JPH0655652B2 - 殺虫剤の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）発明の目的 〔産業上の利用分野〕 本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus t
huringiensis）の各種菌株の培養によって産生される結
晶様殺虫性蛋白質毒素（以下結晶毒素と略記する）を有
効成分とする殺虫剤（以下ＢＴ農薬という）を製造する
方法に関するもので、農薬業界及び農業の分野で広く利
用されるものである。

〔従来の技術〕 バチルス・チューリンゲンシスの各種菌株は、芽胞形成
に伴って、菱型、サイコロ状、又、不定型立方体など
の、蛋白質からなる結晶様微粒子状の結晶毒素を産生
し、そのあるものは鱗翅目昆虫の幼虫に対する選択的食
毒であり、又別のものはヤブカに代表される双翅目の幼
虫に対して高い殺虫活性を示し、或は鞘翅目昆虫のみに
選択的毒性を示すことが知られている。

上記のように結晶毒素の選択性は著しく、対象種と種目
を異にする昆虫には作用せず、勿論人畜、魚介、鳥類に
無であることから、選択的殺虫剤としての利用が、例え
ば、フランス特許第1,225,179号、米国特許第3,086,922
号、又英国特許第1,004,327号などに見られるように、
追求されて来ている。

しかしながら、上記特許などによって製造される殺虫剤
は、殺虫有効成分である結晶毒素の他に、自己再生のた
めの生命体である胞子（芽胞ともいう）をかなりの数を
混在させている。

芽胞は休眠細胞であって、強固な耐久性構造を持って居
り、一般の生物にとって不利な周囲条件にも耐え、殊に
乾燥した環境では、そのまま長期にわたり生きつづける
ものである。

従って、芽胞を含む殺虫剤を圃場など野外に散布を繰り
返す時には芽胞が土壌に蓄積し、更にそれは雨風によっ
て広く転流拡散することとなる。

これが養蚕業の行われる地域に侵入する時は、カイコの
所謂卒倒病を流行させるため、芽胞の拡散については十
分な警戒が必要である。

又、ウシの乳房炎による死亡例も報告され、ヒトにも眼
疾患の発症が報報告されている（サンプルス／Sample
s，J.R.and Buttener，H.，１９８３．Am.J.Opthalmo
l.，９５，２５８−２６０）。

更に、最近この芽胞が調理食物に接した場合には、発芽
して栄養細胞となり、対数増殖期に水溶性の蛋白質毒素
を産生分泌し、これは先記の結晶毒素と異なって、ヒト
に食中毒を発症するものであることが指摘されている
（ベネット／Bennett，R.W.，１９８６．The Food Drug
Administrations Workshop on New Microbiological C
oncerns Presentation Abstracts，６−７，品川邦汎，
１９８８．臨床検査３２，１５５９−１５６３）。

以上の懸念される諸事態も、芽胞と結晶毒素とを分離し
て芽胞を含まない殺虫剤とすることが出来れば消失し、
安全な環境を保持できるのあるが、結晶毒素と芽胞は何
れもその大きさが１μｍ前後で、微細な上に、接近した
大きさのため、充分な程度に分離することは困難な作業
であり、工業的に実用化され得ないものである。

また、芽胞を死滅せしめることによって安全な殺虫剤を
製造することも考えられるが、芽胞は先にも触れたよう
に、耐久性構造のもので、通常、微生物の殺滅のために
行われる加熱、乾燥、薬品処理などの物理的、又は化学
的殺菌処理に対して強固な抵抗性を持って居り、充分に
殺滅するためには、激しい殺菌条件の適用が必要であ
り、例えば加熱ならば１００℃を越える高い温度が必要
である。

しかし、このような激しい条件で処理するときは、殺虫
有効成分である結晶毒素が蛋白質であるため、その変性
を惹起し、殺虫効力の喪失を招き、有効な殺虫剤を得る
ことが出来ない。

