JPH0646862A - セファロスポリウム・アクレモニウムのアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼをコードする完全な遺伝子（ｃｅｆ Ｇ）並びにその単離および用途 - Google Patents
セファロスポリウム・アクレモニウムのアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼをコードする完全な遺伝子（ｃｅｆ Ｇ）並びにその単離および用途Info
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- JPH0646862A JPH0646862A JP10503393A JP10503393A JPH0646862A JP H0646862 A JPH0646862 A JP H0646862A JP 10503393 A JP10503393 A JP 10503393A JP 10503393 A JP10503393 A JP 10503393A JP H0646862 A JPH0646862 A JP H0646862A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 セファロスポリウム・アクレモニウム（syn.
Acremonium chrysogenum）Ｃ１０のアセチルＣｏＡ：デ
アセチルセファロスポリンＣ アセチルトランスフェラ
ーゼをコードする遺伝子（cef Ｇ）を単離した。これは
ふたつのイントンを含み、また、４４４個のアミノ酸か
らなるゲル濾過から推定される分子量（５２０００±１
０００）とよく相関する分子量４９２６９のタンパク質
をコードする。 【効果】 cef Ｇは、例えば非生産変異体Ｃ.acremoniu
m （ＡＴＣＣ寄託第２０３７１号）において、デアセチ
ルセファロスポリンアセチルトランスフェラーゼの欠失
を補い、セファロスポリンの生合成をこの系統において
復活させる。従って、上記cef Ｇは、セファロスポリン
Ｃの生産を改良することに有用である。
Acremonium chrysogenum）Ｃ１０のアセチルＣｏＡ：デ
アセチルセファロスポリンＣ アセチルトランスフェラ
ーゼをコードする遺伝子（cef Ｇ）を単離した。これは
ふたつのイントンを含み、また、４４４個のアミノ酸か
らなるゲル濾過から推定される分子量（５２０００±１
０００）とよく相関する分子量４９２６９のタンパク質
をコードする。 【効果】 cef Ｇは、例えば非生産変異体Ｃ.acremoniu
m （ＡＴＣＣ寄託第２０３７１号）において、デアセチ
ルセファロスポリンアセチルトランスフェラーゼの欠失
を補い、セファロスポリンの生合成をこの系統において
復活させる。従って、上記cef Ｇは、セファロスポリン
Ｃの生産を改良することに有用である。
Description
【０００１】［発明の背景］
【産業上の利用分野】セファロスポリウム・アクレモニ
ウムのアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣ
アセチルトランスフェラーゼをコードする完全な遺伝子
（cef Ｇ）並びにその単離および用途に関する。
ウムのアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣ
アセチルトランスフェラーゼをコードする完全な遺伝子
（cef Ｇ）並びにその単離および用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】セファロスポリンの生合成経路の最終段
階は、デアセチルセファロスポリン（ＤＡＣ）を酵素デ
アセチルセファロスポリン- アセチルトランスフェラー
ゼ（ＤＡＣ- ＡＴＦ）によってセファロスポリンＣに変
換する反応である（図１）。最近までこの酵素はほとん
ど知られておらず、完全精製に至っていなかった。欧州
公開特許ＥＰ−Ａ１−０４５０７５８号の特許請求の範
囲にＤＡＣ- ＡＴＦをコードする遺伝子の単離が記載さ
れている。この欧州出願によると、ＤＡＣ- ＡＴＦは、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定さ
れた分子量２７０００±２０００ダルトン（サブユニッ
ト）と分子量１４０００±２０００ダルトン（サブユニ
ット２）の二つのサブユニットからなる。ＤＡＣ- ＡＴ
ＦのｃＤＮＡのスクリーニングに用いたれたプローブ
は、下記のように決定された各々のサブユニットのＮ末
端部分から得られた： サブユニット１： Leu-X-Ala-Gln-Asp-Ile-Ser-Leu-Phe
-Thr-Leu-Glu-Ser-Gly-Val-Ile-Leu-Arg-... サブユニット２： Asp-Ser-Gly-Asn-Ser-His-Arg-Ala-
Gly-Gln-Pro-Ile-Glu-Ala-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Arg-Ty
r-Gln-Ala-Gln-Lys-Phe-Ala-... Ｘは、当時特定されていなかったアミノ酸を表し、Asp
であることがわかった。これらのプローブで単離された
遺伝子をコードするＤＡＣ- ＡＴＦは、３８７個のアミ
ノ酸を持つタンパク質分子をコードすると考えられた。
サブユニットのアミノ末端部分として決定されたLeu-As
p-Ala-Gly-Asp...の前のプレ配列であるMet-Ser-Pro-Gl
n-Ile-Ala-Asn-Arg-Phe-Glu-Ala-Ser で始まるわずかに
大きい分子が、また、記載されていた。
階は、デアセチルセファロスポリン（ＤＡＣ）を酵素デ
アセチルセファロスポリン- アセチルトランスフェラー
ゼ（ＤＡＣ- ＡＴＦ）によってセファロスポリンＣに変
換する反応である（図１）。最近までこの酵素はほとん
ど知られておらず、完全精製に至っていなかった。欧州
公開特許ＥＰ−Ａ１−０４５０７５８号の特許請求の範
囲にＤＡＣ- ＡＴＦをコードする遺伝子の単離が記載さ
れている。この欧州出願によると、ＤＡＣ- ＡＴＦは、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定さ
れた分子量２７０００±２０００ダルトン（サブユニッ
ト）と分子量１４０００±２０００ダルトン（サブユニ
ット２）の二つのサブユニットからなる。ＤＡＣ- ＡＴ
ＦのｃＤＮＡのスクリーニングに用いたれたプローブ
は、下記のように決定された各々のサブユニットのＮ末
端部分から得られた： サブユニット１： Leu-X-Ala-Gln-Asp-Ile-Ser-Leu-Phe
