JPH0637A - 植物組織培養による高生産株の取得方法及び該株を用い た二次代謝産物の取得方法 - Google Patents
植物組織培養による高生産株の取得方法及び該株を用い た二次代謝産物の取得方法Info
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- JPH0637A JPH0637A JP4158325A JP15832592A JPH0637A JP H0637 A JPH0637 A JP H0637A JP 4158325 A JP4158325 A JP 4158325A JP 15832592 A JP15832592 A JP 15832592A JP H0637 A JPH0637 A JP H0637A
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- Japan
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- shoots
- secondary metabolite
- tissue culture
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 有用物質含量の高い植物株を取得する。
【構成】 植物組織の脱分化、黄化シュートの形成、株
分け、緑化シュートの形成という手順を経て含量の高い
株を選抜する方法。 【効果】 細胞小集塊選抜法又は遺伝子操作や交配によ
る株の改良法よりも迅速にかつ簡便に高生産株を選抜で
きる。
分け、緑化シュートの形成という手順を経て含量の高い
株を選抜する方法。 【効果】 細胞小集塊選抜法又は遺伝子操作や交配によ
る株の改良法よりも迅速にかつ簡便に高生産株を選抜で
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有用な二次代謝産物を
含有する植物から、植物組織培養法を用いて、高生産株
を取得する方法に関するものであり、植物に含まれる医
薬品、色素、甘味剤を製造する分野に利用される。
含有する植物から、植物組織培養法を用いて、高生産株
を取得する方法に関するものであり、植物に含まれる医
薬品、色素、甘味剤を製造する分野に利用される。
【０００２】
【従来の技術】植物を培養又は栽培することによって各
種医薬、色素、甘味剤等が生産されている。かかる場
合、生産性を向上させるためには、植物が必要とする栄
養源や温度、光等の環境因子を制御する技術が重要なこ
とはいうまでもないが、更に生産性の高い株を取得する
技術も同様に重要である。
種医薬、色素、甘味剤等が生産されている。かかる場
合、生産性を向上させるためには、植物が必要とする栄
養源や温度、光等の環境因子を制御する技術が重要なこ
とはいうまでもないが、更に生産性の高い株を取得する
技術も同様に重要である。
【０００３】植物培養細胞の場合は、カルスを幾つかの
小集塊に分けてそれぞれの生産能を比較して、それらの
中から高生産株を選抜する方法が広く用いられている。
しかし、植物の生産する二次代謝産物は、葉や根、花等
の分化した器官では生産されるが、カルスのような脱分
化細胞（又は未分化細胞ともいう）では生産されないこ
とが多い。かかる場合、カルスから優良株を選抜する際
に用いられる小集塊選抜法は適用できない。
小集塊に分けてそれぞれの生産能を比較して、それらの
中から高生産株を選抜する方法が広く用いられている。
しかし、植物の生産する二次代謝産物は、葉や根、花等
の分化した器官では生産されるが、カルスのような脱分
化細胞（又は未分化細胞ともいう）では生産されないこ
とが多い。かかる場合、カルスから優良株を選抜する際
に用いられる小集塊選抜法は適用できない。
【０００４】一方、分化した器官、例えば同じ一株から
生じた多くの葉はそれぞれ遺伝的に均一であり、有用な
二次代謝産物の含量の差が小さいので、選抜は困難であ
る。また近年、遺伝子操作技術を利用して、高生産株の
取得が試みられているが、そのような高生産に関わる遺
伝子を取得して、植物細胞内に導入するまでに熟練した
技術及び多くの労力が必要である。
生じた多くの葉はそれぞれ遺伝的に均一であり、有用な
二次代謝産物の含量の差が小さいので、選抜は困難であ
る。また近年、遺伝子操作技術を利用して、高生産株の
取得が試みられているが、そのような高生産に関わる遺