この問題点を解決するために、物理的殺菌処理は、又は
化学的殺菌処理の何れか一方のみを単独に用いて、芽胞
を殺滅する場合に必要な処理条件よりも緩徐な条件、言
葉を換えれば、何れも単独に適用したのでは殺滅を達成
しない所の条件で、上記の二処理を同時に施し芽胞（及
び栄養細胞））を死滅させ、しかも結晶毒素の殺虫活性
を有効に保持する方法を本発明者等は提案した（特公昭
５１−５０４７号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者等の提案した上記記方法は、芽胞の殺滅方法と
して優れているものであり、実用化されている方法であ
るが、該方法の実施においてロット差或は後処理方法の
違いなどで殺芽胞の結果に差が生じ、一定の薬効を示す
製品を定常的に得ることが困難なな方法である。

すなわち栄養寒天表面培養物を収集し、水に懸濁したも
の、或は液内培養でも、遠沈収得物を水に再懸濁したも
のは、完全な殺芽と良好な殺虫活性の保持が得られる
が、液内培養終了液或はそれを遠沈濃縮したもので、水
に再懸濁しないものを殺芽胞処理した場合には殺虫活性
が充分でない場合があり、たとえば、該方法で得られた
結晶毒素はその実用的な濃度（ＢＴ農薬は一般にコナガ
に対して1,000乃至2,000倍の製剤水懸濁液として用いら
れる）における残存殺虫活性が不十分で、場合によって
はかなりの高濃度で使用しなければ充分な殺虫活性を示
さないものになることがあった。

本発明者等は、上記の問題点を追求しそれを解消し、品
質の一定した製品が得られる製造方法を確立すべく鋭意
検討を行なったのである。

（ロ）発明の構成 〔課題を解決するための手段〕 本発明者等は、前記問題点を解消するための検討過程に
おいて殺虫処理を施す培養液のpHの変動及び化学的殺菌
処理における薬剤の種類に応じて、殺菌処理後の結晶毒
素の残存殺虫活性が変化することを見出し、殺菌処理す
る培養液のpHを特定の範囲内に制御することと化学的殺
菌処理における薬剤としてＮ−ハロゲンジカルボン酸イ
ミドを選択採用することによって、実用に供し得る殺虫
剤を製造するに足る残存殺虫活性を有する結晶毒素が一
定して得られるのみならず、残存殺虫活性の飛躍的に向
上した結晶毒素が得られることを見出し本発明を完成し
た。

すなわち、本発明はバチルス・チューリンゲンシスの水
性培養液の殺菌をＮ−ハロゲンジカルボン酸イミドを用
いpH４〜７の範囲内で行うことを特徴とする殺虫剤の製
造方法に関するものである。

バチルス・チューリンゲンシスの水性培養液 本発明に用いられる水性培養液としては、バチルス・チ
ューリンゲンシス・バラエティ・クルスタキ・バチルス
・チューリンゲンシス・バラエテイ・イスラエレンシス
等の結晶毒素を産生するバチルス・チューリンゲンシス
菌株を、通常公知の培養方法及び条件で培養して得られ
る一般的な培養液があげられる。

例えば、肉エキス、ペプトンなどよりなる培養液を用
い、バチルス・チューリンゲンシスを通常の方法及び条
件で培養し、芽胞及び結晶毒素が形成された培養終了
液、或いは該培養液に遠心沈降分離操作や膜濾過操作を
施こして精製または濃縮して得られた結晶毒素と芽胞を
含有する水懸濁液、さらにはそれらを水で希釈した懸濁
液が使用される。