-Thr-Leu-Glu-Ser-Gly-Val-Ile-Leu-Arg-... サブユニット２： Asp-Ser-Gly-Asn-Ser-His-Arg-Ala-
Gly-Gln-Pro-Ile-Glu-Ala-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Arg-Ty
r-Gln-Ala-Gln-Lys-Phe-Ala-... Ｘは、当時特定されていなかったアミノ酸を表し、Asp
であることがわかった。これらのプローブで単離された
遺伝子をコードするＤＡＣ- ＡＴＦは、３８７個のアミ
ノ酸を持つタンパク質分子をコードすると考えられた。
サブユニットのアミノ末端部分として決定されたLeu-As
p-Ala-Gly-Asp...の前のプレ配列であるMet-Ser-Pro-Gl
n-Ile-Ala-Asn-Arg-Phe-Glu-Ala-Ser で始まるわずかに
大きい分子が、また、記載されていた。
【０００３】［発明の概要］
【発明が解決しようとする課題】本発明は完全なcef Ｇ
遺伝子を単離することを目的とする。また、本発明は、
単離された完全なcef Ｇ遺伝子を用いて、例えば、ＤＡ
ＣからセファロスポリンＣへの変換を増大させるような
この遺伝子を発現させるプラスミドを用いて形質転換す
ることによって、cef Ｇの発現を最適化することを目的
とする。
遺伝子を単離することを目的とする。また、本発明は、
単離された完全なcef Ｇ遺伝子を用いて、例えば、ＤＡ
ＣからセファロスポリンＣへの変換を増大させるような
この遺伝子を発現させるプラスミドを用いて形質転換す
ることによって、cef Ｇの発現を最適化することを目的
とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】セファロスポリウム・ア
クレモニウム（syn.Acremonium chrysogenumに同じ）Ｃ
１０のアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣ
アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ce
f Ｇ）が単離された。これはふたつのイントロンを含
み、また、４４４個のアミノ酸からなり、ゲル濾過から
推定される分子量（５２０００±１０００）とよく相関
する分子量４９２６９のタンパク質をコードする。cef
Ｇ遺伝子は、cef ＥＦ遺伝子（二機能性デアセトキシセ
ファロスポリンＣシンターゼ／ヒドロキシラーゼをコー
ドする）と結合しているが、それはcef ＥＦ遺伝子に対
して反対の方向で発現される。単離されたcef Ｇは、例
えば非生産変異体Ｃ.acremonium （ＡＴＣＣ寄託第２０
３７１号）において、デアセチルセファロスポリンアセ
チルトランスフェラーゼの欠失を補い、セファロスポリ
ンの生合成をこの菌株において復活させる。従って、こ
のcef Ｇは、セファロスポリンＣの生産を改良するのに
有用である。
クレモニウム（syn.Acremonium chrysogenumに同じ）Ｃ
１０のアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣ
アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ce
f Ｇ）が単離された。これはふたつのイントロンを含
み、また、４４４個のアミノ酸からなり、ゲル濾過から
推定される分子量（５２０００±１０００）とよく相関
する分子量４９２６９のタンパク質をコードする。cef
Ｇ遺伝子は、cef ＥＦ遺伝子（二機能性デアセトキシセ
ファロスポリンＣシンターゼ／ヒドロキシラーゼをコー
ドする）と結合しているが、それはcef ＥＦ遺伝子に対
して反対の方向で発現される。単離されたcef Ｇは、例
えば非生産変異体Ｃ.acremonium （ＡＴＣＣ寄託第２０
３７１号）において、デアセチルセファロスポリンアセ
チルトランスフェラーゼの欠失を補い、セファロスポリ
ンの生合成をこの菌株において復活させる。従って、こ
のcef Ｇは、セファロスポリンＣの生産を改良するのに
有用である。
【０００５】［発明の具体的説明］上記タンパク質をコ
ードするＤＮＡまたはわずかに大きいＤＮＡを用いて、
完全といわれるＤＡＣ- ＡＴＦ遺伝子をセファロスポリ
ウム系統に導入するのに最適なプラスミッドを構築し
た。
ードするＤＮＡまたはわずかに大きいＤＮＡを用いて、
完全といわれるＤＡＣ- ＡＴＦ遺伝子をセファロスポリ
ウム系統に導入するのに最適なプラスミッドを構築し
た。
【０００６】驚くべきことに、完全なcef Ｇ遺伝子が、
４４４個のアミノ酸からなる推定分子量４９２６９ダル
トンのタンパク質をコードしていることが見い出され
た。この領域のヌクレオチド配列は、ＧＣ含量が５６．
８％であり１．４kbの転写産物に相当する１３３２塩基
対（ｂｐ）の読みとり枠を表す。cef ＥＦ遺伝子を伴う
遺伝子間領域およびcef ＥＦの５’末端領域を含む完全
なcef Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列は、第１表に示され
るとおりである（実施例参照）。
４４４個のアミノ酸からなる推定分子量４９２６９ダル
トンのタンパク質をコードしていることが見い出され
た。この領域のヌクレオチド配列は、ＧＣ含量が５６．
８％であり１．４kbの転写産物に相当する１３３２塩基
対（ｂｐ）の読みとり枠を表す。cef ＥＦ遺伝子を伴う
遺伝子間領域およびcef ＥＦの５’末端領域を含む完全
なcef Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列は、第１表に示され
るとおりである（実施例参照）。
【０００７】cef Ｇは、二つのイントロンを含む。cef
Ｇのヌクレオチド配列のコンピューター解析によると、
イントロンのスプライシング反応におけるラリアット中
間体の形成に関わるイントロン／エクソン結合配列およ
び内部のコンセンサス配列と非常によい相同性を示す二
つのイントロンの存在が推定された。イントロンの存在
を確認するために、三つのオリゴヌクレオチドＬ、Ｍ、
Ｎ（以下参照）をＣ．アクレモニウムの全ＲＮＡとハイ
ブリダイズされることに用いた。プローブＬおよびＭ
は、推定されるイントロン１および２に内在する配列に
相当し、一方プローブＮは、翻訳領域に相当する（ヌク
レオチド２０１６〜２０３５：第１表）。ハイブリダイ
ゼーションの結果、プローブＬおよびＭは、Ｃ．アクレ
モニウムの全ＲＮＡとハイブリダイズしなかったが、プ
ローブＮは明かなハイブリダイゼーションシグナルを与
えた。これらの結果によって、１〜１８７、１８８〜３
０２および３０３〜４４４番目のアミノ酸におよぶ三つ
