JPH06500705A - 光学試験における蛋白質の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光学試験における蛋白質の安定化方法 本発明は、蛋白質を含有する溶液の光学試験において、試験溶液中に存在する蛋 白質成分の低安定性に基づく干渉が生じ得る場合について、一定の感度を保持す るための方法に関するものである。

原核生物中に存在し、蛋白質ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏｓｓから成るＧｒｏＥ複合体 は、ｉｎ　ｖｉｖｏと同様にｉｎ　ｖｉｔｒＯでも、蛋白質の再構成と会合に関 わっている（Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３７ 　（１９８９）、　４４−４７；Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ ａｔｕｒｅ　３４２　（１９８９）、　８８４−８８９　ａｎｄ　Ｖｉｉｔａｎ ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９　（１９９０）、　５ ６６５−５６７１）。ＧｒｏＥＬは“チャベロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）　 ６０”グループの蛋白質の１つであり、一方ＧｒｏＥＳは“チャペロニンｌＯ″ グループに属している。両グループの蛋白質は通常ＡＴＰ依存性で、細胞中での 折りたたみ、会合及び転位の過程に能動的に関与し、最近“チャベロン（ｅｈａ ｐｅｒｏｎ）”蛋白質と定義されるファミリーに属するものとして分類される（ Ｌａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｇｉｅｒａｓｃｈ、　ＴｌＢ５１６　（１９９１）、　 １５９−１６３．　Ｅｌｌｉｓ　ａｎｄｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｉｅｓ、　Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　６０　（１９９１）、　３２１−３４７）　ｏ これらの文献によれば、ＧｒｏＥＬ複合体は１４のサブユニットからなり、蛋白 質の転位と折りたたみを促進する。ざらにＧｒｏＢＬに関連する熱シヨツク蛋白 質が、ミトコンドリア（ＭｃＭｕｌｌｉｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌｂｅｒｇ（１９８ ８）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８．３７１−３８０）、葉緑 体（Ｈｅｍｍｉｎｇｓｅｎｅｔ　ａｌ、、（１９８８）、　Ｎａｔｕｒｅ　３３ ３．３３０−３３４）及び種々の細菌種（Ｖｏｄｋｉｎ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ　（１９８８）、Ｊ、Ｂａｃｔ、１７０．　１２２７−１２３４　；　Ｍｅ ｈｒａ　ｅｔａｌ、、（１９８６）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８３．　７０１３−７０１７　ａｎｄＴｏｒｒｅｓ−Ｒｕｉｚ　ａｎｄ 　ＭｃＦａｄｄｅｎ　（１９８９）、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ。

２６１、１９６−２０４）から見出されている。

蛋白質のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの再生またはｉｎ　ｖｉｖｏでの共発現（ｃｏｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ）に際して活性蛋白質の生成量を増加させるために、変性した 、または新しく生成した蛋白質とチャベロンとが相互作用を行うことがすでに知 られており、いくつかの文献中にも述べられている。例えば、クエン酸シンター ゼのｉｎ　ｖｉｔｒｏ再生において、ＧｒｏＥ複合体またはＧｒｏＥＬ蛋白質が 、再生中に生じる凝集の進行を抑止することを、光散乱測定法によって示すこと ができた（Ｂｕｃｈｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｆｏｃｈｅ＋ｎｆｓｔｒｙ　３ ０　（１９９１）、　１５８６−１５９１）。さらに、別のチャペロンであるＥ 、ｃｏｌｆからのＤｎａＫ蛋白質がＲＮＡポリメラーゼの熱不活性化を防止し、 熱によって不活性化されたあるＲＮＡポリメラーゼをＡＴＰ依存性で再生するこ とができることが知られている（Ｓｋｏｗｙｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　 ６２　（１９９０）、　９３９−９４４）　、しかし、コノ目的のためには、Ｒ ＮＡポリメラーゼに対して極めて大過剰のＤｎａｋ蛋白質が必要である。

