JPH0672892A - ヘモグロビン含有リポソーム - Google Patents
ヘモグロビン含有リポソームInfo
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- JPH0672892A JPH0672892A JP4230670A JP23067092A JPH0672892A JP H0672892 A JPH0672892 A JP H0672892A JP 4230670 A JP4230670 A JP 4230670A JP 23067092 A JP23067092 A JP 23067092A JP H0672892 A JPH0672892 A JP H0672892A
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- Japan
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- hemoglobin
- blood
- peptide
- containing liposome
- liposome
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
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- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ヘモグロビン含有リポソームに止血機能を持た
せることを目的とする。 【構成】ヘモグロビン含有リポソームの表面にアルギニ
ン-グリシン-アスパラギン酸の配列（ＲＧＤ配列）を含
むペプチドを結合させたものである。 【効果】これにより、血液凝固反応時に活性化した血小
板が特異的認識を行い、ヘモグロビン含有リポソームと
ともに凝集して血液凝固物ができるので、血液が本来持
つ止血機能を積極的に補助する効果を持つのである。
せることを目的とする。 【構成】ヘモグロビン含有リポソームの表面にアルギニ
ン-グリシン-アスパラギン酸の配列（ＲＧＤ配列）を含
むペプチドを結合させたものである。 【効果】これにより、血液凝固反応時に活性化した血小
板が特異的認識を行い、ヘモグロビン含有リポソームと
ともに凝集して血液凝固物ができるので、血液が本来持
つ止血機能を積極的に補助する効果を持つのである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は大量出血等により血液成
分の多くを一時的に失った患者に投与される人工血液に
関する。
分の多くを一時的に失った患者に投与される人工血液に
関する。
【０００２】
【従来の技術】血液代替物の分野において人工赤血球の
開発が進んできている（生体材料 Vol.10 No.2 p28-3
5,1992年）。輸血には、ウイルス等の感染の可能性、血
液型の適合性、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作
用、保存の困難さ、などの問題点があるが、これらを解
決するヘモグロビン含有リポソーム（人工赤血球）が開
発され、生体内で充分機能することが動物実験で確認さ
れている（人工臓器 Vol.21 No.1 p304-308,1992
年）。
開発が進んできている（生体材料 Vol.10 No.2 p28-3
5,1992年）。輸血には、ウイルス等の感染の可能性、血
液型の適合性、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作
用、保存の困難さ、などの問題点があるが、これらを解
決するヘモグロビン含有リポソーム（人工赤血球）が開
発され、生体内で充分機能することが動物実験で確認さ
れている（人工臓器 Vol.21 No.1 p304-308,1992
年）。
【０００３】大量出血等で生命の危機的状況にある場
合、循環血液量と酸素運搬能を回復させることが重要で
あるため、代用血漿と人工赤血球を併用することで救命
できる。そのため、酸素運搬機能の優れたヘモグロビン
含有リポソームは、動物実験で救命効果が高かった。し
かし、従来のヘモグロビン含有リポソームは、血液凝固
反応に対し不活性であるため（人工臓器 Vol.20 No.2 p
620-625,1991年）、大量出血させた動物を救命できて
も、失血により不足している血小板や血液凝固因子を補
わなければ、出血傾向があり、手術部位や傷口の止血が
困難であるという欠点があった。
合、循環血液量と酸素運搬能を回復させることが重要で
あるため、代用血漿と人工赤血球を併用することで救命
できる。そのため、酸素運搬機能の優れたヘモグロビン
含有リポソームは、動物実験で救命効果が高かった。し
かし、従来のヘモグロビン含有リポソームは、血液凝固
