JPH0638749A - 新規プロテアーゼ、その製造法及び新規アルテロモナ ス属微生物 - Google Patents
新規プロテアーゼ、その製造法及び新規アルテロモナ ス属微生物Info
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Abstract
ロテアーゼ、アルテロモナス属細菌を利用した該酵素の
製造法及び該酵素を生産する新規細菌、Alteromonas pe
ptidysin。 【効果】 海洋汚損生物であるムラサキイガイの除去が
可能となる。
Description
あるムラサキイガイを除去することを目的とした、ムラ
サキイガイ足糸分解能を有するプロテアーゼ、その製造
法及び該プロテアーゼ生産能を有する新規細菌、Altero
monas peptidysinに関する。
底や養殖施設、発電所の取水路等に付着し、様々な被害
を与えている。そのため、これらの汚損生物の除去は、
従来、水圧や人力等による物理的手段、あるいは亜硫化
銅や有機錫化合物等を使った化学的除去法が行われてき
た。しかし、これらの方法は、人的危険を伴う多大な労
力と出費を必要とし、更には、環境を汚染するという欠
点を有していた。
ガイ足糸の分解除去が目的であり、それを達成すべく鋭
意研究を行い本発明を完成するに至った。
式で付着しているが、その中でムラサキイガイは、L−
ドーパ、4−ヒドロキシプロリンを含むフェノール性タ
ンパクとコラーゲン等からなる足糸で付着している。本
発明者らは、ムラサキイガイ足糸を基質として海洋より
細菌を採取し、その中からムラサキイガイ足糸だけを栄
養源として生育できる細菌、即ちムラサキイガイ足糸分
解能を有する新規な細菌を分離した。更に、本新規細菌
の産生するムラサキイガイ足糸を分解できる3種のプロ
テアーゼを単離した。 1.本細菌のスクリーニングは以下の通り行った。 (1)一次スクリーニング 一次スクリーニング培地は洗浄前処理した足糸を濾過海
水に0.5 %(W/V) 入れ、加熱殺菌したもので、試験管に
入れた本培地10mlに 100μl の採取した海水を添加し、
20℃で10日間振とう培養した。濁度を測定し、OD660 >
0.3 まで増殖した分解活性の高いものを選択した。この
増殖した培養液をマリンアガー2216培地に100 μl塗布
し菌株を単離した。 (2) 二次スクリーニング 二次スクリーニングにより得られた海洋細菌をマリンブ
ロス2216培地でOD660=1.0 まで培養した。培養液を10,
000回転/分で15分遠心し、その上清を得た。この上清2
00 μlと0.2 μ以下の大きさに粉末篩分した足糸10mg
を50mMのトリスバッファー(pH7.5 )中で30℃、1時間
反応させ、しかる後、100 ℃、10分の加熱により反応を
停止させた。反応液を10,000回転/分で5分遠心し、遠
心上清中の遊離したペプチドをニンヒドリン法により定
量した。なお、1酵素単位(U)は上記実験条件下で1
分間に足糸から遊離されるヒドロキシプロリンの1μmo
lに相当する440nm における吸光度を与える場合の活性
度として表した。また、一次スクリーニング培地に、マ
リンブロス2216培地でOD660 =1.0 に培養した一次スク
リーニングで得られた海洋細菌を100 μl接種し、20
℃、15日間培養後、基質乾燥重量を測定した。これら2
つの結果を併せて2次スクリーニングとし、最も分解活
性の高い菌を選択した。 2.二次スクリーニングにより選択した本発明の細菌の
性状は以下の通りである。 (1)形態的性状 a.全長1μm、全幅300 〜400nm の桿菌で、走査型電
子顕微鏡下で図1に示されるもの。
は極毛である。 c.運動性:あり (2)生理学的性状 a.グラム染色: グラム陰性である。 b.糖発酵: 発酵しない。
る。 d.好塩性: 1〜10%のNaCl濃度で生育する。 e.ゼラチン分解:分解する。 f.DNA分解: 分解する。 g.GC含量: 42.4% 3.本発明の新規細菌の分類上の位置の決定は、次の通
り行った。 (1)属の決定 細菌は上記の形態学的及び生理学的性状よりアルテロモ
ナス (Alteromonas)属と同定した。 (2)種の決定 アルテロモナス属にはバージェイ式分類法により11種が
知られている。バージェイ式分類法により本細菌の分類
を試みたところ、公知種とは一致しなかった。公知11種
の中でバージェイ式分類法で一番近縁であったA.luteov
iolacea と本種の性状を表1及び表2に示す。
100 %の菌株で陽性であること、記号「d」は10〜89%
の菌株で陽性であること、記号「−」は10%未満の菌株
で陽性であるか、全く認められないこと、記号「St」は
桿菌を表す。
育しない。 b.本細菌はコハク酸、フマル酸、ペラルゴン酸、カプ
リン酸、L−ロイシン、L−イソロイシン、L−バリン
を利用できるが、A.luteoviolacea は利用できない。
してA.haloplanktis、E.coli、B.subtilisとのDNAの
相同性を検討した結果を表3に示す。
〜10%である。 b.本細菌とE.coli及びB.subtilisとのDNAの相同性
