JPH06510424A - 走化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　走化因子 本発明は新しい走化因子に関するものであり、組織修復、感染、および新形成へ の適用を目的とする該因子の使用に関するものである。

且玉二ｉ見 単球マクロファージ配列（単核食細胞ともいわれる）は炎症、免疫、および組織 修復（１）において中心的な役割を演じている。単核食細胞は、その増殖および 分化がコロニー刺激因子として知られているグリコプロティンのコントロール下 にあるベース骨髄（ｂａｓｅ　ｍａｒｒｏｗ）における前駆体から誘導発生する ものである（２）。単球の段階で、単核食細胞は循環中に放出される。

単球は半減期を８−２０時間として血液内で循環し、血液からこれらの細胞は組 織内に濡出するが、組織内における半減期はまだ正確にはつきとめられていない が、数か月の単位である。単球濡出を規制するすることは炎症および免疫プロセ スにおける重要な決定因子である。単核食細胞配列の細胞の組織内への取り入れ の調節には種々の因子が関与している（３．４）。これらには、循環する単球と 血管壁あるいは組織内での単球の一定方向への遊走（走化性）を誘発する分子の 発生とを結びつける、血管内皮上の付着分子の規制された表現も含まれている。

一度組織内に入ると、単核食細胞は多形質発現機能を発揮する。単核食細胞は粒 子を取り込んだり、あるいは毒性生成物を放出したりすることによって、微生物 菌を処置することができる。さらに、単球は多形質発現性酵素および酵素抑制因 子などを含む、組織の破壊および改変に関与する分子を放出する場合がある。

この細胞外マトリックスはその構成要素の合成と崩壊との動的均衡状態にある。

炎症プロセスにおける中心的な細胞である単核食細胞は、結合組織要素によって も放出されるコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ（５−７）を含むプロテイナーゼ 類の強力な生産因子である。これら、異なった細胞源からの溶菌酵素は、腫瘍の 侵入と、変質性および炎症性疾患の基本的な構成要素である組織破壊に関して極 めて重要な役割を果す。

病理学領域における組織破壊に対する関与に加えて、単核食細胞は、血小板誘導 成長因子（ＰＤＧＦ）などの種々の成長因子、および線維芽細胞成長因子（ＦＧ Ｆ）（８）をいちじるしい量で分泌することにより、組織の再構成および修復を もたらす場合がある。

破損された組織の再構成および修復をもたらすことを基本的な目標とした場合、 単球を引き寄せると同時に、組織破壊性酵素の作用を抑制する分子を確認するこ とが望ましいであろう。

ｍと１紅 我々は、単球の方向性遊走を誘発するポリペプチドを均一になるまで精製して、 その部分的アミノ酸配列を得た。

１７アミノ酸の部分的配列はメタロプロティナーゼ１（９）の組織抑制因子のそ れとまったく同一であった。この分子はゼラチナーゼを抑制すると同時に、単球 の走化性遊走を引き起こす。この分子の二重機能は組織修復の促進のために新し い利用法を示唆している。

夾星１皿皿ユｌ豆 皿± ＨＰＬＣカラムの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。

フラクションを還元条件下で流動させ（２０μｍ／レーン）、銀で染色した。

単球走化性活性のピークはフラクション７ｏおよび７１で見られた。これらのフ ラクションの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、見かけ上の分子量が２５ｋ Ｄａである純粋なポリペプチドの存在が確認された。

皿ユ フラクション７ｏおよび７１のＮＨ，一端末配列分析。

純粋なポリペプチドを含んでいるこれらのフラクションについて、Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の４７７Ａ／１２０Ａ配列システムよる配列分析を 行った。その結果、メタロプロテイナーゼ−１（ｈＴＩＭＰ−１）（９）という ヒト組織抑制因子と完全に対応する単一配列が得られた。

ｌ二二星玉 本発明により、我々は卵巣ガン細胞株から放出されたボリペプチドを精製、分子 的特徴付けを行い、単球の方向性遊走を誘発することができた。Ｓ　Ｗ６２６卵 巣ガン細胞株の上澄み液を例１に示すように調製した。その結果、例２で述べる 方法で判定されるような単球固有ケモアトラグタント（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃ ｔａｎｔ）を含んでいることが認められた。この上澄み液が例３に述べるような 精製手順にかけられた。

この分離手順によって５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で見かけの分子量が２５ｋＤａの純粋 なポリペプチドが得られた（図１）。

