JPH0652268B2

JPH0652268B2 - 固定化抗原

Info

Publication number: JPH0652268B2
Application number: JP14705385A
Authority: JP
Inventors: 幸雄堀川; 敏茨木; 紘神野
Original assignee: 鐘紡株式会社
Priority date: 1985-07-03
Filing date: 1985-07-03
Publication date: 1994-07-06
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: JPS628054A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は特に固相法インムノアッセイ用固定化抗原とし
て好適な固定化抗原に関する。

（従来の技術）抗原と抗体が特異的に結合して複合体が形成される反応
と抗原あるいは抗体に標識されたラジオアイソトープの
放射能を測定するか、あるいはそれらに結合された酵素
による酵素反応速度を測定することによる高感度計測法
とを組合せた分析法はすなわちそれぞれラジオインムノ
アッセイ（ＲＩＡ）あるいはエンザイムインムノアッセ
イ（ＥＩＡ）と呼ばれている分析法である。これら分析
法は生体内成分の微量定量法として生化学の研究分野お
よび臨床検査の分野で汎用されるものとなっている。

ＲＩＡとＥＩＡにおいては、いずれも、検体中に生成し
た抗原・抗体結合体と未結合の抗原あるいは抗体とを分
離する必要があり、分離操作を容易にするために抗原あ
るいは抗体は一般に担体に固定化したもの（固定化抗原
あるいは抗体）が用いられる。

抗原あるいは抗体を担体に固定化する方法として、デキ
ストラン（架橋されたもの）アガロースゲルあるいは表
面を有機官能基化したガラスビーズ、多孔性ガラス等の
担体にそれらを化学結合で結合する方法、プラスチック
スチューブ、シリコンゴム片上に物理的に吸着させ結合
する方法、ポリアクリルアミドゲル中に包括する方法
〔Clinical Chemistry、vol.19、No.12、1339(1973)〕など
が知られている。

フィブロインは、従来、低分子量の酵素基質に対しては
透過性がありそのような基質に対応する酵素の担体とし
て用い得ること、階担体中で酵素活性は相当安定に保持
されることは知られている〔公開昭52-57392、Agric.Bio
l.Chem.、42(9)、1661(1978)〕。

しかしながら上記フィブロインを固定化抗原の担体とし
て適用する試みは未だなされていない。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者等はフィブロインの抗原担体としての用途につ
いて研究を行い、各種の抗原をそれぞれ抗原抗体反応な
し得る状態において、強固且つ安定にフィブロイン中に
包括させ得ること、また担体のフィブロインに対する抗
体の非特異的吸着（インムノアセイあるいはアフィニフ
ィクロマトグラフィーにおいて分析防害因子となる）は
これを容易に排除し得るものであることを見出し本発明
を完成したものである。

（問題点を解決するための手段）本発明は結晶化フィブロインを担体とする固定化抗原で
ある。

本発明のフィブロイン固定化抗原はフィブロイン水溶液
より液晶性フィブロインを再生するに際してフィブロイ
ン中に抗原を包括せしめることにより製造される。

上記のフィブロイン水溶液は常法により絹原料（生糸、
生糸屑、キキ、ビスあるいは屑まゆ等）により得られた
精製フィブロイン繊維を水酸化銅−アンモニア水溶液、
水酸化銅−エチレンジアミン水溶液、ロダン酸塩水溶
液、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム水溶液、硝酸
カルシウム水溶液あるいは硝酸マグネジウム水溶液等に
溶解し、それら溶液より塩類を透析脱塩して得られる。

本発明の固定化抗原は目的に応じてフィブロインの再生
法を変えフィルム状、粉末状、顆粒状あるいは繊維状等
にすることができる。

インムノアッセイ用の固定化抗原の形態は固定化抗原−
抗体複合体と検体中の遊離の抗体との分離あるいはその
洗浄除去の操作を簡便、容易にするためフィルム状ある
いは支持体コーティング薄膜とすることが特に好まし
い。

