JPH07104342B2 - 粒子を含む生物試料の含有粒子量の診断上の有意性を決定する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、粒子含有生物試料の含有粒子量に係る診断上
の有意性を決定する方法に関する。より詳細には、本発
明は、生物試料の第１の区分（第１部分量）内の粒子の
数を低倍率の第１顕微鏡装置により数え、ここで診断上
の有意性があると認められる場合は、該生物試料の２番
目の区分（第２部分量）中の粒子の数を第２顕微鏡装置
により高倍率下で数えて調べる２段階法に関する。

背景技術 従来、粒子含有生物試料の含有粒子量の診断上の有意性
を調べる方法は、生物試料の部分量のうちの一部少量部
分、即ち、アリコート（aliquot）を顕微鏡装置で調べ
ることによって行なっている。具体的には、１つのアリ
コート中の粒子の存在数を調べる。このステップを繰り
返し、十分に多数のアリコート（これは１部分量とな
る）が調べられる。調べた各アリコート中に発見された
粒子の数が合計される。この１部分量中の粒子の合計数
に数えの精度処理した粒子の数を算出し、この算出した
数を生物試料の診断上の有意性を決定するための限界値
と比べる。例えば、尿の場合、高解像倍率400x下で単位
量当たりの視野中に赤血球が３個より多く、あるいは、
白血球が５個より多く発見されれば、この尿試料は、通
常、診断性の有意性があると考えられる（時として、量
の単位は顕微鏡下の視野として表わされる）。

上記方法は、調べるアリコートの個数が十分多く、それ
により生物試料の全量に対するサンプリングが統計的に
健全に行われるという仮定に基づいている。調査の統計
上の健全さを確実にするため、十分に多数のアリコート
が調査される。このように１段階の高解像力で生物試料
の調査を行なうと、極微量の試料しか調査できないた
め、一定量の試料を調べるときに、試料の試験数が多く
なり、これは極めて時間がかかるという欠点がある。そ
の上、粒子含有生物試料の含有粒子量を診断上の有意性
を決定する諸従来法はいずれも、大部分手動的方法で行
われてきた。従って、目の緊張や疲労の結果として、粒
子の検出を仕損じとか分類の仕損じとかの間違いが起こ
る。

細胞分析用の２重改造の方法及び装置が完成された。例
えば、米国特許第3,970,841号及び米国特許4,061,914号
が参照される。しかし、これらの特許のいずれにおいて
も、目的物が検出されるまで、低解像力が用いられる。
ついで、目的物が高解像力で分析されるが、この間も、
低解像力が同じ試料部分（同一の生物試料部分量）の分
析に連続して用いられているのである。上記いずれの特
許も生物試料の含有粒子量の診断上の有意性を決定する
方法を教示あるいは開示していない。

発明の要約 本発明の目的は、上記欠点をなくし、検査時間の短縮を
図る、あるいは同時間でより多くの試料数を調べること
を可能にする２段階検査方法を提供することにある。即
ち、最初に低解像力で生物試料の第１部分量の複数個の
アリコートを調べ（これにより高解像力下で調べるより
も試料のより多くの部分を最初に調べることが可能にな
る）、次に、必要に応じて、同じ生物試料の第２部分量
の複数個のアリコートを高解像力下で調べるといった２
段階法を採り、１段階法に比べより多くの試験体（試料
数）を調べることができる。