光学試験、特に酵素試験の精度は、多くの場合、その感度に依存する。試験溶液 中に不安定なまたは変化しやすい蛋白質成分が存在する場合、感度は長期間の貯 蔵中に低下することが多い。こうした例として、パン酵母のα−グルコシダーゼ の安定性の研究において、この蛋白質が非常に温度感受性であることが見出され た。この蛋白質は、４０℃以上では高次構造が破壊され、その後に凝集が起こる 。低い程度ながら３７℃でも起こる、こうした過程で生成する沈澱物が、光度測 定試験系での、例えばα−アミラーゼの測定での、この蛋白質の使用を妨げてい る。

不安定な蛋白質成分の安定性を強化することによって、ある期間にわたり、光学 試験の感度を一定に保持する方法は、すでに知られている。こうした例として、 試験溶液にウシ血清アルブミンまたはある種の界面活性剤を低濃度で添加するも のがある。しかしながら、既知の方法の不利な点として、安定化が多くの場合不 十分であること、そして、安定化剤と試験系の他の成分との干渉相互作用が起こ り得ること、があげられる。

そこで、本発明の目的は、光学試験、特に酵素試験において、不安定な蛋白質成 分の安定性を強化する方法を提供することであり、この方法によって、現状の技 術段階での欠点が、少なくとも部分的には解消される。

本発明の目的は、試験溶液中に存在する蛋白質成分の低安定性に起因する干渉が 生じ得る、蛋白質を含む溶液の光学試験において、一定の感度を保持するための 方法によって達成されるが、その方法は、“チャベロエン６０″蛋白質の物質ク ラスからの一種または数種の蛋白質を試験試薬および／または試験溶液に添加す ることを特徴としている。

意外にも、パン酵母のα−グルコシダーゼの凝集が、熱的ストレスをかけたとき 、ε、ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＬ蛋白質を存在させることによって完全に抑止さ れることがわかった。α−グルコシダーゼとＧｒｏＥＬ蛋白質を含む溶液に、さ らにＭｇ−ＡＴＰとＧｒｏｓｓ蛋白質とカリウムイオンを加えると、沈澱がより 高温で生じ、α−グルコシダーゼの再活性化はより低温で生じる。

ＧｒｏＥＬ蛋白質の単離方法は、Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓによる文献、Ｍｏ１ ．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９８６）　２０２、に記載されている。Ｇｒｏ ＥＬ蛋白質の精製方法は、Ｂｕｃｈｎｅｒ他による文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　３０　（１９９１）、　１５８６（５９１）に記載されている。

Ｅ、　ｃｏ目由来のＧｒｏＥＬ蛋白質の他に、“チャベロエン６０″フアミリー 中の他の蛋白質も、本発明の方法に好適である。例えば、ＧｒｏＥＬに相同な他 のバクテリア種由来の蛋白質、または真核細胞由来の”Ｃｐｎ　６０″蛋白質、 例えばミトコンドリア中に存在するｈｓｐ　６０蛋白質、葉緑体由来の“Ｒｕｂ ｉｓｃｏサブユニット結合蛋白質“および／または真核細胞中どこにでも見られ る類似の細胞質ゾル蛋白質である。”Ｃｐｎ　６０″蛋白質の一覧表は、例えば 、Ｈａｌｌｂｅｒｇ　（１９９０）、　Ｓｅｍ１ｎ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 　１．３７−４５およびＨｅｍｍＨｅｍｍ１ｎ　（１９９０）。

Ｓｅｍ１ｎ、　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　１．４７−５４に記載されている。Ｅ 、ｃｏｌｉのＧｒ。

ＥＬ蛋白質は本発明の方法に特に好適に使用される。

本発明方法において、添加される“チャペロエン６０″蛋白質と安定化される蛋 白質成分とのモル比は、０．０００１　：　ｌから２０＝１が望ましい。ここに おけるモル比は、１４サブユニツトからなる“チャヘロニン６０″複合体として のものである。″チャペロニジ６０″蛋白質の添加は、安定化される蛋白質成分 に対し、モル比０．００１　：ｌから１０：１が特に望ましく、０．１：１から ５：ｌが最適である。

安定化される蛋白質成分の一部分しか凝集する傾向を持っていない場合には、比 較的少量の蛋白質だけが高次構造の破壊を受けるに過ぎないので、“チャペロニ ン６０′はモル不定量の添加で十分である。しかし、外部状況、特に熱的ストレ スによって、安定化される蛋白質成分の大部分が不安定になって高次構造が破壊 され、その結果最終的に凝集を生じる可能性があるような場合には、事情が異な る。この場合には、チャペロンを少なくとも等モル量添加しなければならないし 、過剰に添加する方がより望ましい。