は1%以下である。 以上の性状の相違から、本細菌はアルテロモナス属の新
種であると結論し、Alteromonas peptidysinと命名し
た。
所に微工研菌寄第12875号として寄託されている。
本発明は、また、下記の理化学的性質を有する3種のプ
ロテアーゼをも提供するものである。 A.下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ(以下
「Enz-F20 」という。) (1) 作用:ムラサキイガイ足糸分解能を有する。 (2)基質特異性: (a)配列表の配列番号1で示される過ギ酸酸化ウシイン
シュリンB鎖における3番目のAsn と4番目のGln の間
の結合、4番目のGln と5番目のHis の間の結合、9番
目のSer と10番目のHis の間の結合、14番目のAla と15
番目のLeu の間の結合、15番目のLeu と16番目のTyr の
間の結合、20番目のGly と21番目のGlu の間の結合、24
番目のPhe と25番目のPhe の間の結合及び29番目のLys
と30番目のAla の間の結合を切断する(図2参照)。
プチドにおける8番目のThr と9番目のL−ドーパ(Dop
a)の間の結合、9番目のL−ドーパ(Dopa)と10番目のLy
s の間の結合を切断する(図3参照)。 (3)至適pH: 9.5〜10 (4)至適温度:50〜55℃ (5)至適NaCl濃度:5% (6)分子量:44,000 (7)阻害剤:フェニルメタンスルホニルフルオリドによ
り阻害される。 B.下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ(以下
「Enz-F30 」という。) (1) 作用:ムラサキイガイ足糸分解能を有する。 (2)基質特異性:配列表の配列番号2で示されるデカペ
プチドにおける9番目のL−ドーパ(Dopa)と10番目のLy
s の間の結合を切断する(図3参照)。 (3)至適pH: 8.5〜9 (4)至適温度:60〜65℃ (5)分子量:40,000 (6)阻害剤:p−クロロメルクリ安息香酸により阻害さ
れる。 C.下記の理化学的性質を有するプロテアーゼ(以下
「Enz-F15 」という。) (1) 作用:ムラサキイガイ足糸分解能を有する。 (2)基質特異性:配列表の配列番号2で示されるデカペ
プチドにおける8番目のThr と9番目のL−ドーパ(Dop
a)の間の結合を切断する(図3参照)。 (3)至適pH: 8〜8.5 (4)至適温度:45〜50℃ (5)分子量:22,000 (6)阻害剤:エチレンジアミン四酢酸により阻害され
る。
テアーゼ生産能を有するアルテロモナス属細菌を培地に
培養して、培養物中に該プロテアーゼを生成蓄積させ、
該培養物からこれを採取することにより製造することが
できる。ここで用いられるアルテロモナス属細菌として
は、例えば前述したAlteromonas peptidysinが挙げられ
る。
示す。 (1)培地: マリンブロス2216(DIFCO) 又はこ
れに類するもの (2)培養温度: 10〜40℃(至適温度、30℃) (3)培養pH: 6〜11(至適pH、pH7) (4) 培養NaCl濃度: 1〜10%(至適NaCl濃度、5%) (5)培養時間: 6時間以上(至適培養時間、48時
間) (6)培養回転数: 60〜120 回転/分(至適回転数、
100 回転/分)
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 (実施例1)A.peptidysinの産生するムラサキイガイ足
糸分解能を有する新規プロテアーゼの製造例 100ml の一次スクリーニング培地(滅菌海水に0.5 %
(W/V )の殺菌済の足糸を入れた培地)に、マリンブロ
ス2216培地でOD660 =1.0 まで培養したA.peptidysinを
100 μl 添加し、25℃で一週間振とう培養した。培養液
を10,000回転/分で15分遠心分離し、その上清を得た。
足糸分解活性を測定したところ、乾燥重量で基質残存率
が36.4%、足糸分解比活性が1,600 U/mgを示した。足
糸分解比活性の値は、市販、既存のプロテアーゼの値を
大きく上回るものであった(図4に示す)。
サキイガイ足糸分解能を有する新規プロテアーゼの製造
例 2Lの三角フラスコ内の400ml のマリンブロス2216培地
でA.peptidysinを2日間培養した。10,000回転/分、15
分の遠心分離でその上清を得た。これに硫酸アンモニウ
ムを添加し、その40〜60%画分を得た。この沈澱を0.02
Mのトリスバッファー(pH7.2 )に溶解し、超純水で十
分透析した。凍結乾燥後、セファクリルS−100HR
でのゲルクロマトグラフィー、DEAEクロマトグラフ
ィー、CMクロマトグラフィー、HPLC(ゲルクロマ
トグラフィー)により足糸分解能を有するプロテアーゼ
の精製を行った。
F15 、Enz-F20 及びEnz-F30 を得た。
解能を有し、海洋汚損生物であるムラサキイガイの除去
に有用な新規プロテアーゼを提供することができる。