反応に対し不活性であるため（人工臓器 Vol.20 No.2 p
620-625,1991年）、大量出血させた動物を救命できて
も、失血により不足している血小板や血液凝固因子を補
わなければ、出血傾向があり、手術部位や傷口の止血が
困難であるという欠点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】大量出血等で血液成分
の多くを失った患者を救命するための人工血液には、酸
素運搬機能の他、上述したように止血作用を補助する作
用を付加する必要がある。
の多くを失った患者を救命するための人工血液には、酸
素運搬機能の他、上述したように止血作用を補助する作
用を付加する必要がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】血小板は種々の要因で活
性化すると血小板膜上に存在する糖蛋白質ＧＰIIｂとII
Iａが複合体を形成し、フィブリノーゲンに代表される
接着性タンパクのアルギニン-グリシン-アスパラギン酸
配列（以下ＲＧＤ配列と略す）を認識して血小板と接着
性タンパクが結合することが明らかになっている（Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA Vol.82 p8057 1985年）。
性化すると血小板膜上に存在する糖蛋白質ＧＰIIｂとII
Iａが複合体を形成し、フィブリノーゲンに代表される
接着性タンパクのアルギニン-グリシン-アスパラギン酸
配列（以下ＲＧＤ配列と略す）を認識して血小板と接着
性タンパクが結合することが明らかになっている（Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA Vol.82 p8057 1985年）。
【０００６】人工血液に止血補助機能を持たせるために
鋭意検討を重ねた結果、この細胞接着性蛋白質に共通す
る最小活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドをヘモグ
ロビン含有リポソームに結合させると、活性化した血小
板はフィブリノーゲンだけでなくヘモグロビン含有リポ
ソームにも結合できるため、フィブリノーゲンや血小板
が少ない状態でも凝集塊（血栓）が形成され、止血を補
助できることを見いだし本発明を完成した。
鋭意検討を重ねた結果、この細胞接着性蛋白質に共通す
る最小活性部位（ＲＧＤ配列）を含むペプチドをヘモグ
ロビン含有リポソームに結合させると、活性化した血小
板はフィブリノーゲンだけでなくヘモグロビン含有リポ
ソームにも結合できるため、フィブリノーゲンや血小板
が少ない状態でも凝集塊（血栓）が形成され、止血を補
助できることを見いだし本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は、ＲＧＤ配列を含むペプチ
ドを結合したヘモグロビン含有リポソームからなる人工
血液である。
ドを結合したヘモグロビン含有リポソームからなる人工
血液である。
【０００８】ＲＧＤ配列を有するペプチドは特に限定さ
れないが、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸の配列
（ＲＧＤ配列）を含む２０個以下、望ましくは１０個以
下のアミノ酸がペプチド結合をもって連結した化合物が
好適に使用される。そのペプチド合成は、通常の液相及
び固相合成法を用いれば良く、また自動ペプチド合成装
置（Applied Biosystems社 430A型，等）を用いても合
成される。
れないが、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸の配列
（ＲＧＤ配列）を含む２０個以下、望ましくは１０個以
下のアミノ酸がペプチド結合をもって連結した化合物が
好適に使用される。そのペプチド合成は、通常の液相及
び固相合成法を用いれば良く、また自動ペプチド合成装
置（Applied Biosystems社 430A型，等）を用いても合
成される。
【０００９】ＲＧＤ配列を有するペプチド（以下、ＲＧ
Ｄペプチドと呼ぶ）をヘモグロビン含有リポソームの膜
に結合させる方法は特に限定されないが、その方法の１
つに、ＲＧＤペプチドとリン脂質が共有結合した化合物
（以下、ＲＧＤペプチド結合リン脂質と呼ぶ）を用いる
方法がある。同様にコレステロールや脂肪酸にＲＧＤペ
プチドを結合させた分子を用いることもできる。
Ｄペプチドと呼ぶ）をヘモグロビン含有リポソームの膜
に結合させる方法は特に限定されないが、その方法の１
つに、ＲＧＤペプチドとリン脂質が共有結合した化合物
（以下、ＲＧＤペプチド結合リン脂質と呼ぶ）を用いる
方法がある。同様にコレステロールや脂肪酸にＲＧＤペ
プチドを結合させた分子を用いることもできる。
【００１０】本発明におけるＲＧＤペプチド結合リン脂
