JPH0630624B2 - 真核細胞の核酸合成速度を測定する方法 - Google Patents
真核細胞の核酸合成速度を測定する方法Info
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- JPH0630624B2 JPH0630624B2 JP2130444A JP13044490A JPH0630624B2 JP H0630624 B2 JPH0630624 B2 JP H0630624B2 JP 2130444 A JP2130444 A JP 2130444A JP 13044490 A JP13044490 A JP 13044490A JP H0630624 B2 JPH0630624 B2 JP H0630624B2
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- Japan
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- digoxigenin
- nucleic acid
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- acid synthesis
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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-
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- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、真核細胞の核酸合成速度を測定する方法に関
する。
する。
［従来の技術］ 真核細胞の核酸合成速度及びこれに伴なう増殖速度を速
度するために、従来は、主として、放射性（3H、32P、14C
等で）標識されたヌクレオシド（これは細胞により生体
内に収容され、ホスホリル化され、核酸構成物として、
細胞核酸中に取り込まれる）を用いている［B.Helpap及
びW.Mauer.Naturwissenschaften.５４（１９６７）、５
２０］。細胞核酸内に取り込まれた放射能は、計測器又
は他の公知技術を用いて測定することができる。
度するために、従来は、主として、放射性（3H、32P、14C
等で）標識されたヌクレオシド（これは細胞により生体
内に収容され、ホスホリル化され、核酸構成物として、
細胞核酸中に取り込まれる）を用いている［B.Helpap及
びW.Mauer.Naturwissenschaften.５４（１９６７）、５
２０］。細胞核酸内に取り込まれた放射能は、計測器又
は他の公知技術を用いて測定することができる。
放射性物質での処理を、非放射性標識の使用により代替
する一般的傾向がある。その理由は、特に放射性物質を
用いる工程での周知の危険性にある。しかしながら、公
知の非放射性標識化物例えば蛍光染料又は標識化酵素
は、一般にかなり大きい分子であり、直ちに生細胞内に
取り込むことはできない。従って、H.G.グラッツナー(G
ratzner)等は、Exp.Cell Res.９５（１９７５）、８８
及びJ.Histochem.Cytochem.２４（１９７６）、３４
で、放射性標識されたヌクレオシドの代りに、ヌクレオ
シド５−ブロム−デソキシウリジンを細胞内に入れるこ
とを提案している（このようなヌクレオシドは、細胞に
より、助剤なしで、放射性標識されたヌクレオシドと同
様に吸収される）。このヌクレオシドの取り込みは、こ
れに対向している特異的抗体（これは、それ自体、標識
を有する）を用いて検出された。酵素イムノアッセイを
用いる、細胞ＤＮＡ中への５−ブロム−２−デソキシウ
リジンの取り込みの定量化を記載している文献も公表さ
れた（T.Porstmann等によるJ.Immunol.Methods８３（１
９８５）、１６９〜１７９；F.Martinon等によるLab.２
３（１９８７）、１５３〜１５９参照）。しかしなが
ら、この細胞ＤＮＡ内に取り込まれた５−ブロム−２−
デソキシウリジンを検出することを可能にするために
は、細胞ＤＮＡを変性すべきである。細胞のこのような
強い処理は、後に実施される細胞エリザ（Zell-Elisa）
で、比較的高すぎるバックグラウンド（Background）を
もたらし、これにより、合成速度測定が困難になり、不
正確になる。現在判明したように、この臭素誘導体をハ
プテンで標識されたヌクレオシドで代えると、このもの
の核酸内への取り込みは行なわれず、それ自体、細胞の
強い処理なしで実施可能なハプテン測定を利用すること
ができなかった。
する一般的傾向がある。その理由は、特に放射性物質を
用いる工程での周知の危険性にある。しかしながら、公
知の非放射性標識化物例えば蛍光染料又は標識化酵素
は、一般にかなり大きい分子であり、直ちに生細胞内に
取り込むことはできない。従って、H.G.グラッツナー(G
ratzner)等は、Exp.Cell Res.９５（１９７５）、８８
