡＤ
（５０μＭ）の添加も同様に培地のＮＯ含量を増加させ
た。両細胞におけるＮＯ産生のＦＡＤによる増加は、両
者共にＮ−ニトロアルギニンにより阻害され、Ｌ−アル
ギニンの培地への添加により回復した。
Ｍ添加し、培地中でのＮＯ産生が増加するか否かを、前
記のように、インターメディカル社製のＮＯ測定装置
（ＮＯモニター「Model NO−50」）にて検討した。その
結果、培地のＮＯ含量がＦＡＤ添加後に増加することが
明らかとなった。神経芽細胞腫（ＰＣ１２）へのＦＡＤ
（５０μＭ）の添加も同様に培地のＮＯ含量を増加させ
た。両細胞におけるＮＯ産生のＦＡＤによる増加は、両
者共にＮ−ニトロアルギニンにより阻害され、Ｌ−アル
ギニンの培地への添加により回復した。
【００３０】（ｄ）ＦＡＤの中枢性および末梢性投与効
果 ラットの側脳室にウレタン麻酔下にてＦＡＤ（２００nm
ol／kg）を投与したところ、血圧が下降し（１５〜２０
mmHg）、同時に心拍数も下降した。この降下は、ＳＨＲ
（高血圧自然発症ラット）ではより顕著に認められた
（３５mmHgの血圧降下）。
果 ラットの側脳室にウレタン麻酔下にてＦＡＤ（２００nm
ol／kg）を投与したところ、血圧が下降し（１５〜２０
mmHg）、同時に心拍数も下降した。この降下は、ＳＨＲ
（高血圧自然発症ラット）ではより顕著に認められた
（３５mmHgの血圧降下）。
【００３１】一方、ウレタン麻酔下のラットの静脈内に
ＦＡＤ（２０nmol／kg）を投与したところ、血圧下降
（３０〜５０mmHg）および心拍数の低下が認められた。
しかしながら、in vitroにてＮＯＳ活性化作用を示すＦ
ＭＮは、静脈内投与では血圧下降を示さなかった。
ＦＡＤ（２０nmol／kg）を投与したところ、血圧下降
（３０〜５０mmHg）および心拍数の低下が認められた。
しかしながら、in vitroにてＮＯＳ活性化作用を示すＦ
ＭＮは、静脈内投与では血圧下降を示さなかった。
【００３２】（ｅ）アデノシンレセプターの関与の可能
性の検討 ＦＡＤの上記作用がアデノシンレセプターを介するもの
か否かを検討した結果、（ｉ）アデノシンは直接ＮＯＳ
を活性化せず、ウシの肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）およ
び神経芽細胞腫（ＰＣ１２細胞）にアデノシンを添加し
てもＮＯの産生の増加はＮＯ電極を用いた実験では認め
られなかった、（ii）アデノシンレセプター（Ａ1 およ
びＡ2 ）阻害剤であるアミノフィリンの存在下でＦＡＤ
を上記両培養細胞に添加しても、ＦＡＤによるＮＯ産生
促進効果には影響を与えなかった。
性の検討 ＦＡＤの上記作用がアデノシンレセプターを介するもの
か否かを検討した結果、（ｉ）アデノシンは直接ＮＯＳ
を活性化せず、ウシの肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）およ
び神経芽細胞腫（ＰＣ１２細胞）にアデノシンを添加し
てもＮＯの産生の増加はＮＯ電極を用いた実験では認め
られなかった、（ii）アデノシンレセプター（Ａ1 およ
びＡ2 ）阻害剤であるアミノフィリンの存在下でＦＡＤ
を上記両培養細胞に添加しても、ＦＡＤによるＮＯ産生
促進効果には影響を与えなかった。
【００３３】これらの結果を、下記第１表にまとめて示
す。
す。
【００３４】第１表中、被検物質について付言すると、
ＦＭＮおよびリボフラビンはＦＡＤの前駆体であり、ロ
ゼオフラビンはリボフラビンの誘導体であり、そしてア
デノシンはＦＡＤの構造の一部となっている。また、作
用（ａ）はＮＯ産生脳酵素についてのもの、（ｂ）はＮ
Ｏモニターにより測定したもの、（ｃ）は血圧に対する
影響、（ｄ）はレセプターによる結合または取込みを示
し、そして、（ｅ）はＮＯの血中濃度の変化を示すもの
である。なお、、＋＋＋、＋＋、＋、−およびＮＤは、
それぞれ、強陽性、中等度陽性、弱陽性、陰性および未
検定を意味する。
ＦＭＮおよびリボフラビンはＦＡＤの前駆体であり、ロ
ゼオフラビンはリボフラビンの誘導体であり、そしてア
デノシンはＦＡＤの構造の一部となっている。また、作
用（ａ）はＮＯ産生脳酵素についてのもの、（ｂ）はＮ
Ｏモニターにより測定したもの、（ｃ）は血圧に対する
影響、（ｄ）はレセプターによる結合または取込みを示
し、そして、（ｅ）はＮＯの血中濃度の変化を示すもの
である。なお、、＋＋＋、＋＋、＋、−およびＮＤは、
それぞれ、強陽性、中等度陽性、弱陽性、陰性および未
検定を意味する。
【００３５】
【表１】
【００３６】Ｃ．考 察 以上の結果から、ＦＡＤは、細胞内ＮＯＳに作用してＮ
Ｏの産生を増加させることによって血圧の下降および徐
脈を引き起こすと考えられる。さらにＦＡＤについて次
の薬効が期待される。
Ｏの産生を増加させることによって血圧の下降および徐
脈を引き起こすと考えられる。さらにＦＡＤについて次
