JPH06503259A - コラーゲン粒子の製造法及びその活性基質に対する担体としての使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 コラーゲン粒子の製造法及びその活性基質に対する担体としての使用法 発明の説明 本発明は、寸法がマイクロメータ及びナノメータの範囲にあるコラーゲン粒子の 製造法、及びその、医薬品、食品加工業及び化粧品における活性物質の担体とし ての使用法に関する。

丁度多種類のキャスト材料の場合のように、多数の活性物質及び他の成分例えば 染料、触媒、酵素、放射性活性物質、風味剤、揮発性化合物などをミクロン及び ナノメータの範囲にある大きさのカプセル中に内包させることは良く知られてい る。製薬学的分野において、例えばゼラチンのケース中の蒸留油は、ケースが溶 解した時に始めて芳香を放つ芳香担体として役立つ。カプセル化の目的は、ケー スが溶解した後に内容物を放出することの他、例えば活性基質を酸素、水分又は 他の化学物質から保護すること、液体を「固体」粉末に変換すること、活性基質 の貯蔵形を適当な処理又は関連するケース材料の選択によって作ること、或いは 活性基質及び補助剤の複合物を、担体粒子の表面に活性基質を負荷することによ って製造することにある。

ナノメータ範囲の粒子の大きさは、この他に非常に小さい寸法のカプセルの結果 として、これを、封入された又は吸収された活性物質と一緒に水へコロイド的に 溶解させうることである。斯くしてそのような溶液は静脈内非投与することも可 能である。

コラーゲンはを推動物の結合組織の主成分であり、殆んど至る所に存在する。コ ラーゲンから作られた薬剤の粒状物担体は、他の担体形と比べて、生体適合性及 び粒子の完全な生分解性及び代謝転換性のためにそれを局所的に及び全身的に適 用しても毒物学的問題が予想できないという利点をもつ。

コラーゲンの、カプセルのケース材料としての使用は、蛋白質粒子と非常に良く 結合する高蛋白質親和性をもつ基質の場合、この担体系への高負荷が可能である という更なる利点を提供する。吸着剤負荷のための担体系の能力は、これらの場 合、同一の粒子表面積を考慮しても、例えばアクリレートに基づく担体粒子のそ れより非常に高い。

コラーゲンのミクロ粒子の製造法は例えば米国特許第４．５６５．５８０号及び 第４．１０７．２８８号に記述されている。ここに「ミクロ粒子」とは、マイク ロメータ及びそれ以下の範囲の粒子寸法が記述されているという意味において用 いられる。これに記述されている方法の共通の特徴は、コアセルベーションの理 論に従ってミクロ粒子が製造されるということである。この方法においては、コ ラーゲンの分子分散溶液に解溶媒和剤例えばアルコール又は電解質が添加される 。蛋白質の溶解度は、光を散乱する蛋白質凝集物の生成を示す溶液の濁りに帰結 する混合物を用いることによって減ぜられる。

コアセルベートを分離し、これを乾燥するならば、最終的にマイクロカプセルが 得られ、続く処理で硬化させることができる。粒子の直径はそれぞれ１０〜１０ ００μｍ（米国特許第４．５６５．５８０号）及び１０〜１１００（Ｌｑ　（米 国特許ｊＮ４．１０７．２８８号）である。

米国特許第４．、’％　３７．２　ｓ　５号には、水性コラーゲン分散液を、直 径が定義されている振動する中空管中を強制的に通過させる方法が記述されてい る。管の端で小滴が生成し、これが液体窒素からなる冷却洛中に落下する。窒素 を蒸発させた後、凍結した小滴を凍結乾燥し、次いで水性分散液中で架橋により 後処理硬化させる。この粒子の直径は１００〜４００μｍである。

