JPH06508103A - 抗菌、抗ウイルスまたは免疫刺激剤として使用するためのベンゾピランフェノール誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗菌、抗ウィルスまたは免疫刺激剤として使用するためのベンゾビランフェノー ル誘導体 本発明は抗菌、抗ウィルス、免疫刺激または創傷治癒剤として使用するためのベ ンゾビランフェノール誘導体またはその混合物、該誘導体混合物の製法、並びに 少なくとも１種の該誘導体を含有するヒトまたは獣医学で使用するための組成物 に関するものである。

本発明の該ベンゾビランフェノール誘導体はある種のウィルス感染（インフルエ ンザ、ヘルペス）により生じる炎症に対する予防薬として使用でき、また抗炎症 剤として使用される。

蜂グルー（ｂｅｅ　ｇｌｕｅ）とも呼ばれる蜂蝋（ｐｒｏｐｏｌｉｓ）は、蜜蜂 による天然生成物である。蜜蜂は植物の芽および他の部分上の蜂蝋を採集し、こ れをその生息環境において、孔および裂は目を形成し、かつまたその巣内で異物 体（昆虫および他の生物）から孤立させ、かくして感染の蔓延を防止するのに利 用している。蜜蜂はまた、蜂の巣のセルに蜜および花粉などの物質を貯蔵する前 に該セルを被覆するためにこの蜂蝋を利用している。

蜂蝋は６０種以上の化合物からなる特異的、複雑な生活性をもつ物質である。そ の基本的な成分は種々の樹脂、蝋、エーテル性オイルおよび花粉である。更に、 蜂蝋の主な生活性成分は植物染料であり、その最も重要なものはフラボン類およ び黄色染料、例えばクリシンまたはテクトクリシン、フラボノン類（ｆｌａｖｏ ｎｏｎｅｓ）、例えばピノストロビン、ピノセンプリンおよびクエルセチンおよ びその誘導体並びにフラボノール類、例えばラムノシトリン、ガランギンおよび イソアルピニン（ｉｓｏａｌｐｉｎｉｎ）である。これはまた芳香物質、例えば イソバニリンおよびアセトキシベラリノール（ａｃｅｔｏｘｙｂｅｔｕｌ　１ｎ ｏｌ）、並びに芳香族酸、例えば桂皮酸、安息香酸、カフェー酸、フェルラ酸お よびプロトカテチュー酸並びにそのベンジルアルコール、ペンタノール、フェニ ルエチルアルコールおよびシンナミルアルコールとのエステルなどをも含む（Ｅ 、ｌｔ　シュナイデピント（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｗｉｎｄ）、んブライン（Ｂｒｉ ｇｅ）、　ｔｔ、カラ（Ｋａｌａ）、　Ｊ−メツナー（Ｍｅｔｚｎｅｒ）＆Ａ、 ツンケ（Ｚｓｕｎｋｅ）、　ｉｎ　Ｄｉｅ　Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、　１９７９． 　Ｎｏ、　３４．　ｐ、　１０３）。

以下の一般式Ｉ： （ここで、Ｒは同一または異なっていてもよく、各々Ｈ１ＯＨまたはＣ１，−Ｃ ｏ−０を表す）で示される化合物が、蜂蝋よりも良好な効果を有する薬物である 抗菌、抗ウィルスまたは免疫刺激剤として使用できる蜂蝋中の成分であることが 今や明らか本発明は、特にピノセンプリン、４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン 、２．３−ジヒドロ−５，７−シヒドロキシー２−フェニル、ピノバンクシン− ３−アセテート、４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、２，３−ジヒドロ−５， ７−シヒドロキシー２−フェニル−３−アセテート、およびナリンゲニン（Ｎａ ｒｉｎｇｅｎｉｎ）、５．７．４’−トリヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−２− フェニル−１，４−ベンゾピロンまたは５．７．４’−フラバノンを抗菌、抗ウ ィルスまたは免疫刺激剤として使用することに関する。

本発明は、また上記一般式Ｉの化合物の混合物および特にピノセンプリン、およ びピノバンクシン−３−アセテートおよびナリンゲニンの混合物にも関する。好 ましくは、これら３種の化合物は治療において一緒に使用する。本発明に従って 製造された抽出物はプロピッコム（Ｐｒｏｐｉｎｏｃｏ＋ｎ）と呼ば瓢以下ＰＲ Ｐ−Ｃと略称することとする。

本発明は、更に上記一般式■で示される物質の混合物の製造法にも関する。本発 明の方法によれば、蜂蝋生成物を水または塩、好ましくは製薬上許容される塩を 含む水溶液で抽出する。本発明者は先ず０．９重量％のＮａＣ１溶液（生理的塩 化ナトリウム溶液）を使用して、ヒトまたは獣医学で使用するための抽出物を生 成した。しかしながら、この抽出に水が使用できること並びに純水を使用するこ とにより該抽出操作時間が短縮できることが明らかとなった。従って、水による 抽出が好ましい。しかしながら、塩溶液を使用することも可能であり、任意の塩 が使用できる。好ましくは、製薬上許容される塩、例え治ａｃｌまたはＫＣＩが 使用される。この抽出に水を使用した場合、生成物は凍結乾燥される。また、塩 溶液を使用した場合には、生成物を先ず透析して原塩を除去する。抗菌剤として 使用する場合には、塩溶液による抽出が好ましい。この生成物を抗菌剤として使 用するためには、該抽出生成物は０．５〜２重量％、好ましくは０．９重量％、 例えば０．９％のＮａＣ１を含むことができる。