本発明の、粒子含有生物試料の粒子含有量の診断上の有
意性を決定する方法は、生物試料のアリコートの複数個
Y1をまず低解像力下で調べることにより行われる。各ア
リコートに対して光学静止像が作られる。各光学静止像
が電子像に変換される。電子処理装置を用いて電子像内
の粒子の数を数える。低解像力下でのアリコートに対す
る調査は、第１の所定の数Y1のアリコートに対して行わ
れる。電子処理装置は、低解像力下で調べた第１所定数
のアリコート中の合計粒子数Z1を得る。ここで所定数と
は、調査される全数のアリコートの量に対するサンプリ
ングが統計的に健全に行われるような数を意味し、一般
的に知られた数である。この合計粒子数Z1に数えの精度
処理をした数を第１の限界値X1と比較する。この比較に
基づき、生物試料の含有粒子数が診断上の有意性を有さ
ないと思われる場合は、調査を中止する。有意性がある
と診断された場合は調査を続行する。生物試料の一定量
の別の（第２の）部分量を調べる。即ち、この部分量の
アリコートの複数個Y2を第２の顕微鏡装置によって高解
像力下で調べる。各アリコートに対する光学静止像が形
成される。各光学静止像は電子像に変換される。電子処
理装置を用いて各電子像中の粒子の数を数える。高解像
力下で調べるアリコート数Y2は、第２の所定数である
（上記所定数と同じ意味であり、この場合は、特に高解
像度における所定数である）。高解像力下で調べた第２
の所定数（複数）のアリコート中の粒子の合計数Z2を求
める。合計粒子数Z2に数えの精度処理をした数を第２の
限界値X2と比較する。この比較により、生物試料の一定
量中の含有粒子数の診断上の有意性が決定される。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法の実施に用いられる検査装置の斜
視図。

図1aは、図１の装置において用いられるフロー・セル
（flow cell）の斜視図。

図２は、図１の装置の用いられる電子処理装置の概略
図。

図３は、計数に関する統計分布と確率を示すグラフ。

発明の詳細な説明 本発明の生物試料の含有粒子量の診断上の有意性を決定
する方法において、粒子含有生物試料の１部分量のうち
の一定量のアリコートは所定面積に広げられ、第１の顕
微鏡により低解像力下で調べられる。この顕微鏡は、上
記面積部分の光学静止像を形成する。光学静止像は電子
像に変換される。電子処理装置は、電子像中の粒子の数
を電子的に数える。低解像力下で調べられる複数のアリ
コートの個数が第１の所定数に達するまで上記ステップ
を繰り返す。電子像中に数えられる粒子の総数Z1−これ
は低解像力下で調べられる全部のアリコートの個数中に
数えられる粒子数である−を求める。求めた粒子の総数
に数えの精度処理した数 を算出して、この算出した数を第１の限界値と比較す
る。この比較に基づき、含有粒子数の診断上の有意性が
あるか、あるいは、ないことを決定する。有意性が無い
場合は、実施中の方法を中止する。

有意性がある場合は、方法を続行する。生物試料の第２
部分量の１つのアリコートを所定面積に広げる。広げた
アリコートを第２顕微鏡装置により高解像力下で調べ
る。該面積部分の光学静止像が形成される。この光学像
は電子像に変換される。電子像中の粒子の数を電子処理
装置によって数える。高解像力下における上記操作をア
リコートの総数が第２の所定数と等しくなるまで繰り返
す。高解像力下で調べた全アリコート中の合計粒子数Z2
を求める。ついで、この合計数に数えの精度処理した数 を算出し、この算出数を第２の限界値と比較する。この
比較により、生物試料の診断上の有意性を決定する。

本発明の方法を、図１に示す装置10を用いて実施するこ
とができる。装置10は顕微鏡30を有しており、顕微鏡30
は、低解像力レンズ31及び高解像力レンズ33を有する。
これらのレンズ31及び33の何れも、スライド20の試験面
積部分18に焦点を合わすことができる。生物試料の各ア
リコートをスライド20上に広げる。ストロボ装置32によ
り試験面積部分18を下から照らす。ストロボ装置32は、
米国Scientific Instrument Corporationのモデル3018
であることが好ましい。顕微鏡30においてストロボ装置
32のストロボ光をスライドの厚み方向に照射する。好ま
しくは、ストロボ光を1/60秒照射する。これにより顕微
鏡における一連の光学静止像が形成される。