の薬効が期待される。
【００３７】（ａ）ＮＯは脳、肺、心筋その他の末梢血
管などの血管を拡張させるので、その効果から、ＦＡＤ
は降圧効果、脳循環改善、肺および心臓機能の改善効果
があると考えられる。
管などの血管を拡張させるので、その効果から、ＦＡＤ
は降圧効果、脳循環改善、肺および心臓機能の改善効果
があると考えられる。
【００３８】（ｂ）ペニスの勃起はＮＯによる海綿体の
弛緩より起こるので、インポテンスの改善効果が予測さ
れる。
弛緩より起こるので、インポテンスの改善効果が予測さ
れる。
【００３９】（ｃ）マクロファージからのＮＯ産生が増
加すると、癌細胞をはじめとして微生物、リンパ球に対
して阻害、抑制効果があるので、免疫能の活性化効果が
予測される。この点に関して、脾臓のＴ細胞の増殖抑制
はＮＯ依存性があるので、場合によっては免疫能の抑制
に影響がある。
加すると、癌細胞をはじめとして微生物、リンパ球に対
して阻害、抑制効果があるので、免疫能の活性化効果が
予測される。この点に関して、脾臓のＴ細胞の増殖抑制
はＮＯ依存性があるので、場合によっては免疫能の抑制
に影響がある。
【００４０】（ｄ）ＮＯはアルギニンやトルブタマイド
製剤で刺激されるインスリン放出を仲介するので、糖尿
病改善効果が予測される。
製剤で刺激されるインスリン放出を仲介するので、糖尿
病改善効果が予測される。
【００４１】（ｅ）ＮＯはＬＰＳ（リポポリサッカライ
ド）で起こる肝細胞毒性、腸障害、血管透過性を改善す
るので、これらの保護作用が期待される。
ド）で起こる肝細胞毒性、腸障害、血管透過性を改善す
るので、これらの保護作用が期待される。
【００４２】（ｆ）ＮＯがインターフェロンによる癌細
胞、線維芽細胞の増殖の抑制に関与するので、インター
フェロンによる抗腫瘍作用の増強効果が期待される。
胞、線維芽細胞の増殖の抑制に関与するので、インター
フェロンによる抗腫瘍作用の増強効果が期待される。
【００４３】（ｇ）ＮＯは肝臓ではマラリアのような肝
臓への感染や、敗血症時の肝機能不全の防御を促進する
ので、これらの効果も期待される。
臓への感染や、敗血症時の肝機能不全の防御を促進する
ので、これらの効果も期待される。
【００４４】（ｈ）ＮＯは腸管の弛緩を引き起こすの
で、けいれん性便秘の改善や腸管機能の改善効果がある
と予測される。
で、けいれん性便秘の改善や腸管機能の改善効果がある
と予測される。
【００４５】（ｉ）腎臓の糸球体や髄質などの血管はＮ
Ｏによって調節に関与しているので、腎機能効果が期待
される。
Ｏによって調節に関与しているので、腎機能効果が期待
される。
【００４６】（ｊ）中枢神経系では、ＮＯは興奮性アミ
ノ酸の神経伝達を介する、また、長期増強のメディエー
ターでもあるので、脳機能の改善、記憶改善効果が期待
される。ただし、過剰では毒性あり。
ノ酸の神経伝達を介する、また、長期増強のメディエー
ターでもあるので、脳機能の改善、記憶改善効果が期待
される。ただし、過剰では毒性あり。
【００４７】（ｋ）網膜のアマクリン細胞では、ＮＯは
ギャップジャンクションの伝導性を調節するし、脈絡膜
の血流調節にも関連するので、視覚機能の改善効果も期
待される。
ギャップジャンクションの伝導性を調節するし、脈絡膜
の血流調節にも関連するので、視覚機能の改善効果も期
待される。
【００４８】（試験例２）ヒトよりクエン酸採血し、Ｐ
ＲＰ（多血小板血漿）を調製後、これにＦＡＤを下記第
２表に示す種々の濃度となるように添加し、コラーゲン
（０．４μｇ／ｍｌ）およびセロトニン（５μｇ／ｍ
ｌ）を同時に添加したときに惹起される血小板凝集を血
小板凝集測定装置（「ＨＥＭＡ ＴＲＡＣＥＲ ８０
１」二光バイオサイエンス社製）を用いて測定した。
ＲＰ（多血小板血漿）を調製後、これにＦＡＤを下記第
２表に示す種々の濃度となるように添加し、コラーゲン
（０．４μｇ／ｍｌ）およびセロトニン（５μｇ／ｍ
ｌ）を同時に添加したときに惹起される血小板凝集を血
小板凝集測定装置（「ＨＥＭＡ ＴＲＡＣＥＲ ８０
１」二光バイオサイエンス社製）を用いて測定した。
【００４９】結果を第２表に示す。同表より、ＦＡＤは
１０-7Ｍより濃度に依存して血小板凝集を抑制した。
１０-7Ｍより濃度に依存して血小板凝集を抑制した。
【００５０】
【表２】
【００５１】実施例１（調剤例） 蒸留水にフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を
溶解してその２．５％水溶液とし、これを２ｍｌ容アン
プルに充填封入して本発明の薬剤（血圧降下剤および抗
血小板薬）を作成した。
溶解してその２．５％水溶液とし、これを２ｍｌ容アン
プルに充填封入して本発明の薬剤（血圧降下剤および抗
血小板薬）を作成した。
【００５２】
【発明の効果】本発明により、新規の、優れたＮＯ合成
