JPH07103979A - 競合法を利用する生体成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体成分に対する抗体を利用した、生体成
分、例えば血中リポプロティンスモールＡ(以下、Ｌｐ
(a)と略称することがある)等の免疫学的測定方法におい
て、被検試料の前希釈操作を軽減、あるいは削除させる
ことのできる方法を提供する。 【構成】 酵素免疫測定法(以下、ＥＬＩＳＡと略称す
ることがある)等の免疫学的測定方法に基づく生体成分
の測定において、生体成分を捕捉する固相抗体と被検試
料中の生体成分との反応時に、固相抗体と同一の遊離抗
体を生体成分を含む被検試料に添加することにより、固
相抗体と遊離抗体との間で生じる当該生体成分に対する
競合反応を利用し、当該生体成分が固相抗体側に過剰に
結合する量を制限するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体成分に対する抗体
を利用した、生体成分、例えば血中リポプロティンスモ
ールＡ(以下、Ｌｐ(a)と略称することがある)等の測定
方法に関する。さらに詳細には、酵素免疫測定法(以
下、ＥＬＩＳＡと略称することがある)等の免疫学的測
定方法に基づく血中Ｌｐ(a)の測定において、固相抗体
と被検試料中の抗原蛋白質との反応時に、固相抗体と同
一の遊離抗体をＬｐ(a)を含む被検試料に添加すること
により、固相抗体と遊離抗体との間で生じる当該抗原蛋
白に対する競合反応を利用し、当該抗原蛋白が固相抗体
側に結合する量を制限するものである。これにより、従
来不可欠の被検試料の前希釈操作を軽減、あるいは削除
させることのできる方法を提供する。従って、本発明は
生体成分の測定に生化学的あるいは医学的意義が存する
分野、例えば臨床診断の分野において利用価値を有す
る。

【０００２】

【従来技術および発明が解決しようとする問題点】リポ
蛋白は蛋白質と脂質の複合体であり、生体内、特に血液
中の一成分としてその存在が知られている。リポ蛋白に
は、低比重リポ蛋白(以下ＬＤＬと称する)、高比重リポ
蛋白(以下ＨＤＬと称する)等、種々のリポ蛋白が存在す
るが、なかでも、リポ蛋白の１つであるリポプロティン
スモールＡの生体内存在量と動脈硬化症との関連性が最
近特に注目されている。

【０００３】Ｌｐ(a)は１９６３年にＢｅｒｇ等によっ
て発見され(Berg K. Acta Pathol.Microbiol.Scand. 5
9, p.369-382(1963))、構造的に類似したＬＤＬの遺伝
的変異として報告されたもので、現在では動脈硬化性疾
患の独立した危険因子として考えられている。Ｌｐ(a)
の構造やその生理的意義については不明な点が多かった
が、１９８７年 Ｅａｔｏｎ等により、Ｌｐ(a)に固有な
アポ蛋白であるアポリポプロティンスモールＡ(以下ａ
ｐｏ(a)と称する)が、血液線溶系の酵素の一種であるプ
ラスミノーゲンと構造的に著しい相同性を有することが
発表されてから、リポ蛋白と血液凝固線溶系を結びつけ
るものとして、動脈硬化性疾患に深く関与しているもの
と考えられている(J.W.McLean, et al., Nature 300,
p.132-137(1987))。

【０００４】図１にＬｐ(a)の構造を示す。図に示した
ように、Ｌｐ(a)はＬｐ(a)に固有なアポ蛋白であるａｐ
ｏ(a)が、ＬＤＬにそのアポ蛋白(リポ蛋白の脂質部分を
除いた蛋白部分、ＬＤＬの場合ａｐｏB100)とのジスル
フィド結合を介して結合した構造を有する。ａｐｏ(a)
は大量の糖鎖を含む高分子蛋白であり、その分子量は２
８万から８０万ダルトンまで報告されている。その特徴
は線溶系に働くプラスミノーゲンとの構造的な相同性が
著しいことである。プラスミノーゲンにはループ状のク
リングルドメインが５つあり、最後にセリンプロテアー
ゼ構造部分を持っている。ａｐｏ(a)も同じくこのクリ
ングル構造を有しており、プラスミノーゲンのクリング
ル４と相同性の高いクリングルを最大３７個、次にプラ
スミノーゲンのクリングル５に相同性の高い部分、最後
にセリンプロテアーゼ部分に相同性の高い部分から形成
されている。