本発明によれば、該蜂蝋生成物は、好ましくは有機溶媒溶液、例えば蜂蝋を含有 するアルコール性溶液である。このアルコール性溶液を、温度３０〜９５℃にて 、０．１〜１７重量％のＮａＣ１を含む水性溶液または水に添加し、この混合物 を温度３０〜９５℃にて１０〜１００時間維持し、その後肢溶液から底部の沈殿 物を除去する。

該アルコールは、炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜５のアルコール、例えば メタノール、エタノール、プロパツール、ブタノール１、特にエタノールであり 得る。好ましくは、ドイツ特許第８８１０９８２４．８号に従って調製したエタ ノール性蜂蝋溶液を使用する。

本発明によれば、エタノール性蜂蝋生成物は、低温（０−２０℃）にて、容積比 ８７：１３のエタノール／水混合物を使用して、約１８〜２５駒の超音波を印加 しつつ、短時間例えば２５分間に渡り閉鎖系で蜂蝋を抽出し、生成する懸濁液を デカンテーションして、固体粒子を含まない透明な蜂蝋抽出物を得ることにより 調製できる。

好ましくは、該蜂蝋を抽出前に粒径３ｎｍにまで粉砕する。該蜂蝋を適当なミル 中で微粒子（最大径５ｍｍ）にまで粉砕する。上記のドイツ特許第８８１０９８ ２４．８号を本発明の参考文献とする。

このアルコール溶液は、好ましくは水または塩溶液に、これら２種の溶液の体積 の和として計算して、１〜６０容量％の量で添加する。

該蜂蝋溶液を、好ましくは約１〜７時間、好ましくは５時間掛けて原水また（よ 塩溶液に滴下する。褐色の沈殿物が形成される。この混合物を更に５〜１００時 間、好ましくは約４０〜８０時間、３０〜９５℃に維持する。温度は、好ましく は５０〜７０℃、特に６０℃である。淡い黄色の溶液が硬質で暗褐色の沈殿物上 に形成される。このアルコール性蜂蝋溶液をこの工程中に蒸発させ、生成する黄 色の抽出物（よ使用したＮａＣＩ溶液の体積とほぼ同じ体積を有する。

本発明の物質および組成物はヒトおよび獣医用途用の抗生物薬として使用できる 。これらはダラム陽性またはグラム陰性バクテリア、ウィルスおよび菌類により 発生する炎症または感染を防止し、もしくは治療するために使用できる。該物質 またはその混合物を家畜の飼料、食料品、衛生物品、医薬品および天然薬品とし て使用できる。これらは、また免疫刺激剤、例えばアジュバント、並びに防腐剤 および鎮痛剤として使用して、創傷の治癒過程を改善することもできる。以下に 議論するテストは、本発明の抽出物が胃潰瘍および膣感染を生ずるバクテリアに 対しても有利に使用できることを示している。

本発明の抽出物は、更に飼料および食料品用の容器並びに器具の調製、並びに外 科用器具、歯科用器具、化粧器具、例えば注射器、包帯、ギブス、手当用品、圧 迫包帯およびリンス液などの処置のためにも使用できる。更に、これらは手術室 、動物の飼育室、食品並びに飼料を調製しまたは保存するための場所などのあら ゆる種類の空間の処置のためにも使用できる。これらが免疫刺激活性を有するこ とから、ワクチン中のアジュバントとしても利用できる。

本発明の抽出法を使用する場合、ピノセンプリン、ピノバンクシン−３−アセテ ート、およびナツツゲニンを含む生成物が得られる。この抽出物は、好ましくは ０、　Ｈ，９％好ましくは０．９ｘのＮａＣ１を含有する生理液を含むように調 節できる。乳房炎、即ち乳房中の炎症などのバクテリア感染を治療もしくは予防 するのに極めて適している。この塩溶液抽出物は無菌条件下で調製でき、乳房に 直接注入することができる。今日使用されている「プロベット（Ｐｒｏｖｅｔ） 　；商標」は粗製蜂蝋（アビファーム社（Ａｐｉｐｈａｒｍ　Ｃｏ、、　Ｌｔｄ ））、ラナコルム（Ｌａｎａｃｏｌｕｍ）　、アルコール−セチル−ステアレー ト、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウレート、ワセリンおよびパラフ ィンを含有する。この製品「プロベット」は、疾患のある哺乳動物の各乳頭の孔 管に搾乳の完了後に導入する必要がある。「プロベット」は、従って該乳頭の各 々への注入のための４種の使い捨て注射器からなる。従って、本発明の組成物は 従来の製品よりも投与が容易である。

本発明の該混合物の免疫刺激効果は、胸腺および膵臓由来の細胞（バンド（Ｂｉ ｎｄ）Ｔ−リンパ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞））につき直接テ ストした。これらのテストにおいて、該混合物は高い免疫刺激効果を示した。ま た、本発明の組成物を飼料を通して動物に投与したところ、胸腺および牌臓雨者 におけるタンド（Ｔａｎｄ）Ｂ−細胞の活性増加を生じた。本発明の組成物は体 液性および細胞媒介免コクサッキーウイル２８３（Ｃ８４）に感染したマウスに おいて、その生存時間は本発明の組成物で予防処置したマウスについて有意に延 長された。