純粋なポリペプチドを含んでいるフラクションがＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ社の４７７Ａ／１２０Ａ配列決定システムによる配列分析にかけられた。

この配列を図２に示す。

Ｓ　Ｗ６２６ケモアトラグタントの配列はアミノ酸４からアミノ酸１２まで、お よびアミノ酸１３からアミノ酸２０までのＴＩＭＰ−１の配列とまったく同じで ある。

３　Ｗ６２６ケモアトラクタントがメタロプロテイナーゼを抑制する能力（ＴＩ ＭＰ−１の典型的な活性）は、ＭＤＡ２３１乳房悪性腫瘍細胞株からのＭＭＰ− ３を用いた逆カゼイン・ザイモグラフイーによってメタロプロテイナーゼが抑制 されることが確認された。

表１に示すように、Ｓ　Ｗ６２６走化因子（ＣＦ／ＴＩＭＰ）は単球の遊走を誘 発したが、好中球の遊走は誘発しなかった。

この種の作用は知られているＴＩＭＰからは一度も報告されていなかったもので あった。

本発明によるＣＦ／ＴＩＭＰのこの特殊な作用が計算され、単球の置火遊走の半 分の量の誘発を引き起こすのに必要な物質の量を特定した。ＣＦ／ＴＩＭＰは６ ０００μ／ｍｇ蛋白程度の作用量を示した。

本発明によるＣＦ／ＴＩＭＰは、単球の方向性遊走を誘発する能力を含む、ここ で述べられているようなその新しい活性を考慮に入れると、組織内の単球を引き つけ、同時に組織破壊を抑制する作用が望ましいような状態の下では有益である 。これらの状態には、単球が侵入してくる微生物の破壊に関与する限りにおいて は有益性を発揮するが、その活性化が組織の破壊をもたらす場合もあるような感 染性不全も含まれる。本発明はまた、単核食細胞によって分泌されたポリペプチ ド成長因子が組織の統合性の再構成を促進するが、同じ細胞によりつくりだされ る破壊性酵素を抑制するのが望ましいような、組織修復および傷治癒の部位での 単球の引きっけを促進する上でも有益である。

単核食細胞は腫瘍細胞を殺すことができ、腫瘍緩解にはマクロファージ浸潤が関 係ずけられてきた（参考交歓１０参照）。

一方、腫瘍細胞あるいは腫瘍組織のその他の成分によってつくりだされる、細胞 外マトリックスを消化する酵素はガンの侵入および転移を促進する（１１参照） 。したがって、本発明は腫瘍内の単球を引きつけると同時に、それらの腫瘍が侵 入および拡散のために利用する酵素を抑制する上で有益である。

意図的な治療目的のために使用する際には、本発明によるＣＦ／ＴＩＭＰは例え ば米国ニューヨーク州Ｈａｃｋ　Ｐｕｂ、Ｃｏ、。

により出版された“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　 ５ｃｉｅｎｃｅｓＨａｎｄｂｏｏｋ”に述べられているような適切な医薬組成の 形態で投与される。好ましい投与経路は非経口ルートで、投与量は０．０１−１ ０００ｍｇ／日の範囲である。局所、鼻、直腸などポリペプチドに関してこれま でに用いられてきた種々の投与ルートも、医師が特にそれを必要とする場合には 用いることが可能である。

に−Ｌ ＣＦ／ＴＩＭＰの単球に対する走化活性遊走単球数 刺　激　濃　度　（５オイル・フィールド、　±ＳＤ）培養液　２Ｉ±３ ｆ　Ｍ　Ｌ　Ｐ　１０″″″Ｍ　６７±２Ｃ５ａ　５％　１５４±５ ＣＦ／ＴＩＭＰ　１１５０　６７±３ １　／１００　４０±２ １　／２００　２４±２ ９０分間のアッセイで、ポリカーボネート・フィルターを通じての遊走に関する 測定が行われた。ＣＦ　／　Ｔ　Ｉ　Ｍ　Ｐは５Ｗ６２６からのＨＰＬＣフラク ション７１で、推定蛋白質濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。同じフラクションは ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（銀染色）で１バンドをもたらし、配列決定に用いられた。

以下の例は本発明をさらに説明するためのものである。

勇−上 −５Ｗ６２６からの上澄み液の作成 ニューヨーク、Ｍｅｍｏｒｉａｌ　５ｌｏａｎ　Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ研究所、Ｉ 。