及びJ.Histochem.Cytochem.２４（１９７６）、３４
で、放射性標識されたヌクレオシドの代りに、ヌクレオ
シド５−ブロム−デソキシウリジンを細胞内に入れるこ
とを提案している（このようなヌクレオシドは、細胞に
より、助剤なしで、放射性標識されたヌクレオシドと同
様に吸収される）。このヌクレオシドの取り込みは、こ
れに対向している特異的抗体（これは、それ自体、標識
を有する）を用いて検出された。酵素イムノアッセイを
用いる、細胞ＤＮＡ中への５−ブロム−２−デソキシウ
リジンの取り込みの定量化を記載している文献も公表さ
れた（T.Porstmann等によるJ.Immunol.Methods８３（１
９８５）、１６９〜１７９；F.Martinon等によるLab.２
３（１９８７）、１５３〜１５９参照）。しかしなが
ら、この細胞ＤＮＡ内に取り込まれた５−ブロム−２−
デソキシウリジンを検出することを可能にするために
は、細胞ＤＮＡを変性すべきである。細胞のこのような
強い処理は、後に実施される細胞エリザ（Zell-Elisa）
で、比較的高すぎるバックグラウンド（Background）を
もたらし、これにより、合成速度測定が困難になり、不
正確になる。現在判明したように、この臭素誘導体をハ
プテンで標識されたヌクレオシドで代えると、このもの
の核酸内への取り込みは行なわれず、それ自体、細胞の
強い処理なしで実施可能なハプテン測定を利用すること
ができなかった。
［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の課題は、真核細胞の核酸合成速度を簡
単かつ正確に検出する方法を得ることであるが、この
際、放射性化合物の使用及び細胞の変性は避けるべきで
ある。
単かつ正確に検出する方法を得ることであるが、この
際、放射性化合物の使用及び細胞の変性は避けるべきで
ある。
［課題を解決するための手段］ この課題は、本発明により、真核細胞の核酸合成速度の
測定法により解決され、この方法は、リポソームの添加
のもとに、ハプテンで誘導体化されたか又は非放射性標
識されたヌクレオチドを細胞内に導入し、その核酸合成
速度をヌクレオチドの取り込みに基づき、その標識付け
又は誘導体化を介して測定することよりなる。
測定法により解決され、この方法は、リポソームの添加
のもとに、ハプテンで誘導体化されたか又は非放射性標
識されたヌクレオチドを細胞内に導入し、その核酸合成
速度をヌクレオチドの取り込みに基づき、その標識付け
又は誘導体化を介して測定することよりなる。
本発明は、リポソームの存在下に、標識されたヌクレオ
チドの使用の際に、標識されたヌクレオシドの使用とは
反対に、核酸内への所望取り込みが起こり、核酸合成速
度の尺度として使用することができることの意想外の確
認に基づく。
チドの使用の際に、標識されたヌクレオシドの使用とは
反対に、核酸内への所望取り込みが起こり、核酸合成速
度の尺度として使用することができることの意想外の確
認に基づく。
本発明の方法により、ヌクレオチド分子を細胞中の新た
に合成された核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）中に取り込み、こ
れを、その後に、その標識化に基づき測定することが可
能になる。この標識化は、有利に、蛍光染料を介して又
は検出可能な誘導体にすることにより行なうことができ
る（上記参照）。従って、標識化又は誘導体化されたヌ
クレオチドの取り込み速度に基づき、細胞内での核酸合
成速度が推測できる。ヌクレオチドとしては、リボー、
デソキシー及びジデソキシヌクレオチド系の天然に由来
するか又は他のヌクレオチドを使用することができる。
に合成された核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）中に取り込み、こ
れを、その後に、その標識化に基づき測定することが可
能になる。この標識化は、有利に、蛍光染料を介して又
は検出可能な誘導体にすることにより行なうことができ
る（上記参照）。従って、標識化又は誘導体化されたヌ
クレオチドの取り込み速度に基づき、細胞内での核酸合
成速度が推測できる。ヌクレオチドとしては、リボー、
デソキシー及びジデソキシヌクレオチド系の天然に由来
するか又は他のヌクレオチドを使用することができる。
標識としては、本発明によれば、全ての非放射性標識が
好適である。
好適である。
ハプテンで標識されたヌクレオチドの有利な使用の際
に、その測定を、その側で標識された抗−ハプテン−抗
体を介して実施するのが有利である。ハプテンとして
は、過度の大きさにより、核酸内中へのヌクレオチドの
取り込みもしくは核酸の合成速度を阻害せず、特異的な
抗−ハプテン−抗体により検出することができるような
すべてのものが好適である。ハプテンとしては、次のも
のが有利である；分子量３００〜１２００を有する分子
例えばステロイド及びステロイド類似化合物（例えばコ
ルチゾール、エストリオール、エストラジオール、テオ
フィリン、テストステロール、胆汁酸、プロゲステロ
ン、アルドステロン、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、シ