全体で５８名の患者に１−１０％を鼻孔散布してテストした場合、局所的または 全身的なアレルギー反応は何等観察されなかった。

本発明の物質および組成物は、任意の剤層、例えば錠剤、カプセル、注射用溶液 、経鼻治療用の溶液またはスプレーとして使用できる。

これらの投与剤形は製薬上許容される担体、例えば１種以上の相客性固体充填剤 希釈物または該剤層の製造を補助するために添加される固体または液体物質、例 えば摩擦を減するための滑剤および該粒状混合物の流動性を改善するためのグリ ダント（ｇｌ　１ｄａｎｔｓ）などを含むことができる。ここで使用する「相客 性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）Ｊなる用語は、該成分が薬剤の有効性を実質的に減 するような相互作用を生ずることなしに、相互に混和し得ることを意味する。

製薬上の担体として機能し得る物質の幾つかの例は、糖類例えばラクトース、グ ルコースおよびスクロース、澱粉例えばコーンスターチおよび馬鈴薯澱粉、セル ロースおよびその誘導体例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチル セルロースおよびセルロースアセテート、粉末化したトラガカンスゴム、モルト 、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸 亜鉛、硫酸カルシウム、二酸化珪素、食用油例えばビーナツツオイル、綿実油、 ゴマ油、オリーブオイル、コーン油およびココアバター、ポリオール例えばプロ ピレングリコール、ソルビトール、マニトールおよびポリエチレングリコール、 寒天およびアルギン酸、並びに薬理処方物に使用されている他の無毒の相容性物 質である。湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム並びに着色剤、滑剤、賦形剤 、安定化剤、酸化防止剤、および保存剤を含むこともできる。

経鼻治療のためには、０．９重量％のＮａＣ＋および１−２０％の蜂蝋抽出物を 含有する生理的ＮａＣｌ−溶液を使用できる。乳房炎の治療のためには、２０− ５０％、好ましくは３０％の蜂蝋抽出物を含有する０゜９重量％のＮａＣ１溶液 を使用できる。

図面の簡単な説明 第１ａ図は温度勾配、４種の領域Ａ−Ｄ　、および全イオン流を含む、透析した 生成物のマススペクトルを示す図である。

第１ｂ図は数値で示した濾過後の全イオン流を示す図である。

第１Ｃ図は第１ａ図の領域Ａにおけるスペクトルを示す。

第１ｄ図は第１ａ図の領域Ｂにおけるスペクトルを示す。

第１ｅ図は第１ａ図の領域Ｃにおけるスペクトルを示す。

第１ｆ図は第１ａ図の領域りにおけるスペクトルを示す。

第２ａ図〜第２ｆ図は、それぞれ透析した生成物に対して第１ａ図〜第１ｆ図に 示したような、未透析生成物の対応するスペクトルを示す図である。

第３図は実施例５のマススペクトルの結果を示す図であり、ここで（１）は全イ オンのクロマトグラムであり、（２）はクロマトグラム１の解析により得られた 全ピークに対するマススペクトルを示し、（３）は内部標準を使用した全イオン のクロマトグラムを示し、（４）は該内部標準の全イオンクロマトグラムを示し 、（５）は実施例５のＧＣ−ＭＳであり、（６）は内部標準を使用した実施例５ のＧＣ−貼でありおよび（７）は該内部標準のマススペクトルを示す。

第５図は未処理および蜂蝋で処理したＢａ１ｂ／ｃマウス中のコクサラキーウィ ルスＢ３の生存性を示す図である。

第６図は実施例８．９および１０の生成物のマススペクトルを示す図である。こ こで ａは内部標準（Ｉｓ）、ピノセンプリン−７−メチルエーテルのＧＣ−ＭＳ　、 全イオンクロマトグラムであり、 ｂはａにおける解析の結果得られたピノセンプリン−７−メチルエーテルのマス スペクトルであり、 Ｃは実施例９ａのＧＣ−ＭＳ　、全イオンクロマトグラムであり、ｄはＣにおけ る解析の結果得られたピノセンプリンおよびピノバンクシン−３−アセテートの マススペクトルであり、 ｅは内部標準を使用して得た実施例９ａのＧＣ−ＭＳ　、全イオンクロマトグラ ムであり、 ｆはｅでの解析の結果得られたピノセンプリン、ピノバンクシン−３−アセテー トおよびピノセンプリン−７−メチルエーテル（Ｉｓ）のマススペクトルであり 、ｇは実施例９ｂの全イオンクロマトグラムであり、ｈは実施例９ｂのマススペ クトルであり、ｉは実施例９ｂ＋内部標準の全イオンクロマトグラムであり、ｊ は実施例９ｂ＋内部標準のマススペクトルであり、ｋは実施例８の全イオンクロ マトグラムであり、ｌは実施例８のマススペクトルであり、ｍは実施例８＋内部 標準の全イオンクロマトグラムであり、ｎは実施例８＋内部標準のマススペクト ルであり、０は実施例１０の全イオンクロマトグラムであり、ｐは実施例１Ｏの マススペクトルであり、ｑは実施例１０＋内部標準の全イオンクロマトグラムで あり、ｒは実施例１０＋内部標準のマススペクトルである。

本発明の諸特徴および種々の利点は以下の実施例を参照することにより、より一 層明確なものとなろう。しかしながら、該実施例により本発明を何等限定するも のではない。

実施例１：　（出発物質の調製） 抽出容器内に、８７重量％以下のエタノールの水溶液５００　Ｉ！を調製した。

この混合物を攪拌しつつ、２０ｋｇの粉砕した蜂蝋を該抽出器の内容物に添加し た。このノくッチを２５分間超音波（１８−２５ｋ）Ｉｚ）抽出にかけ、次いで ２時間放置し、デカンテーションし、濾過した。