質とは、リン脂質の親水部（極性頭部）にＲＧＤペプチ
ドを共有結合した構造の分子である。ＲＧＤペプチドと
リン脂質を共有結合させるには、リン脂質の極性部に反
応活性な官能基が必要である。これにはホスファチジル
エタノールアミンのアミノ基，ホスファチジルグリセロ
ールの水酸基，ホスファチジルセリンのカルボキシル
基，あるいはアミノ基を導入したホスファチジルコリン
などがあり、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ
基が好ましく利用される。
質とは、リン脂質の親水部（極性頭部）にＲＧＤペプチ
ドを共有結合した構造の分子である。ＲＧＤペプチドと
リン脂質を共有結合させるには、リン脂質の極性部に反
応活性な官能基が必要である。これにはホスファチジル
エタノールアミンのアミノ基，ホスファチジルグリセロ
ールの水酸基，ホスファチジルセリンのカルボキシル
基，あるいはアミノ基を導入したホスファチジルコリン
などがあり、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ
基が好ましく利用される。
【００１１】リン脂質の反応活性な官能基とＲＧＤペプ
チドを共有結合させる方法としてペプチド結合があり、
公知の技術（ＤＣＣ法，アジド法，混合酸無水物法，
等）により結合させる。例えば、アミノ保護基として第
三ブチルオキシカルボニル（Boc）基を導入したＲＧＤ
ペプチドとホスファチジルエタノールアミンとをＮ，
Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をカ
ップリング試薬に使用して結合させる。
チドを共有結合させる方法としてペプチド結合があり、
公知の技術（ＤＣＣ法，アジド法，混合酸無水物法，
等）により結合させる。例えば、アミノ保護基として第
三ブチルオキシカルボニル（Boc）基を導入したＲＧＤ
ペプチドとホスファチジルエタノールアミンとをＮ，
Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をカ
ップリング試薬に使用して結合させる。
【００１２】また、水酸基に公知の技術によりカルボキ
シル基を導入したコレステロールや脂肪酸をカルボジイ
ミドを用いてＲＧＤペプチドを結合させ、ＲＧＤペプチ
ド結合コレステロールやＲＧＤペプチド結合脂肪酸を合
成し、以下に述べるＲＧＤペプチド結合リン脂質の使用
方法と同様に利用し目的の人工血液を得ることもでき
る。
シル基を導入したコレステロールや脂肪酸をカルボジイ
ミドを用いてＲＧＤペプチドを結合させ、ＲＧＤペプチ
ド結合コレステロールやＲＧＤペプチド結合脂肪酸を合
成し、以下に述べるＲＧＤペプチド結合リン脂質の使用
方法と同様に利用し目的の人工血液を得ることもでき
る。
【００１３】本発明のＲＧＤペプチドが膜表面に固定さ
れているヘモグロビン含有リポソームの製造は、上記の
ＲＧＤペプチド結合リン脂質をリポソーム膜構成脂質に
均一に混合し調製するか、又はヘモグロビン含有リポソ
ームの浮遊液中にＲＧＤペプチド結合リン脂質を添加す
ることで調製できる。また、脂肪酸を荷電物質に使用し
たヘモグロビン含有リポソームを水溶性カルボジイミド
のカルボキシル基で活性化しＲＧＤペプチドと結合させ
る方法もある。
れているヘモグロビン含有リポソームの製造は、上記の
ＲＧＤペプチド結合リン脂質をリポソーム膜構成脂質に
均一に混合し調製するか、又はヘモグロビン含有リポソ
ームの浮遊液中にＲＧＤペプチド結合リン脂質を添加す
ることで調製できる。また、脂肪酸を荷電物質に使用し
たヘモグロビン含有リポソームを水溶性カルボジイミド
のカルボキシル基で活性化しＲＧＤペプチドと結合させ
る方法もある。
【００１４】ヘモグロビン含有リポソームの原料及び製
造方法については、特開平2-149512等に記載されている
通りである。つまり、水和したリポソーム構成リン脂質
とヘモグロビン水溶液を混和、撹拌すればよい。この
時、ヘモグロビン水溶液の濃度は３０〜６０％が望まし
い。このようにして製造されたヘモグロビン含有リポソ
ームは、粒子径１μ以下（平均０．２μ）、総脂質重量
濃度に対するヘモグロビン（Ｈｂ）重量濃度の値は１.
３〜２.２（Hb mg／脂質 mg），総ヘモグロビンに対す
るメトヘモグロビンの比率は５％以下，ネガティブ染色
した後の透過型電子顕微鏡による観察では２〜７枚の膜
数のヘモグロビン内包リポソーム液が得られる。
造方法については、特開平2-149512等に記載されている
通りである。つまり、水和したリポソーム構成リン脂質
とヘモグロビン水溶液を混和、撹拌すればよい。この
時、ヘモグロビン水溶液の濃度は３０〜６０％が望まし
い。このようにして製造されたヘモグロビン含有リポソ
ームは、粒子径１μ以下（平均０．２μ）、総脂質重量
濃度に対するヘモグロビン（Ｈｂ）重量濃度の値は１.