顕微鏡30の出力は、カメラ34−このカメラは好ましくは
JVC Corporation製のVidiconカメラモデルKY1900′であ
る−に結像される。カメラ34により各光学像は電子像に
変換される。カメラ34に付設されたアナログ・デジタル
（A/D）変換器により各電子像は複数の映像単位（ピク
セル）に分割され、各ピクセルが各像の一部に相当す
る。複数の電子像（各光学像が１つの電子像に変換され
る）は、粒子像を含んでいる。生物試料が希釈されてい
る場合（例えば、尿の場合）があるので、各電子像が１
個以上の粒子像を含んでいるとは限らない。

すべての電子像がカメラ34から処理装置36に送られる。
処理装置36は電子像から粒子像を取り出す。粒子像は、
目で判別できる各種特性記号による配列でディスプレイ
52に表示される。

本発明の方法は、図1aに示すフロー・セル（flow cel
l）20aを使用することによっても実施することができ
る。フロー・セル20aは、米国特許第4,338,024号に記載
されているタイプのものである。尿のような試料液を第
１の入口17aを通してフロー・セル20aに送り込む。第２
の入口19aを通してシース液（Sheath fluids）をフロー
・セル20aに供給する。試料液はフロー・セルの中で矢
印Ａで示す方向に移動する。試料液は、延伸する領域18
a−この領域の各部における流れ方向に直交する幅は、
厚みの多数倍である−上に広げられる。この場合、粒子
同士が本質的に重なり合わないように広げられる。フロ
ー・セル20a中の試料液は、顕微鏡30の焦点が領域18aに
合うように顕微鏡30の下に置かれる。試料液がフロー・
セル20aを移動する間に、顕微鏡30が検査領域18aの試料
液の光学像を捕える。試料液は移動するので、装置10は
固定されている。このようにして、顕微鏡30により形成
される各光学像は、試料液のそれぞれ異なる部分に対す
るものである。

処理装置36は、カメラ34から電子像を受けるフレイムグ
ラバー・アンド・メモリー（フレーム像取り込み記憶装
置）40を有する。この像取り込み記憶装置40は、モント
リオールのMatrox Corporationより入手可能なモジュー
ルを使用することができるが、カルフォルニア・チャト
ワースのinternational Remote Imaging Systems,Inc.
のモデル101−0009CRT/IOモジュールが好ましい。像取
り込み記憶装置40の出力は、アディショナル（増設）・
リフレッシュ・ビデオメモリー42に与えられる。ビデオ
メモリー42は、64Kのデュアルポートのルミナンス（光
度）メモリー及び32KのデュアルポートのＲ−ＹとＢ−
Ｙメモリーを有する。ビデオメモリー42の出力は、カラ
ー・モニター52に接続されたデジタル−アナログ（D/
A）変換器に与えられる。

像取り込み記憶装置40は、また、CPU（中央処理装置）
のＱバス44に接続されている（CPUは、好ましくは、Tel
esoft T68である）。Ｑバス44には、また、Chrislin In
dustries Inc.の256Kメモリー48が接続されている。更
に、フロッピー・ディスク・ドライブ62の付いたディス
ク・コントローラー60がＱバス44に接続されている。処
理装置36は、また、Ｑバス44に接続されたクロック・カ
レンダー64を有する。Ｑバス44には、また、プリンター
68の付いたシリアルポートが接続されている。メモリー
・トゥ・メモリーDMA70は、像取り込み記憶装置40から
ビデオメモリー42への像の転送を制御する。装置40は、
また、ストロボ32を活性化する。更に、プライム（基
本）・メモリーを備えるプライム・ジェネレーター72
（粒子像境界発生装置）がＱバス44に接続されている。

カメラ34からの各電子像は、像取り込み記憶装置40に記
憶される。CPU46は、処理装置36が受け取った電子像を
処理する。処理された像はビデオメモリー42に記憶さ
れ、モニター52に伝達されて表示される。処理像を長期
間記憶させておきたい場合は、それをフロッピーディス
ク62に記憶させることができる。プライム・ジェネレー
タ72は、電子像中の粒子のエッジ（境界）を検出する。
プライム・ジェネレーター72の作動は、1983年２月28日
出願の米国特許出願第470,208号（日本国において昭和5
9年２月６日に出願された特願昭59−18531に相当）に述
べられており、参考として本明細書において言及する。

