JPH07124252A

JPH07124252A - 化学療法剤を固定化した不溶性担体を用いた、負に帯電した生理活性物質の吸着、分離および定量方法。

Info

Publication number: JPH07124252A
Application number: JP5312459A
Authority: JP
Inventors: Masashi Funayama; 政志船山; Seizo Funayama; 政蔵船山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-11-07
Filing date: 1993-11-07
Publication date: 1995-05-16

Abstract

(57)【要約】【目的】化学療法剤を固定化したことを特徴とする、負
に帯電した生理活性物質を吸着、分離、定量する不溶性
担体を提供する。更に、当該担体を洗浄する方法を提供
する。【構成】不溶性担体、化学療法剤および当該不溶性担体
を洗浄する洗浄液よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は核酸関連物質等の負に帯
電した生理活性物質の吸着に関わり、第一に、全身性エ
リトマトーデス等の患者の血液中に出現し、病気の進行
と密接な関係にあるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ
核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体複合体、ＲＮＡ
−抗ＲＮＡ抗体複合体、抗ＤＮＡ抗体、抗ＲＮＡ抗体等
の核酸、核酸−抗核酸抗体複合体等の負に帯電した生理
活性物質の吸着除去に関する。第二に、当該担体を用い
た、負に帯電した生理活性物質の定量に関する。第三
に、本発明に関わる緩衝液を用いた当該担体の洗浄、再
生方法に関する。尚、本発明に関わる負に帯電した生理
活性物質には、発熱性リポ多糖は含まれない。また、本
発明に関わる化学療法剤には、アクチノマイシンＤは含
まれない。

【０００２】

【従来の技術】全身性エリトマトーデス等の疾患によ
り、血液中にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体
複体、ＲＮＡ−抗ＲＮＡ抗体複合体、抗ＤＮＡ抗体、抗
ＲＮＡ抗体等の核酸、核酸−抗核酸抗体複合体等が出現
する。病気の進行を阻止し、その症状を軽減し、治癒を
促進する為に、これらのものを除去することが望まれ
る。しかし、これらの有害物質のみを血液中から選択的
に除去する手段は未だに考案されていない。

【０００３】

【問題を解決する為の手段】本発明はこの様な事情を鑑
みてなされたものであり、血液等の体液中に存在する有
害な核酸、核酸−抗核酸抗体複合体、ビリルビン等の負
に帯電する生理活性物質を、選択的に吸着除去、定量す
る方法に関するものであり、その特徴は、第一に、化学
療法剤を固定化したことを特徴とする不溶性担体を充填
した装置により、血液等の体液中に存在する核酸、核酸
−抗核酸抗体複合体、ビリルビン等の負に帯電する生理
活性物質を吸着、除去することにある。本発明の第二の
特徴は、前記の手段により捕捉した負に帯電する生理活
性物質を、従来法により定量することにある。本発明の
第三の特徴は、本発明に関わる緩衝液を用いた当該担体
の洗浄、再生方法に関する。核酸、核酸−抗核酸抗体複
合体、ビリルビン等の毒性物質は、透析で除去すること
はできない為、吸着剤を用いてこれらの毒性物質を除去
する試みが為されてきた。試みられた方法は、粒状活性
炭、アンバーライトＩＲ−９３８（イオン交換樹脂）、
イオン交換繊維等であるが、何れも吸着性能が充分では
なく、未だに製品として市場に出るには至っていない。
一方、本発明の発明者らは、アミノグリコシド系抗生物
質をリガンドとする担体を用いて、発熱性リポ多糖を吸
着除去する方法を発明し、出願に及んだ（特許出願公告
平５−６８４５０）。本発明の発明者らは、当該担体を
用いて、核酸、核酸−抗核酸抗体複合体、ビリルビン等
の毒性物質の吸着を試みたところ、当該担体はこれらの
毒性物質をも吸着することを見い出し、本発明を完成す
るに至った。本発明の特徴は、本発明に関わるリガンド
の抜群の吸着活性にある。例えば、ストレプトマイシン
固定化繊維は、アンバーライトＩＲ−９３８のおよそ１
０倍量の負に帯電した生理活性物質を吸着する。また、
本発明に関わる吸着担体は、ヘパリン共存下に於いて、
吸着活性が殆ど低下しないという特徴を持つ。また、本
発明に用いる担体は、粒状物、繊維、またはこれらの高
次加工品の形状をとりうる。担体の大きさには特に制限
はない。粒状物の場合は、直径０．５マイクロメーター
以上、２ミリメーター以以下が適当で、繊維状の場合は
断面の直径が０．０１マイクロメーター以上、１００マ
イクロメーター以下が望ましい。繊維の断面は円形の
他、非円形断面も用いられる。担体の使用形態には限定
がなく、粒状、繊維状の他、これらの高次加工物の形態
で用いることができる。また担体が繊維の場合、強度の
大きいポリマーによって補強することも可能である。本
発明に関わる担体は多孔質構造を持つことも可能であ
り、細孔構造は、０．７〜２．１ｍｌ／ｇ、比表面積１
５０ｍ^２／ｇ〜５００ｍ^２／ｇ範囲であることが望まし
い。