３〜２.２（Hb mg／脂質 mg），総ヘモグロビンに対す
るメトヘモグロビンの比率は５％以下，ネガティブ染色
した後の透過型電子顕微鏡による観察では２〜７枚の膜
数のヘモグロビン内包リポソーム液が得られる。
【００１５】ヘモグロビン含有リポソームのＲＧＤペプ
チド結合量は、リポソーム構成脂質の主成分であるリン
脂質に対して、モル比で０.１mol％〜５０mol％、好ま
しくは０.５mol％〜２０mol％、より好ましくは１mol％
〜５mol％である。この範囲を下回る場合には活性化血
小板との凝集効果が不充分となり、上回る場合にはリポ
ソームが非特異的な凝集を起こし不安定となる。
チド結合量は、リポソーム構成脂質の主成分であるリン
脂質に対して、モル比で０.１mol％〜５０mol％、好ま
しくは０.５mol％〜２０mol％、より好ましくは１mol％
〜５mol％である。この範囲を下回る場合には活性化血
小板との凝集効果が不充分となり、上回る場合にはリポ
ソームが非特異的な凝集を起こし不安定となる。
【００１６】ヘモグロビン内包リポソームの脂質組成に
ついては特に限定されないが、フォスファチジルコリ
ン,フォスファチジルエタノールアミン,フォスファチジ
ルセリン，スフィンゴミエリン等に代表されるリン脂質
で、卵黄や大豆など天然物由来のもの、或は有機化学合
成手段により得られるものを主成分とする。特に天然リ
ン脂質を公知の方法で水素添加した飽和脂肪酸組成を有
するリン脂質が好適に使用される。さらに膜安定のため
に、コレステロールやコレスタノール等のステロール類
を添加したり、荷電を与えるためにジセチルフォスフェ
ート，高級脂肪酸，フォスファチジン酸を添加する。血
液凝固反応を促進させる効果を上げるために、天然物由
来のフォスファチジルセリンやフォスファチジルエタノ
ールアミンの比率を上げる方法もある。
ついては特に限定されないが、フォスファチジルコリ
ン,フォスファチジルエタノールアミン,フォスファチジ
ルセリン，スフィンゴミエリン等に代表されるリン脂質
で、卵黄や大豆など天然物由来のもの、或は有機化学合
成手段により得られるものを主成分とする。特に天然リ
ン脂質を公知の方法で水素添加した飽和脂肪酸組成を有
するリン脂質が好適に使用される。さらに膜安定のため
に、コレステロールやコレスタノール等のステロール類
を添加したり、荷電を与えるためにジセチルフォスフェ
ート，高級脂肪酸，フォスファチジン酸を添加する。血
液凝固反応を促進させる効果を上げるために、天然物由
来のフォスファチジルセリンやフォスファチジルエタノ
ールアミンの比率を上げる方法もある。
【００１７】以下、本発明を実施例によって詳しく説明
する。
する。
【００１８】
［実施例１］ １，ＲＧＤペプチド結合リン脂質の調製 ＲＧＤペプチドとして、テトラペプチド：アルギニン-
グリシン-アスパラギン酸-セリン ,略号：RGDS）を用
いる場合の調製法について、その実施例を挙げる。自動
ペプチド合成装置(Applied Biosystems 430A型）により
ペプチドＲＧＤＳを合成した。全保護基を外したペプチ
ド867mg(2mmol)をジオキサン-水（２：１）に溶かし、
かき混ぜながらジメチルスルホアミドとジ-ｔ-ブチル-
ジカルボナートを加えた。減圧濃縮し、塩酸でｐＨ２.