【０００５】ところで、心筋梗塞、虚血性心疾患、脳梗
塞などの疾患を持つ疾患群は有意にＬｐ(a)値が対象群
に比べ高値を示すことが知られている。例えば、Ｄａｈ
ｌｅｎ等は２３２人についての血清Ｌｐ(a)を測定し、
Ｌｐ(a)値が４８ｍｇ／ｄｌ以下群に比較し、４８ｍｇ
／ｄｌ以上群では１１年間の経過中で心血管障害による
死亡が２.６倍に達し、虚血性心疾患の発症率は４倍高
いと報告している(DahlenG.H. et al., Circulation 7
4, p.758-765(1986))。また、バイパス手術後１〜１４
年を経過した１６７例で、移植静脈片の梗塞群と非梗塞
群ではＬｐ(a)値が有意に異なり、梗塞群が非梗塞群の
２倍であり、この差異は若年者で著しいとの報告もある
(Hoff H.F. et al., Circulation 77, p,1238- (198
8))。

【０００６】このＬｐ(a)の血液内の存在量を測定する
ことにより、これらの疾患群の危険因子をあらかじめ知
ることが可能である。また、危険因子の予知の結果、患
者の血液を取り出し、Ｌｐ(a)を除いた後、再び採血者
に血液を戻す手法であるプラズマアフェレーシス、ある
いは、薬物投与によりＬｐ(a)を除くことができればこ
れら危険因子を除くことが可能となる。

【０００７】従来、Ｌｐ(a)を初めとする血中内に多量
に存在する物質を測定する場合は、一般に免疫比濁法等
が広く使用されており、当該測定方法の測定域は５〜５
０ｍｇ／ｄｌとみなされている。

【０００８】ところで、一般に、血中に存在する物質の
存在量は、一般健常人であれば一定量に対して正規分布
するが、本発明の対象であるＬｐ(a)は、健常人の分布
が１〜１００ｍｇ／ｄｌと非常に広く分布し、その分布
形態は、極度に低値側に傾いた８〜９ｍｇ／ｄｌを中央
値とする対数正規分布することが特徴的である。上述の
ような、分布及び濃度域が対象となるＬｐ(a)抗原量の
定量には、免疫比濁法よりもさらに感度が高いことが要
求され、この意味においてＥＬＩＳＡ法はＬｐ(a)の測
定に関しては有利である。また、Ｌｐ(a)には、多くの
多形性があり(Utermann,G et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 86,P.4171-4174(1989))、これがＬｐ(a)の測定にお
ける問題となっている。この点について言及すれば、免
疫凝集体の量を測定する免疫比濁法は、厳密には、各フ
ェノタイプに起因する分子サイズに影響される可能性は
高く、その意味からもＬｐ(a)の測定に限っては、ＥＬ
ＩＳＡ法が推奨されるものである。

【０００９】Ｌｐ(a)の測定に対するＥＬＩＳＡ法につ
いては、現実的に、既にいくつかの報告がなされてお
り、例えば、抗ａｐｏ(a)抗体を利用した酵素免疫測定
法(ＥＬＩＳＡ法)を挙げることができる(H.Guo, et a
l., J. Lipid Res., 30, p.23-37(1989); W.L.T.Wong
et al., Clin. Chem., 36, p.192-197(1990))。上述の
理由により、Ｌｐ(a)を測定する際においては、ＥＬＩ
ＳＡ法が推奨されるところであるが、しかしながら、Ｅ
ＬＩＳＡ法は高感度であるが故に、被測定物質が多量に
存在する被検試料の実際の測定においては、通常、数段
階に及ぶ希釈操作を経て被検試料を調製することを与儀
なくされる。この被検試料調製操作は、測定者に多大な
労力を課すとともに、希釈率の増大は誤差の増大に結び
つくものである。この被検試料の希釈操作の問題は、解
決されるべき重要な問題点である。