伝子を取得して、植物細胞内に導入するまでに熟練した
技術及び多くの労力が必要である。
【０００５】更に伝統的な圃場栽培による交配によっ
て、生産性の高い品種をつくることも行われているが、
この方法は長い年月を要する。
て、生産性の高い品種をつくることも行われているが、
この方法は長い年月を要する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】植物培養細胞から選抜
するときの従来の問題点は、１）小集塊選抜法は、葉や
根、花等の分化した器官でしか生産できない場合は適用
できない、２）分化した器官は遺伝的に均一なので選抜
は困難である、３）遺伝子操作技術による方法は、遺伝
子の取得及び植物細胞内への遺伝子の導入に熟練と多く
の労力を必要とする、４）圃場栽培における交配法は、
長い年月を要する、ことである。即ち分化した器官（組
織）で高生産株を選抜するには、遺伝的に不均一な状態
を作り出す技術、及び迅速で簡便な選抜方法を創出する
技術が望まれていた。
するときの従来の問題点は、１）小集塊選抜法は、葉や
根、花等の分化した器官でしか生産できない場合は適用
できない、２）分化した器官は遺伝的に均一なので選抜
は困難である、３）遺伝子操作技術による方法は、遺伝
子の取得及び植物細胞内への遺伝子の導入に熟練と多く
の労力を必要とする、４）圃場栽培における交配法は、
長い年月を要する、ことである。即ち分化した器官（組
織）で高生産株を選抜するには、遺伝的に不均一な状態
を作り出す技術、及び迅速で簡便な選抜方法を創出する
技術が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題
を解決すべく、研究を重ねた結果、組織培養で得た苗条
（シュート）を、一旦カルスが生成する条件で培養を行
い、引き続きそれぞれのカルスから黄化シュートを形成
させた後、それらを株分けし、次にシュートの成長しや
すい条件下でそれぞれの未熟な黄化シュートの培養を行
い、発達したシュートにまで培養を続けた後、それぞれ
の株の含量を調べることによって、高生産株が得られる
こと、及びここで得た高生産株を、再度カルスに戻すと
いう方法を繰り返すことによって、含量が飛躍的に向上
した株を取得できることを見いだし、本発明を完成する
に至った。
を解決すべく、研究を重ねた結果、組織培養で得た苗条
（シュート）を、一旦カルスが生成する条件で培養を行
い、引き続きそれぞれのカルスから黄化シュートを形成
させた後、それらを株分けし、次にシュートの成長しや
すい条件下でそれぞれの未熟な黄化シュートの培養を行
い、発達したシュートにまで培養を続けた後、それぞれ
の株の含量を調べることによって、高生産株が得られる
こと、及びここで得た高生産株を、再度カルスに戻すと
いう方法を繰り返すことによって、含量が飛躍的に向上
した株を取得できることを見いだし、本発明を完成する
に至った。
【０００８】即ち、本発明は、苗条（シュート）を一旦
カルス化させた後、再び苗条（シュート）に戻して株分
けし、それぞれの株を二次代謝産物を生産させる条件で
培養し、それらの中から該二次代謝産物の含量の高い株
を選抜することを特徴とする植物組織培養による高生産
株の取得方法に関するものであり、器官形成にともなっ
て生産される有用二次代謝産物の高生産株を取得する方
法を提供するものである。
カルス化させた後、再び苗条（シュート）に戻して株分
けし、それぞれの株を二次代謝産物を生産させる条件で
培養し、それらの中から該二次代謝産物の含量の高い株
を選抜することを特徴とする植物組織培養による高生産
株の取得方法に関するものであり、器官形成にともなっ
て生産される有用二次代謝産物の高生産株を取得する方
法を提供するものである。
【０００９】本発明の取得方法の対象となる植物体とし
ては、有用二次代謝産物を生産するする植物体であれば
特に制限はなく、例えば、Digitalis purpurea, Digita
lislanata等のジギタリス属植物；Strophanthus gratu
s, Strophanthus kombe等のストロファンサス属植物；S
tevia rebaudiana等のステビア属植物；Atropa bellado
nna等のアトロパ属植物；などの植物体が挙げられる。
ては、有用二次代謝産物を生産するする植物体であれば