【０００７】リガンドと担体との結合方式には担体結合
法、架橋法、包括法、グラフト法等が考えられるが、通
常、担体結合法を用いる。担体とリガンドとは、直接結
合してもスペーサーを介して結合してもよい。担体とリ
ガンドとの結合方法は、共有結合、イオン結合、疎水結
合、配位結合等が考えられるが、リガンドの剥離の可能
性の低い共有結合が望ましい。共有結合の例としてアミ
ド結合、エステル結合、エーテル結合、アミノ結合、イ
ミノ結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合等が挙げ
られる。担体にリガンドまたはスペーサーを結合させる
方法として望ましいのは、ハロゲン化シアン、エポキシ
化合物、ハロゲノ有機ハロイド、ジアルデヒド、ベンゾ
キノン等により担体を活性化した後、ポリペプチド系抗
生物質または、アミノグリコシド系抗生物質または、ス
ペーサーを結合させる。スペーサーを介したリガンドの
結合方法には、エポキシ化法、還元アミノ化法、チオー
ル活性化法等が考えられる。

【０００８】血液中に存在する核酸、核酸−抗核酸抗体
複合体、ビリルビン等の負に帯電する生理活性物質を吸
着、除去した後に担体は再生処理される。再生処理は以
下の様にして行なう。即ち、最初に被処理担体の２〜１
０倍量の生理食塩液で処理する。つぎに、被処理担体の
２〜１０倍量の陽イオン界面活性剤等本発明に関わる薬
剤を含有する緩衝液で洗浄する。最後に、生理食塩液に
置換するか、保存液に置換して保存する。

【０００９】本発明に関わる担体を用いた生理活性物質
の定量は以下の様にして行なう。即ち、表面にアミノ基
を持つマイクロプレートにグルタルアルデヒド法等の方
法により、本発明に関わる化学療法剤を導入することに
より、マイクロプレートを調製する。当該マイクロプレ
ートの各穴に検体を分取し、インキュベートした後、当
該マイクロプレートを洗浄し、更に、当該マイクロプレ
ートのリガンドに結合している、被定量物質に対する標
識抗体を添加し、室温で反応させた後、マイクロプレー
トを洗浄し、酵素基質を添加し、室温で反応させた後、
特定波長の吸光度を測定することにより、定量する。

【００１０】

【発明の効果】本発明により、ヘパリンの存在に関係な
く、血液中の負に帯電した生理活性物質を有効に吸着除
去することができる。また、本発明に関わる担体を用い
て負に帯電した生理活性物質を吸着し、従来法により定
量することにより、容易に負に帯電した生理活性物質の
定量が可能になる。更にまた、本発明に関わる緩衝液に
より本発明に関わる担体を洗浄することにより、担体の
再生が容易になる。