残基(CySO3H)を表す。
す。
顕微鏡写真である。
ュリンB鎖に対する特異性を示す図である。
特異性を示す図である。
ある。
Claims (5)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。 (1) 作用:ムラサキイガイ足糸分解能を有する。 (2)基質特異性: (a)配列表の配列番号1で示される過ギ酸酸化ウシイン
シュリンB鎖における3番目のAsn と4番目のGln の間
の結合、4番目のGln と5番目のHis の間の結合、9番
目のSer と10番目のHis の間の結合、14番目のAla と15
番目のLeu の間の結合、15番目のLeu と16番目のTyr の
間の結合、20番目のGly と21番目のGlu の間の結合、24
番目のPhe と25番目のPhe の間の結合及び29番目のLys
と30番目のAla の間の結合を切断する。 (b)配列表の配列番号2で示されるデカペプチドにおけ
る8番目のThr と9番目のL−ドーパの間の結合、9番
目のL−ドーパと10番目のLys の間の結合を切断する。 (3)至適pH: 9.5〜10 (4)至適温度:50〜55℃ (5)至適NaCl濃度:5% (6)分子量:44,000 (7)阻害剤:フェニルメタンスルホニルフルオリドによ
り阻害される。 - 【請求項2】 下記の理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。 (1) 作用:ムラサキイガイ足糸分解能を有する。 (2)基質特異性:配列表の配列番号2で示されるデカペ
プチドにおける9番目のL−ドーパと10番目のLys の間
の結合を切断する。 (3)至適pH: 8.5〜9 (4)至適温度:60〜65℃ (5)分子量:40,000 (6)阻害剤:p−クロロメルクリ安息香酸により阻害さ
れる。 - 【請求項3】 下記の理化学的性質を有するプロテアー
ゼ。 (1) 作用:ムラサキイガイ足糸分解能を有する。 (2)基質特異性:配列表の配列番号2で示されるデカペ
プチドにおける8番目のThr と9番目のL−ドーパの間
の結合を切断する。 (3)至適pH: 8〜8.5 (4)至適温度:45〜50℃ (5)分子量:22,000 (6)阻害剤:エチレンジアミン四酢酸により阻害され
る。 - 【請求項4】 請求項1〜3の少なくとも1項に記載の
プロテアーゼ生産能を有するアルテロモナス属細菌を培
地に培養して、培養物中に該プロテアーゼを生成蓄積さ
せ、該培養物からこれを採取することを特徴とするプロ
テアーゼの製造法。 - 【請求項5】 ムラサキイガイ足糸分解能を有するAlte
romonas peptidysin。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7500093A JP3609102B2 (ja) | 1992-04-03 | 1993-03-10 | 新規プロテアーゼ、その製造法及び新規アルテロモナス属微生物 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4-109108 | 1992-04-03 | ||
JP10910892 | 1992-04-03 | ||
JP7500093A JP3609102B2 (ja) | 1992-04-03 | 1993-03-10 | 新規プロテアーゼ、その製造法及び新規アルテロモナス属微生物 |
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JPH0638749A true JPH0638749A (ja) | 1994-02-15 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002537470A (ja) * | 1996-10-29 | 2002-11-05 | ダブリュ.ピー.パワーズ カンパニー | 海洋構造物防汚方法および組成物 |
JP2005289910A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Chugoku Electric Power Co Inc:The | 微小物質浮上方法とクラゲ分解微小物質浮上方法 |
-
1993
- 1993-03-10 JP JP7500093A patent/JP3609102B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2002537470A (ja) * | 1996-10-29 | 2002-11-05 | ダブリュ.ピー.パワーズ カンパニー | 海洋構造物防汚方法および組成物 |
JP2005289910A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Chugoku Electric Power Co Inc:The | 微小物質浮上方法とクラゲ分解微小物質浮上方法 |
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