Ｆｏｇｌｈｉ博士が確立したヒト卵巣腫瘍細胞株、５Ｗ６２６を、ミラノ、ｌ５ ｔｉｔｕｔｏ　Ｎａｚｉｏｎａｌｅ　ＴｕｍｏｒｉのＳ０Ｍｅｎａｒｄ博士を通 じて入手した。Ｓ　Ｗ６２６はＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培養液中で成長され、２ ０％胎仔性ウシ血清が加えられた。細胞の準融合（ｓｕｂｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔ 　）状態下で、通常の培養液が血清を含まないＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０と取り替 えられ、２４時間後に回収された。

五−主 一　走化性アッセイ 細胞：イタリア、ミラノ、オスペダーレ・サックのＣｅｎｔｒ。

Ｔｒａｓｆｕｓｉｏｎａｌｅから、正常な志願者から提供された血液のバフイー ・コートから、白血球群が採取された。血液はヘパリン化され（２０μｌ／ｍｌ ）　、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；英国グラスゴー、Ｇｉｂｃｏ　Ｂｉｏｃｕｌ ｔ社）によって６分の１に希釈され、血漿、および血小板を取り除くために、再 度４００　ｇで１０分間洗浄された。ペレットをＰＢＳ内に再懸濁させ、室温下 、４００ｇで３０分間、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　（ノールウェイ、オス 口、ＮｙａｇａｄのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ社製）で遠心分離を行った。周辺血液 単核細胞が界面で回収され、ＰＢＳで二環洗浄してから、１０％胎仔性ウシ血清 （Ｆｅ２　；　ＧＩ　ＢＣＯ）を加えたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０培養液（ＧＩ ＢＣＯ）内でｌＸｌ０“／ｍｌの濃度で再懸濁された。

ＰＭＮ後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅによる遠心分離後、赤血球と多形核白 血球（ＰＭＭ）を含むペレットをＨａｎｋｓ均衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣ Ｏ）に再懸濁させ、血液細胞１ｍｌあたりＥｕｆｕｓｉｎ　３　ｍｌの濃度でＥ ｕｆｕｓｉｎ　（ＳＴＨＯＬＬＦａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ、　Ｍｏｄｅｎａ、イ タリア）と混合した。そして、４℃の温度下、４０分間培養した後に得られた白 血球を多く含んだ上澄み液を遠心分離した後、残留している赤血球を溶解するた めに、その細胞ペレットを３０秒間蒸留水と混合した。細胞は二度洗浄された後 、０．２％ヒト血清アルブミンを加えたＨ　Ｂ　Ｓ　Ｓ　（ＨＳＡ　；Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）内に１×ｌＯ“／ｍｌの濃度で再懸濁させた。最終的に調 整されたものには９５％以上のＰＭＮが含まれていた。

−走化作用因子：標準走化作用因子として、Ｎ−フォルミルメチオニル−ロイシ ル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　 Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）が用いられた。ＦＭ　Ｌ　ＰはＤＭＳＯ内に１０ −”　Ｍの最終濃度で溶解され、２０°Ｃの温度下で保存された。陽性対照とし て用いられた最終濃度は１０−“−１０−”　Ｍの範囲であった。

−手順：マイクロチェンバー手法によって、単球とＰＮＭの遊走に関する評価が 行われた。各サンプルを２５ミリリツトルづつ走化室の下側区分に入れると同時 に、５０μｍの細胞懸濁液（各細胞タイプについてｌＸｌ０“７ｍ１）が上側の 区分に入れられた。ふたつの区分は５μｍ微孔サイズのポリカーボネート′フィ ルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ。

ＣＡ）　、で分離されており、そしてこれらのチェンバーはＣｏ６を５％含む空 気中で３７℃の温度下、（単球の場合）９０分および（ＰＭＮの場合）１２０分 培養された。培養終了後、フィルターを取り除き、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ　（Ｈａ ｒｌｅｃｏ。

Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、　ＮＪ）で固定、染色して、サープル・コーディング後５ つのオイル浸潤フィールドが数えられた。

五−主 −ケイ酸吸収による精製手順：　５Ｗ６２６細胞株からの上澄み液を濃縮して、 中性ｐＨ領域で、４℃の温度下、２時間、ケイ酸（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｔｄ） に対するバッチ吸着による部分的精製を行った。３０００ｒｐｍで遠心分離し、 ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで洗浄した後、１．４Ｍ　Ｎａｃｌ内で５０％エチレ ン・グリコールを用いて連続溶離を行ったところ、生物学的活性物質が回収され た。