本発明の方法は、試験溶液中に存在する低安定性の蛋白質成分によって干渉が生 じ得る光学試験のすべてに適用できる。こうした試験手法には、通常、酵素反応 が含まれる。本発明の中で意味する“光学試験”とは、例えば吸光度、透過率、 散乱光などの光学的量または光学的量の変化を測定する試験である。

本発明における、一種または数種の“チャペロニン６ｏ”蛋白質の添加は、試験 溶液中の蛋白質成分の安定性を増強させ、そして溶液中に濁りが生じることを抑 止する。これによって、試験において低ブランク値が示されて、一定感度の維持 にがなりの程度の改善が得られる。本発明方法のさらに有利な点は、凝集を抑止 することによって、蛋白質凝集物のキャリオーバー（持ち越し）に起因する測定 の誤りが防止されることである。

ＧｒｏＥＬなどの“チャベロエン６０″蛋白質によって安定化される蛋白質成分 の好ましい例として、パン酵母のα−グルコシダーゼＰＩがある。しかしながら 、本発明の方法がこの蛋白質に限定されるわけではない。

本発明の方法においては、“チャペロニン６０”蛋白質単独で不安定な蛋白質の 凝集物形成を抑止して安定化できるので、“チャペロニン１０″またはＧｒｏＥ Ｓ蛋白質は通常添加されない。′チャペロニンｌＯ″蛋白質の添加、すなわち“ チャペロエン６０″′蛋白質およびＭｇ−ＡＴＰと一緒になって複合体を形成し 得る蛋白質の添加が必要なのは、変性された蛋白質成分の再活性化を目的とする 場合のみである。この場合、′チャペロエン１０″蛋白質としてＥ、ｃｏｌｉの Ｇｒａｓｓ蛋白質を使用することが望ましい。

本発明はまた、光学試験用の試薬にも関するものであり、それは固体のことも液 体のこともあり、“チャベロエン６０″蛋白質の物質クラスからの一種または数 種の蛋白質、特にＥ、ｃｏｌｉのＧｒｏＥＬ蛋白質、ミトコンドリアのｈｓｐ６ ０蛋白質、葉緑体の“Ｒｕｂｉｓｃｏサブユニット結合蛋白質”および／または 、原核または真核細胞の細胞質ゾルからの類似の蛋白質、を含むものである。本 発明の試薬としては、例えば溶解状態でおよび／または凍結乾燥品としての“チ ャペロニン６０”蛋白質を含むものをあげることができる。

“チャペロエン６０″蛋白質はＥ、ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＢＬ蛋白質が好ましい 。

最後に、本発明は、光学試験用の蛋白質成分を安定化するために、′チャベロニ ン６０″蛋白質、特にＧｒｏＥＬ蛋白質を使用することにも関するものである。

以下の実施例と図面によって、本発明をさらに明らかにするつもりである。

図１．４６．３℃における、１．５倍モル過剰量のＧｒｏＥＬ蛋白質の非存在下 または存在下でのα−グルコシダーゼの凝集を示す図。

図２９種々の量のＧｒｏＢＬ蛋白質存在下でのα−グルコシダーゼの凝集を示す 図。

図３．ＡＴＰ、　ＭｇＣ１ｚ、　Ｋ”およびＧｒｏＥＳ蛋白質の添加によって生 じるα−グルコシダーゼ−ＧｒｏＥＬ複合体の解離を示す図。

図４．　ＧｒｏＥＬ蛋白質存在下での熱変性後、ＡＴＰ、　ＭｇＣ１ｚ、　Ｋ＋ およびＧｒｏＥＳ蛋白質の添加による、室温においてのα−グルコシダーゼの再 活性化を示す図。

α−グルコシダーゼＰＩが酵母（ＡＢＹＳＭＡＬ８１菌株、プラスミドＹＩｌ！ ｐ１５ｃ６ｂ３によって形質転換）中で発現され（Ｋｏｐｅｔｚｋｉ　ｅｔ　ａ ｌ、（１９８９）、　ＥＰ　０３２３８３８．　Ｋｏｐｅｔｚｋｉ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｙｅａｓｔ　５　（１９８９）、　１ｌ−２４）、イオン交換クロマトグ ラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィーの通常の方法によって精製さ れた。

ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏｓｓは、過剰発現Ｅ、ｃｏｌｉ株（Ｆａｙｅｔ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｍ。

ｉ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０２　（１９８６）、　４３５−４４５）か ら、分子ふるいおよびイオン交換クロマトグラフィーの方法によって精製された （Ｂｕｃｈｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　３０　（１９９１） 、　１５８７−１５９１）。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびｐ−ニトロフ ェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨのものを使用した。

実施例１ α−グルコシダーゼＰＩの熱ストレス下における凝集の、ＧｒｏＥＬによる抑止 分光蛍光光度計のキュベットホールダーに、０．１　ｍｏｌ／１　トリス緩衝液 、ｐＨ７，６を入れたキュベツトを約４６．５℃の恒温下に保つ。

キュベツトの温度をサーモセンサーで検知する。α−グルコシダーゼＰＩを加え る（最終濃度１０μｇ／ｍ１＝ｏ、１４６μｍｏｌ／ｌ）　；この酵素の凝集を 日立製分光蛍光光度計Ｆ４０００によって、下記機器設定条件で光散乱測定を行 うことによってモニターする。

時間走査 励起波長：　３６０ｎｍ 発光波長：　３６０ｎｍ 励起スリット幅：　５ｎｍ 発光スリット幅：　５ｎｍ この蛍光定量計には恒温装置およびマグネチックスクーラーのついたキュベット ホールダーがついている。凝集の抑止の実験においては、初めにＧｒｏＥＬを緩 衝液に添加し、その後α−グルコシダーゼを加える。

α−グルコシダーゼは温度に対して極めて敏感な酵素である。

４６℃、ＧｒａＥＬ蛋白質非存在下（○）では、すでに１０分以内に極めて明ら かな凝集（光散乱）が見られる（図１）。

しかし、１４サブユニツトからなるＧｒｏＥＬ複合体として、１．５倍モル過剰 のＧｒｏＥＬ蛋白質存在下（・）でα−グルコシダーゼが４６℃の熱的ストレス を受ける場合には、凝集の形成を完全に抑止することができる（図１）。

α−グルコシダーゼ：　ＧｒｏＥＬ比を変化させた実験〔α−グルコシダーゼ濃 度１０μｇ／ｍｌ：０．１４６μｍｏｌ／ｌにおいて、α−グルコシダーゼ：　 ＧｒｏＥＬ＝　１　：　０．２５　（ロ）、ｌ：０．５（■）、　１：　１　（ ０）、　１：　１．５（・）またはｌ：２　（◇）〕は、ＧｒｏＥＬの添加が少 量であっても、凝集の形成を遅延させること、モしてＧｒｏＥＬが過剰になると 、凝集を完全に抑止することを示している（図２）。

実施例２ ＡＴＰ、　ＧｒｏＥＳおよびに＋の添加によるα−グルコシダーゼ−〇ｒｏＢＬ 複合体の解離 上記と同様に０．１　ｍｏｌ／１　トリス、　ｌｏｍｍｏｌ／Ｉ　ＫＣｌ、　ｐ Ｈ７，６中、α−グルコシダーゼ（１０μｇ／ｍｌ、　Ｏ，１４６μｍｏｌ／ｌ ）を、１．５倍過剰のＧｒｏＥＬ　（１４量体として０．２１９μｍｏｌ／ｌ） と共に４６℃でインキュベートする。２０分後、２ｍｍｏｌ／ｌ　ＡＴＰ、　１ ０ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣＩｚ、および０．１４６　μｍ。