特に制限はなく、例えば、Digitalis purpurea, Digita
lislanata等のジギタリス属植物；Strophanthus gratu
s, Strophanthus kombe等のストロファンサス属植物；S
tevia rebaudiana等のステビア属植物；Atropa bellado
nna等のアトロパ属植物；などの植物体が挙げられる。
【００１０】また、前記有用二次代謝産物としては、例
えばジギトキシン、ジゴキシン、ラナトシドＣ、プルプ
レアグリコシドＡ、ジギトキシゲニン、ジゴキシゲニ
ン、デアセチルラナトシドＣが挙げられる。シュートを
カルス化するには、植物ホルモンであるオーキシン、好
ましくはインドール酢酸と、サイトカイニン、好ましく
はベンジルアデニンを、それぞれ０．０５〜１ｐｐｍ、
０．１〜５ppm の濃度で添加したムラシゲ−スクーグ寒
天培地上で、５００ルクス以下、好ましくは暗黒下で、
７〜１４日間培養を行う。この間に寒天に継代したシュ
ートの基部付近からカルスが誘導形成するのが観察でき
る。更に７〜１４日間、引き続き同じ条件で培養を行う
と、カルスの各部からシュート原基（苗条原基）が形成
された後、黄色の細い茎を持ったいわゆる黄化シュート
が形成される。この段階で、１０〜２０の株に分けて、
サイトカイニン、好ましくはカイネチンを添加したニッ
チ＆ニッチの寒天培地に継代し、光照射を行いながら、
更に２〜４週間培養を続ける。カイネチンの濃度は０．
１〜１０μＭの範囲が好ましい。
えばジギトキシン、ジゴキシン、ラナトシドＣ、プルプ
レアグリコシドＡ、ジギトキシゲニン、ジゴキシゲニ
ン、デアセチルラナトシドＣが挙げられる。シュートを
カルス化するには、植物ホルモンであるオーキシン、好
ましくはインドール酢酸と、サイトカイニン、好ましく
はベンジルアデニンを、それぞれ０．０５〜１ｐｐｍ、
０．１〜５ppm の濃度で添加したムラシゲ−スクーグ寒
天培地上で、５００ルクス以下、好ましくは暗黒下で、
７〜１４日間培養を行う。この間に寒天に継代したシュ
ートの基部付近からカルスが誘導形成するのが観察でき
る。更に７〜１４日間、引き続き同じ条件で培養を行う
と、カルスの各部からシュート原基（苗条原基）が形成
された後、黄色の細い茎を持ったいわゆる黄化シュート
が形成される。この段階で、１０〜２０の株に分けて、
サイトカイニン、好ましくはカイネチンを添加したニッ
チ＆ニッチの寒天培地に継代し、光照射を行いながら、
更に２〜４週間培養を続ける。カイネチンの濃度は０．
１〜１０μＭの範囲が好ましい。
【００１１】次いで、有用な二次代謝産物を含むシュー
トを70％アセトニトリル中で超音波処理を行いながら二
次代謝産物を抽出し、その抽出液を液体クロマトグラフ
ィーや酵素免疫法によって含量を測定することにより、
二次代謝産物の含量の高い株を選抜することができる。
なお、酵素免疫法では、上記のジギトキシンやジゴキシ
ンなどのカルデノライドと総称する構造のよく似た化合
物を同時に定量できる。そこで、ジギトキシン抗体を用
いた場合はジギトキシン相当のカルデノライド量とし
て、またジゴキシン抗体を用いた場合はジゴキシン相当
のカルデノライド量として表した。
トを70％アセトニトリル中で超音波処理を行いながら二
次代謝産物を抽出し、その抽出液を液体クロマトグラフ
ィーや酵素免疫法によって含量を測定することにより、
二次代謝産物の含量の高い株を選抜することができる。
なお、酵素免疫法では、上記のジギトキシンやジゴキシ
ンなどのカルデノライドと総称する構造のよく似た化合
物を同時に定量できる。そこで、ジギトキシン抗体を用
いた場合はジギトキシン相当のカルデノライド量とし
て、またジゴキシン抗体を用いた場合はジゴキシン相当
のカルデノライド量として表した。
【００１２】以上のようにして得られる高生産株を用い
て、これから二次代謝産物を取得することにより効率よ
く有用な二次代謝産物を得ることができる。
て、これから二次代謝産物を取得することにより効率よ
く有用な二次代謝産物を得ることができる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ (1) 無菌苗条の誘導 圃場で二年間栽培したジギタリス・プルプレア（Digita
lis purpurea) （国立試験所）の葉を８０％エタノール
で洗浄後、１％次亜塩素酸ナトリウムで滅菌して無菌化