【００１０】

【問題点を解決するための手段、発明の構成】上述の問
題点に鑑み、本発明者は競合反応をＥＬＩＳＡ法に導入
し、被検試料の希釈操作を軽減する方法を考案し、この
方法を用いてＬｐ(a)を好適に測定できる方法の提供を
課題として検討した。

【００１１】本発明者等は鋭意研究の結果、ハイブリド
ーマ法の技術を用いてＬｐ(a)の添加によって免疫凝集
反応を認めないモノクローナル抗体を作製し、当該モノ
クローナル抗体をマイクロプレートに固定化し、抗原抗
体反応時にこの固定したモノクローナル抗体と同一種の
遊離モノクローナル抗体を被検試料とともに添加するこ
とにより、被検試料中のＬｐ(a)に対して固定化抗体と
遊離抗体が競合する免疫学的測定系を構築した。なお、
遊離モノクローナル抗体の添加量については、被検試料
中のＬｐ(a)量を考慮して、適宜増減させることができ
る。この方法により、固相抗体側に結合すべきＬｐ(a)
量を制限することが可能となり、従来不可欠であった希
釈操作を低減あるいは削除することのできる本発明を完
成させるに至った。

【００１２】以下本発明を詳細に説明する。本測定法の
原理及び測定法の概略を図２及び図３に示した。今回の
測定法では、一般的にサンドイッチＥＬＩＳＡに分類さ
れる測定系の一次反応(抗原抗体反応)時に、固相抗体と
同一の遊離抗体を被検試料とともに反応系に添加させる
ことを大きな特徴とする。また、今回の測定法で使用す
る固相抗体及び競合反応に使用する遊離抗体は、Ｌｐ
(a)の添加に際して免疫学的凝集体を認めないモノクロ
ーナル抗体を用いることを特徴とする。なお、本測定系
の標識抗体に関しては、Ｌｐ(a)を認識するポリクロー
ナル抗体、あるいは固定化抗体とは異なるＬｐ(a)上の
エピトープを認識するものであればどの部位を認識して
いるモノクローナル抗体を用いても本測定は可能であ
る。

【００１３】１分子中の１つの認識部位を認識する性質
を有するモノクローナル抗体の場合、通常、抗原の添加
によって抗原抗体複合体からなる凝集体を形成すること
はないが、Ｌｐ(a)のように１つの分子内に数多くの同
一ドメインがくり返し存在している場合は、たとえモノ
クローナル抗体といえどもこのくり返し構造を認識して
おれば、凝集体を形成する可能性は否定できない。本測
定系においては、固相抗体に結合する抗原量を制限する
ことを目的としており、液相で生ずる免疫複合体形成
は、本来目的とした反応を複雑にするものであり、回避
されるべきものである。

【００１４】以下、本発明の最適な実施態様である、遊
離抗体を競合的にサンドイッチ型ＥＬＩＳＡに適用した
場合のＬｐ(a)の測定について概略を述べる。しかしな
がら、本発明は抗ヒトａｐｏ(a)モノクローナル抗体を
用いた免疫学的測定方法を広く包含するものであり、サ
ンドイッチ型ＥＬＩＳＡに限定されるものではない。サ
ンドイッチ型ＲＩＡ(放射免疫測定法)、蛍光物質あるい
は化学発光物質を標識化した免疫学的測定法等も好適な
態様と考えられる。また、本測定法は、上記の測定法等
において希釈を不可欠とするものであれば、Ｌｐ(a)以
外の他の測定対象に対しても適用可能と考えられる。

【００１５】まず、あらかじめ用意した抗Ｌｐ(a)モノ
クローナル抗体をマイクロタイタープレートのウエルに
吸着固定させる。アルブミンを用いブロッキングを行な
った後、ここに、Ｌｐ(a)を含む被検試料である血清
と、マイクロタイタープレートに固定させたものと同一
の遊離モノクローナル抗体を同時に添加する。インキュ
ベートし、洗浄後、酵素標識した抗ヒトａｐｏ(a)モノ
クローナル抗体を加えインキュベートし、さらに洗浄
後、基質を添加し、一定時間後に反応を停止し、基質の
発色量を吸光度で測定すればよい。