【００１１】

【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。《実施例１．》ストレプトマイシン固定化ポリビニルアルコール膜の調
製１）ポリビニルアルコール中空子膜（クラレＳＰ４０
１、ポアサイズ約０．１μｍの均質膜）をミニカラムに
固定化したミニモジュールを作製した。２）１ＭＮａＣｌ溶液１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミ
ニモジュールの中空糸の内外を通過させた。３）精製水１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュー
ルの中空糸の内外を通過させた。４）６０℃の１ＭＮａＯＨ溶液１００ｍｌを流速２０ｍ
ｌ／ｍｉｎでミニモジュールの中空糸の内外を１時間循
環させた。５）４）の溶液にエピクロルヒドリン溶液１５ｍｌを添
加し、更に２時間循環させた。６）精製水１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュー
ルの中空糸の内外を通過させた。７）６０℃の０．６％ヘキサメチレンジアミン溶液５０
ｍｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎで２時間、ミニモジュール
の中空糸の内外を循環させた。８）精製水１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュー
ルの中空糸の内外を通過させた。９）６０℃の１ＭＮａＯＨ溶液１００ｍｌを流速２０
ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュールの中空糸の内外を１時間
循環させた。１０）９）の溶液にエピクロルヒドリン溶液１５ｍｌを
添加し、更に２時間循環させた。１１）精製水１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジ
ュールの中空糸の内外を通過させた。１２）６０℃の２ｍＭストレプトマイシン溶液（ｐＨ１
２）１００ｍｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎで２時間、ミニ
モジュールの中空糸の内外を循環させた。１３）１ＭＮａＣｌ溶液１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎで
ミニモジュールの中空糸の内外を通過させた。１４）精製水１ｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュ
ールの中空糸の内外を通過させた。１５）２０％エタノール溶液に溶解した０．２ＭＮａＯ
Ｈ溶液１００ｍｌを流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュ
ールの中空糸の内外を通過させた。１６）流出液のｐＨが７．０になるまで、パイロジェン
フリーの精製水を流速２０ｍｌ／ｍｉｎでミニモジュー
ルの中空糸の内外を通過させた。１７）ミニモジュールをプラスチック袋に入れ、ヱチレ
ンオキサイドガスを充填、保存した。

【００１２】《実施例２．》ウシ血液中のビリルビンの吸着除去実施例１で調製したミニモジュールにビリルビン含有血
液（ビリルビン２０ｍｇにジメチルスルフォキシド１ｍ
ｌ、０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液２ｍｌを添加して溶
解し、０．１％のヘパリンを含有するウシ全血１００ｍ
ｌに混合して調整）１００ｍｌを流速１０ｍｌ／ｍｉ
ｎ、膜透過速度０．２ｍｌ／ｍｉｎで１時間循環させ
た。ミニモジュール通過血液について、ビリルビン測定
試薬（第一化学薬品製、Ｂｉｌセット第一）を用いてビ
リルビンの定量を行なった。その結果、ミニモジュール
処理後の血液中のビリルビン量は１ｍｇ／ｍｌ以下とな
った。また、血液の回収量は９８ｍｌ、ＩｇＧの回収率
は９８％、アルプミンの回収率は９６％であった。

【００１３】《実施例３．》ポリミキシンＢ固定化ポリエチレン中空糸膜の調製１）ポリエチレン製多孔性中空子（内径０．６２ｍｍ
φ、外径１．２ｍｍφ、平均孔孔径０．１μｍ）に電子
線加速器（加速電圧２ＭｅＶ、電子線電流１ｍＡ）を用
いて、窒素雰囲気下で２００ＫＧｙを照射した後、減圧
下でグリシジルメタクリレートの蒸気と４０℃で６時間
接触させ、気相グラフト化反応を行なった。この際の重
量増加率は９０％であった。２）炭酸緩衝液（ｐＨ１０．５）に溶解した３％ポリミ
キシンＢ溶液に当該グラフト膜を浸漬し、８０℃で２４
時間反応させ、ポリミキシンＢが基材１ｇ当たり０．５
ｍｍｏｌ固定化された多孔性中空子膜を得た。以上の
１）および２）の操作はすべて無菌操作で行ない、更
に、無菌的にミニカラムに充填し、ミニモジュールを調
製した。３）ミニモジュールをプラスチック袋に入れ、エチレン
オキサイドガスを充填、保存した。