従来法に従う上述したコラーゲンミクロ粒子の粒径分布は、深刻な欠点を示す。

１つを言えば、粒径分布が非常に広い範囲に広がっていることである。非常に狭 い粒子分布を有する均質な粒子画分は、コラーゲン分子の凝集及び粒子の凝集が 任意に起こり且つこれを殆んど制御することができないので、上述した方法に従 って得ることができない。低マイクロメータの及びナノメータ範囲の直径を有す る限定されたコラーゲン粒子画分はこの方法によって製造することができず、斯 （して製造されるミクロ粒子は静脈内注射の調製物には不適当である。

本発明はその基礎として、狭い粒径分布が制御できるマイクロメータ及びナノメ ータ範囲の均質なコラーゲン粒子の製造法の発見という作業を設定した。

この作業は、驚くことにコラーゲンの水中分散液又は溶液を、乳化剤を添加した 水と混和しない有機相中へ分離した小滴で細かく分布させ、これによって油中水 乳化液を生成せしめ、続いてコラーゲンを、架橋剤の添加によって小滴の界面で 架橋させ、そしてこのように製造されたコラーゲン粒子を、有機相の分離及び水 洗によって精製及び分離する方法によって解決された。

粒子を製造するために、同業者には公知の方法に従って、同業者には公知の種々 の起源からの主審のコラーゲン或いは化学試剤又は物理的影響によって変性した コラーゲンを含有する水性コラ−ケン分散液から、乳化剤から及び有機相から乳 化液を調製する。この乳化液の種類の決定は電導計を用いて行うことができる。

本発明の方法において有利に使用することのできる乳化剤は、ポリエチレングリ コール脂肪酸エステル例えばポリエチレングリコール−４００−ステアレート； ポリエチレングリコール脂肪族アルコールエーテル例えばポリエチレングリコー ル−２００−ラウリルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エス テル例えばポリエチレングリコール−（２０）−ソルビタンモノオレエート、多 価アルコールの部分的脂肪酸エステル例えばグリセロールモノステアレート又は ソルビタントリオレエート、或いは糖の部分的脂肪酸エステル例えばサッカロー ズモノラウリン酸エステルである。

水と混和しない有機相は、天然の、半合成の又は合成の液体の脂、油又はワック ス例えばオリーブ油、ヒマシ油、綿実油、大豆油、水和南京豆油、トリグリセリ ド混合物［ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ［Ｆ］）、ソフチサン（Ｓｏｆｔｉｓ ａｎ■）］、シリコーン油、オレイン酸オレイルエステル、ミリスチン酸イソプ ロピル又はオレイン酸エチルを含むことができる。

乳化液の調製は、最終的に得られるミクロ粒子の寸法及び均一性に影響するので 決定的な段階である。有機相中に分散された水の小滴の寸法は、乳化剤又は乳化 複合物の種類及び乳化過程の種類及び強度の双方によって決定され且つ調節され る。

次いでコラーゲン分子は架橋剤を添加することにより小滴の界面で重合せしめら れる。１又は２亘熊性アルデヒド例えばホルムアルデヒド、ゲルタールアルデヒ ド又はシｒルデヒド殿粉、或いは２官能性イソシアネート例えばヘキサメチレン ジイソシアネートが架橋剤として使用でき続いて有機相を分離し、そして粒子を 洗浄により、即ち有機相、乳化剤及び架橋剤の残りを除去することにより精製す る。

凝集物を壊すために、コラーゲンのミクロ粒子を超音波浴中で再分散させること が必要なことがある。粒径及び粒径分布の決定は、凍結乾燥及び再分散後に光電 子相関分光法（ｐｈｏｔｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔ ｒｙ）を用いて行われる。同時にレーザー光を、２０パルス／秒でコラーゲン粒 子の希釈コロイド溶液を満した容器中に送る。粒子によって散乱されるレーザー 光を、照射レーザーに対して９０°の角度にある光電管で記録する。この散乱は 粒子の寸法に依存し、得られた電気信号の変換により粒径を数学的方程式により 推定することができる。

ブラウン運動のために、各パルスにおいて他の「粒子集団」が照射される。この ようにして多数回（＞２５００）のパルスから得られる情報は粒子の平均粒径及 び粒径分布の正確な描写を与える。