ヘパリン−セファ０−ス・カラム：ケイ酸からの溶離液を５０ｍＭトリス、５０ ｍＭ　Ｎａｃｌ　（ｐＨ７，４）で透析し、同じ緩衝液で均衡化されたヘパリン −セファロースＣＬ−６Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（０，９Ｘ　１５ｃｍ　；ベッド容積 ：　１０ｍ１）に入れられた。均衡化緩衝液による洗浄後、カラムを５０ｍＭ０ ｍＭトリスル８フ、ａＣｌ勾配（０−２Ｍ）にかけた（２０ｍｌ／時間、５ｍｌ フラクション）。

ＦＰＬＣ分離：ヘパリン−セフ７０−ス・カラムがらの活性フラクションを５０ ｍＭｆｉ酸塩ｐＨ４，０で透析し、モノ−８５カチオン交換カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）を用いて、ＦＰＬＣにかけた。５０ｍＭ蟻酸塩ｐＨ４，０により一回 洗浄した後、同じ緩衝液内で線形Ｎａｃｌ勾配（０−ＩＭ）を行うことによって 、活性物質が溶離された（　１　ｍｌ／ｍｉｎ、、１　ｍｌフラクション）。

蛋白質濃度のパラメータとして、２８０ｎｍで吸収度が観察された。

ＨＰＬＣ：単球走化活性物質を含むＦＰＬＣフラクションが最終的にＬＫＢ　Ｈ ＰＬＣシステム（Ｂｒｏｍｍａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）内で、Ｃ８アクアポアＲＰ− ３００カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　ＣＡ）上で、逆相ＨＰＬＣにがけられた。このカラム は０．０５％（体積ベースで）トリフルオロ酢酸で均衡化され、線形アセトニト リル勾配（０−１００％緩衝液Ｂ；緩衝液Ｂは体積ベースで８０％、均衡化緩衝 液内のアセトニトリル）により溶離された。流速は０．４ｍｌ／ｍｉｎで維持さ れ、１分毎のフラクションが回収された。カラム流出液は２８０ｎｍでモニター された。

ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　：　５ＤＳ−ＰＡＧＥによッテ走化活性の純度がテストされ た。

サンプル（２０μｌ）は、上部に０．２５％（重量／体積）ＳＤＳを含んだスタ ッキング・ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ）を用いて、０．１％（重量／体積 ）ＳＤＳを含む線形勾配Ｉｏ−２５％（重量／体積）ポリアミド・ゲル上に加え られた。このゲルの寸法は１７　Ｘ　１３　Ｘ　Ｏ，１ｃｍであった。用いられ た分子質量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）はフォス フォリラーゼｂ　（Ｍｒ　９２５００）　、ウシ血清アルブミン（Ｍｒ　６６２ ００）　、卵巣アルブミン（Ｍｒ　４５０００）　、カルボニック・アンヒドラ ーゼ（Ｍｒ　３１０００）、タイプ・トリプシン抑制因子（Ｍｒ　２１５００） 、リゾチーム（Ｍｒ　１４４００）　、そして低Ｍｒマーカー（Ｐｉｅｒｃｅｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）アプロチニン （Ｍｒ　６５００）であった。ゲル内の蛋白質の銀染色が行われた。

ｗｑ　Ｏ工　× ［ ＦＩＧＵＲＥ２ １　５　１０　１５　２Ｏ −Ｔ−ＶＰＰＩ（ＰＱＴＡＪ’−ＮＳＤＬＶＩＲ（フラクション７Ｏ−７１）Ｃ ＴＣＶＰＰＨＰＱＴＡＦＣＮＳＤＬＶＩＲ（ｈＴＩＭＰ−１）フロントページの 続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１ ００ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、　ＲＵ、　ＳＤ 、　ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　ヴアン　ダム、ジョウベルギー国　ビー３０００　ラーヴアン 、ユーニヴアースティ　オブ　ラーヴアン、レイガ　インスティテユート　フォ ア　メディカル　リサーチ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．単球の遊走を誘発することはできるが、好中球の遊走は誘発することができ ず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で見かけの分子重量が２５ｋＤａで、図２に示す部分ア ミノ酸配列を有している走化因子。
2. ２．ヒト卵巣ガン細胞株ＳＷ６２６から分泌された請求項１の走化因子。
3. ３．組織メタロプロティナーゼ抑制活性も有している請求項１−７の走化因子。
4. ４．組織修復において有益な医薬品製造、および感染症および異常増殖の処置を 目的とする、請求項１−３の走化因子の使用。
5. ５．請求項１−３の走化因子を活性因子として含んでいる医薬組成物。