JPH0159280B2 - - Google Patents

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JPH0159280B2
JPH0159280B2 JP55098195A JP9819580A JPH0159280B2 JP H0159280 B2 JPH0159280 B2 JP H0159280B2 JP 55098195 A JP55098195 A JP 55098195A JP 9819580 A JP9819580 A JP 9819580A JP H0159280 B2 JPH0159280 B2 JP H0159280B2
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collagen
solution
factor
plasma
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Betsukaa Udoo
Buraun Konratsuto
Haimuburugaa Noberuto
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Behringwerke AG
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Publication of JPH0159280B2 publication Critical patent/JPH0159280B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人間もしくは動物の組織、なかんずく
人間の臍帯および胎盤からのコラーゲン溶液の製
法、および凝固因子およびを吸着させるた
めのその使用に関する。
コラーゲンの製法は知られている。また特定の
コラーゲン製剤が因子抗原を結合でき、その際
因子活性は上澄み液中に残ることも知られてい
る〔「Thrombos Research」第11巻第433頁
（1977）参照〕。
従来記載されている製剤は、例えば血漿からの
これらの因子の選択的および定量的吸着による上
記因子の取得にとつて適当でない。しかしなが
ら、凝固障害および創傷治瘉障害の治療にとつて
のこれらの因子の価値および必要のゆえに、特に
またフリースの製造のための基礎材料として使用
するために、かかるコラーゲンには興味がある。
今や驚ろくべきことに、特定の条件下に調製さ
れたコラーゲンが凝固因子およびを吸着し
うることが見出された。
本発明の目的は、ペプシン処理したコラーゲン
を塩基性アミノ酸なかんずくアルギニンを５〜20
ミリモル／なかんずく10nmol／の濃度で包
含しているPH７〜8.5の緩衝溶液なかんずくPH7.2
の燐酸塩で緩衝された等張性塩溶液に対して透析
することを特徴とする、コラーゲンの製法にあ
る。
適当なペプシン処理されたコラーゲンは例えば
次のようにして得ることができる。すなわち、人
間もしくは動物の組織、なかんずく人間の臍帯あ
るいは胎盤を、中性塩を包含し得るPH７〜９の適
当な緩衝溶液を用いて、なかんずく塩化ナトリウ
ムおよび場合によつては錯体形成剤例えば
EDTA、クエン酸塩あるいは燐酸塩なかんずく
EDTAおよび／または蛋白質分解酵素抑制剤、
例えば大豆トリプシンあるいはkunitz抑制剤ある
いはなかんずくアプロチニンを包含しているPH
7.4のトリス塩酸緩衝液を用いて抽出し、分離さ
れた沈殿を錯体形成剤および抑制剤を包含してい
ない同じ緩衝溶液を用いて抽出し、分離された沈
殿をpK3〜５を有する酸の水溶液なかんずく0.5
モル濃度の酢酸を用いて処理し、分離された沈殿
をpK3〜５を有する酸の水溶液なかんずく0.1モ
ル濃度の酢酸中にとり、なかんずく塩酸を用いて
PH２となし、ペプシンを用いてなかんずく１日間
４〜25℃なかんずく25℃で処理し、上澄みを分離
し、残留物のペプシン処理をくり返し、上澄み液
を分離し、両上澄み液を合し、中性塩の添加によ