殺菌 本発明における殺菌は、栄養細胞・芽胞を殺滅するため
に行われるものであって、下記のような化学的殺菌処理
及び物理的殺菌処理方法があり、前掲の特公昭５１−５
０４７号公報に開示されているように、単に一種類の殺
菌処理のみでは、結晶毒素の殺虫能力を保持させなが
ら、栄養細胞・芽胞を完全に死滅させることは困難であ
るから、本発明においても緩徐な化学的殺菌処理と物理
的殺菌処理とを組合せて、それらを同時に行うことが好
ましく、その方法により容易に栄養細胞・芽胞を完全に
死滅させることができ、殺虫能の優れた産業上極めて有
用な殺虫剤を得ることができる。

化学的殺菌処理 化学的殺菌処理方法は、Ｎ−クロルコハク酸イミド、Ｎ
−ブロムコハク酸イミド、Ｎ−クロルグルタール酸イミ
ド、Ｎ−クロル安息香酸イミドなどの脂肪族、芳香族の
Ｎ−ハロゲンジカルボン酸イミドを上述の水性培養液等
に加え殺菌する方法である。

Ｎ−ハロゲンジカルボン酸イミドの水性培養液への添加
量は、予備試験を行うことにより容易に定められる。

物理的殺菌処理 物理的殺菌処理方法は、加熱、超音波波、放射線などに
より、上述の水性培養液等を殺菌する方法である。

工業的に有利な加熱方式は、反応槽内で撹拌しながら加
熱するバッチ加熱方式、或は長い反応管内に一方の端か
ら流入し、途中で加熱昇温しつつ他端から排出する流管
連続加熱方式などであり、特に後者は工業的実施に当っ
て有用である。

pH調整方法 本発明においては、バチルス・チューリンゲンシスの水
性培養液の殺菌をpH４〜７、好ましくはpH５〜７、特に
好ましくはpH５〜5.5の範囲内で行うことが必要であ
り、前記培養液は一般的にpH８〜９程度であるので、硫
酸等の酸によりそのpHを４〜７に調整してから殺菌処理
を行なう。また、殺菌処理中に、処理に伴ないpHが変動
し上記範囲外に逸脱する恐れがあるときも、その変動に
応じて酸やアルカリを添加し、pHを上記範囲内に維持す
ることが必要である。

上記範囲外で殺菌処理を行なうと、結晶毒素の殺虫活性
が損なわれ、実用的濃度で有効な殺虫剤を定常的に製造
することが不可能となり、また残存殺虫活性が飛躍的に
は向上しない。

製剤方法 殺芽胞処理を終わった水性培養液は、そのまま、或は濃
縮し、又、別段の後処理を施した後、適宜の助剤を添加
或は添加せずして、懸濁液状で製品とし、或は更に好ま
しくは噴霧乾燥や、流動乾燥によって水和剤粉末、乃至
は顆粒状製品に製剤化される。

殺虫活性の測定法 結晶毒素の殺虫活性を定量的に把握する方法としては、
生虫を用いた殺虫試験により半数致死濃度を求め、残存
殺虫活性を定量的に測定するという方法を採用した。す
なわち、適当に稀釈した試料液夫々に検定供試昆虫の死
亡率を測定し、試料液の濃度と死亡率との関係から半数
致死濃度を求め殺虫活性の高低を比較する方法である。

〔作用〕

殺菌処理を施すバチルス・チューリンゲンシスの水性培
養液のpHを４乃至７に調整することが、なぜ結晶毒素の
殺虫活性を維持することに有効であるのか、また殺菌用
の薬剤としてのＮ−ハロゲンジカルボン酸イミドがなぜ
優れているのか、その具体的な機構は不明であるが、Ｎ
−ハロゲンジカルボン酸イミドの分解温度が殺菌温度に
近接していることや弱酸性の化合物であることが原因と
も考えられるがいずれにしても、本発明によれば殺菌処
理後の殺虫活性を飛躍的に高めることができるのであ
る。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 肉エキス0.5％、ペプトン0.5％、ＣＳＬ２％、グルコー
ス１％、pH7.0の培養原料液１０を１１０℃にて１０
分間加熱殺菌し、これにバチルス・チューリンゲンシス
・バラエティ・クルスタキＨＤ−１菌株（（アメリカ農
務省ブランズビル研究所保管菌株）を接種し、３０℃に
保って、毎分５の無菌空気で通気・撹拌培養を行っ
た。