のエクソンに分割する二つのイントロンの存在が確認さ
れた。
Ｇのヌクレオチド配列のコンピューター解析によると、
イントロンのスプライシング反応におけるラリアット中
間体の形成に関わるイントロン／エクソン結合配列およ
び内部のコンセンサス配列と非常によい相同性を示す二
つのイントロンの存在が推定された。イントロンの存在
を確認するために、三つのオリゴヌクレオチドＬ、Ｍ、
Ｎ（以下参照）をＣ．アクレモニウムの全ＲＮＡとハイ
ブリダイズされることに用いた。プローブＬおよびＭ
は、推定されるイントロン１および２に内在する配列に
相当し、一方プローブＮは、翻訳領域に相当する（ヌク
レオチド２０１６〜２０３５：第１表）。ハイブリダイ
ゼーションの結果、プローブＬおよびＭは、Ｃ．アクレ
モニウムの全ＲＮＡとハイブリダイズしなかったが、プ
ローブＮは明かなハイブリダイゼーションシグナルを与
えた。これらの結果によって、１〜１８７、１８８〜３
０２および３０３〜４４４番目のアミノ酸におよぶ三つ
のエクソンに分割する二つのイントロンの存在が確認さ
れた。
【０００８】Ｃ．アクレモニウムのcef Ｇ遺伝子のイン
トロンＡは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．cerevisiae）ｍｅｔ
２遺伝子のＤＮＡにない領域に相当する。イントロンＢ
は、Ａ．イマーサス（Ａ．immersus）またはＳ．セレビ
シエのいずれかのｍｅｔ２遺伝子にほとんど保存されて
いない領域に相当する。
トロンＡは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．cerevisiae）ｍｅｔ
２遺伝子のＤＮＡにない領域に相当する。イントロンＢ
は、Ａ．イマーサス（Ａ．immersus）またはＳ．セレビ
シエのいずれかのｍｅｔ２遺伝子にほとんど保存されて
いない領域に相当する。
【０００９】３’非コード領域は、古典的なＡＡＴＡＡ
Ａポリアデニル化配列を含む（第１表の２８４５〜２８
５２番目のヌクレオチド）。第１表のＡＴＧ開始コドン
から上流の５’末端領域の解析は、コンセンサス“ＴＡ
ＴＡ”ボックス と関連した配列（ＴＡＣＴＡＴ：１００１〜１００６番
目のヌクレオチド）を明かにする。コンセンサス“ＣＡ
ＡＴ”ボックス（ＧＧＰｙＣＡＡＴＣＴ）は観察されな
かった。これらの配列は、高等生物における転写開始に
用いられるが、繊維状菌のプロモーターに必ず存在する
と言うわけではない。菌のプロモーターの特質を表して
いると思われるピリミジンに富む（６６％）ストレッチ
（８６５〜８９５番目のヌクレオチド）が、cef Ｇ遺伝
子の上流領域に存在している。
Ａポリアデニル化配列を含む（第１表の２８４５〜２８
５２番目のヌクレオチド）。第１表のＡＴＧ開始コドン
から上流の５’末端領域の解析は、コンセンサス“ＴＡ
ＴＡ”ボックス と関連した配列（ＴＡＣＴＡＴ：１００１〜１００６番
目のヌクレオチド）を明かにする。コンセンサス“ＣＡ
ＡＴ”ボックス（ＧＧＰｙＣＡＡＴＣＴ）は観察されな
かった。これらの配列は、高等生物における転写開始に
用いられるが、繊維状菌のプロモーターに必ず存在する
と言うわけではない。菌のプロモーターの特質を表して
いると思われるピリミジンに富む（６６％）ストレッチ
（８６５〜８９５番目のヌクレオチド）が、cef Ｇ遺伝
子の上流領域に存在している。
【００１０】Ｃ．アクレモニウムにおけるcef Ｇ遺伝子
の発現を、ＤＡＣ−アセチルトランスフェラーゼに欠陥
を有するＣ．アクレモニウム変異体の補完性を用いて行
った。７．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片中のcef Ｇ遺伝子
を、ＢａｍＨＩで切断され脱リン酸化された菌由来のベ
クターｐＵＬＪＬ４３においてサブクローニングした。
この構築物を、ＤＡＣを蓄積し（第３表）、ＤＡＣ−ア
セチルトランスフェラーゼに欠陥を有するＣ．アクレモ
ニウム（ＡＴＣＣ寄託番号第２０３７１号：セファロス
ポリン欠陥変異体、第２表）を形質転換することに用い
た。セファロスポリンＣおよびＤＡＣの濃度を、非形質
転換カルチャーおよび三つの形質転換体、すなわちＣ．
アクレモニウム３７１．１、３７１．２および３７１．
３、並びにコントロールクローンＣ．アクレモニウム３
７１Ｐ４３（遺伝子を挿入しないでｐＵＬＪＬ４３で形
質転換した）、で測定した。
の発現を、ＤＡＣ−アセチルトランスフェラーゼに欠陥
を有するＣ．アクレモニウム変異体の補完性を用いて行
った。７．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片中のcef Ｇ遺伝子
を、ＢａｍＨＩで切断され脱リン酸化された菌由来のベ
クターｐＵＬＪＬ４３においてサブクローニングした。
この構築物を、ＤＡＣを蓄積し（第３表）、ＤＡＣ−ア
セチルトランスフェラーゼに欠陥を有するＣ．アクレモ
ニウム（ＡＴＣＣ寄託番号第２０３７１号：セファロス
ポリン欠陥変異体、第２表）を形質転換することに用い
た。セファロスポリンＣおよびＤＡＣの濃度を、非形質
転換カルチャーおよび三つの形質転換体、すなわちＣ．
アクレモニウム３７１．１、３７１．２および３７１．
３、並びにコントロールクローンＣ．アクレモニウム３
７１Ｐ４３（遺伝子を挿入しないでｐＵＬＪＬ４３で形
質転換した）、で測定した。
【００１１】（第２表及び第３表）結果は、完全なcef
Ｇ遺伝子を導入することによってセファロスポリンＣの
生産が生ずることを示している。
Ｇ遺伝子を導入することによってセファロスポリンＣの
生産が生ずることを示している。
【００１２】従って本発明は、完全なcef Ｇ遺伝子およ
びセファロスポリンＣの生産を改良するための用途（工
業的セファロスポリン生産系統において大量のＤＡＣが
セファロスポリンＣに変換されずに残っていることが知
られている）に関する。
びセファロスポリンＣの生産を改良するための用途（工
業的セファロスポリン生産系統において大量のＤＡＣが
セファロスポリンＣに変換されずに残っていることが知
られている）に関する。
【００１３】cef ＥＦおよびcef Ｇ遺伝子に相当するプ
ローブによるノーザンブロット分析は、ハイブリダイゼ
ーションの強度は、４８時間後の細胞において、イクス
パンダーゼ（expandase ）／ヒドロキシラーゼの転写物
に対してよりＤＡＣ−アセチルトランスフェラーゼに対
しての方がより小さいことを示している。このプローブ
は両方の場合において相補性があり、また同様のＲＮＡ
の調製を用いたことから、これらの結果は、cef Ｇ遺伝
子（セファロスポリン合成経路の最終酵素をコードして
いる）が４８時間の培養ではほとんど発現されないこと
を示している。この最終発現は、セファロスポリン発酵