【００１６】抗ａｐｏ(a)モノクローナル抗体は通常用
いられている方法を参考にして調製すればよく、その概
略は以下の如くである。Ｌｐ(a)は正常ヒト血清より、
超遠心処理で比重１.０６３〜１.１５の画分を分取し、
それらをセファロース ＣＬ-６Ｂカラムを用いて精製す
る。得られたＬｐ(a)をマウスに免疫し、この免疫マウ
スより得られた脾臓細胞と適当なミエローマ細胞とを融
合し、ハイブリドーマを作製してこのハイブリドーマよ
り所望のマウスモノクローナル抗体を調製する。

【００１７】マウス抗体のスクリーニング法は以下の方
法で行なった。つまり、まずＬｐ(a)に反応するが、Ｌ
ＤＬには反応しないクローンを選択した。得られたクロ
ーンをマウス腹腔に接種し腹水を得、これをプロテイン
Ａカラムに通液して精製し、数十種のモノクローナル抗
体を得た。得られたモノクローナル抗体のうち、プラス
ミノーゲンに反応しない抗体を選択し、かつＬｐ(a)添
加により免疫学的比濁を認めない抗体を選択した。

【００１８】標識抗体の調製法としては固相抗体とは異
なる部位を認識する抗ヒトａｐｏ(a)モノクローナル抗
体を上述の方法に準じて調製し、マウス腹腔よりプロテ
インＡカラムを用いて精製し、さらにペプシン処理後、
そのＦ(ab)'2を例えば石川等の方法に従いペルオキシダ
ーゼで標識すればよい。

【００１９】

【発明の効果】本発明において確立した測定系によっ
て、ＥＬＩＳＡ法において従来不可欠であった被検試料
の希釈操作を低減あるいは削除することのできる、Ｌｐ
(a)の好適な測定が可能となった。

【００２０】以下、本発明の理解を深めるために実施例
に添って説明するが、本発明はこれらの実施例に何等限
定されるものではない。

【００２１】

【実施例】 実施例 １ (モノクローナル抗体の調製並びに選定)精製ヒトＬｐ
(a)を免疫原として、本発明において使用されるモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマはケラーとミル
シュタインの方法(Kohler and Milstein, Nature,256
p,495-497(1975))としてよく知られた方法を参考にして
得られた。得られたハイブリドーマより調製された数十
種の抗ヒトＬｐ(a)モノクローナル抗体をすべて、Cambi
aso等の方法に従い、ラテックス粒子（セキスイ化学
社）に感作した(Cambiaso CL etal. Methods Enzymol.7
4(B):106,1981.)。Ｌｐ(a)を含む血清５０μｌにグリシ
ンからなる緩衝液７６０μｌを添加し、３７℃で一定時
間インキュベーション後、調製した抗ヒトＬｐ(a)モノ
クローナル抗体感作ラテックスを２００μｌ添加し、３
７℃で一定時間反応させ、その凝集を吸光度を測定する
ことにより確認した。

【００２２】上述の方法で選択された抗体のラテックス
凝集反応での挙動を図４に示す。白丸実線はラテックス
凝集反応において凝集を与えない抗体、黒角実線は凝集
を与える抗体の挙動である。これらの測定で凝集反応を
起こさないモノクローナル抗体、Ｎｏ.８９５を選択
し、固相抗体及び競合抗体用として選択した。なお、標
識抗体用のモノクローナル抗体は、本選択方法による必
要性はない。こうして得られたモノクローナル抗体を実
施例２に示すＥＬＩＳＡ法による測定に供した。なお、
上述のモノクローナル抗体はいずれもＩｇＧ1タイプの
サブクラスに属し、代表的なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマは微工研に受託番号１３１２３号
(ＦＥＲＭ Ｐ-１３１２３)として寄託されている。