りイオン強度を１〜1.3モル／に高めることに
よりコラーゲンを析出させ、分離された沈殿を中
性塩を包含しているPH７〜8.5の緩衝溶液なかん
ずくPH7.4のトリス―塩酸緩衝液中に溶解し、同
じ緩衝液で透析し、場合によつてはこの溶液にカ
オリン、エアロシルのような珪酸塩含有吸着剤例
えば「デカライト・スピードプラス（Decalite
speedplus）」（Degussa社製品）を加え、そして
コラーゲン溶液を分離する。
透析はコラーゲン溶液を透析チユーブ（例えば
ビスキング36／32型）に充填し、コラーゲン溶液
の溶媒と同じ緩衝液で透析することにより実施さ
れる。
この方法で得られるコラーゲン溶液はそれが少
くとも約37℃に加温された場合、コラーゲン原線
維を分離する。この溶液を凝固因子および
の存在下に加温する場合、析出する原繊維はこれ
ら因子を活性形態で吸着する。温度は高収量の活
性因子が得られるように選択される。この性質
は、その個々の操作処置が部分的に知られている
本発明による方法により得られるコラーゲンの更
に別の特性表示として役立てられ得る。
本発明は、特定の凝固障害および創傷治瘉障害
の治療に使用される因子およびの濃厚物の
調製に重要である。血友病Ａの治療は現在入手可
能な因子濃厚物を用いては高価である。何故な
らばその製造においては血漿中に存在している因
子含量の約10％のみしか得られないからであ
る。それゆえにもつと良好な収量を伴う方法が関
心をもたれている。
本発明により製造されたコラーゲン製剤はさら
に止血特にまた特別な出血傾向（血友病）を有す
る例えば抜歯後の患者についての止血のための創
傷被覆の調製に適している。これには、人間の血
漿をコラーゲン製剤に吸着させ、結合していない
血漿部分を洗い去り、そして凍結乾燥する。かく
して得られるフリース様コラーゲンは止血、フイ
ブリン（線維素）安定化および創傷治瘉に必要な
すべての要素を含有している。
その他に、凝固因子が吸着されているコラーゲ
ン製剤は、血小板機能の障害を診断するための診
断剤として使用できる。例えば健康人の血液もし
くは血小板に富んだ血漿上澄み液を本発明により
調製されるコラーゲン溶液と、原繊維（フイブリ
ル）が生じ得る温度で混合すると血小板が塊状と
なる。一定の病理学的状況では反応は起らない。
自然発生的な原繊維形成はこのコラーゲン溶液を
して診断剤として特によく適合せしめうる。従来
使用されてきた懸濁液は原繊維の大きさに関して
標準化可能でない。
かかるコラーゲン溶液もしくはコラーゲン懸濁
液は化粧用目的のための使用にも特に適してい
る。何故ならば化粧用目的には均質なコラーゲン
が肝要であるからである。
次に凝固因子の測定法を掲げると次のとおり
である。
因子：Ｃ：ベーリングヴエルケ社
（BehringwerkeAG）製の試験キヤツトを用い
て因子単相測定による。
因子Ｒ：AG：Laurell氏による「Anal.
Biochem.」第10巻第358頁（1965）記載の方法
により免疫学的に実施。
因子Ｒ：WF：Weiss氏他の「J.Clin.Invest.」
第52巻第2708頁（1973）記載の方法によりリス
トセチン（Ristocetin）を用いて機能的に測
定。
因子：ベーリングヴエルケ社の迅速試験を用
いる因子単相測定による。
血小板集合：Born氏による「J.Physiol.
（London）」第162巻第67頁（1962）記載の方法
による。
免疫螢光：Wick、BaudnerおよびHerzog氏等著
「Immunfluoreszenz」（1976年）の記載によ
る。
ヒドロキシプロリン測定：Woessner氏の
「Arch.Biochem.Biophys.」第95巻第440頁
（1961）記載の方法による。
本発明を以下の参考例および実施例によりさら
に説明する。
参考例 １ （コラーゲンの調製） 冷凍された10個の臍帯を解凍し、そして１cm長
さの断片に切断する。この断片を抽出緩衝液Ｉ
（NaCl0.5モル、EDTA0.01モル、アンタゴサン
（Antagosan（登録商標））250単位／を包含して