におけるＤＡＣからセファロスポリンへの最終変換とよ
く相関する。cef ＥＦおよびcef Ｇの発現における同様
の違いは、低生産菌株ＣＷ１９およびセファロスポリン
高生産菌株Ｃ．アクレモニウムＣ１０において観察され
た。cef ＥＦおよびcef Ｇは両方とも同様のプロモータ
ー領域から分岐して発現されることから、合成経路にお
けるこれら最終遺伝子を調節する異なる機構が生じてい
るに違いない。
ローブによるノーザンブロット分析は、ハイブリダイゼ
ーションの強度は、４８時間後の細胞において、イクス
パンダーゼ（expandase ）／ヒドロキシラーゼの転写物
に対してよりＤＡＣ−アセチルトランスフェラーゼに対
しての方がより小さいことを示している。このプローブ
は両方の場合において相補性があり、また同様のＲＮＡ
の調製を用いたことから、これらの結果は、cef Ｇ遺伝
子（セファロスポリン合成経路の最終酵素をコードして
いる）が４８時間の培養ではほとんど発現されないこと
を示している。この最終発現は、セファロスポリン発酵
におけるＤＡＣからセファロスポリンへの最終変換とよ
く相関する。cef ＥＦおよびcef Ｇの発現における同様
の違いは、低生産菌株ＣＷ１９およびセファロスポリン
高生産菌株Ｃ．アクレモニウムＣ１０において観察され
た。cef ＥＦおよびcef Ｇは両方とも同様のプロモータ
ー領域から分岐して発現されることから、合成経路にお
けるこれら最終遺伝子を調節する異なる機構が生じてい
るに違いない。
【００１４】従って単離された完全なcef Ｇ遺伝子を用
いて、例えば、ＤＡＣからセファロスポリンＣへの変換
を増大させるようなこの遺伝子を発現させるプラスミド
を用いて形質転換することによって、cef Ｇの発現を最
適化することができる。
いて、例えば、ＤＡＣからセファロスポリンＣへの変換
を増大させるようなこの遺伝子を発現させるプラスミド
を用いて形質転換することによって、cef Ｇの発現を最
適化することができる。
【００１５】本発明を実施例および特許請求の範囲にお
いてさらに詳しく説明する。
いてさらに詳しく説明する。
【００１６】
【実施例】実施例１ 完全なcef Ｇ遺伝子の単離 Ｃ．アクレモニウムＣ−１０（セファロスポリンＣ高生
産：Ramos,F.R.et.al.,FEMS Microbiol.Lett.35,p123-1
27(1986)）をＤＮＡ源に用いた。Ｃ．アクレモニウムＣ
−１０の遺伝子ライブラリーを以下に記載されるように
ble ＥＭＢＬ３ベクターに構築した（Gutierrez et.a
l.,J.Bacteriol.173,p2354-2365(1991) ）。cef ＥＦ遺
伝子に対するファージのスクリーニングは、Ｃ．アクレ
モニウムのcef ＥＦ遺伝子のヌクレオチド配列（２７４
〜３０３番目のヌクレオチド：Samson et.al.,Bio/Tech
nology 5,p1207-1214(1987) ）に従って合成された３０
-merオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＣ
ＧＧＡＣＴＡＣＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＡＣ−３’（プロ
ーブＫ）を用いて行った。三つの他のプローブ、Ｌ
（５’−ＧＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＣＴＴＡＣＣ−
３’）、Ｍ（５’−ＴＧＡＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＣＧ
ＧＣＡＡ−３’）およびＮ（５’−ＴＡＣＴＣＣＣＣＧ
ＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＴ−３’）、をcef Ｇ遺伝子にお
ける二つの異なったイントロンの存在を確認するために
用いた。
産：Ramos,F.R.et.al.,FEMS Microbiol.Lett.35,p123-1
27(1986)）をＤＮＡ源に用いた。Ｃ．アクレモニウムＣ
−１０の遺伝子ライブラリーを以下に記載されるように
ble ＥＭＢＬ３ベクターに構築した（Gutierrez et.a
l.,J.Bacteriol.173,p2354-2365(1991) ）。cef ＥＦ遺
伝子に対するファージのスクリーニングは、Ｃ．アクレ
モニウムのcef ＥＦ遺伝子のヌクレオチド配列（２７４
〜３０３番目のヌクレオチド：Samson et.al.,Bio/Tech
nology 5,p1207-1214(1987) ）に従って合成された３０
-merオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＣ
ＧＧＡＣＴＡＣＴＣＧＡＣＧＴＧＣＴＡＣ−３’（プロ
ーブＫ）を用いて行った。三つの他のプローブ、Ｌ
（５’−ＧＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＣＴＴＡＣＣ−
３’）、Ｍ（５’−ＴＧＡＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＡＣＧ
ＧＣＡＡ−３’）およびＮ（５’−ＴＡＣＴＣＣＣＣＧ
ＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＴ−３’）、をcef Ｇ遺伝子にお
ける二つの異なったイントロンの存在を確認するために
用いた。
【００１７】オリゴヌクレオチドを、前記したようにポ
リヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末端について
標識した（Diez et.al.,J.Biol.Chem.265,p16358-16365
(1990)）。サザンハイブリダイゼーションを、０．２５
％ＳＤＳと６×ＳＳＣ、２×Denhardtの溶液とを含むプ
レハイブリダイゼーションバッファーを用いて、標準的
方法で行った。
リヌクレオチドキナーゼを用いてその５’末端について
標識した（Diez et.al.,J.Biol.Chem.265,p16358-16365
(1990)）。サザンハイブリダイゼーションを、０．２５
％ＳＤＳと６×ＳＳＣ、２×Denhardtの溶液とを含むプ
レハイブリダイゼーションバッファーを用いて、標準的
方法で行った。
【００１８】Bluescript（登録商標）ＫＳ（＋）ベクタ
ーにサブクローニングされた遺伝子の断片の配列を、er
ase-a-base system （Promega,Madison,WI）を用いてエ
クソヌクレアーゼIII で切断することによって、一定方
向の一連の欠失を生じさせることによって決定した（S.