活性基質は粒子の架橋に先立って乳化液に添加することができる。活性基質は界 面重合による粒子の製造中に粒子内に内包され、或いは粒子の生成後に粒子の表 面に吸着される。

活性基質の負荷を粒子の生成後に行うならば、コラーゲン粒子を、その製造、分 離及び精製後に同業者に公知のいずれかの、好ましくは凍結乾燥法を用いる乾燥 過程に供する。高い温度低下速度で、粒子を凍結乾煽機により≦−５０℃以下の 温度まで、できるだけ小さい氷の結晶ができるようにショック（ｓｈｏｃｋ）凍 結し、続いて真空下に凍結乾燥する。

この乾燥過程は更なる工程ｔｒの貯蔵中の粒子の安定性を増大させる。

乾燥粒子の、続く活性基質でΦ負荷に対しては、粒子を先ず水に再分散さ也次い で活性基質、活性基質溶液又は活性基質分散液を先の再分散液に添加する。続い て吸着により活性物質の負荷された粒子を分離且つ精製する。

本発明の方法によれば、乳化重合により、静脈内注射に又は目への適用に対する 調製物に使用することのできる非常に小さい直径のコラーゲン粒子を製造するこ とが可能である。本発明の比較的簡単な方法は、正確な工程制御を可能にし、斯 くしてそれぞれ所望の狭い粒径分布を有する粒子を均一な量で且つ高収率で製造 する改善された制御を可能にする。

次の実施例は本発明を例示する。

実施例１ コラーゲンミクロ粒子の、油中水乳化液からの製造乳棒を用いることにより、ソ ルビタンモノラウレート１５ｇを、乳鉢に予じめ入れておいた綿実油１００ｇ中 に均一に混入した。１０分後、生来の子牛の皮膚のコラーゲンの１　ｐ、　ｃ、 分散液２５ｇを５回に分けて添加し、注意深く混入した。この乳化液を冷却しな がら超音波洛中で３ＸＩＯ分間均質にした。

更なる工程において、乳化液を、中間で冷却しなから３×１５秒間高速ホモゲナ イザー混合機で処理した。乳化液をマグネチック・スターラーにより４００ｒｐ ｍで撹拌し、粒子の架橋を行うためにゲルタールアルデヒド溶液（２５％）５． ０ｍｌを添加した。１０分後に亜硫酸水素ナトリウム溶液（２５％）７．０ｍｌ を添加して反応を停止させ、次いで混合物を処理した。

過剰なエーテルを調製ηに３回添加し、後者をその度毎に２５００ｒｐｍ下に１ ０分間遠心分灘した。この工程を過剰の水を用いて２回繰返した。次いで粒子を 凍結乾燥し、或いは直ぐに次の工程に供した。

本実施例において、平均直径２．１５μｍのコラーゲン粒子が得られ、粒子の９ ０％が３．２μｍより小さがった。またコラーゲン粒子の収率は用いた純コラー ゲンの量に対して約９５％でありだ。

実施例２ 生来の子牛の皮膚コラーゲンの１ｐ、ｃ、分散液の代りに、変性した子牛の皮膚 コラーゲンの１　ｐ、　ｃ、分散液を用いる以外実施例１に記述した如（実験を 行った。得られた平均直径は３２０ｎｍであった。収率：コラーゲンのマイクロ カプセルの、油中水乳化液からの製造ポリオキシエチレン−（２ｏ）−ソルビタ ンモノオレエート１０ｇを、生来の子牛の皮膚コラーゲンの０．７５ｐ、ｃ、分 散液２５ｍ／！中に分散させた。１０分後に綿実油１００ｇを５回に分けて添加 し、撹拌した。