【００２３】実施例 ２ (モノクローナル抗体を用いた競合法ＥＬＩＳＡによる
Ｌｐ(a)の測定)ＰＢＳよりなる抗体希釈液に抗ヒトａｐ
ｏ(a)モノクローナル抗体を５μｇ／ｍｌになるように
溶解し、これを９６ウエルマイクロタイタープレート(N
UNC 社製、IMMUNO MODULE MAXI SORP F8)に、１ウエル
当たり１５０μｌずつ添加し、４℃で一晩靜置した。各
ウエルより上記抗体液を吸引除去し、マイクロプレート
洗浄器(DYNATECH社製、ULTRA WASH II)を用いて洗浄
後、１％アルブミン(生化学工業社製、Albumin Fractio
n V, Bovine)溶解液を３００μｌ添加し、４℃で靜置し
た。アルブミン溶液を吸引除去し、前記緩衝液で３回洗
浄し測定ウエルとした。

【００２４】別に、ペルオキシダーゼ標識した抗ａｐｏ
(a)モノクローナル抗体Ｆ(ab)'2を準備した。また、Ｐ
ＢＳを基本とする緩衝液に、１００μｇ／ｍｌの濃度に
なるよう、マイクロタイタープレートに結合させたもの
と同種のモノクローナル抗体を希釈し、これを競合抗体
液とした。

【００２５】測定用ウエルに下記の方法で調製した測定
試料を１ウエルあたり１０μｌずつ入れ、同時に上述の
競合抗体液を２００μｌ入れ、３０℃で４５分間放置し
一次の抗原抗体反応を実施した。各ウエル中の反応液を
吸引除去し、０.５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ(ｐ
Ｈ７.２)で４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した抗ａ
ｐｏ(a)モノクローナル抗体Ｆ(ab)'2 を１ウエル当たり
１００μｌずつ加え、さらに４５分間反応を行なった。
同様に緩衝液で４回洗浄の後、基質溶液(ＯＰＤ／Ｈ₂Ｏ
₂)１００μｌを各ウエルに添加後、４５分間遮光下で放
置した後、２Ｎ硫酸を各ウエルに１００μｌずつ加え反
応を停止した。撹拌し、各ウエルを均一にした後、４９
２ｎｍの吸光度を測定した。

【００２６】実施例 ３ (ポリクローナル抗体を用いた競合法ＥＬＩＳＡによる
Ｌｐ(a)の測定)ＰＢＳよりなる抗体希釈液に抗ヒトａｐ
ｏ(a)抗体(Ｄａｋｏ社)を１０μｇ ／ｍｌになるように
溶解し、これを９６ウエルマイクロタイタープレート(N
UNC 社製、IMMUNO MODULE MAXI SORP F8)に、１ウエル
当たり１５０μｌずつ添加し、４℃で一晩靜置した。各
ウエルより上記抗体液を吸引除去し、マイクロプレート
洗浄器(DYNATECH社製、ULTRA WASH II)を用いて洗浄
後、１％アルブミン(生化学工業社製、Albumin Fractio
n V, Bovine)溶解液を３００μｌ添加し、４℃で靜置し
た。アルブミン溶液を吸引除去し、前記緩衝液で３回洗
浄し測定ウエルとした。

【００２７】別に、ペルオキシダーゼ標識した抗ａｐｏ
(a)モノクローナル抗体Ｆ(ab)'2を準備した。また、Ｐ
ＢＳを基本とする緩衝液に、１００μｇ／ｍｌの濃度に
なるよう、マイクロタイタープレートに結合させたもの
と同種のポリクローナル抗体を希釈し、これを競合抗体
液とした。

【００２８】測定用ウエルに下記の方法で調製した測定
試料を１ウエルあたり１０μｌずつ入れ、同時に上述の
競合抗体液を２００μｌ入れ、３０℃で４５分間放置し
一次の抗原抗体反応を実施した。各ウエル中の反応液を
吸引除去し、０.５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ(ｐ
Ｈ７.２)で４回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識した抗ａ
ｐｏ(a)モノクローナル抗体Ｆ(ab)'2 を１ウエル当たり
１００μｌずつ加え、さらに４５分間反応を行なった。
同様に緩衝液で４回洗浄の後、基質溶液(ＯＰＤ／Ｈ₂Ｏ
₂)１００μｌを各ウエルに添加後、４５分間遮光下で放
置した後、２Ｎ硫酸を各ウエルに１００μｌずつ加え反
応を停止した。撹拌し、各ウエルを均一にした後、４９
２ｎｍの吸光度を測定した。