Henitzoff,Gene 28,p351-359(1984)）。一定方向の一連
の断片の配列の決定を、前記したようにSequenase （登
録商標：U.S.Biochemicals,Cleveland,Oh ）またはＴａ
ｑポリメラーゼ（Promega,Madison,WI）のいずれかを用
いてジデオキシヌクレオチド法によって行った（Monten
egro et.al.,Mol.Gen.Genet.221,p322-330(1990)）。
ーにサブクローニングされた遺伝子の断片の配列を、er
ase-a-base system （Promega,Madison,WI）を用いてエ
クソヌクレアーゼIII で切断することによって、一定方
向の一連の欠失を生じさせることによって決定した（S.
Henitzoff,Gene 28,p351-359(1984)）。一定方向の一連
の断片の配列の決定を、前記したようにSequenase （登
録商標：U.S.Biochemicals,Cleveland,Oh ）またはＴａ
ｑポリメラーゼ（Promega,Madison,WI）のいずれかを用
いてジデオキシヌクレオチド法によって行った（Monten
egro et.al.,Mol.Gen.Genet.221,p322-330(1990)）。
【００１９】結果は、図２並びに第１表に示されるとお
りである。完全なcef Ｇ遺伝子は、cef ＥＦ遺伝子のフ
ランキングＤＮＡ領域に位置する可能性がある。イクス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ（cef ＥＦ）遺伝子を保
持するクローンを、３０merプローブＫ（上記参照）で
ハイブリダイゼーションすることによって選択した。二
つの明らかにハイブリッド形成したファージＦ３１およ
びＦ３９を選択し、精製した。両方のファージは、共通
の２．７ｋｂＳａｌＩバンドを持ったオーバーラップし
たＤＮＡ挿入物を示した。プローブＫとハイブリダイズ
したファージＦ３１の７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片を、Bl
uescript（登録商標）中にサブクローニングし、次いで
マッピングした（図２）。ＳｓｔII部位（３００ｂｐ）
付近の断片の配列を決定し、クローン化された断片がイ
クスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むことを
確認した。図２において、矢印は、cef ＥＦおよびcef
Ｇ遺伝子それぞれの位置および長さを表しており、これ
らは反対方向に発現される。７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片
において線で囲んだ領域の配列を決定した。４．８ｋｂ
の断片Ａを、その両方向において末端を満たしてサブク
ローニングし、ｐＢＸＲ４．８ＡおよびｐＢＸＲ４．８
Ｂを得た。第１表は、完全なcef Ｇ遺伝子並びに上流お
よび下流の遺伝子間配列を含む３．１１ｋｂＤＮＡ領域
のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示した
ものである。cef ＥＦおよびcef Ｇ遺伝子のＡＴＧ翻訳
開始トリプレットは線で囲んである。cef Ｇ遺伝子から
下流のポリアデニル化配列ＡＡＡＴＡＡＡおよびイント
ロンコンセンサス配列には下線が引いてある。プロモー
ター領域のピリミジンストレッチおよびＴＡＴＡボック
スのような配列には上線か引いてある。cef ＥＦ遺伝子
は、相補鎖と反対の方向で発現される、ということに注
意すべきである。
りである。完全なcef Ｇ遺伝子は、cef ＥＦ遺伝子のフ
ランキングＤＮＡ領域に位置する可能性がある。イクス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ（cef ＥＦ）遺伝子を保
持するクローンを、３０merプローブＫ（上記参照）で
ハイブリダイゼーションすることによって選択した。二
つの明らかにハイブリッド形成したファージＦ３１およ
びＦ３９を選択し、精製した。両方のファージは、共通
の２．７ｋｂＳａｌＩバンドを持ったオーバーラップし
たＤＮＡ挿入物を示した。プローブＫとハイブリダイズ
したファージＦ３１の７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片を、Bl
uescript（登録商標）中にサブクローニングし、次いで
マッピングした（図２）。ＳｓｔII部位（３００ｂｐ）
付近の断片の配列を決定し、クローン化された断片がイ
クスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むことを
確認した。図２において、矢印は、cef ＥＦおよびcef
Ｇ遺伝子それぞれの位置および長さを表しており、これ
らは反対方向に発現される。７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片
において線で囲んだ領域の配列を決定した。４．８ｋｂ
の断片Ａを、その両方向において末端を満たしてサブク
ローニングし、ｐＢＸＲ４．８ＡおよびｐＢＸＲ４．８
Ｂを得た。第１表は、完全なcef Ｇ遺伝子並びに上流お
よび下流の遺伝子間配列を含む３．１１ｋｂＤＮＡ領域
のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を示した
ものである。cef ＥＦおよびcef Ｇ遺伝子のＡＴＧ翻訳
開始トリプレットは線で囲んである。cef Ｇ遺伝子から
下流のポリアデニル化配列ＡＡＡＴＡＡＡおよびイント
ロンコンセンサス配列には下線が引いてある。プロモー
ター領域のピリミジンストレッチおよびＴＡＴＡボック
スのような配列には上線か引いてある。cef ＥＦ遺伝子