処理を行い、約１cm×１cmに刻んで、カイネチン１０μ
Ｍを含むニッチ＆ニッチの寒天培地に移植し、暗黒下で
培養することによって無菌苗条を誘導した。 (2) 緑化シュートの誘導 (1)で得た無菌苗条を、カイネチン１μＭを含むニッチ
＆ニッチの寒天培地に移植して、３０００ルクスの光照
射下、２５℃で３週間培養を行い、０．５〜１．５cmの
葉長をもつ緑化シュートを得た。 (3) 緑化シュートのカルス誘導 (2)で得たシュートをインドール酢酸０．１ｐｐｍ及び
ベンジルアデニン１ｐｐｍを含むムラシゲ−スクーグの
寒天培地に移植し、暗黒下で１週間培養を行った。寒天
培地に植え込んだ基部付近に淡黄色のカルスの形成が観
察された。更に同じ培地上で２週間、暗黒下で培養を行
うと、カルスの数カ所から１〜２cmの黄色の茎と未発達
の白色葉を持った黄化シュートが形成した。 (4) 高生産株の選抜 (a) (3)で得た黄化シュートを、下胚軸を含むように１
６個の株に分けた。それらをカイネチン１μＭを含むニ
ッチ＆ニッチの寒天培地に継代して３０００ルクスの光
照射下２５℃で３週間培養を行った。それぞれの株は葉
身０．５〜１．５cmの緑化シュートを形成した。各株か
ら葉を３枚ずつ取り、７０％アセトニトリルを加えて超
音波処理を３時間行いカルデノライドを抽出した。それ
らの抽出液中のジギトキシン相当のカルデノライドは酵
素免疫法を用いて測定した。表１に１６株の乾燥重量当
りのジギトキシン相当のカルデノライド含量を示す。含
量はppm 、即ちジギトキシン相当のカルデノライド−μ
g ／乾燥重量-gで表した。
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ (1) 無菌苗条の誘導 圃場で二年間栽培したジギタリス・プルプレア（Digita
lis purpurea) （国立試験所）の葉を８０％エタノール
で洗浄後、１％次亜塩素酸ナトリウムで滅菌して無菌化
処理を行い、約１cm×１cmに刻んで、カイネチン１０μ
Ｍを含むニッチ＆ニッチの寒天培地に移植し、暗黒下で
培養することによって無菌苗条を誘導した。 (2) 緑化シュートの誘導 (1)で得た無菌苗条を、カイネチン１μＭを含むニッチ
＆ニッチの寒天培地に移植して、３０００ルクスの光照
射下、２５℃で３週間培養を行い、０．５〜１．５cmの
葉長をもつ緑化シュートを得た。 (3) 緑化シュートのカルス誘導 (2)で得たシュートをインドール酢酸０．１ｐｐｍ及び
ベンジルアデニン１ｐｐｍを含むムラシゲ−スクーグの
寒天培地に移植し、暗黒下で１週間培養を行った。寒天
培地に植え込んだ基部付近に淡黄色のカルスの形成が観
察された。更に同じ培地上で２週間、暗黒下で培養を行
うと、カルスの数カ所から１〜２cmの黄色の茎と未発達
の白色葉を持った黄化シュートが形成した。 (4) 高生産株の選抜 (a) (3)で得た黄化シュートを、下胚軸を含むように１
６個の株に分けた。それらをカイネチン１μＭを含むニ
ッチ＆ニッチの寒天培地に継代して３０００ルクスの光
照射下２５℃で３週間培養を行った。それぞれの株は葉
身０．５〜１．５cmの緑化シュートを形成した。各株か
ら葉を３枚ずつ取り、７０％アセトニトリルを加えて超
音波処理を３時間行いカルデノライドを抽出した。それ
らの抽出液中のジギトキシン相当のカルデノライドは酵
素免疫法を用いて測定した。表１に１６株の乾燥重量当
りのジギトキシン相当のカルデノライド含量を示す。含
量はppm 、即ちジギトキシン相当のカルデノライド−μ
g ／乾燥重量-gで表した。
【００１４】
【表１】 (b) (a)で得た高含量株ＫＳ−１−１４−９株及びＫＳ
−１−１４−３株を (3)と同様の操作によって培養を行
い、カルスから黄化したシュートを形成させた。次に
(a)と同様にしてシュートを少なくとも２葉をもつ42の
シュートに分けて、光照射下で３週間培養を行った緑色
シュートを用いて、７０％アセトニトリルでカルデノラ
イドを抽出後、含量を測定した。表２に高含量株（上位
から５株）の乾燥重量当りのカルデノライド含量を示
す。
−１−１４−３株を (3)と同様の操作によって培養を行
い、カルスから黄化したシュートを形成させた。次に
(a)と同様にしてシュートを少なくとも２葉をもつ42の
シュートに分けて、光照射下で３週間培養を行った緑色
シュートを用いて、７０％アセトニトリルでカルデノラ
イドを抽出後、含量を測定した。表２に高含量株（上位