該濾過は迅速濾紙装入器（ｒａｐｉｄ　ｆｉｌｔｅｒ−ｐａｐｅｒ　１ｎｓｅｒ ｔｓ）を備えた加圧濾過器で実施した。得られた透明な蜂蝋抽出物を、ヒートポ ンプにより、１５０−５０　ｗＩＦＩｔＯの真空下で、カラム濃縮器内で、所定 の乾燥物質の濃度５〜８０％の範囲に濃縮した。

この濃縮は最大２０℃の温度にて実施した。

実施例２ 実施例１で得た抽出物を希釈して、該抽出物をエタノール中に乾燥物質基準の濃 度で１０重量％を含む溶液を得た。蒸留水に濃度０．９％となるようにＮａＣ１ を溶解した。この溶液７００　ｍｌをビーカーに入れ、これを水浴上に配置した 。該ビーカーの温度を３０℃に維持した。エタノール中に１０重量％の該蜂蝋を 含有する蜂蝋抽出物３００　ｍｌを、約５時間に渡り該ＮａＣｌ溶液に滴下した 。泥褐色の沈殿が得られた。この溶液の温度を、該水浴を沸騰状態に維持するこ とにより、かつ該水浴中の水のレベルを維持するために１５時間に渡り連続的に 水を添加することにより制御した。

かくして、淡い褐色の溶液が形成され、その体積は７００ｍ１であった。該溶液 の残部は該加熱中に蒸発した。該溶液を含有するビーカーを、その内容物が室温 に達するまで該水浴中に放置した。該沈殿を該溶液から除去した。この黄色溶液 のマススペクトルによる分析は、該溶液がピノセンプリンおよびピノバンクシン −３−アセテートを含有することを示した。

実施例３ 実施例１で得られた抽出物を希釈して、該抽出物をエタノール中に乾燥物質基準 で１０重量％含む溶液を得た。ＮａＣｌを１０％の濃度となるように蒸留水に溶 解し、該溶液７００ｍ１をビーカーに入れ、これを水浴上に配置した。該ビーカ ーの温度を３０℃に維持した。エタノール中に１０重量％の蜂蝋を含有する該蜂 蝋抽出物３００ｍ１を、約５時間に渡り該ＮａＣｌ溶液に滴下した。泥褐色の沈 殿が得られた。この溶液の温度を、該水浴を沸騰状態に維持することにより、か つ該水浴中の水のレベルを一定に維持するために１５時間に渡り連続的に水を添 加することにより制御した。

かくして、淡い褐色の溶液が形成され、その体積は７００ｍ１であった。該溶液 の残部は該加熱中に蒸発された。該溶液を含有するビーカーを、その内容物が室 温に達するまで該水浴中に放置した。該沈殿を該溶液から除去した。

実施例４ 実施例１で得られた抽出物を希釈して、この抽出物をエタノール中に乾燥物質基 準で１０重量％含む溶液を得た。ＮａＣＩを１５％の濃度となるように蒸留水１ こ溶解し、該溶液７００ｍ１をビーカーに入れ、これを水浴上に配置した。該ビ ーカーの温度を３０℃に維持した。エタノール中に１０重量％の蜂蝋を含有する 該蜂蝋抽出物３００　ｍｌを、約５時間に渡り該ＮａＣｌ溶液に滴下した。泥褐 色の沈殿が得られた。この溶液の温度を、該水浴を沸騰状態に維持することによ り、かつ該水浴中の水のレベルを維持するために１５時間に渡り連続的に水を添 加することにより制御した。力Ａくして、淡い褐色の溶液が形成され、その体積 は７００ｍ１であった。該溶液の残部は該加熱中に蒸発された。該溶液を含有す るビーカーを、その内容物が室温１こ達するまで該水浴中に放置した。該沈殿を 該溶液から除去した。

実施例５ 実施例２の手順を繰り返した。但し、８００　ｍｌのＮａＣｌ溶液および２００ 　ｍｌの該蜂蝋抽出物を使用した。得られた溶液を以下の如くして、マススペク トノシ法により分析した。該黄色の抽出物２ｍｌを２ｍｌの酢酸エチルで抽出し た。該酢酸エチル相の１および５μｌを、ジエオール（Ｊｅｏｌ）　３００マス スペクトロメータに結合したがスクロマトグラフに注入した。このガスクロマト グラフは、無極性の固定相をもつ１５ｍの長いキャピラリーカラムを備えていた 。連続的な注入を２４０℃にて１分間行い、４５℃にて１分間、ｌＯ℃／分の温 度プログラムでガスクロマトグラフィーを実施した。このマススペクトル分析パ ラメータは、質量３５〜３００に対して、Ｅ１７０　ＢＹ　、１．２秒／走査で あった。抽出を実施する前に、内部標準として０．７μｍｍｌのピノセンプリン −７−メチルエーテル４３０μｌを試料に添加した。

この内部標準ピノセンプリン十メチルエーテルは該試料中（こも存在しており、 これが分析を困難にする。該内部標準を使用可能なものとするため１こ、該試料 を該内部標準の存在下、または不在下でクロマトグラフ処理し、該内部標準（こ よる妨害を差引きできるようにした。ピノセンプリンおよびピノｌくツクシン− ３−アセテートが基準スペクトルにより同定された。

この結果を第３図に示した。クロマトグラム１は全イオンクロマトグラムを示す 。クロマトグラム２はクロマトグラム１の解析から得た全ピークに対するマスス ペクトルである。クロマトグラム３は内部標準を使用した場合の全イオンクロマ トグラムである。クロマトグラム４は内部標準の全イオンクロマトグラムである 。クロマトグラム５は内部標準を使用した場合の実施例５のＧＣ−ＭＳである。