３にし酢酸エチルで抽出する。水洗、乾燥し、第三ブチ
ルオキシカルボニル(Boc)基を導入したＲＧＤペプチド
を得る。次いでＮ，Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド227mg(1.1mmol)と共に塩化メチレンとジオキサンの
混合溶媒に溶かし、濾液を再結晶化する。この結晶と水
素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＨＳＰ
Ｅ）1540mg(2mmol)を塩化メチレンに溶解し４時間放置
後、結晶を得る。得られた結晶を２Ｍ 塩酸／ジオキサン
に溶かし、室温で１時間放置する。減圧濃縮し乾燥して
ＲＧＤペプチド結合リン脂質（RGDS-HSPE）1338mg（1.1
mmol)が得られた。 ２，ヘモグロビン含有リポソームの調製 水素添加率９０％の精製大豆フォスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ），コレステロール（Chol），ミリスチン酸
（ＭＡ），α-トコフェロール（α-Toc）の均一混合粉
末［HSPC:Chol:MA:α-Toc=7:7:2:0.28(モル比)，日本精化
製，商品名：プレソーム］１０８ｇに等量の精製水を加
え、６０℃ ６０分間加熱し振り混ぜ水和する。ヘモグ
ロビン溶液（濃度５０ｇ／ｄｌ）６００ｍｌにフィチン
酸六ナトリウム３.７２ｇ添加し溶解した後、水和した
脂質と混合し、高速撹拌機を用いて10000rpm６０分間の
処理を行った。得られた液に生理食塩水を１０倍量加
え、遠心分離（12000xｇ，30分）し、上澄みを除去し沈
殿を回収した。この沈殿を生理食塩水で懸濁し、同様に
遠心分離と上澄みの除去を行った。再度、懸濁→遠心分
離→沈殿回収を行った後、沈殿を生理食塩水で懸濁し、
液を孔径０.４５μのメンブランフィルター（ミリポア
製）で濾過した。ヘモグロビン濃度５ｇ／ｄｌの懸濁液
1200ｍｌが得られた。さらにホ゜リエチレンク゛リコ―ル（平均分子
量約5000）が結合した水素添加大豆フォスファチジルエ
タノールアミン（PEG-PE)の3g/dl液を40ｍｌ添加し、37
℃で1時間放置してヘモク゛ロヒ゛ン内包リホ゜ソ―ム液が調製され
た。（この液を未修飾人工血液と呼ぶ）総脂質濃度35.8
mg/ml（リン脂質濃度23.9mg/ml），ヘモグロビン濃度50
mg/ml，平均粒径206nm，メトヘモグロビン比率3.4％で
あった。 ３，リポソーム表面へのＲＧＤペプチド処理 ＲＧＤペプチド結合リン脂質（この実施例では、RGDS-H
SPE）１.０ｇをヘモグロビン含有リポソーム液１０００
ｍｌに溶解し３７℃２時間保温させることで、リポソー
ム膜表面にＲＧＤペプチド結合リン脂質が固定された。
遠心分離（12000xｇ，３０分）により結合しなかったRG
D-HSPEを除き、ヘモグロビン濃度５ｇ／ｄｌに生理食塩
水で懸濁する。（この液をＲＧＤ人工血液と呼ぶことす
る。） ［比較例］ＲＧＤ配列を持たないテトラペプチド：アル
ギニン-グリシン-グルタミン酸-セリン（略号：ＲＧＥ
Ｓ）を結合したリン脂質を実施例１と同様に合成し、ヘ
モグロビン内包リポソームの表面に結合させた。以下、
この液を非ＲＧＤペプチド結合人工血液と呼ぶことにす
る。
グリシン-アスパラギン酸-セリン ,略号：RGDS）を用
いる場合の調製法について、その実施例を挙げる。自動
ペプチド合成装置(Applied Biosystems 430A型）により
ペプチドＲＧＤＳを合成した。全保護基を外したペプチ
ド867mg(2mmol)をジオキサン-水（２：１）に溶かし、
かき混ぜながらジメチルスルホアミドとジ-ｔ-ブチル-
ジカルボナートを加えた。減圧濃縮し、塩酸でｐＨ２.