から５株）の乾燥重量当りのカルデノライド含量を示
す。
【００１５】なお、カルデノライドはジギトキシン抗体
及びペルオキシダーゼ標識抗原を用いて酵素免疫法で測
定した。また、表２において、含量はppm 、即ちジギト
キシン相当のカルデノライド−μg ／乾燥重量-gで表し
た。
及びペルオキシダーゼ標識抗原を用いて酵素免疫法で測
定した。また、表２において、含量はppm 、即ちジギト
キシン相当のカルデノライド−μg ／乾燥重量-gで表し
た。
【００１６】
【表２】 実施例２及び３ 実施例１の(4)(b)と同様の操作を、繰り返し１回行った
結果（上位５株）を表３に、繰り返し２回行った結果
（上位５株）を表４に示す。
結果（上位５株）を表３に、繰り返し２回行った結果
（上位５株）を表４に示す。
【００１７】なお、カルデノライドはジギトキシン抗体
及びペルオキシダーゼ標識抗原を用いて酵素免疫法で測
定した。また、表３及び４において、含量はppm 、即ち
ジギトキシン相当のカルデノライド−μg ／乾燥重量-g
で表した。
及びペルオキシダーゼ標識抗原を用いて酵素免疫法で測
定した。また、表３及び４において、含量はppm 、即ち
ジギトキシン相当のカルデノライド−μg ／乾燥重量-g
で表した。
【００１８】
【表３】
【００１９】
【表４】 実施例４ ジギタリス・ラナータを用いて実施例１〜３と同様な操
作を行った。ただし、酵素免疫法ではジゴキシン抗体を
用いた。含量はジゴキシン相当のカルデノライド含量と
して表した。
作を行った。ただし、酵素免疫法ではジゴキシン抗体を
用いた。含量はジゴキシン相当のカルデノライド含量と
して表した。
【００２０】表５に各選抜時に得られた株の最高含量を
示した。５回の選抜で2500ppm のジゴキシン相当のカル
デノライドを含む株が得られることを示している。
示した。５回の選抜で2500ppm のジゴキシン相当のカル
デノライドを含む株が得られることを示している。
【００２１】
【表５】 以上の結果は、本選抜方法を繰り返すことによって含量
の高い株が取得できることを示している。
の高い株が取得できることを示している。
【００２２】
【発明の効果】本発明は、植物の特定の器官の発達に伴
い生産される二次代謝産物の高生産株を取得する場合、
細胞小集塊選抜法又は遺伝子操作や交配による株の改良
法よりも迅速にかつ簡便に高生産株を選抜できる。 出願人 株式会社 ピーシーシーテクノロジー代理人
弁理士 平木 祐輔同 弁理士 石井 貞次同 弁
理士 早川 康
い生産される二次代謝産物の高生産株を取得する場合、
細胞小集塊選抜法又は遺伝子操作や交配による株の改良
法よりも迅速にかつ簡便に高生産株を選抜できる。 出願人 株式会社 ピーシーシーテクノロジー代理人
弁理士 平木 祐輔同 弁理士 石井 貞次同 弁
理士 早川 康
Claims (4)
- 【請求項１】 苗条を一旦カルス化させた後、再び苗条
に戻して株分けし、それぞれの株を二次代謝産物を生産
させる条件で培養し、それらの中から該二次代謝産物の
含量の高い株を選抜することを特徴とする植物組織培養
による高生産株の取得方法。 - 【請求項２】 苗条がジギタリス属植物体に由来する苗
条であることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 二次代謝産物がジギトキシン、ジゴキシ
ン、ラナトシドＣ、プルプレアグリコシドＡ、ジギトキ
シゲニン、ジゴキシゲニン、デアセチルラナトシドＣで
あることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法によって得られる高
生産株を用いて、これから二次代謝産物を取得すること
を特徴とする二次代謝産物の取得方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4158325A JPH0637A (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | 植物組織培養による高生産株の取得方法及び該株を用い た二次代謝産物の取得方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4158325A JPH0637A (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | 植物組織培養による高生産株の取得方法及び該株を用い た二次代謝産物の取得方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0637A true JPH0637A (ja) | 1994-01-11 |