クロマトグラム６は内部標準を使用した場合の実施例５のｃｃ−砺であり、クロ マトグラム７は該内部標準のマススペクトルである。コントロールスペクトルは 酢酸エチルに可溶性の物質を何等含まない。

これらの結果は、０．９％ＮａＣ１溶液である該抽出物２＋＋＋１が２００　ｎ ｇ／ｍ１（２０ｘｌＯ−”　ｇ／ｍｌ）のピノセンプリンおよび９０ｎｇ／＋ｏ ｌ　（９０Ｘ　１０−’ｇ１０１）のピノバンクシン−３−アセテートを含有す ることを示す。該抽出物中には検出可能な他の成分を含まない。

実施例６ 実施例２の手順を繰り返した。但し、７７０　ｍｌのＮａＣｌ溶液および２３０ 　ｍｌの該蜂蝋抽出物を使用した。

実施例７ 実施例２の手順を繰り返した。但し、５００　ｍｌのＮａＣｌ溶液および５００ 　ｇｅｌの該蜂蝋抽出物を使用した。

生成した淡い黄色の溶液を水に対して透析することにより更に精製した。この抽 出物５０ｍ１をチューブ（モデル（Ｍｏｄｅｌ）　ＷＩＬカタフ（ｃａｔａｆ） 　３５００ケポ（Ｋｅｂｏ）ＡＢスウェーデン）を通して蒸留水２５０ｍ１に対 して透析した。

透析しなかったおよび透析した溶液両者を固体プローブ（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｒｏｂ ｅ）／μＳにてマススペクトル法によりテストした。ｌμｌの該テスト溶液と９ ６％ｐ、Ｌ　ＥｔＯＨｌ：ｌとの混合物を約６０℃にて蒸発させ、２５℃に冷却 し、次いでｌＯ℃／Ｓにて３７５℃まで加熱した。該温度を約４分間維持した。

サイクルＩＳでｍ／２４１−６４１からのマススペクトルをこの期間中調べた。

該透析生成物のマススペクトルを第１図に示した。該第１図において、それぞれ 第１ａ図は温度勾配、４種の領域ＭＯおよび全イオン流を示し、第１ｂ図は数値 で示した濾過後の全イオン流を示し、第１Ｃ図は第１ａ図の領域Ａにおけるスペ クトルを示し、第１ｄ図は第１ａ図の領域Ｂにおけるスペクトルを示し、第１ｅ 図は第１ａ図の領域Ｃにおけるスペクトルを示し、かつ第１ｒ図は第１ａ図の領 域りにおけるスペクトルを示す。第２ａ図〜第２ｆ図は、それぞれ未透析生成物 の対応する同様なスペクトルを示す図である。これらのマススペクトルは該生成 物がピノセンプリンおよびピノバンクシン−３−アセテートを含有することを示 しているものと解釈される。

実施例８ 実施例７の手順を繰り返した。但し、該蜂蝋抽出物を該ＮａＣ１溶液に滴下した 後に、該混合物を６０℃にて７６時間加熱した。得られた黄色の抽出物を生成す る沈殿から分離し、分析した。実施例７とは別のもう一つの透析装置を使用した 。該黄色溶液のマススペクトルによる分析は該溶液がピノセンプリン、ピノバン クシン−３−アセテートおよびナツンゲニンを含むことを示す。

実施例９ 実施例２の手順を繰り返した。但し、該蜂蝋抽出物を該ＮａＣｌ溶液に滴下した 後に、該混合物を６０℃にて７８時間に渡り加熱した。実施例７とは別にもう一 台の透析装置を使用した。得られた黄色溶液のマススペクトルによる分析は該溶 液がピノセンプリン、ピノバンクシン−３−アセテートおよびナツンゲニンを含 むことを示す。

実施例１０ 出発物質を実施例１と同様に調製し、透明な蜂蝋抽出物を濃度が２０重量％とな るまで濃縮した。その後、実施例７の手順を繰り返した。但し、該蜂蝋抽出物を 該ＮａＣｌ溶液に滴下した後に、該混合物を６０℃にて７２〜７８時間に渡り加 熱した。実施例７とは別にもう一台の透析装置を使用した。得られた黄色溶液の マススペクトルによる分析は該溶液がピノセンプリン、ピノバンクシン−３−ア セテートおよびナツンゲニンを含むことを示す。この抽出物は抗ウィルス剤とし て適しており、例えば免疫系の刺激を介して作用する（実施例１５）。

実施例８．９および１０の生成物をガスクロマトグラフィー−マススペクトル法 により分析した。

分析法 内部標準（Ｉｓ）　：　３．２Ｘ１０”　ｇ／ａｉ１のピノセンプリン−７−メ チルエーテル１：１ｍｌの試料を１ｍｌの酢酸エチルで抽出した。

２：添加された０、１ｍｌの内部標準を含む１ｍｌの試料を１■１の酢酸エチル で抽出した。

３：２μＩの各酢酸エチル相をガスクロマトグラフィー−マススペクトル分析装 置（ＧＣ−ＭＳ）上に注入した。

ＧＣプログラム カラム：無極性の固定相を有する寸法１５■×ｏ、２５ｒｗ）もの。

注入：２８０℃にて連続式に１分間。

温度プログラム二６０℃にて（１分間）から５℃／分にて２８０　’Ｃまで。

マススペクトル分析装置のパラメータ 走査＝１．２秒間ｉ：ａ／ｚ　３０−５００゜イオン化：電子衝撃（Ｅｌ）　７ ０　ｅＶ、イオン化電流５０μ八〇結果 基準スペクトルの助けによって、ピノセンプリンおよびピノバンクシン−３−ア セテートを同定した。