３にし酢酸エチルで抽出する。水洗、乾燥し、第三ブチ
ルオキシカルボニル(Boc)基を導入したＲＧＤペプチド
を得る。次いでＮ，Ｎ’-ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド227mg(1.1mmol)と共に塩化メチレンとジオキサンの
混合溶媒に溶かし、濾液を再結晶化する。この結晶と水
素添加大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＨＳＰ
Ｅ）1540mg(2mmol)を塩化メチレンに溶解し４時間放置
後、結晶を得る。得られた結晶を２Ｍ 塩酸／ジオキサン
に溶かし、室温で１時間放置する。減圧濃縮し乾燥して
ＲＧＤペプチド結合リン脂質（RGDS-HSPE）1338mg（1.1
mmol)が得られた。 ２，ヘモグロビン含有リポソームの調製 水素添加率９０％の精製大豆フォスファチジルコリン
（ＨＳＰＣ），コレステロール（Chol），ミリスチン酸
（ＭＡ），α-トコフェロール（α-Toc）の均一混合粉
末［HSPC:Chol:MA:α-Toc=7:7:2:0.28(モル比)，日本精化
製，商品名：プレソーム］１０８ｇに等量の精製水を加
え、６０℃ ６０分間加熱し振り混ぜ水和する。ヘモグ
ロビン溶液（濃度５０ｇ／ｄｌ）６００ｍｌにフィチン
酸六ナトリウム３.７２ｇ添加し溶解した後、水和した
脂質と混合し、高速撹拌機を用いて10000rpm６０分間の
処理を行った。得られた液に生理食塩水を１０倍量加
え、遠心分離（12000xｇ，30分）し、上澄みを除去し沈
殿を回収した。この沈殿を生理食塩水で懸濁し、同様に
遠心分離と上澄みの除去を行った。再度、懸濁→遠心分
離→沈殿回収を行った後、沈殿を生理食塩水で懸濁し、
液を孔径０.４５μのメンブランフィルター（ミリポア
製）で濾過した。ヘモグロビン濃度５ｇ／ｄｌの懸濁液
1200ｍｌが得られた。さらにホ゜リエチレンク゛リコ―ル（平均分子
量約5000）が結合した水素添加大豆フォスファチジルエ
タノールアミン（PEG-PE)の3g/dl液を40ｍｌ添加し、37
℃で1時間放置してヘモク゛ロヒ゛ン内包リホ゜ソ―ム液が調製され
た。（この液を未修飾人工血液と呼ぶ）総脂質濃度35.8
mg/ml（リン脂質濃度23.9mg/ml），ヘモグロビン濃度50
mg/ml，平均粒径206nm，メトヘモグロビン比率3.4％で
あった。 ３，リポソーム表面へのＲＧＤペプチド処理 ＲＧＤペプチド結合リン脂質（この実施例では、RGDS-H
SPE）１.０ｇをヘモグロビン含有リポソーム液１０００
ｍｌに溶解し３７℃２時間保温させることで、リポソー
ム膜表面にＲＧＤペプチド結合リン脂質が固定された。
遠心分離（12000xｇ，３０分）により結合しなかったRG
D-HSPEを除き、ヘモグロビン濃度５ｇ／ｄｌに生理食塩
水で懸濁する。（この液をＲＧＤ人工血液と呼ぶことす
る。） ［比較例］ＲＧＤ配列を持たないテトラペプチド：アル
ギニン-グリシン-グルタミン酸-セリン（略号：ＲＧＥ
Ｓ）を結合したリン脂質を実施例１と同様に合成し、ヘ
モグロビン内包リポソームの表面に結合させた。以下、
この液を非ＲＧＤペプチド結合人工血液と呼ぶことにす
る。
【００１９】［試験］実施例１で調製した未修飾人工血
液（ａ液），ＲＧＤぺプチド結合人工血液（ｂ液），非
ＲＧＤペプチド結合人工血液（ｃ液）を次の２つの試験
で血液凝固補助機能と酸素運搬機能を調べた。
液（ａ液），ＲＧＤぺプチド結合人工血液（ｂ液），非
ＲＧＤペプチド結合人工血液（ｃ液）を次の２つの試験
で血液凝固補助機能と酸素運搬機能を調べた。
【００２０】〈試験〉3.8%クエン酸ナトリウム液で抗
凝固したヒト新鮮血漿を遠心分離（800rpm，５分）し、
多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。同時に遠心分離（3000
rpm１０分）により乏血小板血漿（ＰＰＰ）も得た。マ
イクロプレート上でＰＲＰまたはＰＰＰ100μｌと人工
血液５０μｌを混合した。さらに０.１ｍＭアデノシン
二リン酸（ＡＤＰ）溶液または生理食塩水を５μｌ加
え、２２℃で５分間緩やかに撹拌した。肉眼及び顕微鏡
上で液を観察すると人工血液凝集物の生成は下表のよう
になった。この結果、ＲＧＤペプチド結合人工血液のみ
が活性化した血小板と反応し凝集することが証明され
た。
凝固したヒト新鮮血漿を遠心分離（800rpm，５分）し、