いるPH7.4の0.05モル濃度トリス／HCl）0.5と
共にメツサーホモジナイザーを用いて微細に分割
する。その混合物を遠心分離しそして上澄み液を
捨てる。沈殿を２の抽出緩衝液中で24時間４
℃において撹拌する。これを遠心分離しそして上
澄み液を捨てる。この沈殿を抽出緩衝液（抽出
緩衝液に相当するが、しかしながら何らアンタ
ゴサンを包含していない）0.5中に懸濁させ、
そして30分後に新たに遠心分離する。次いで沈殿
を0.5モル濃度の酢酸0.5中に懸濁し、そして30
分後に遠心分離する。沈殿を新鮮な0.5モル濃度
の酢酸２中にとりそして24時間４℃で撹拌す
る。遠心分離しそして上澄み液を捨てたのちに沈
殿を0.1モル濃度の酢酸３中にとりそして撹拌
しながら1n塩酸を用いてPH制御下にPH２となす。
これにペプシン〔Serva社製品、１mg当り30アン
ソン（Anson）単位〕0.5ｇを加えそして25℃の
温度で24時間撹拌する。これを遠心分離し、上澄
み液を保存し、そして残留物に新たにペプシンを
加え、同じ条件下に分解する。上記条件下におい
て臍帯組織の完全な溶解が行われる。両抽出液を
合し、固体NaClを用いて0.9モル／の濃度とな
す。２時間撹拌後に遠心分離しそして上澄み液を
捨てる。沈殿を１モル／のNaClを含有してい
るPH7.4の0.05モル濃度トリス／HCl3中に溶解
させる。溶解後同じ緩衝液で各２回10ずつで48
時間透析する。この溶液を20ｇ／のデカライト
スピードプラスと混合しそして遠心分離する。透
明な溶液は1.8mg／mlのコラーゲン含量を有して
いる。
実施例 １ 上記参考例１で得られた溶液１をビスキング
チユーブ36／32型、直径25mm、膜厚0.025mm
（Roth―Pharma Karlsruhe F.R.G.社製）に充
填し、0.01モル／のアルギニンを含有するPH
7.2の燐酸塩緩衝された生理食塩溶液（食塩８
ｇ／、燐酸水素ジナトリウム1.15ｇ／、燐酸
二水素カリウム0.2ｇ／）５で２回24時間室
温で透析し、そして続いて透析緩衝液を用いてコ
ラーゲン１mg／mlの濃度に調整する。
参考例 ２ 血液凝固阻止物質として3.8％クエン酸塩溶液
10容量部を含有している人血漿２ml×５を水浴上
で37℃としそして実施例１により得られるコラー
ゲン溶液の漸増量を加える。その際容量は0.01モ
ル／のアルギニンを含有するPH7.2の燐酸塩緩
衝された食塩溶液により均一とされる。添加され
たコラーゲン量は血漿１ml当り0.1mg、0.2mg、0.5
mgおよび1.0mgに相当する。これを37℃で10分間
培養しそして次に1500ｇで10分間遠心分離する。
血漿上澄み液および沈殿したコラーゲン原線維を
傾瀉により相互に分離する。血漿上澄み液中の因
子活性を測定する。因子分子の３種の生物学
的機能の活性、因子凝固活性（Ｆ ：Ｃ）、
因子抗原（Ｆ Ｒ：AG）およびフオン・
ウイレブランド（V.Willebrand）因子（Ｆ
Ｒ：WF）を同じ方法で最適のコラーゲン濃度
でほとんど定量的に溶液から除去する。
参考例 ３ 参考例２に記載されている実験を、血液凝固阻
止物質として4IE／ml（IEは国際単位を意味す
る）のヘパリンを含有する人血漿を用いて実施す
る。Ｆ Ｒ：AGおよびＦ Ｒ：WFに
ついての結果は実施例２のそれと一致する。Ｆ
：Ｃはヘパリン含有環境の下では方法的理由か
ら測定され得ない。
参考例 ４ 実施例１により血漿１ml当り１mgのコラーゲン
を添加して調製されたコラーゲン原線維の沈殿を
各１mlずつの生理食塩溶液を用いて３回洗いそし
て５mg／mlの濃度で生理食塩溶液中に懸濁させ
る。比較試料としてコラーゲン溶液の相当する容
量を37℃に10分間加温することにより調製された
同じ濃度の同様の方法で洗浄されたコラーゲン原
線維懸濁液が用いられる。
シユニツトガー・アンド・グロス（Schnitger
＆Gross）による凝固器中に、先天性の因子欠
乏血漿各0.1mlを有している４個の小管を置きそ
して37℃に加温する。小管１は生理食塩溶液中に