Family
ID=15669177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4158325A Pending JPH0637A (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | 植物組織培養による高生産株の取得方法及び該株を用い た二次代謝産物の取得方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0637A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888573A (en) * | 1995-05-22 | 1999-03-30 | Rheon Automatic Machinery Co., Ltd. | Method for continuously and uniformly supplying dough |
| US6117472A (en) * | 1997-11-25 | 2000-09-12 | Rheon Automatic Machinery Co., Inc. | Process for preparing dough pieces |
| US6126431A (en) * | 1996-05-22 | 2000-10-03 | Rheon Automatic Machinery, Co., Inc. | Apparatus for continuously and quantitatively supplying bread dough |
| JP2012229938A (ja) * | 2011-04-25 | 2012-11-22 | Oji Paper Co Ltd | 植物雑種の形質推定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01228413A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Tokyo Gas Co Ltd | 精油の製造方法 |
-
1992
- 1992-06-17 JP JP4158325A patent/JPH0637A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01228413A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Tokyo Gas Co Ltd | 精油の製造方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888573A (en) * | 1995-05-22 | 1999-03-30 | Rheon Automatic Machinery Co., Ltd. | Method for continuously and uniformly supplying dough |
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| US6268004B1 (en) | 1996-05-22 | 2001-07-31 | Rheon Automatic Machinery Co., Ltd. | Method for continuously and quantitatively supplying bread dough |
| US6117472A (en) * | 1997-11-25 | 2000-09-12 | Rheon Automatic Machinery Co., Inc. | Process for preparing dough pieces |
| JP2012229938A (ja) * | 2011-04-25 | 2012-11-22 | Oji Paper Co Ltd | 植物雑種の形質推定方法 |
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