フィルム状の固定化抗原は、好ましくはフィブロイン水
溶液（フィブロインの濃度は好ましくは２〜２０重量
％）に抗原を溶解し、ガラス板、テフロン板、アクリル
板等の平板上に該溶液を流延、乾燥し結晶化フィブロイ
ン膜を再生しこれを剥離する方法、より好ましくは抗原
を均一に付着せしめた平板若しくは抗原を高濃度に含有
するフィブロイン極薄膜を均一に付着せしめた平板上に
フィブロイン水溶液（フィブロインの濃度は好ましくは
２〜２０重量％）を流延、乾燥し、結晶化フィブロイン
膜を再生せしめ、これを剥離する、言わば転写法的な方
法等により製造することができる。上記の抗原付着平板
は抗原水溶液あるいはフィブロイン水溶液を添加した抗
原水溶液（フィブロイン水溶液の添加は抗原に対するフ
ィブロインが好ましくは４０〜１０重量％となる如く行
われる）を平板上に流延、乾燥して調製される。

支持体コーティング薄膜はガラス板、アクリル板等の平
板面上あるいは分析用試験管の内面を抗原含有フィブロ
イン水溶液（フィブロイン濃度は好ましくは0.1〜５重
量％）でコーティングし乾燥を行いそれら面上にフィブ
ロイン薄膜を再生せしめる方法により製造できる。

粉末、顆粒あるいは繊維状で用いることもでき、粉末あ
るいは顆粒形態のものは好ましくは抗原含有フィブロイ
ン水溶液（フィブロイン濃度は好ましくは２〜２０重量
％）を攪拌下の硫酸アンモニウム水溶液、酢酸ナトリウ
ム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液に添加し固相フィブロ
インを析出させ分離、乾燥する方法、より好ましくはガ
ラスビーズあるいは細孔径の大きなシリカ担体等に抗原
含有フィブロイン水溶液（フィブロイン濃度は好ましく
は0.1〜５重量％）を含浸させ水を蒸発させてフィブロ
イン膜を担体上に再生せしめる方法等により製造するこ
とができる。繊維状形態のものは抗原含有フィブロイン
水溶液（フィブロイン濃度は好ましくは１５〜２０重量
％）を前記同様のフィブロイン凝固性無機塩水溶液中に
紡糸して製造することができる。

粉末、顆粒あるいは繊維状の固定化抗原は分析法に用い
るだけでなく、生体成分等の中から特定成分を分離、精
製するためのクロマトグラフィーいわゆるアフィニティ
クロマトグラフィー用担体として用いることもできる。

固定化抗原は通常水溶液中で使用されるので担体の再生
フィブロインは耐水性であることが要求される。このた
め本発明における再生フィブロインはその結晶化度が少
なくとも２０％以上、好ましくは３０％以上となる如く
再生処理が行なわれる。そのため、水分蒸発により固相
フィブロインを再生する場合、水分蒸発は好ましくはは
室温〜６０℃、相対湿度６０％以上の雰囲気下に風乾し
て行われる。この場合、結晶化促進ないしは品質を安定
化するため、フィブロイン水溶液中に好ましくは２〜４
０重量％のエチルアルコール、エチレングリコール、グ
リセリン等のアルコール類あるいは好ましくは２〜２０
重量％の硫酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸アン
モニウム等の凝固性塩を添加することが望ましい。析出
によりフィブロイン粉末あるいは顆粒を再生する場合に
おいては凝固性塩の８０％飽和以上の水溶液中に抗原を
溶解したフィブロイン水溶液を添加し、析出させる。

上記の再生処理法によりフィブロインの結晶化度を２０
％以上、３０〜５０％程度とすることができる。なお、
ここで結晶化度とは結晶性フィルムあるいは結晶性フィ
ブロイン粉末とフィブロイン水溶液を平板上４℃で風乾
して得たほぼ無定形とみなせるフィルムとに関するＣｕ
Ｋα線による第１図に示した如き広角Ｘ線回折チャート
（赤道方向の回折強度を記録して得られたチャート）に
おいて、２θ＝１５°と３０°の回折強度点を結んだ直
線上の回折強度曲線下の面積をそれぞれＡ、ＢとしてＡ
−Ｂ／Ａの百分率として定義されたものをいう。

本発明において固定化される抗原としては、ヒト絨毛性
性腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、横体形成ホルモ
ン、インシュリン等の蛋白ホルモン、α−フェトプロテ
イン、ハプトクロビン等の血清蛋白、大腸菌毒素、コレ
ラトキシン、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、
ＨＢ_Ｓ抗原等のトキシン、ウイルスあるいはウイルス成
分、ステロイドホルモン、各種低分子量の薬物等を血清
蛋白に結合したものなどを挙げることができる。