【００１４】《実施例４．》抗ＤＮＡ抗体の吸着試験実施例３で調製したミニモジュールに、コウシ胸腺由来
の二本鎖ＤＮＡ溶液を循環させることにより、ＤＮＡを
結合させた。固定化ＤＮＡの表面密度は、ＤＮＡ中の燐
酸基をモリブデンブルー法により定量することにより求
めた。当該カラムに抗ＤＮＡ抗体を含有する、ＳＬＥモ
デルマウスの血液を循環させることにより、ＤＮＡを結
合させたカラムへの抗ＤＮＡ抗体の吸着試験を行なっ
た。吸着試験前後の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定
し、抗ＤＮＡ抗体の除去率を求めた。抗ＤＮＡ抗体の除
去率はおよそ９８％であった。

【００１５】《実施例５．》抗ＤＮＡ抗体定量用マイクロプレートの調製（１）グルタルアルデヒド溶液（電子顕微鏡グレード）
をｐＨ７．４のリン酸緩衝液に溶解し、２％の濃度に調
製した。（２）アミノ基固定化マイクロプレート（住ベメディカ
ル製）の各穴に（１）のグルタルアルデヒド溶液を０．
２ｍｌづつ分注し、室温で２時間反応させた。（３）マイクロプレートの各穴を精製水で２回洗浄し
た。（４）ストレプトマイシン（明治製菓製）をｐＨ７．４
のリン酸緩衝液に溶解し、２％の濃度に調製した。（５）（４）のストレプトマイシン溶液を（３）のマイ
クロプレートの各穴に各０．２ｍｌづつ分注し、４℃で
終夜反応させた。（６）ウシ血清アルブミン（和光純薬製）をｐＨ７．４
のリン酸緩衝液に溶解し、１％の濃度に調製した。（７）（６）のウシ血清アルブミン溶液を（５）のマイ
クロプレートの各穴に各０．２ｍｌづつ分注し、室温で
４時間反応させた。（８）マイクロプレートの各穴を精製水で２回洗浄し
た。（９）（８）のマイクロプレートを凍結乾燥した。

【００１６】《実施例６．》抗ＤＮＡ抗体の定量（１）実施例５で調製したマイクロプレートの各穴にＳ
ＬＥ患者血清０．１ｍｌを分注し、室温で２時間反応さ
せた。（２）マイクロプレートの各穴をリン酸緩衝液で２回洗
浄した。（３）マイクロプレートの各穴に抗・抗ＤＮＡ標識抗
体、各０．２ｍｌを分注し、室温で２時間反応させた。（４）マイクロプレートの各穴をリン酸緩衝液で２回洗
浄した。（５）マイクロプレートの各穴に酵素基質各０．２ｍｌ
を分注し、室温で３０分反応させた。（６）３０分後にマイクロプレートの各穴に反応停止液
を各０．１ｍｌ分注し、反応を停止し、各穴の吸光度を
測定した。（７）抗ＤＮＡ抗体標準液を用いて（１）〜（６）の操
作を行ない、検量線をえがいた。（８）（７）の検量線から患者血清中の抗ＤＮＡ抗体量
を求めた。

【００１７】《実施例７．》大腸菌抽出液中の蛋白質、核酸、エンドトキシンの分離大腸菌Ｂ株（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｔｒ
ａｉｎＢＡＴＣＣ１１３０３）の凍結乾燥菌体２．
５ｇをリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５０ｍｌに懸濁し、
超音波処理し、菌体を破砕した。４℃、１０，０００ｒ
ｐｍで遠心分離し、大腸菌Ｂ株抽出液を得た。この抽出
液１０ｍｌに１％ヒト血清アルブミン溶液（ｐＨ６．
０）０．５ｍｌを添加した。アミノーセルロファイン
（チッソ社製）にストレプトマイシンを５ｍｇ／ｍｌ固
定化して得た担体５ｍｌと、前記ヒト血清アルブミン溶
液含有大腸菌Ｂ株抽出液１０．５ｍｌとを試験管に分取
し、栓をして、２時間震盪攪拌した。２時間後、遠心分
離して得た上清について、ＤＮＡ含量、ＲＮＡ含量、エ
ンドトキシン含量、ヒト血清アルブミソ含量を求めた。
その結果、ＤＮＡ含量、ＲＮＡ含量、エンドトキシン含
量は何れも０．０１％以下であった。ヒト血清アルブミ
ン含量は９６％であった。