は、相補鎖と反対の方向で発現される、ということに注
意すべきである。
【００２０】実施例２ ＤＡＣ- ＡＴＦを欠失するＣ．
アクレモニウム変異体における完全なcef Ｇ遺伝子の発
現 ７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片におけるcef Ｇ遺伝子を、Ｂ
ａｍＨＩで切断された菌ベクターｐＵＬＪＬ４３におい
てサブクローニングし、脱リン酸化した。この構成物を
用いて、Ｃ．アクレモニウム（ＡＡＴＣ寄託第２０３７
１号）、すなわちＤＡＣを蓄積し（第３表）ＤＡＣアセ
チルトランスフェラーゼを欠失する（図３）セファロス
ポリン欠失変異体（第２表）、を形質転換した。セファ
ロスポリンＣおよびＤＡＣの濃度を、非形質転換カルチ
ャー並びに三つの形質転換体、すなわちＣ．アクレモニ
ウム３７１．１、３７１．２および３７１．３、および
コントロールクローンＣ．アクレモニウム３７１Ｐ４３
（遺伝子を挿入しないでｐＵＬＪＬ４３で形質転換し
た）、で測定した。結果（第２表および第３表）は、
Ｃ．アクレモニウム２０３７１が形質転換されない場合
もコントロールプラスミドｐＵＬＪＬ４３で形質転換さ
れた場合も、セファロスポリンＣを有意な量生産せず、
一方でＤＡＣをかなりの量蓄積することを示している。
形質転換体３７１．２および３７１．３（cef Ｇ遺伝子
が補われた）は、セファロスポリンＣ合成能力を再び獲
得し、検出可能なＤＡＣの蓄積を行なわなくなった。形
質転換菌株３７１．１はセファロスポリンＣを合成する
が、依然としてかなりの量のＤＡＣを維持しており、こ
のことはアセチルトランスフェエラーゼ遺伝子の発現が
低いことを示唆している（５頁およびノーザンブロット
の結果を参照）。
アクレモニウム変異体における完全なcef Ｇ遺伝子の発
現 ７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片におけるcef Ｇ遺伝子を、Ｂ
ａｍＨＩで切断された菌ベクターｐＵＬＪＬ４３におい
てサブクローニングし、脱リン酸化した。この構成物を
用いて、Ｃ．アクレモニウム（ＡＡＴＣ寄託第２０３７
１号）、すなわちＤＡＣを蓄積し（第３表）ＤＡＣアセ
チルトランスフェラーゼを欠失する（図３）セファロス
ポリン欠失変異体（第２表）、を形質転換した。セファ
ロスポリンＣおよびＤＡＣの濃度を、非形質転換カルチ
ャー並びに三つの形質転換体、すなわちＣ．アクレモニ
ウム３７１．１、３７１．２および３７１．３、および
コントロールクローンＣ．アクレモニウム３７１Ｐ４３
（遺伝子を挿入しないでｐＵＬＪＬ４３で形質転換し
た）、で測定した。結果（第２表および第３表）は、
Ｃ．アクレモニウム２０３７１が形質転換されない場合
もコントロールプラスミドｐＵＬＪＬ４３で形質転換さ
れた場合も、セファロスポリンＣを有意な量生産せず、
一方でＤＡＣをかなりの量蓄積することを示している。
形質転換体３７１．２および３７１．３（cef Ｇ遺伝子
が補われた）は、セファロスポリンＣ合成能力を再び獲
得し、検出可能なＤＡＣの蓄積を行なわなくなった。形
質転換菌株３７１．１はセファロスポリンＣを合成する
が、依然としてかなりの量のＤＡＣを維持しており、こ
のことはアセチルトランスフェエラーゼ遺伝子の発現が
低いことを示唆している（５頁およびノーザンブロット
の結果を参照）。
【００２１】非生産変異体（ＡＴＣＣ２０３７１）は、
９６時間カルチャーした後で、残存するＤＡＣ−アセチ
ルトランスフェラーゼ活性を示したが、一方三つの形質
転換されたクローンはこれよりも１０〜１５倍の高い活
性を示した（図３）。第２表および第３表を比較するこ
とにより推定されるＤＡＣからセファロスポリンＣへの
変換と、異なった形質転換体におけるＤＡＣ−アセチル
トランスフェラーゼ活性（すなわち形質転換体３７１．
３は他の形質転換体よりも低いアセチルトランスフェラ
ーゼ活性を示したこと）との間には、良い関係が観察さ
れた。
９６時間カルチャーした後で、残存するＤＡＣ−アセチ
ルトランスフェラーゼ活性を示したが、一方三つの形質
転換されたクローンはこれよりも１０〜１５倍の高い活
性を示した（図３）。第２表および第３表を比較するこ
とにより推定されるＤＡＣからセファロスポリンＣへの
変換と、異なった形質転換体におけるＤＡＣ−アセチル
トランスフェラーゼ活性（すなわち形質転換体３７１．
３は他の形質転換体よりも低いアセチルトランスフェラ
ーゼ活性を示したこと）との間には、良い関係が観察さ
れた。
【００２２】セファロスポリンＣおよびデアセチルセフ
ァロスポリンＣの定量を以下に説明する。
ァロスポリンＣの定量を以下に説明する。
【００２３】異なった菌株およびＣ．アクレモニウム形
質転換体の培養を、以下に記載されような決められた生
産培地において、セファロスポリンＣまたはＤＡＣの生
産用に行った（D.H.Zanca and J.F.Martin,J.Antibiot.
36,p700-708(1983) ）。１ｍｌの培養汁を２４時間ごと
に得てミリポア（Millipore ）１００００ＮＭＷＬで濾
過し、分子量１０，０００ダルトン以上の分子を取り除
いた。ろ液の一部（５０μｌ）をμＢｏｎｄａｐａｃｋ
（登録商標）Ｃ１８カラム（３００×４ｍｍ）を装備し
たBeckman System Gold ＨＰＬＣでのセファロスポリン
の分析に用いた。ＤＡＣおよびセファロスポリンＣを、
溶媒Ａ：１０ｍＭ酢酸- 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）
および溶媒Ｂ：アセトニトリル（１００％）の混合溶液
で、以下のような勾配を用いた１．３ｍｌ／ｍｉｎ一定
流量で溶出した。
質転換体の培養を、以下に記載されような決められた生
産培地において、セファロスポリンＣまたはＤＡＣの生
産用に行った（D.H.Zanca and J.F.Martin,J.Antibiot.