実施例９ａ、９ｂ、８および１０の分析は、ピノセンプリンの量に関連する以下 の結果を与えた。

出所　ピノセンプリン　ピノバンクシン−３−ア　ナツンゲニンの（Ｐｒｏｗ、 　）　の濃度（Ｉｌ１ｇ／Ｉ）　セテートの濃度（ｆｆ１ｇ／Ｉ）　濃度（ｍｇ ／ｌ）実施例８　１．０　５．３　５２ 実施例９ａ　５．３　５．９　４５ 実施例９ｂ　５．８　７．８　５８ 実施例１０　１０．０　１３．０　５９コメント：ここに与えたピノセンプリン およびピノバンクシン−３−アセテートの濃度は該試料中におけるこれら化合物 の量に関する示唆を与えるものと理解すべきである。例えば、ピノセンプリン、 ピノバンクシン−３−アセテート、ナツンゲ二ンおよびピノセンプリン−７−メ チルエーテル（標準）間の抽出回収率に関する差異、およびこれら化合物と該標 準との間の該マススペクトル分析装置に関する応答における差異のために、これ らの濃度には大きな誤差がある可能性がある。

ピノセンプリンおよびピノバンクシン−３−アセテートの量のより精度の高い分 析を実施するためには、標準として純粋な形状のこれら化合物を使用する必要が ある。

上記実施例１〜ｌＯはＮａＣｌ溶液の代わりに水溶液を使用して繰り返すことが できる。

実施例１１ 実施例ＩＯを繰り返した。但し、５００　ｍｌの水および２０重量％の蜂蝋抽出 物５００　ｍｌを使用した。温度は６０℃に維持し、抽出時間を３２時間とした 。

成育テストまえに実施した滅菌性に関するコントロールテストにおいて、これら ４種の蜂蝋溶液は負であった。全ての菌株を一度にテストした。ウシブロス中で ３７℃にて２０時間これら菌株を培養したところ、これらのブロスは１ｍｌ当た り１０’−１０＠個の微生物を含んでいた（表工を参照のこと）。

各ブロスから０．１ｍｌの試料を採取しく１０２〜１０”の希釈率）、これらを 実施例２または５に従って該抽出物０．９ｍｌに添加して、各混合物がｉｏ”− ｉｏ’個／ｍｌのバクテリアを含むようにした（表ＩＩを参照のこと）。次いで 、これらの溶液を３８℃にてインキュベートした。０および３時間後に、バクテ リア数を計数した。結果を表ｌｌｌ−ｆｆに与えた。培養の３時間後に、該培養 物中にバクテリアは観測されなかった。このことは、テストした各バクテリアが 、実施例２および５のテストされた抽出物中で、インキュベートの３時間後に死 滅したことを意味する。

表１＝ブロス中のバクテリア数 バクテリア　テストｌ　（実施例２）　テストｌ（実施例２）Ｋｌ　１．５ｘｌ Ｏ”　２．０ｘｌＯ’Ｐ、ａ　４．０Ｘ１０’　１２刈ｏ９ ＳＫ−５，５ｘｌＯ’　５．０ｘｌＯ’Ｓｒｕ　９．５ｘｌＯ’　３．５Ｘ１０ ”Ｓｒａ　４．０ＸＩＯ’　９．５Ｘ１０’Ｐ、ｍ　２．５ｘｌＯ”　２．０ｘ ｌＯ”Ａ、ｐ　８．５ｘｌＯ”　１．０ｘｌＯ’’　Ｓ、ｃｅ　１．５Ｘ１０’ 　３．０ｘｌＯ’Ｃ，ｐｓ　３．５ＸｌＯ’　１．７Ｘ１０’表ＩＩ：バクテリ ア数／ｍｌ抽出物 バクテリア　実施例２　実施例５ Ｋｌ　１．５ｘｌＯ’　２．ｏｘｌＯ’Ｐ、ａ　４．０Ｘ１０’　１２　ＸＩＯ ’ＳＫ−５，５ｘｌＯ’　５．０ｘｌＯ’Ｓｒｕ　９．５ＸＩＯ’　３．５刈０ ６Ｓｒａ　４　ＸＩＯ’　９．５刈θ′ Ｐ、　ｍ　２．５刈０’　２．０ｘｌＯ’Ａ、Ｉ）　８．５Ｘ１０’　１．０Ｘ １０’Ｓ、ｃｅ　１．５Ｘ１０”　３．０ｘｌＯ”Ｃ，ｐｓ　３．５ｘｌＯ”　 １．７ｘｌｏ”表Ｉｌｌ　（時間０） バクテリア　実施例２　実施例５　実施例５Ｋｌ　２．５ｘｌＯ”　７．５Ｘ１ ０’　５．５ｘｌＯ’Ｐ、ａ　０　０　０ ＳＫ−１ｘｌＯ”　２．０刈０”　９．０ｘｌＯ”Ｓｒｕ　Ｏ０３，０ｘｌＯ” Ｓｒａ　０　１．０ＸＩＯ’　５．０Ｘ１０”Ｐ、ｍ　２Ｘ１０’　９．５Ｘ１ ０’　５．５ＸＩＯ’Ａ、ｐＯＯｌ、ＱＸＩＱ’ Ｓ、ｃｅ　０　０　２，５ｘｌＯ” Ｃ，ｐｓ　ｌＸｌ０”　３．０ＸＩＯ’　１．ｌＸｌ０”表ＩＶ（３時間後） バクテリア　実施例２　実施例５　実施例５Ｋｌ　０　０　０　０ Ｐ、ａ　ＯＯ００ ＳＫ−００００ Ｓｒｕ　Ｏ０００ Ｓｒａ　Ｏ０００ Ｐ、ｍ　Ｏ０００ Ａ、ｌ）　ＯＯＯＯ ３，ｃｅ　０　０　０　０ Ｃ，ｐｓ　ＯＯ００ コントロール：該蜂蝋バクテリア懸濁液１０ｍ１を３ｍｌのブロスに添加し、３ ７℃にて２４時間培養し、プレート上に移し、３７℃にて４８時間培養した。成 育バクテリア数は零であった。