培養初期のpH低下に対しては、アンモニア水を注入して
pHを６から７の間に維持した。６０時間で培養を終了し
たが、終了液のpHは8.9に達していた。

これから１００mlずつを採取し、表１に示す様に、その
まま、および稀硫酸を適量加えて、pHをそれぞれの値に
調整した上で、Ｎ−クロルコハク酸イミドを0.2％にな
るように加え、６０℃に１０分間加熱した後冷却した。

各殺菌終了液を15,000rpmにおいて１０分間遠心分離操
作に付し、上清液を沈降物に５mlの無菌水を加えて懸濁
する操作を２回繰り返し、ホルマリン及び菌体外可溶性
毒素物質を除去した。

このようにして得られた夫々の試料液の生残細胞・芽胞
数（ケ／ml）と殺虫活性保持率を以下の方法に準じて測
定した結果を表１に示す。

生残細胞・芽胞数測定 試料液１mlを採り、無菌水にて適宜稀釈し、肉エキス・
ペプトン寒天平板上に流し、３０℃にて４８時間培養
し、発生する集落を数えて、これより試料中の生残細胞
・芽胞数（ケ／ml）を計算する。

殺虫活性保持率測定 展着剤ダイン（武田薬品工業株式会社）を0.03％添加し
た水道水で殺菌処理液を順次稀釈し、段階濃度稀釈液列
を整える。

直径８cmの円形に打ち抜いたキャベツの葉片を稀釈液中
に浸漬し、風乾する。此の葉片の上にコナガ３令幼虫１
０匹を載せ、３日後死亡虫数を測定する。

１水準３連で半数致死濃度を求め、培養液了液について
の値と対比して、活性保持率（％）を算出する。

実施例２ バチルス・チューリンゲンシス・バラエティ・イスラエ
レンシスＨＤ−５２２菌株〔アメリカ農務省ブランズビ
ル研究所保管菌株〕を肉エキス１％、ペプトン0.5％、
酵母エキス0.5％、pH7.0の加熱殺菌済培養原料液１０
に接種し、３０℃に保って、毎分５の無菌空気で通気
撹拌培養した。

６０時間で培養を終了し、最終pHは8.5であった。此の
培養終了液について、表１に示すようなpHに調整し、実
施例１と同様の操作で殺芽胞し、それぞれについて生残
細胞・芽胞数を測定した。

殺虫力測定は、各殺菌終了液を蒸留水で稀釈し、段階濃
度稀釈液をつくり、その各２mlをアカイエカ（Culex pi
piens）の３令幼虫３０頭を浮遊した２００mlの飼育液
中に加え、２７℃に保って２日後死亡虫数を測定し、半
数致死濃度を求め、培養終了液についての値と対比し
て、活性保持率（％）を算出した。結果を表１に示す。

実施例１は、鱗翅目幼虫に選択食毒である菱型結晶毒素
を主として産生するバチルス・チューリンゲンシス×バ
ラエティ・クルスタキＨＤ−１株培養物についての殺芽
胞実験であり、実施例２は双翅目幼虫に有効なサイコロ
型結晶毒素を産するバチルス・チューリンゲンシス・バ
ラエティ・イスラエレンシスＨＤ−５２２株を用いた殺
芽胞実験であるが、表１に見られるように、両種類の結
晶毒素共に、殺芽胞処理時のpHが殺虫活性保持率に大き
く影響し、アルカリ性で失活が大きく、又酸性が過ぎて
も好ましくないことが明らかである。