36,p700-708(1983) ）。１ｍｌの培養汁を２４時間ごと
に得てミリポア（Millipore ）１００００ＮＭＷＬで濾
過し、分子量１０，０００ダルトン以上の分子を取り除
いた。ろ液の一部（５０μｌ）をμＢｏｎｄａｐａｃｋ
（登録商標）Ｃ１８カラム（３００×４ｍｍ）を装備し
たBeckman System Gold ＨＰＬＣでのセファロスポリン
の分析に用いた。ＤＡＣおよびセファロスポリンＣを、
溶媒Ａ：１０ｍＭ酢酸- 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）
および溶媒Ｂ：アセトニトリル（１００％）の混合溶液
で、以下のような勾配を用いた１．３ｍｌ／ｍｉｎ一定
流量で溶出した。
【００２４】 時間 ０分→ ５分→１０分→２０分→２５分 溶媒Ｂの濃度 ０％→ ０％→ ５％→ ５％→ ０％ これらの条件下で、ＤＡＣを３．４分の保持時間で、セ
ファロスポリンＣを１２．８分の保持時間で溶出した。
両方の化合物を、セファロスポリンＣおよびＤＡＣの真
正なサンプル（F.Salto,Antibioticos,S.A.,Leon,Spain
の提供による）をＨＰＬＣで同時に溶出することによっ
て特定した。
ファロスポリンＣを１２．８分の保持時間で溶出した。
両方の化合物を、セファロスポリンＣおよびＤＡＣの真
正なサンプル（F.Salto,Antibioticos,S.A.,Leon,Spain
の提供による）をＨＰＬＣで同時に溶出することによっ
て特定した。
【００２５】ＤＡＣ- アセチルトランスフェラーゼ活性
を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
１５０μｌ中に、５ｍＭアセチルＣｏＡ（Sigma Chem.
Co.,St.Louis,Mo ）５０μｌと、５ｍＭＤＡＣ（または
デアセチル- ７- アミノセファロスポリン酸（デアセチ
ル- ７- ＡＣＡ））５０μｌと、５０ｍＭ硫酸マグネシ
ウム２５μｌと、細胞を除いた抽出液（タンパク１００
ｇ）とを含む反応混合液において測定した。この酵素
は、基質類似体デアセチル- ７- ＡＣＡをアセチル化さ
れた誘導体７- ＡＣＡに変換することができる。
を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
１５０μｌ中に、５ｍＭアセチルＣｏＡ（Sigma Chem.
Co.,St.Louis,Mo ）５０μｌと、５ｍＭＤＡＣ（または
デアセチル- ７- アミノセファロスポリン酸（デアセチ
ル- ７- ＡＣＡ））５０μｌと、５０ｍＭ硫酸マグネシ
ウム２５μｌと、細胞を除いた抽出液（タンパク１００
ｇ）とを含む反応混合液において測定した。この酵素
は、基質類似体デアセチル- ７- ＡＣＡをアセチル化さ
れた誘導体７- ＡＣＡに変換することができる。
【００２６】混合物を３７℃で１時間インキュベート
し、反応物を氷中で急冷し、次いで冷却された反応混合
物をミリポア１００００ＮＭＷＬフィルターで濾過し
た。反応混合物５μｌをＨＰＬＣに注入し、セファロス
ポリンＣ（または７- ＡＣＡ）を以下のようなプログラ
ムで溶出した。
し、反応物を氷中で急冷し、次いで冷却された反応混合
物をミリポア１００００ＮＭＷＬフィルターで濾過し
た。反応混合物５μｌをＨＰＬＣに注入し、セファロス
ポリンＣ（または７- ＡＣＡ）を以下のようなプログラ
ムで溶出した。
【００２７】 時間 ０分→ ２分→１０分→１５分→２０分→２５分 溶媒Ｂの濃度 ０％→ ３％→ ３％→ ７％→ ７％→ ０％ ７- ＡＣＡは保持時間７．１分で溶出されたが、デアセ
チル化された基質デアセチル- ７- ＡＣＡは２．５分の
保持時間を示した。
チル化された基質デアセチル- ７- ＡＣＡは２．５分の
保持時間を示した。
【００２８】実施例３ Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．chryso
genum ）におけるcef Ｇ遺伝子の発現 cef Ｇ遺伝子の異種間の発現を、Ｐ．クリソゲナム（P.
chrysogenum ）npe ６で観察した。これは、イソペニシ
リンＮアシルトランスフェラーゼを欠くためペニシリン
生合成が阻害された変異体である。ＤＡＣ- アセチルト
ランスフェラーゼはこの菌株において観察されなかった
が、形質転換体ｎｐｅ６．Ｔ１およびｎｐｅ６．Ｔ２は
それぞれ１．３５および７．４nkatals ／ｍｇ・タンパ
ク質のＤＡＣ- アセチルトランスフェラーゼ活性を示し
た（図４）。これらの二つの形質転換体は、イクスパン
ダーゼ／ヒドロキシラーゼおよびＤＡＣ- アセチルトラ
ンスフェラーゼの両方をコードする遺伝子を保持する
が、セファロスポリンを合成しない。このことは、イソ
ペニシリンエピメラーゼ遺伝子（セファロスポリン合成
経路を完結するのに欠かせない）が、Ｐ．クリソゲナム
を形質転換するのに用いた７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片に
位置していないのか、または少なくともそれが機能して
いないことを示している。さらにそれらはペニシリンを
合成せず、このことはＤＡＣ- アセチルトランスフェラ
ーゼがイソペニシリンＮアシルトランスフェラーゼの代
わりにペニシリンを合成することができない、というこ
とを示した。
genum ）におけるcef Ｇ遺伝子の発現 cef Ｇ遺伝子の異種間の発現を、Ｐ．クリソゲナム（P.