本発明の方法においては、一般的に、粒子含有生物試料
の１部分量は低解像度下においては2.88マイクロリット
ルであり、これを第１の所定のアリコート数700に分割
して行なう。各アリコートをある領域に広げるが、アリ
コートを顕微鏡のスライド20上に広げてもよいし、図1a
のフロー・セル20a内を通過させてもよい。各アリコー
トは、低解像力レンズ31を有する顕微鏡30により低解像
度下で調べられる。顕微鏡30は、スライド20の試験面積
部分18又はフロー・セル20aの領域18aの光学静止像を形
成する。各光学像は、カメラ34により電子像に変換され
る。処理装置36は、カメラ34から送信される各電子像中
の粒子の数を電子的に数える。

このステップは、低解像力下で調べる複数のアリコート
の数が第１の所定数Y1（即ち700）と等しくなるまで繰
り返される。第１の所定数のアリコートの総量を生物試
料の第１の部分量とすることができる。この第１部分量
（あるいは、低解像力下で検査される第１の所定数のア
リコートの総量）中に検出される粒子の総数Z1が数えら
れる。この粒子総数Z1に数えの精度処理した（Z1に を加減する）値を算出する。この算出値を第１の限界値
（一般的に知られる値あるいは数値範囲である）と比較
する。この比較により前記算出値が前記第１の限界値か
ら外れるときは、検査されている生物試料は診断性の有
意性を有しないと決定し、本発明の方法を中止する。限
界値から外れていないときは、方法を続行する。

方法を続行する場合、生物試料の第２の部分量のアリコ
ートが面積部分18又は領域18aに広げられる。一般的に
高解像度下においては、部分量は0.18マイクロリットル
であり、これを一般的に700である第２の所定数（Y2）
に分ける。各アリコートは、高解像力レンズ33を有する
顕微鏡30により高解像力下で調べられる。広げられた部
分の光学静止像が形成される。光学像は、ついでカメラ
34により電子像に変換される。処理装置36は電子像中の
粒子数を電子的に数える。

アリコートを広げ、光学静止像を形成し、各光学静止像
を電子像に変換し、そして各電子像中の粒子の数を電子
的に数えるステップは、高解像力下で検査する複数のア
リコートの数が第２の所定の数700と等しくなるまで、
繰り返される。この第２の所定数のアリコートの総量は
第２部分量と等しくすることもできる。この第２部分量
（あるいは第２の所定数のアリコート）中の粒子の総数
Z2が数えられる。同様に、この総数に数えの精度処理を
行なった数をを第２の限界値と比較する。この比較に基
づき、生物試料の診断上の有意性が決定される。

図１からわかるように、低解像力レンズ31と高解像力レ
ンズ33は、同じ顕微鏡30の部分とすることができる。

本発明の理論は、以下のように理解することができる。
検査する生物試料は、その診断上の有意性を決めるため
の限界値を有する。試料が尿の場合、例えば、尿の沈殿
物の400Xの視野の高解像力下のHPF（高解像度下の部分
量）当たり赤血球が３個より多く、あるいは、白血球が
５個より多く発見されれば、普通、診断上の有意性があ
ると考えられる。前述したように、量の単位は顕微鏡下
の視野として表わすことができる。従って、一般に、こ
のような如何なる生物試料についても、診断上の有意性
のための限界値が存在する。その数は、生物試料単位量
当たりの粒子Ｘ個として表わすことができる。限界値
は、単位量当たり粒子Ｘ個より多くい場合もあり（例え
ば、尿の場合、HPFにおいて単位量当たり赤血球３個又
は白血球５個より多く）、単位量当たり粒子Ｘ個より少
ない場合もある（例えば、血液の場合、単位量当たり赤
血球Ｘ個より少ないことが検出されれば、この血液試料
は、診断上の有意性を有し貧血症状の可能性を示してい
ると思われる）。故に、如何なる生物試料にも、その種
類の生物試料の診断上の有意性を示す限界値があり、そ
れは普通、単位量当たりＸ個として示される。