多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。同時に遠心分離（3000
rpm１０分）により乏血小板血漿（ＰＰＰ）も得た。マ
イクロプレート上でＰＲＰまたはＰＰＰ100μｌと人工
血液５０μｌを混合した。さらに０.１ｍＭアデノシン
二リン酸（ＡＤＰ）溶液または生理食塩水を５μｌ加
え、２２℃で５分間緩やかに撹拌した。肉眼及び顕微鏡
上で液を観察すると人工血液凝集物の生成は下表のよう
になった。この結果、ＲＧＤペプチド結合人工血液のみ
が活性化した血小板と反応し凝集することが証明され
た。
【表１】 〈試験〉ウサギ（♂，約３Ｋｇ）の大腿動脈と大腿静
脈にカテーテルを挿入し、動脈からの脱血と静脈への人
工血液の投与を同時に等速度（５ｍｌ／ｍｉｎ）で行
い、ウサギの赤血球のヘマトクリット値の８％以下まで
血液交換した（約８００ｍｌの送脱血）。人工血液の代
わりに生理食塩水を使用した場合には、血液交換途中ま
たは交換後２４時間以内に酸素不足のため死亡したが、
人工血液では、ａ液、ｂ液、ｃ液ともに長期間（１年以
上）生存した。血液交換後、頚部の毛を剃り、メス刃で
皮膚を深さ１．５ｍｍ、長さ１ｃｍの傷をつけ、１分間
ガーゼで圧迫した。ＲＧＤペプチド結合人工血液（ｂ
液）で血液交換したウサギの場合、傷口からの出血はす
ぐに凝固し止血したが、未修飾人工血液（ａ液）と非Ｒ
ＧＤペプチド結合人工血液のウサギの場合には、傷口か
らの出血は止まらなかった。血液交換後の血小板数は、
約４万個／μｌ，フィブリノーゲン濃度約３５ｍｇ／ｄ
ｌで共に１／８程度になっていたが、ＲＧＤペプチド結
合人工血液で血液交換した場合には、止血機能が正常に
近いことが証明された。
脈にカテーテルを挿入し、動脈からの脱血と静脈への人
工血液の投与を同時に等速度（５ｍｌ／ｍｉｎ）で行
い、ウサギの赤血球のヘマトクリット値の８％以下まで
血液交換した（約８００ｍｌの送脱血）。人工血液の代
わりに生理食塩水を使用した場合には、血液交換途中ま
たは交換後２４時間以内に酸素不足のため死亡したが、
人工血液では、ａ液、ｂ液、ｃ液ともに長期間（１年以
上）生存した。血液交換後、頚部の毛を剃り、メス刃で
皮膚を深さ１．５ｍｍ、長さ１ｃｍの傷をつけ、１分間
ガーゼで圧迫した。ＲＧＤペプチド結合人工血液（ｂ
液）で血液交換したウサギの場合、傷口からの出血はす
ぐに凝固し止血したが、未修飾人工血液（ａ液）と非Ｒ
ＧＤペプチド結合人工血液のウサギの場合には、傷口か
らの出血は止まらなかった。血液交換後の血小板数は、
約４万個／μｌ，フィブリノーゲン濃度約３５ｍｇ／ｄ
ｌで共に１／８程度になっていたが、ＲＧＤペプチド結
合人工血液で血液交換した場合には、止血機能が正常に
近いことが証明された。
【００２１】［実施例２］ＲＧＤペプチドに、ペンタペ
プチド：グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン
酸-フェニルアラニン（略号：ＧＲＧＤＦ）を合成し、
実施例１と同様にＲＧＤペプチド結合リン脂質を合成
し、ヘモグロビン含有リポソームに結合させた。この人
工血液の止血補助機能を試験，で試験したところ、
実施例１と同様の作用を有することが示された。
プチド：グリシン-アルギニン-グリシン-アスパラギン
酸-フェニルアラニン（略号：ＧＲＧＤＦ）を合成し、
実施例１と同様にＲＧＤペプチド結合リン脂質を合成
し、ヘモグロビン含有リポソームに結合させた。この人
工血液の止血補助機能を試験，で試験したところ、
実施例１と同様の作用を有することが示された。
【００２２】［実施例３］へモグロビン内包リポソーム
の製法で、ポリエチレングルコールを用いない以外は実
施例１と同様にＲＧＤペプチドが結合したヘモグロビン
含有リポソームを作成した。この人工血液について止血
補助機能を試験で試験したところ、実施例１と同様の
作用を有することが確認された。
の製法で、ポリエチレングルコールを用いない以外は実
施例１と同様にＲＧＤペプチドが結合したヘモグロビン
含有リポソームを作成した。この人工血液について止血
補助機能を試験で試験したところ、実施例１と同様の
作用を有することが確認された。
【００２３】［実施例４］実施例１と同様にヘモグロビ
ン含有リポソームを調製した後、水溶性カルボジイミド
でリポソーム膜表面上のミリスチン酸のカルボキシル基
を活性化し、次いでテトラペプチド：アルギニン-グリシ
ン-アスパラギン酸-セリン（略号：ＲＧＤＳ）０.４ｇ
を加えて１８時間撹拌した。生理食塩水で希釈し遠心分