その度毎に、続いて乳化液を５分間高速ポモゲナイザー混合機及びスリット（ｓ ｌｉｔ）ホモゲナイザーで処理した。次いでゲルタールアルデヒド溶液（２５％ ）１．０ｇを添加し、分散液を１ｏ分間撹拌した。過剰のゲルタールアルデヒド を回収するために、亜硫酸水素ナトリウム溶液（２５％）１．４ｍｊｉを添加し た。有機相の除去は実施例１に記述したように行った。収率：９２％。

得られた粒子は１．２３μｍの平均直径を示した。粒子の９０％は２．２μｍよ り小さかった。

実施例４ コラーゲン粒子への、エタク＋８ジンラクテートの負荷粒子５０ｍｇを超音波浴 中において水５０ｍｊ！に分散させた。この粒子分散液にエタクリジンラクテー ト（ｅｔｈａｃｒｉｄｉｎｅ　１ａｃｔａｔｅ）　２５ｍｇを添加し、２０Ｏｒ ｐｍで２４時間撹拌した。負荷量を決定するために、懸濁液を限外濾過に供し、 濾液中の薬剤の含量を決定し、続いて粒子への負荷量を計算した。粒子への負荷 量はコラーゲン粒子５０ｍｇ上に１２ｍｇであった。斯くして絶対負荷量は用い た薬剤に対して４８重量％コラーゲン粒子への、クロロフィルの負荷コラーゲン 粒子２５０ｍｇを、生理ＮａＯＨ溶液２２．５ｒｎｊ中に分散させた。この分散 液を１０分間超音波照射した。次いで飽和エタノール性クロロフィル溶液２．５ ｍＡを添加し、３００ｒｐｍで約２４時間撹拌した。次いで粒子を、セファデッ クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ■）Ｇ−５０（架橋した多糖類）を充填したＧＰＣカラ ムにより精製した。第２のバンドは現われなかった。このことは負荷が定量的に 行われたことを示す。次いで得られた粒子を凍結乾燥した。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条８）平成５年６月１日１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．マイクロメータ及びナノメータ範囲の架橋したコラーゲンミクロ粒子の製造 に際して、コラーゲンの水中分散液又は溶液を、乳化剤を添加した水と混和しな い有機相中へ分離した小滴で細かく分散させ、これによって油中水乳化液を生成 せしめ、続いてコラーゲンを、架橋剤の添加によって小滴の界面で架橋させ、そ してこのように製造されたコラーゲン粒子を、有機相の分離及び水洗によって精 製及び分離する、該コラーゲンミクロ粒子の製造法。
2. ２．生来の（ｎａｔｉｖｅ）コラーゲンを用いる請求の範囲１の方法。
3. ３．変性したコラーゲンを用いる請求の範囲１の方法。
4. ４．乳化剤を、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコー ル脂肪族アルコールエーテル、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステ ル、多価アルコールの部分的脂肪酸エステル又は糖の部分的脂肪酸エステルの群 から選択する請求の範囲１〜３のいずれか１つの方法。
5. ５．水と混和しない有機相を調製するために、天然の、半合成の又は合成の液体 の脂、油又はワックスを用いる請求の範囲１〜４の１つ又はそれ以上の方法。
6. ６．架橋剤として、１又は２官能性アルデヒド或いは２官能性イソシアネートを 用いる請求の範囲１〜５の１つ又はそれ以上の方法。
7. ７．有機相の分離に続いて、粒子を乾燥工程、好ましくは凍結乾燥に供する請求 の範囲１〜６の１つ又はそれ以上の方法。
8. ８．活性基質（ａｃｔｉｖｅ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を乳化液に添加する請求の 範囲１〜７の１つ又はそれ以上の方法。
9. ９．分離及び精製後、粒子に活性基質を負荷（ｌｏａｄ）する請求の範囲１〜７ の１つ又はそれ以上の方法。
10. １０．請求の範囲１〜９のいずれか１つのコラーゲン粒子を、医薬品、化粧品又 は食品加工における活性基質担体として使用する方法。
11. １１．静脈内注射による適用に適当である請求の範囲１０のコラーゲン粒子の使 用法。