以下の３種の菌株を別のテストで分析した。即ち、スタフィロコッカス・オー全 での蜂の溶液をバクテリアの存在につき検査した。これらは何れもバクテリアを 含んでいなかった。

これらのバクテリアをブロス中で２４時間培養した。これらは１ｍｌ当たり１０ ’−１０”個のバクテリアを含んでいた。各ブロスからそれぞれ０．１ｍｌの培 養物を取り出し、０．９ｍｌの蜂の溶液と混合し、３７℃にてインキュベートし た。バクテリア数を０１３．２４および４８時間後に計数した。

結果：３時間の培養後、該培養物中にはバクテリアは検出されなかった。このこ とは、全てのバクテリアが死滅したことを示している。

全ての蜂の溶液をバクテリアの存在につき検査した。これらは何れもバクテリア を含んでいなかった。

これらのバクテリアを、１ｍｌ当たり１０’−１０’個のバクテリアなる密度と なるように２４時間培養した。各ブロスからそれぞれ０．１ｍｌの培養物を取り 出し、０．９ｍｌの蜂の溶液と混合し、３７℃にてインキュベートした。バクテ リア数を０，３．２４および４８時間後に計数した。３時間の培養後、該培養物 中にはバクテリアは検出されなかった。このことは、全てのバクテリアが死滅し たことを示している。

実施例１４ 以下のバクテリア菌株を使用した。

へりコバフタ−・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）　ＮＣＴ Ｃ１１７３６、国際標準菌株ヘリコハクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ ｒ　ｐｙｌｏｒｉ）　Ｓ−３、スウェーデンオレブロ（Ｏｒｅｂｒｏ）で単離し たもの ヘリコハクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）　Ｓ−６ 、フィンランドヘルシンキにて単離したもの へりコバフタ−・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）　７−８ ８、フィンランドヘルシンキにて単離したもの カンピロバクタ−・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ） 　Ｓ−５６２、スウェーデンオレブロ（Ｏｒｅｂｒｏ）で単離したものカンピロ バクタ−・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ）　Ｓ−２ ６１、スウェーデンオレブロ（Ｏｒｅｂｒｏ）で単離したものスタフィロコッカ ス・エビデルミゾイス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｎｎｉｄｉ ｓ）、本研究室で保存している菌株 へりコバフタ一群およびカンピロバクタ一群は２種の重要な腸管病因バクテリア であり、胃腸炎を引き起こす。ヘリコハクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔ ｅｒ　ｐｙｌｏｒＤは、特に腸管感染の原因であり、かつ消化性潰瘍疾患におけ る原因物質として認識されている。スタフィロコッカス菌株は一般的な病院バク テリア種（ｃｏｍｍｏｎｈｏｓｐｉｔａｌ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　５ｐｅｃｉｅ ｓ）であり、スタフィロコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）は流産を誘発する膣内バクテリアである。上記／ くクチリアに関する幅広いスペクトルをもつ抗生物質として使用できる、副作用 のない抗菌治療法に対する大きな要求がある。現時点では、該バクテリアによる 疾患の治療は２種の異なる構成物質と組み合わせたビスマスの使用を含む。

これらのテストで使用する菌株を富化したミューラーヒントンブロス（Ｍｕｅｌ ｌｅｒＨｉｎｔｏｎ　Ｂｒｏｔｈ）中で一夜培養する。コロニー形成単位（ＣＦ Ｕ）は比ピロリに関しては１　ｘｌＯ’／ｍｌ〜８　ＸＩＯ’／＋ｏｌおよびＳ 、アガラクチアエおよびＳ、エビデルミゾイスに対しては２　ＸＩＯ’／ｍｌ〜 ５　ＸＩＯ’／ｍｌの範囲内である。

各ブロス培養物から体積０．１ｍｌの試料を採取し、実施例２および５で得た蜂 の溶液０．９ｍｌと混合し、３７℃にてインキュベートした。０．３．２４およ び４８時間後にこれら混合初冬々から０．１ｍｌの試料を採取し、血液寒天培地 上で培養する。

３時間後には、バクテリアの成育は観測されず、このことはテストしたバクテリ アが該テストした溶液中でのインキュベーションの３時間後には死滅したことを 意味する。これらテストの各々を少なくとも２回繰り返したが、同一の結果が得 られた。

実施例１５ 本発明の混合物の免疫刺激作用は、胸腺および膵臓由来の細胞（Ｂ−およｒ−リ ンパ球およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞））について直接テストした。こ れらテストにおいて、該混合物は高い免疫刺激効果を示した。インビボ治療の結 果を第４図に示す。本発明の組成物をも試料を介して動物に与えたところ、胸腺 および膵臓両者におけるＴ−およびＢ−細胞の高い活性をもたらした。本発明の 組成物は体液性および細胞媒介免疫応答両者を高める。

コクサラキーウィルスＢ３（Ｃ８４）に感染したマウスにおいて、本発明の組成 物で予防処置したマウスについては該マウスの生存時間は有意に延長された。こ の結果を第５図に示す。