実施例３、比較例１〜２ バチルス・チューリンゲンシス・バラエティ・クルスタ
キＨＤ−１株についての実施例１の培養終了液を１００
mlずつ分取し、硫酸を添加して、各pHに調節し、比較例
１は次亜塩素酸ナトリウムを有効塩素濃度0.04％になる
ように添加し、５０℃に１０分間加熱し、実施例３には
Ｎ−クロルコハク酸イミドを0.2％添加し、６０℃に１
０分間加熱し（実施例１の実験）、比較例２はパラトル
エンスルホン酸クロルアミドナトリウムを0.4％添加
し、７０℃に１０分間加熱し、殺芽胞処理し、生残細胞
・芽胞数（ケ／ml）およびコナガ幼虫に対する幼虫力測
定によって、活性保持率（％）を算出し、表２に示し
た。

なお、実施例３、比較例１〜２それぞれに薬剤添加量な
らびに加熱温度を異にするが、予備実験により、各薬剤
毎に適当する処理条件として選定されたものである。表
２の結果に見られる通り、Ｎ−クロルコハク酸イミド使
用の場合に最も高い活性保持率が得られることが明らか
である。

実施例４ 内エキス0.5％、ペプトン0.5％、ＣＳＬ２％、グルコー
ス１％の培養原料液を加熱滅菌し、これにバチルス・チ
ューリンゲンシス・バラエティ・クルスタキＨＤ−１株
を、予め６時間前培養した種菌液を接種し、３０℃で通
気撹拌培養する。培養初期のpH低下傾向に対してアンモ
ニア水を注加してpHを６から７の間に調節し、中期以降
はpH上昇にまかせ５４時間にて培養を終了する。終了時
pHは8.8に達していた。

これに硫酸を添加してpHを5.5とした後８０００rpm連続
遠心沈降機を通して、濃縮泥を収得し、これにＮ−クロ
ルコハク酸イミドを0.4％添加し、６０℃に昇温し５分
間保持した。

生残細胞・芽胞数０ケ／ml及び殺虫力保持率７５％を得
た。

実施例５ 実施例４と同様にして得たpH5.5の遠心沈降濃縮泥にＮ
−クロルコハク酸イミドを0.4％添加し、二重管のステ
ンレス内管の一端から連続的に送入し、外管に６５℃の
温湯を並流で流して、ピストン流で６０℃に昇温し、そ
の温度に３分保持してから、連続的に流出せしめる。

生残細胞・芽胞数０ケ／ml、および殺虫活性保持率８２
％を得た。

実施例６ バチルス・チューリンゲンシス・イスラエレンシスＨＤ
−５２２株を肉エキス１％、ペプトン0.5％、酵母エキ
ス0.5％、pH7.0の加熱殺菌済培養原料液に接種し、５４
時間通気撹拌培養した。

培養終了pHは8.6に達していた。これに塩酸を注加してp
H5.5とした後、10,000rpmで遠心沈降により上澄液を去
り、結晶毒素と生芽胞混在沈泥を得る。

次で、Ｎ−プロムコハクルボン酸イミドを0.4％添加
し、６０℃に昇温し５分間保持した。

実施例２に倣って生残細胞・芽胞数およびアカイエカ幼
虫に対する殺虫力を測定し、生残細胞・芽胞数０ケ／ml
および殺虫活性保持率７５％の結果であった。

（ハ）発明の効果 本発明方法は、バチルス・チューリンゲンシスの結晶毒
素を含む培養液の細菌細胞及び芽胞を高い殺虫活性を維
持したまま完全に殺滅することができ、生芽胞による二
次的災害生起のない安全でより高い薬効のＢＴ農薬を、
工業的に安定に製造することが可能となるという優れた
効果を奏する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審査官 今村 玲英子 (56)参考文献 特開 昭48−99324（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus
   thuringiensis）の水性培養液の殺菌をＮ−ハロゲンジ
   カルボン酸イミドを用いpH４〜７の範囲内で行うことを
   特徴とする殺虫剤の製造方法。