抗原の使用量は目的により適宜選定することができる
が、抗原含有フィブロイン水溶液よりフィルム、粉末顆
粒、繊維を再生せしめる場合においては、通常、乾燥フ
ィブロインあたり0.1〜４０重量％、好ましくは0.5〜３
０重量％、特に好ましくは１〜２０重量％の抗原をフィ
ブロイン水溶液に添加して用いられる。転写法的に抗原
固定化フィルムを製造する場合においては、抗原は基板
上に通常0.2〜２０μg/cm²、好ましくは0.5〜１５μg/c
m²、特に好ましくは１〜１０μg/cm²となる如く付着さ
せ用いられる。

（発明の効果）本発明の固定化抗原は以上の記載からも明らかなように
極めて簡単な方法で製造でき、以下実施例によって明ら
かにする如く抗原の担体に対する固定は強固であり、強
力な洗浄に対しては勿論、摩擦による脱落に対しても抵
抗性があり保存安定性も極めて優れており、ＲＩＡ、Ｅ
ＩＡ分析あるいはアフィニティクロマトグラフィー用の
固定化抗原として優れた性質を持つ。

以下、本発明の固定化抗原の製法、その特性を実施例に
よって明らかにする。

実施例１ (A)フィブロイン水溶液の調製生糸１００ｇを1.0重量％のマルセル石けん水溶液５
中に浸漬し、９０℃で３時間精練し、続いて0.5重量％
のマルセル石けん３中に浸漬し、更に３時間精練を行
いセリシン等を実質的に除去したフィブロイン原料７１
ｇを得た。

駆動下のニーダー中に水５０ｇ、エチルアルコール７５
ｇおよび塩化カルシウム１００ｇを加え、７５℃に昇温
後、上記のフィブロイン原料５０ｇを投入し、該原料が
完全に溶解した１時間後に７５℃の水２００ｇを添加、
希釈しフィブロイン溶解液を得た。この溶解液を冷却後
ホローファイバー型の透析器に注入し流水により透析脱
塩し5.5重量％のフィブロイン水溶液（塩化カルシウム
残留量は0.08重量％）８３０ｍを得、ロータリーエバ
ポレーターで濃縮し、次いでその一部を水で希釈して、
フィブロイン濃度をそれぞれ１０重量％および１８重量
％に調整した溶液を得た。

(B)ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）固定化フィルム
と対称フィルムの調製乾燥器中に設置された水平台上にガムテープで１０cm四
方が仕切られたガラス板を置き、１０００ＩＵのhCGを
含む水溶液３ｍを仕切内に流延し、１５℃で１０時間
乾燥した。次いで上記のフィブロイン水溶液（濃度は１
０重量％のもの）１５ｇにグリセリン0.45ｇを添加混合
した溶液を仕切り内に流延し、１５℃で１０時間乾燥し
た。形成されたフィルムを剥離し、厚さ１２０μｍの柔
軟なフィルムを得た。その結晶化度は３５％であった。

ガラス板にあらかじめhCGを付着させることなく上記同
様にして厚さ１２０μｍ、結晶化度３７％のフィルムを
得た。

(C)hCGの有効固定化量と対称フィブロイン薄膜に対する
抗体の非特異的吸着量の測定１×0.5cmに裁断した上記hCG固定化フィルム片を生理食
塩水で充分に洗浄した後、ペルオキシダーゼを標識した
マウス抗hCG抗体を５μｇ含む牛血清アルブミン0.1重量
％含有生理食塩水0.5ｍ中に浸漬し４℃で２４時間放
置した。このフィルム片を生理食塩水で充分洗浄した
後、ｏ−フェニレンジアミン4.65ｍＭ、過酸化水素4.4
ｍＭを含むpH5.5のクエン酸緩衝液４ｍ中に浸漬し５
分間振とう後3.4規定の硫酸２ｍを添加し反応を停止
させ反応液の４９２ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は
1.024であり、一方対称フィブロインフィルムを上記同
様に処理、反応させた場合の吸光度は0.018であり、こ
れよりフィルム上に固定化された有効hCGは約0.1IU/cm²
（有効固定化率１％）、非特異的吸着による見かけhCG
固定化率は0.0012IU/cm²と計算された。