【００２９】実施例 ４ (モノクローナル抗体を用いた競合法ＥＬＩＳＡの評価)
高濃度のＬｐ(a)を含む被検試料である血清の希釈系を
用い、競合法ＥＬＩＳＡで測定し、その反応曲線を図５
に示した。また対象として、競合抗体を含まない同様の
系で測定した結果を白丸で示した。図に示したように、
本測定方法により、０.５〜約１００ｍｇ／ｄｌ付近ま
でＬｐ(a)が測定可能となり、一方、従来のＥＬＩＳＡ
法での測定範囲は０.０５〜約２ｍｇ／ｄｌである。対
象と比較すれば、本測定法においては約５０〜１００倍
の希釈を削除できることとなる。

【００３０】実施例 ５ (ポリクローナル抗体を用いた競合法ＥＬＩＳＡの評価)
高濃度のＬｐ(a)を含む血清被検試料の希釈系を用い、
実施例３に示した方法に従い、その反応曲線を得た。結
果は図６に示したように、Ｌｐ(a)の固相抗体への結合
は抑制されたが、反応曲線はある臨界的なＬｐ(a)濃度
を境に、急激に上昇しＬｐ(a)の定量性を示さなかっ
た。 以上の結果は、抗原抗体反応時、一定の臨界的Ｌ
ｐ(a)濃度で反応液相で抗原とポリクローナル抗体との
間に、免疫複合体が形成されたことを示唆するものであ
り、以後、その状態でのＬｐ(a)の定量化を複雑なもの
としている。

【００３１】実施例 ６ (Ｌｐ(a)に対して凝集体を認めるモノクローナル抗体を
競合抗体、及び固相抗体に用いた系でのＥＬＩＳＡの評
価) 高濃度のＬｐ(a)を含む血清被検試料の希釈系を用
い、実施例２に示した方法に従い、その反応曲線を得
た。結果は図７に示したように、実施例５の結果とほぼ
同様の結果が得られた。 しかし、本実施例における測
定は、ポリクローナル抗体系のそれと比較すると、凝集
体の形成が緩和なことに起因ためか、反応曲線の上昇は
緩やかであり、約２０ｍｇ／ｄｌ付近までは定量可能と
考えられた。つまり、本発明におけるモノクローナル抗
体の選択はＬｐ(a)とモノクローナル抗体との免疫凝集
反応の程度に因るところが大きく、望ましくは、免疫凝
集体を認めないものが選択されるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌｐ(a)の構造を解説する図である。

【図２】 本測定の原理及び測定方法を示す図である。

【図３】 本測定の原理及び測定方法を示す図である。
(図２の続き)

【図４】 本発明に使用される抗体のラテックス凝集反
応での挙動を示す図である。

【図５】 競合法ＥＬＩＳＡでの反応曲線を示す図であ
る。

【図６】 ポリクローナル抗体を固相及び競合抗体とし
て競合法ＥＬＩＳＡの系を組んだ際の反応曲線を示す図
である。

【図７】 Ｌｐ(a)に対して凝集体を認めるモノクロー
ナル抗体を固相及び競合抗体として競合法ＥＬＩＳＡの
系を組んだ際の反応曲線を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 モノクローナル抗体を用いた免疫学的測
   定方法において、希釈操作を施さないか選択的に希釈操
   作を施した生体試料を被検試料とし、被検試料中の測定
   対象物質と当該測定対象物質を捕捉する固相抗体との反
   応時に、当該固相抗体と同一の遊離抗体を添加し、固相
   抗体と遊離抗体との間に競合を生ぜしめることを特徴と
   する生体成分の測定方法。
2. 【請求項２】 生体成分との抗原抗体反応により凝集体
   を形成することのない性質を有するモノクローナル抗体
   を固相抗体並びに遊離抗体として使用する請求項１記載
   の生体成分の測定方法。
3. 【請求項３】 測定対象物質である生体成分が血中リポ
   プロティンスモールＡである請求項１ないし請求項２に
   記載の生体成分の測定方法。
4. 【請求項４】 免疫学的測定方法が、酵素免疫測定法、
   放射免疫測定法、化学発光免疫測定法及び蛍光免疫測定
   法より選ばれる請求項１ないし請求項３に記載の生体成
   分の測定方法。