離（12000xｇ，30分）し、沈殿を懸濁してＲＧＤペプチ
ド結合人工血液を製造した。この人工血液を試験，
で止血補助機能を調べたところ、実施例１と同様の作用
が確認できた。
ン含有リポソームを調製した後、水溶性カルボジイミド
でリポソーム膜表面上のミリスチン酸のカルボキシル基
を活性化し、次いでテトラペプチド：アルギニン-グリシ
ン-アスパラギン酸-セリン（略号：ＲＧＤＳ）０.４ｇ
を加えて１８時間撹拌した。生理食塩水で希釈し遠心分
離（12000xｇ，30分）し、沈殿を懸濁してＲＧＤペプチ
ド結合人工血液を製造した。この人工血液を試験，
で止血補助機能を調べたところ、実施例１と同様の作用
が確認できた。
【００２４】
【発明の効果】以上 詳しく説明したように、本発明に
よれば、ヘモグロビン含有リポソームの表面にＲＧＤ配
列を有するペプチドを結合させることにより、活性化し
た血小板と凝集できる人工血液を提供することができ
る。大量失血で血小板や血漿中の血液凝固因子が失われ
た場合に、本発明の人工血液を用いれば、残存する血小
板が出血部位で活性化し、ＲＧＤペプチド結合ヘモグロ
ビン含有リポソームと共に凝集するので、少ない血小板
が人工血液と共に有効に機能して血液が凝固できる。ま
た、血小板が活性化しない限り、ヘモグロビン含有リポ
ソームは凝集しないので、安全性が高い。以上のよう
に、酸素運搬能だけでなく止血補助機能を有する安全性
の優れた人工血液を提供可能となる。
よれば、ヘモグロビン含有リポソームの表面にＲＧＤ配
列を有するペプチドを結合させることにより、活性化し
た血小板と凝集できる人工血液を提供することができ
る。大量失血で血小板や血漿中の血液凝固因子が失われ
た場合に、本発明の人工血液を用いれば、残存する血小
板が出血部位で活性化し、ＲＧＤペプチド結合ヘモグロ
ビン含有リポソームと共に凝集するので、少ない血小板
が人工血液と共に有効に機能して血液が凝固できる。ま
た、血小板が活性化しない限り、ヘモグロビン含有リポ
ソームは凝集しないので、安全性が高い。以上のよう
に、酸素運搬能だけでなく止血補助機能を有する安全性
の優れた人工血液を提供可能となる。
Claims (1)
- 【請求項１】アルギニン-グリシン-アスパラギン酸の配
列を含むペプチドを膜表面に結合させたヘモグロビン含
有リポソーム。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4230670A JPH0672892A (ja) | 1992-08-31 | 1992-08-31 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4230670A JPH0672892A (ja) | 1992-08-31 | 1992-08-31 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0672892A true JPH0672892A (ja) | 1994-03-15 |
Family
ID=16911465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4230670A Pending JPH0672892A (ja) | 1992-08-31 | 1992-08-31 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0672892A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2058398A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-13 | Nipro Corporation | Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast |
-
1992
- 1992-08-31 JP JP4230670A patent/JPH0672892A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2058398A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-13 | Nipro Corporation | Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040302 |