【００１８】《実施例８．》実施例７で使用したストレ
プトマイシン固定化セルロファイン５ｍｌを滅菌生理食
塩液５０ｍｌで洗浄した。次に、０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムおよび２％のストレプトマイシンを含有する０．１
Ｎリン酸緩衝液５０ｍｌで洗浄した。更に、７０％エタ
ノール溶液５０ｍｌで洗浄した。最後に滅菌生理食塩液
５０ｍｌで洗浄し、カラムに充填した。当該カラムの滅
菌生理食塩液をすべて流出させた後、新たに、滅菌生理
食塩液２０ｍｌをアプライし、１ｍｌづつ分画した。各
画分について、パイロディック（生化学工業製）によ
り、エンドトキシン活性を測定した。何れの画分からも
エンドトキシンは検出されなかった。当該吸着洗浄操作
を１０回繰り返しても、当該ゲルの吸着活性の低下は認
められなかった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化学療法剤を固定化したことを特徴と
する不溶性担体。
【請求項２】化学療法剤が；（１）ＤＮＡ合成系に
作用する化学療法剤（マイトマイシンＣ、ブレオマイシ
ン、フレオマイシン、カルチノフィリン、ストレプトニ
グリン、ザルコマイシン、ネオカルチノスタチン等）、
（２）ＲＮＡ合成系に作用する化学療法剤（クロモマイ
シン、ドーノマイシン、ブルラマイシン、リファマイシ
ン、ストレプトバリシン、ストレプトリジギン、フォル
マイシン、コルジセピン、ツバーサイジン、サンギバマ
イシン、トヨカマイシン等）、（３）蛋白質合成を阻害
する化学療法剤（アミノグリコシド系抗生物質、テトラ
サイクリン、エディン、パクタマイシン、ボトロマイシ
ン、ミカマイシン系抗生物質、チオペプチン、クロラム
フェニコール、リンコマイシン、マクロライド系抗生物
質、スパーソマイシン、アミノアシルヌクレオチド関連
物質等）、（４）細胞壁合成を阻害する化学療法剤（ペ
ニシリン系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、バ
ンコマイシン、バシトラシン、エンジュラジン、リスト
セチン、マカルボマイシン、メノマイシン、プラシノマ
イシン、ジューマイシン等）、（５）細胞質膜を障害す
る化学療法剤（ポリペプチド系抗生物質、ポリエン系抗
生物質、アミノペプチド系抗生物質等）の中から選ばれ
たことを特徴とする請求項１記載の不溶性担体。
【請求項３】請求項１記載の不溶性担体を用いて、
負に帯電した生理活性物質を吸着、分離する方法。
【請求項４】請求項１記載の不溶性担体を用いて、
負に帯電した生理活性物質を定量する方法。
【請求項５】請求項２記載の化学療法剤を含有する
ことを特徴とする、請求項１記載の不溶性担体の洗浄用
緩衝液。
【請求項６】陽イオン界面活性剤を含有することを
特徴とする、請求項１記載の不溶性担体の洗浄用緩衝
液。
【請求項７】ポリアミドイミドを含有することを特
徴とする、請求項１記載の不溶性担体の洗浄用緩衝液。
【請求項８】ポリエチレンイミンを含有することを
特徴とする、請求項１記載の不溶性担体の洗浄用緩衝
液。
【請求項９】請求項５、請求項６、請求項７および
請求項８記載の洗浄用緩衝液を用いて、請求項１記載の
不溶性担体を洗浄する方法。