特定の生物試料の一定量を本発明の測定法で分析する場
合、該生物試料の最初の部分量が選ばれる。その最初の
部分量が低解像力下で調べられる最初の部分量は、複数
個の単位量又は複数個のアリコートよりなっている。こ
れらの複数個の単位量につき、対象とする特定粒子の数
が合計される。従って例えば、分析用試料が尿であり、
Y1個よりなるLPF（低解像度で検査される最初の１つの
部分量）が分析され赤血球粒子がZ1個検出された場合
に、この数Z1個を限界値と比較するには数えの精度の問
題があるので、以下のように数えの精度の処理をする。

一般に、数えた数Ｎに対する数えの精度は1/Nとして変
化する。具体的に説明すると、Ｎ個の粒子が数えられた
とすると、実際の数が の範囲にある確率は95％である。従って、Ｙ個の単位量
の試料を調べて合計でＺ個の粒子が検出されたとする
と、単位量当たり（2.88/Yマイクロリットル）にほぼ95
％の確率で存在する粒子の範囲は として表わされる。このように数えの精度処理した粒子
数を限界値（単位量当りＸ個の粒子）と比較することに
より、検査する試料の診断的意義が測定される。この比
較は、具体的には、数えの精度処理した単位量（例え
ば、0.18/700又は2.88/700マイクロリットル）当たりの
粒子数 を同じ単位量当たりの臨界値と比較するか、あるいは数
えの精度処理した、１部分量に等しい単位量（0.18又は
2.88マイクロリットル）当りの粒子数 を同じ単位量（１部分量、即ちLPF又はHPF）当たりの限
界値と比較することにより行われる。

この理論は、以下の実施例により、最も良く示すことが
できる。

実施例１ 生物試料は尿である。診断的意義限界値はHPF当り赤血
球粒子３個以上又は白血球粒子５個以上である。尿試料
につき、最初の部分量が低解像力下で分析される。

低解像力下で見られる１アリコートの試料の量は、一般
的に高解像力下で見られる１アリコートの試料の量の16
倍である（例えば、前述したように、低解像力下におけ
るアリコート量は2.88マイクロリットルの1/700、高解
像力下におけるアリコートの量はその1/16であり、0.18
マイクロリットルの1/700である）。従って、低解像力
下における診断的意義限界値は、LPF当り赤血球粒子48
個以上又はLPF当り白血球粒子80個以上である。赤血球
粒子及び白血球粒子は低解像力下では正確には識別でき
ないので、低いほうの限界値、即ちLPF当り赤血球型又
は白血球型の粒子48個が用いられる。

検査する最初の部分量中のフレームの数がLPF当たりの
アリコート数Ｙと等しいことが望ましい。尿試料はフレ
ームの数だけ調べられる。前記フレーム中の白血球サイ
ズの粒子の数が合計される。

発見された粒子の合計数が25だとする。発見された粒子
の数が 即ち15ないし35の範囲にある確率は95％である。試料が
含む赤血球型粒子数は、LPFの限界値48個より少なく、
あるいは、HPFの３個より少ないので、この試料は診断
的意義を有しないと考えられるので測定を中止する。

実施例２ 実施例１と同様に、尿が生物試料である。同様に、赤血
球型粒子に焦点を当てる。低解像力下での尿の診断的意
義限界値は、LPF当り赤血球型粒子48個以上である。最
初の部分量、即ち、LPF1個が検査される。

低解像力下で検出された１部分量中の赤血球型粒子の合
計数Z1が49だとする。検出された粒子の数が 即ち35乃至63の範囲にある確率は95％である。LPF当り
赤血球型粒子が63個検出されることも可能であり、か
つ、この数はLPF当り粒子48個（第１の限界値）を超え
ているので、高解像力下での分析が更に必要である。