ｆ／ｌ　ＧｒｏＥＳを加える。

ＡＴＰ／ＭｇＣｌ。とＧｒｏＥＳとを同時に加えると（０）　、ＧｒｏＥＬとα −グルコシダーゼの結合が切れて、遊離した酵素分子は凝集する（図３）　。２ ｍｍｏｌ／ｌ　ＡＴＰと１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣ１ｚだけの（ＧｒｏＥＳは加 えない）場合でも、α−グルコシダーゼ−ＧｒｏＥＬ複合体の解離が生じる：し かしながら、光散乱度の増加は前の実験におけるよりも少ない値を示している； その後、Ｇｒｏｓｓを添加すると（・）、急速で完全な複合体の解離、つまり遊 離したα−グルコシダーゼの凝集が熱変性されたα−グルコシダーゼＰ１の再活 性化０、１　ｍｏｌ／ｌ　トリス緩衝液、ｐＨ７，６中、α−グルコシダーゼ（ １０μｇ／ｍｌ）を１．５倍過剰のＧｒｏＢＬ存在下で４７℃、６０分間インキ ュベートする。この蛋白質混合物を２５℃まで冷却した後、０．１４６μｍｏｌ ／Ｉ　ＧｒｏＥＳと２ｍｍｏｌ／Ｉ　ＡＴＰ、　ｌＯｍｍｏｌ／Ｉ　ＭｇＣｌ２ ．１０ｍｍｏｌ／Ｉ　ＫＣＩを加える（口）。対照（■）においては何も添加し ない。α−グルコシダーゼの再活性化は、α−グルコシダーゼの基質としてｐ− ニトロフェノール−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用した活性試験によって測定 される（図４）。

時間〔分〕 時間〔分〕 時間〔分〕 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ブッフナー、ヨハネスドイツ連邦共和国　Ｗ　−８４００レゲ ンスブルク　アルントシュトラーセ　１１

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．蛋白質を含有する溶液の光学試験において、試験溶液中に存在する蛋白質成 分の低安定性が原因で干渉が生じ得る場合に、一定の感度を保持するための方法 であって：“チャペロニン６０”蛋白質の物質クラスからの一種または数種の蛋 白質を試験用試薬および／または試験溶液に添加することからなる方法。
2. ２．“チャペロニン６０”蛋白質を、安定化される蛋白質成分に対し、モル比０ ．０００１：１〜２０：１で添加することからなる、請求の範囲１の方法。
3. ３．“チャペロニン６０”蛋白質を、安定化される蛋白質成分に対し、モル比０ ．００１：１〜１０：１で添加することからなる、請求の範囲２の方法。
4. ４．“チャペロニン６０”蛋白質を、安定化される蛋白質成分に対し、モル比０ ．１：１〜５：１で添加することからなる、請求の範囲３の方法。
5. ５．光学試験が酵素反応を含むものである、請求の範囲１〜４のいずれか１つに 記載した方法。
6. ６．安定化される蛋白質成分がα−グルコシダーゼＰＩである、請求の範囲５の 方法。
7. ７．“チャペロニン６０”蛋白質として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＬ蛋白質 、ミトコンドリア由来のｈｓｐ６０蛋白質、葉緑体由来の“Ｒｕｂｉｓｃｏサブ ユニット結合蛋白質”および／または、原核または真核細胞の細胞質ゾル由来の 類似蛋白質を使用することからなる、請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載し た方法。
8. ８．Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＬ蛋白質を使用することからなる、請求の範囲 ７の方法。
9. ９．変性した蛋白質成分の再生のために、“チャペロニン１０”蛋白質、特にＥ ．ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＳ蛋白質をさらに添加することからなる、請求の範囲 １〜８のいずれか１つに記載した方法。
10. １０．“チャペロニン６０”蛋白質の物質クラスからの一種または数種の蛋白質 を含む光学試験用の試薬。
11. １１．“チャペロニン６０”蛋白質が、溶解状態および／または凍結乾燥状態で 存在している、請求の範囲１０の試薬。
12. １２．“チャペロニン６０”蛋白質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＬ蛋白質、 ミトコンドリア由来のｈｓｐ６０蛋白質、葉緑体由来の“Ｒｕｂｉｓｃｏサブユ ニット結合蛋白質”および／または、原核または真核細胞の細胞質ゾル由来の類 似蛋白質である、請求の範囲９または１０の試薬。
13. １３．“チャペロニン６０”蛋白質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧｒｏＥＬ蛋白質で ある、請求の範囲１２の試薬。
14. １４．光学試験における、蛋白質成分を安定化するための、“チャペロニン６０ ”蛋白質の使用。
15. １５．“チャペロニン６０”蛋白質として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＣｒｏＥＬを使 用することからなる、請求の範囲１４の使用。