(D)固定化hCGの固定化強度の測定ポリ塩化ビニルフィルム（厚さ１２０μｍ）を１×0.5c
mに裁断し、hCG１０IU/mのリン酸緩衝液（pH7.2）中
に４℃で２４時間浸漬した。次いで充分水洗した後、
(C)と同様な操作で吸着hCG量を測定したところ吸光度が
1.242で約0.12IU/cm²であった。(C)で使用したhCG固定
化フィブロインフィルムと対照として上記のhCG固定化
ポリ塩化ビニルフィルムとを0.1Ｍグリシン−塩酸緩衝
液（pH2.2中に５分浸漬したもの、及び荷重１Kg/cm²で
ろ紙間を３回擦過したものについて、(C)と同様にhCG固
定化量を測定したところ、本発明のhCG固定化フィブロ
インフィルムでは両者共固定化量の減少はほとんど認め
られなかったが、対照のポリ塩化ビニルフィルムの場合
にはグリシン−塩酸緩衝液で約５０％、ろ紙擦過では約
８０％のhCGが脱落した。

実施例２実施例１(B)におけると同様にして、第１表に示す抗原
をそれぞれアクリル板上に５μg/cm²の割合となるよう
に付着させた（ただし乾燥は１０℃１０時間の風乾）。
次にその上に実施例１(A)で得たフィブロイン水溶液
（濃度は１３重量％のもの）にグリセリン４重量％を添
加混合した溶液を流延し、１５℃で１０時間乾燥後、形
成されたフィルムを剥離し水で充分洗浄し、第１表に示
す抗原固定化フィルムを得た。有効固定化抗原量は対応
するマウスの抗体にペルオキシダーゼを標識したものを
用いて実施例１(C)におけると同様にして測定した。

実施例３ヒトアルグミン、ヒトIgGをそれぞれ２mg、２％フィブ
ロイン水溶液（フィブロインに対して３０％のグリセリ
ンを含有）３００mgに溶解し、表面をサンドペーパーで
粗面化したポリエステルフィルム（厚さ２００μｍ）に
均一に塗布した。（計算上フィブロイン皮膜が２μｍの
厚さになるように塗布した）次いで２５℃で３時間乾燥した後、実施例１(C)におけ
ると同様にしてそれぞれの抗原に対する抗体のペルオキ
シダーゼ標識物を用いて固定化抗原量を想定したところ
ヒトアルブミンで0.06μg/cm²ヒトIgGで0.08μg/cm²で
あった。

実施例４実施例２で得たヒト−α−フェトプロテイン固定化フィ
ブロインフィルムを0.7×1.2cmに裁断し、一端を２mm×
１０cmのポリエステルフィルム（厚さ１５０μｍ）に接
着して取り扱い易くした。

外径１３mm、長さ９０mmのガラス製試験管に抗ヒト−α
−フェトプロテイン抗体（免疫動物マウス、モノクロー
ナル抗体）を０〜３２０μg/m含有する0.1％牛血清ア
ルブミン生理食塩液0.5mを入れ、それぞれに上記のフ
ィルムを浸漬し、２５℃で２時間反応させた。次にフィ
ルムを水洗した後、１μg/mの抗マウスIgG抗体（免疫
動物、家兎、抗血清IgG留分）の西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ標識物を含有する0.1％牛血清アルブミン生理食
塩液0.5mを入れ、２５℃で１時間反応した。

フィルムを取り出し、水洗した後、別に準備したガラス
試験管に入れ、０−フェニレンジアミン19.1mM、過酸化
水素2.45mMのクエン酸−リン酸２−ナトリウム緩衝液
（pH5.5)0.5ｍづつ加え、室温で暗所で３０分間反応
させ、１Ｎ硫酸２ｍで酵素反応を停止させ、この反応
液についてAbs４９２を測定し、標準曲線を得た。

結果を第２図に示したが抗ヒト−α−フェトプロテイン
抗体５ng/mの測定が可能であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はフィブロインの結晶化度を測定するためのＸ線
広角回折チャートの一例を示すものであり、(a)はフィ
ブロインフィルムの、また(b)は無定形フィブロインフ
ィルム（対照）の回折強度曲線である。第２図は抗ＡＦ
Ｐ抗体の標準曲線を表わしたものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】結晶化フィブロインで固定化してなる固定
化抗原
【請求項２】フィブロインが少なくとも２０％以上の結
晶化度を有するものである特許請求の範囲第１項に記載
の固定化抗原
【請求項３】固定化抗原がフィルム状のものである特許
請求の範囲第１項に記載の固定化抗原