高解像力下でHPF当り以下の粒子が検出されたとする。

蓚酸カルシウム粒子 １個 赤 血 球 １個 白 血 球 １個 この数は、HPF当り赤血球３個（第２の限界値）より少
なく、あるいはHPF当り白血球５個（第２の限界値）よ
り少ないので、この試料は診断的意義を有さない。

実施例３ この場合も尿を調べ、赤血球型粒子を分析する。この場
合もLPF1個を調べ、限界値がLPF当り赤血球型粒子48個
である。

赤血球型粒子81個が検出されたとする。粒子数が63乃至
99の範囲にある確率は、95％である。従って、高解像力
下での検査に進む。

高解像力下で、HPF当り赤血球４個と血球球１個が検出
される。これは診断的に意義を有し軽い血尿症（microh
ematuria）を示す。

実施例４ 尿を検査する。低解像力下で赤血球粒子2,500個が検出
される。この粒子数が2,400ないし2,600の間に入る確率
は95％である。この範囲のあらゆる数字が48を超える。

高解像力下で試験して、HPF当り白血球が140個と赤血球
が10個存在する。これは診断的意義を有し、膿尿症及び
血尿症を示す。

以上説明したように、最初に低解像力下で生物試料を調
べることにより、最初により多くの試料を調べらること
ができる。高倍率下でのアリコートの検査は、低倍率下
でのアリコートの検査より少ない量の試料で行なうこと
ができる。このように、本発明の診断上の有意性を決定
して行なう２段階方法により、より多くの試料を迅速に
検査することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒子を含む生物試料の内容物の診断上の有
   意性を測定する方法であって、 （ａ）前記試料の部分量中のアリコートを拡張した領域
   に分布し、 （ｂ）第１の顕微鏡装置により低分解能で前記アリコー
   トを検査し、 （ｃ）前記拡張領域の静止光学像を形成し、 （ｄ）前記光学像を電子像に変換し、 （ｅ）前記電子像内の粒子の数を電子的に計数し、 （ｆ）低分解能で検査される前記アリコートの数が第１
   の所定数と等しくなるまで、上記ａ項乃至ｅ項の操作を
   繰り返し、 （ｇ）低分解能で検査された前記第１の所定数のアリコ
   ート中の前記各計数された粒子数の合計を算出し、 （ｈ）前記算出粒子数に数えの精度の処理した数を第１
   限界値と比較し、 （ｉ）前記比較に基づいて前記生物試料の診断上の有意
   性がない場合には当該方法を終了し、 （ｊ）有意性がある場合には測定を継続し、 （ｋ）前記生物試料の別の部分量中のアリコートを拡張
   した領域に分布し、 （ｌ）第２の顕微鏡装置により高分解能で前記アリコー
   トを検査し、 （ｍ）前記拡張領域の静止光学像を形成し、 （ｎ）前記光学像を電子像に変換し、 （ｏ）前記電子像内の粒子の数を電子的に計数し、 （ｐ）高分解能で検査される前記アリコートの数が第２
   の所定数と等しくなるまで、上記ｋ項乃至ｏ項の操作を
   繰り返し、 （ｑ）高分解能で検査された前記第２の所定数のアリコ
   ート中の前記各計数された粒子数の合計を算出し、 （ｒ）前記算出粒子数に数えの精度の処理した数を第２
   限界値と比較し、 （ｓ）前記比較に基づいて前記生物試料の内容物の診断
   上の有意性を測定する、 ことを含む測定方法。
2. 【請求項２】請求の範囲第１項記載の測定方法におい
   て、前記第１及び第２顕微鏡装置が同一の顕微鏡装置で
   ある測定方法。
3. 【請求項３】請求の範囲第１項記載の測定方法におい
   て、前記生物試料が尿である測定方法。