実施例１６：マウスにおける毒性 本発明の生成物の、動物中におけるアジュバントとしての作用に関する情報をる 入手するために、実施例１Ｏの生成物を投与量１μｇを使用して、マウスにつき 調べた。

これらの動物を２群に分けた。各群は６匹の雌１２週令のＢＡＬＢ／ｃマウスか らなっていた。

動物の２群に対して該処方物を、皮下（Ｓ／Ｃ）または腹腔内（ｉ／ｐ）経路の 何れかで与えた。

結果 ３週間の観察期間中致死効果は何等観察されなかった。しかしながら、Ｓ／Ｃ経 路で接種した６匹の動物中の２匹において僅かな局所的な反応が観察された。こ の観察された変化は、該注入部位における完全脱毛であった。

２群（ＡおよびＢ）の雌の１２週令ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。各群は６匹 の動物からなっていた。

この免疫化に使用した抗原（Ａｇ）はウマのヘルペスウィルスタイプ−２（ＥＨ Ｖ−２）のエンベロープ糖タンパクであった。この抗原の投与量は２種の異なる 処方の各々に対して、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法により測定した タンパク５μｇであった。

これらマウス群を以下の方法で免疫化した。

群Ａにはフロインド不完全アジュバント（Ｆ［Ａ）と混合したＡｇを投与した。

群Ｂには実施例１Ｏの生成物ｌμｇと混合した該抗原を投与した。

これらマウスは４週間の間隔で２回免疫化した。血液試料をそれぞれ該最初の免 疫化の４．５および７週間後に採取した。血清を分離し、５６℃にて１時間処理 することにより不活化した。該エンベロープ抗原に応答する血清の抗体をＥＬＩ ＳＡ法に従って測定した。

表Ｖ ５μｇ　Ｅｌ（Ｖ−２エンベロープ抗原１で免疫したマウスの血清抗体応答（平 均値）。

Ａ）フロインド不完全アジュバントと混合した抗原を使用、Ｂ）実施例１０の生 成物ｌμｇと混合した該抗原を使用。結果は依然として抗体応答を呈する希釈率 で示した。

Ａ　Ｉ／８００　１／６４００　１／６４００Ｂ　１／６４００　１／１０２４ ００　１／１０２４００（ネ）動物は４週間間隔で２回免疫化した。

結果 このテストにおいて抗原および実施例ＩＯの生成物を投与した動物は、抗原とＦ ＩＡとの混合物を投与した動物群よりも約１６倍も高い抗体価を示す。

以上本発明を特定の実施態様に従って記載してきたが、種々の変更、改良並びに 態様が可能であり、従ってこれら全ての変更、改良並びに態様は本発明の精神並 びに範囲内に入るものであることを理解すべきである。

−〇 ね蔓　竪 ％生存率 図 く −巨 区　忙 区 Ｎ　巨 区　言 メ　− 区 平成　年　月　日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．抗菌剤、抗ウイルス剤または免疫刺激剤として、あるいは創傷治癒因子とし て使用するための、以下の一般式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒは同一または異なっていてもよく、各々Ｈ、ＯＨまたはＣＨ２−Ｃ Ｏ−Ｏを表す）で示される化合物。
2. ２．抗菌剤、抗ウイルス剤または免疫刺激剤として、あるいは創傷治癒因子とし て使用するための請求の範囲第１項に記載のピノセンブリン、４Ｈ−１−ベンゾ ピラン−４−オン又は２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−フェニル 。
3. ３．抗菌剤、抗ウイルス剤または免疫刺激剤として、あるいは創傷治癒因子とし て使用するための請求の範囲第１項に記載のピノバンクシン−３−アセテート、 ４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン又は２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキ シ−２−フェニル−３−アセテート。
4. ４．抗菌剤、抗ウイルス剤または免疫刺激剤として、あるいは創傷治癒因子とし て使用するための請求の範囲第１項に記載のナリンゲニン又は５，７，４′−ト リヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−２−フェニル−１，４−ベンゾピラン。
5. ５．抗菌剤、抗ウイルス剤または免疫刺激剤として、あるいは創傷治癒因子とし て使用するための請求の範囲第１項に記載の化合物の混合物。
6. ６．抗菌剤、抗ウイルス剤または免疫刺激剤として、あるいは創傷治癒因子とし て使用するためのピノバンクシン−３−アセテート、ピノセンプリンおよびナリ ンゲニンを含む混合物。
7. ７．蜂蝋含有物質、例えば有機溶媒、好ましくは蜂蝋を含むアルコール溶液を水 または０．１−１７重量％のＮａＣｌを含有する水溶液に、３０−９５℃にて添 加し、得られた混合物を３０−９５℃にて１０−１００時間維持し、次いで該溶 液から底部沈殿物を除去することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の混合 物の調製法。
8. ８．該アルコール性蜂蝋溶液が、低温例えば最大２０℃の温度にて、体積比８７ ：１３のエタノール／水混合物で、１８〜２５ｋＨｚの超音波を印加しつつ、短 時間例えば２５分間、密閉系内で蜂蝋を抽出し、次いでこの生成した懸濁液をデ カンテーションし、固体粒子を除去して透明な蜂蝋抽出物を生成することにより 得られる、請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．製薬上許容される担体中に、請求の範囲第１〜５項の、あるいは請求の範囲 第６または７項に従って製造した物質を少なくとも１種含有する、ヒトまたは獣 医学用の組成物。
10. １０．該担体が生理塩溶液である請求の範囲第８項に記載の組成物。