１：５で希釈され且つ正常な因子含量を有する
血漿0.1mlを含有する。小管２は血漿を添加され
ているすでに洗浄されたコラーゲン原線維0.1ml
を含有している。小管３は未添加でしかも吸着さ
れていないコラーゲン原繊維0.1mlを含有する。
小管４は生理食塩溶液0.1mlを含有する。
各小管にカオリンおよび血小板因子３の混合物
〔パスロムチン（Pathromtin）（登録商標）、ベー
リングヴエルケ社製品〕0.1mlを加える。混合し
たのち37℃で７分間培養し、続いて各小管に
0.025モル濃度の塩化カルシウム溶液0.1mlずつを
加えそして凝固時間を測定する。その結果を表１
に示す。
表 １ 試 料 0.1ml 凝固時間（秒） 正常血漿（１：５） 53 吸着されたコラーゲン懸濁液（５mg／ml）66 吸着されていないコラーゲン懸濁液（５mg／ml）
124 緩 衝 液 104 凝固時間から、正常血漿で吸着されている本発
明により調製されたコラーゲン懸濁液は生物学的
に活性な凝固因子を包含していることが認めら
れる。
参考例 ５ コラーゲン溶液１ml中に参考例２におけると同
様にしてクエン酸塩含有人血漿１mlを加え、コラ
ーゲン原線維を遠心分離し、そして燐酸塩緩衝さ
れた生理食塩溶液で３回洗う。このコラーゲン原
線維を、一定の血漿蛋白に特異的な家兎の抗血清
を用いて間接的な螢光試験によつて吸着された血
漿蛋白を調べる。家兎の正常血清を用いると陰
性、抗人フイブリノーゲン、抗人免液グロブリン
および抗人アルブミンでは非常に弱い反応がみら
れる。抗因子人血清を用いると非常に強い反応
がみられる。
この実施例は、例えばアルブミンに比して4400
倍低い濃度で血漿中に包含されている因子が選
択的にかつ特異的に結合されていることを示して
いる。
参考例 ６ その因子含量が標準の10％より少いフオンウ
イレブランド氏疾患を有する患者の血漿を用いて
参考例５の操作を行う。因子に対する抗血清を
用いて弱い反応が観察されたのみである。
参考例 ７ 参考例２により、コラーゲンの漸増量を用いて
人間のクエン酸塩血漿の吸着を行う。血漿上澄み
液をその因子含量について調べる。使用され
る試験は、正常血漿に基づいて％で活性度範囲を
示す定性的方法である。１：２の出発希釈度を顧
慮して表２に示される％値が見出される。
表 ２ コラーゲン量（mg／ml）
標準の％での因子範囲 0.0 100〜150 0.1 75〜100 0.2 50〜 75 0.5 25〜 50 1.0 ＜ 25 参考例 ８ 記録計を備えたボルン（Born）氏による凝集
計（Braun社製品）中で血小板に富んだクエン酸
塩血漿１mlをキユベツトに充填する。光度計およ
び記録計を透過０％に調整する。これを磁記撹拌
し、そして温度平均を37℃に保つ。次いでコラー
ゲン1μｇに相当する実施例１による透明なコラ
ーゲン溶液1μをミクロリツトル注射器を用い
て加える。２分以内に血小板の大きな集合物への
集塊化（集合）が行われ、これは強い透過増大を
きたし、それが記録計に示される。この反応は凝
固障害の診断に適している。
参考例 ９ コラーゲン溶液をこれが原線維を分離するよう
に約35〜40℃まで加温する。ゲル様の塊を凍結乾
燥すると、それにより安定な白色のコラーゲンフ
リースが得られる。コラーゲン溶液には因子、
因子および／またはフイブリノーゲンが添加
されうる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ ペプシン処理されたコラーゲンを塩基性アミ
    ノ酸を５〜20ミリモル／の濃度で含有している
    燐酸塩緩衝された等張性塩溶液に対して透析する
    ことを特徴とする、コラーゲンの製法。
JP9819580A 1979-07-19 1980-07-19 Collagen solution and manufacture Granted JPS5616403A (en)

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