chrysogenum ）npe ６で観察した。これは、イソペニシ
リンＮアシルトランスフェラーゼを欠くためペニシリン
生合成が阻害された変異体である。ＤＡＣ- アセチルト
ランスフェラーゼはこの菌株において観察されなかった
が、形質転換体ｎｐｅ６．Ｔ１およびｎｐｅ６．Ｔ２は
それぞれ１．３５および７．４nkatals ／ｍｇ・タンパ
ク質のＤＡＣ- アセチルトランスフェラーゼ活性を示し
た（図４）。これらの二つの形質転換体は、イクスパン
ダーゼ／ヒドロキシラーゼおよびＤＡＣ- アセチルトラ
ンスフェラーゼの両方をコードする遺伝子を保持する
が、セファロスポリンを合成しない。このことは、イソ
ペニシリンエピメラーゼ遺伝子（セファロスポリン合成
経路を完結するのに欠かせない）が、Ｐ．クリソゲナム
を形質転換するのに用いた７．２ｋｂＢａｍＨＩ断片に
位置していないのか、または少なくともそれが機能して
いないことを示している。さらにそれらはペニシリンを
合成せず、このことはＤＡＣ- アセチルトランスフェラ
ーゼがイソペニシリンＮアシルトランスフェラーゼの代
わりにペニシリンを合成することができない、というこ
とを示した。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
【表４】
【図１】デアセチルセファロスポリンＣをアセチルトラ
ンスフェラーゼによってセファロスポリンＣに変換する
反応を示したものである。
ンスフェラーゼによってセファロスポリンＣに変換する
反応を示したものである。
【図２】ファージＦ１およびＦ３９から得られたＤＮＡ
断片の制限地図を示したものである。
断片の制限地図を示したものである。
【図３】cef Ｇ遺伝子を保持するｐＵＬＪＬ４３で形質
転換されたセファロスポリンＣ非生産変異体Ｃ．アクレ
モニウムのアセチルトランスフェラーゼ活性を示したも
のである。
転換されたセファロスポリンＣ非生産変異体Ｃ．アクレ
モニウムのアセチルトランスフェラーゼ活性を示したも
のである。
【図４】cef Ｇ遺伝子を保持するｐＵＬＪＬ４３で形質
転換されたＰ．クリソゲナムnpe ６のアセチルトランス
フェラーゼ活性を示したものである。
転換されたＰ．クリソゲナムnpe ６のアセチルトランス
フェラーゼ活性を示したものである。
【手続補正書】
【提出日】平成５年７月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】３’非コード領域は、古典的なＡＡＴＡＡ
Ａポリアデニル化配列を含む（第１表の２８４５〜２８
５２番目のヌクレオチド）。第１表のＡＴＧ開始コドン
から上流の５’末端領域の解析は、コンセンサス“ＴＡ
ＴＡ”ボックス と関連した配列（ＴＡＣＴＡＴ：１００１〜１００６番
目のヌクレオチド）を明かにする。コンセンサス“ＣＡ
ＡＴ”ボックス（ＧＧＰｙＣＡＡＴＣＴ）は観察されな
かった。これらの配列は、高等生物における転写開始に
用いられるが、繊維状菌のプロモーターに必ず存在する
と言うわけではない。菌のプロモーターの特質を表して
いると思われるピリミジンに富む（６６％）ストレッチ
（８６５〜８９５番目のヌクレオチド）が、ｃｅｆ Ｇ
遺伝子の上流領域に存在している。
Ａポリアデニル化配列を含む（第１表の２８４５〜２８
５２番目のヌクレオチド）。第１表のＡＴＧ開始コドン
から上流の５’末端領域の解析は、コンセンサス“ＴＡ
ＴＡ”ボックス と関連した配列（ＴＡＣＴＡＴ：１００１〜１００６番
目のヌクレオチド）を明かにする。コンセンサス“ＣＡ
ＡＴ”ボックス（ＧＧＰｙＣＡＡＴＣＴ）は観察されな
かった。これらの配列は、高等生物における転写開始に
用いられるが、繊維状菌のプロモーターに必ず存在する
と言うわけではない。菌のプロモーターの特質を表して
いると思われるピリミジンに富む（６６％）ストレッチ
（８６５〜８９５番目のヌクレオチド）が、ｃｅｆ Ｇ
遺伝子の上流領域に存在している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:75） (Ｃ１２Ｐ 35/06 Ｃ１２Ｒ 1:75） (72)発明者 ハビエル、ベラスコ、アルバレス スペイン国サモラ、カーイエ、ベラ、ビス タ、ヌメロ、10 (72)発明者 フランシスコ、ホセ、フェルナンデス、ペ リノ スペイン国バリャドリド、カーイエ、ノガ ル、ヌメロ、６−３デー
Claims (9)
- 【請求項１】セファロスポリウム・アクレモニウムのア
セチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣアセチル
トランスフェラーゼ（ＤＡＣ- ＡＴＦ）をコードする、
完全な遺伝子（cef Ｇ）。 - 【請求項２】第１表のヌクレオチド配列で表されること
を特徴とする、請求項１記載のcefＧ遺伝子。 - 【請求項３】請求項１または２記載のcef Ｇ遺伝子をコ
ードする、ｃＤＮＡ。 - 【請求項４】請求項１〜３いずれか一項記載のcef Ｇ遺
伝子を含んでなる、プラスミド。 - 【請求項５】cef Ｇ遺伝子が独立した誘導性のプロモー
ターの調節下にあることを特徴とする、請求項４記載の
プラスミド。 - 【請求項６】請求項４または５記載のプラスミドで形質
転換されたことを特徴とする、セファロスポリンＣ生産
能を有する微生物。 - 【請求項７】請求項４または５記載のプラスミドで形質
転換された、セファロスポリウム・アクレモニウム菌
株。 - 【請求項８】請求項６または７記載の微生物を発酵さ
せ、生産されたセファロスポリンＣを単離することを含
んでなる、セファロスポリンＣの製造法。 - 【請求項９】セファロスポリンＣの生産を改良するため
の、請求項１または２記載の完全なcef Ｇ遺伝子の使用
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE92105986.1 | 1992-04-07 | ||
| EP92105986 | 1992-04-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646862A true JPH0646862A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=8209520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10503393A Pending JPH0646862A (ja) | 1992-04-07 | 1993-04-07 | セファロスポリウム・アクレモニウムのアセチルＣｏＡ：デアセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼをコードする完全な遺伝子（ｃｅｆ Ｇ）並びにその単離および用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646862A (ja) |
| CA (1) | CA2093498A1 (ja) |
-
1993
- 1993-04-06 CA CA 2093498 patent/CA2093498A1/en not_active Abandoned
- 1993-04-07 JP JP10503393A patent/JPH0646862A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2093498A1 (en) | 1993-10-08 |
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