酵素活性化剤および血圧降下剤が容易に提供されるとこ
ろとなった。
酵素活性化剤および血圧降下剤が容易に提供されるとこ
ろとなった。
Claims (3)
- 【請求項１】 フラビンアデニンジヌクレオチドを有効
成分とすることを特徴とするＮＯ合成酵素活性化剤。 - 【請求項２】 フラビンアデニンジヌクレオチドを有効
成分とすることを特徴とする血圧降下剤。 - 【請求項３】 フラビンアデニンジヌクレオチドを有効
成分とすることを特徴とする抗血小板薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29844693A JPH07149655A (ja) | 1993-11-29 | 1993-11-29 | Ｎｏ合成酵素活性化剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29844693A JPH07149655A (ja) | 1993-11-29 | 1993-11-29 | Ｎｏ合成酵素活性化剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07149655A true JPH07149655A (ja) | 1995-06-13 |
Family
ID=17859821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29844693A Pending JPH07149655A (ja) | 1993-11-29 | 1993-11-29 | Ｎｏ合成酵素活性化剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07149655A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07188052A (ja) * | 1993-12-27 | 1995-07-25 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | インターフェロン用作用効果増強剤及び該増強剤とインターフェロンとを含有する抗ウイルス活性増強組成物 |
| KR20000054332A (ko) * | 2000-06-01 | 2000-09-05 | 김진경 | 혈관내피세포 성장인자 억제제에 의한 암 치료법 |
| JP2004115507A (ja) * | 2002-09-06 | 2004-04-15 | Sankyo Co Ltd | 血管内皮性酸化窒素の合成促進剤 |
| FR3087650A1 (fr) * | 2018-10-31 | 2020-05-01 | Bio Even | Flavine adenine dinucleotide (fad) pour son utilisation pour la prevention et/ou le traitement de cancer |
-
1993
- 1993-11-29 JP JP29844693A patent/JPH07149655A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07188052A (ja) * | 1993-12-27 | 1995-07-25 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | インターフェロン用作用効果増強剤及び該増強剤とインターフェロンとを含有する抗ウイルス活性増強組成物 |
| KR20000054332A (ko) * | 2000-06-01 | 2000-09-05 | 김진경 | 혈관내피세포 성장인자 억제제에 의한 암 치료법 |
| JP2004115507A (ja) * | 2002-09-06 | 2004-04-15 | Sankyo Co Ltd | 血管内皮性酸化窒素の合成促進剤 |
| FR3087650A1 (fr) * | 2018-10-31 | 2020-05-01 | Bio Even | Flavine adenine dinucleotide (fad) pour son utilisation pour la prevention et/ou le traitement de cancer |
| WO2020089310A1 (fr) * | 2018-10-31 | 2020-05-07 | Bio Even | Flavine adénine dinucléotide (fad) pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement de cancer |
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