ラレニン、ブファタリン、エクジソン、(Ecdyson)及び
トマチジン(Tomatidin)、短鎖ペプチド（例えばアンチ
プレシン、オキシトシン、ブラディキニン）；蛍光色素
（例えばフルオレッセイン及びその誘導体、レゾルフィ
ン、ローダミン等）；T3，T4、ビオチン及びその誘導
体；アフラトキシン、アトラジン、植物ホルモン（例え
ばジベレリン）；アルカロイド（例えばレゼルピン及び
アジャマリシン(Ajamalicin)；フェノバルビタール；ビ
タミン（例えばＢ１２及びその誘導体）。本発明によれ
ば、ハプテンとしてジゴキシゲニン、ビオチン又はフル
オレッセインを使用するのが有利である。抗−ハプテン
−抗体としては、モノクローナル又はポリクローナル抗
体又はそのフラグメント及び誘導体を使用することがで
きる。このような抗体は、当業者にとって公知である。
に、その測定を、その側で標識された抗−ハプテン−抗
体を介して実施するのが有利である。ハプテンとして
は、過度の大きさにより、核酸内中へのヌクレオチドの
取り込みもしくは核酸の合成速度を阻害せず、特異的な
抗−ハプテン−抗体により検出することができるような
すべてのものが好適である。ハプテンとしては、次のも
のが有利である；分子量３００〜１２００を有する分子
例えばステロイド及びステロイド類似化合物（例えばコ
ルチゾール、エストリオール、エストラジオール、テオ
フィリン、テストステロール、胆汁酸、プロゲステロ
ン、アルドステロン、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、シ
ラレニン、ブファタリン、エクジソン、(Ecdyson)及び
トマチジン(Tomatidin)、短鎖ペプチド（例えばアンチ
プレシン、オキシトシン、ブラディキニン）；蛍光色素
（例えばフルオレッセイン及びその誘導体、レゾルフィ
ン、ローダミン等）；T3，T4、ビオチン及びその誘導
体；アフラトキシン、アトラジン、植物ホルモン（例え
ばジベレリン）；アルカロイド（例えばレゼルピン及び
アジャマリシン(Ajamalicin)；フェノバルビタール；ビ
タミン（例えばＢ１２及びその誘導体）。本発明によれ
ば、ハプテンとしてジゴキシゲニン、ビオチン又はフル
オレッセインを使用するのが有利である。抗−ハプテン
−抗体としては、モノクローナル又はポリクローナル抗
体又はそのフラグメント及び誘導体を使用することがで
きる。このような抗体は、当業者にとって公知である。
抗−ハプテン−抗体の代りに、このハプテン検出のため
に、結合パートナーとしてのハプテンを包含する結合系
の他のパートナー（これ自体も検出可能な標識を担持で
きる）も使用できる。このような結合剤系中のパートナ
ーとして、例えばビオチンの場合にハプテンとしてスト
レプトアビジンまたはアビジンが好適であるが、一緒に
なって結合対を形成する比較可能な大きさの他の分子も
好適である。
に、結合パートナーとしてのハプテンを包含する結合系
の他のパートナー（これ自体も検出可能な標識を担持で
きる）も使用できる。このような結合剤系中のパートナ
ーとして、例えばビオチンの場合にハプテンとしてスト
レプトアビジンまたはアビジンが好適であるが、一緒に
なって結合対を形成する比較可能な大きさの他の分子も
好適である。
本発明により有利に使用されるヌクレオチドは、５−位
で標識されたか又は誘導体化されたビリミジン−ヌクレ
オチド、８−位で標識されたか又は誘導体化されたプリ
ン−ヌクレオチド又は７−位で標識されたか又は誘導体
された７−デスアザプリン−ヌクレオチド（それぞれ糖
残基としてのリボース、デソキシリボース又はジデソキ
シリボースを有する）、特に５−ジゴキシゲニン−２−
デソキシウリジン三燐酸（これは、ジゴキシゲニンに対
して高親和性のモノクローナル抗体で検出される）であ
る。特に、ポリクローナル抗体のFab−フラグメントを
使用するのが有利である。
で標識されたか又は誘導体化されたビリミジン−ヌクレ
オチド、８−位で標識されたか又は誘導体化されたプリ
ン−ヌクレオチド又は７−位で標識されたか又は誘導体
された７−デスアザプリン−ヌクレオチド（それぞれ糖
残基としてのリボース、デソキシリボース又はジデソキ
シリボースを有する）、特に５−ジゴキシゲニン−２−
デソキシウリジン三燐酸（これは、ジゴキシゲニンに対
して高親和性のモノクローナル抗体で検出される）であ
る。特に、ポリクローナル抗体のFab−フラグメントを
使用するのが有利である。
ヌクレオチドの非放射性標識化のためにも、抗−ハプテ
ン−抗体又は結合系の標識付きパートナーの非放射性標
識付けのために、蛍光色素を使用するのが有利である。
好適な蛍光色素は当業者にとっては公知であり、本発明
によれば、特にレゾルフィン、ローダミン、クマリン、
又はフルオレッセインを使用するのが有利である。他の
有利な実施形では、ヌクレオチド、抗−ハプテン−抗体
又は結合系の他のパートナーの標識として、酵素標識を
用い、取り込み速度の測定を標識系の特異的な基質分解
を介して実施する。この際、酵素活性から、変性された
ヌクレオチドの取り込み速度及びこれに伴なう核酸−合
成速度を逆推論することができる。標識系としては、当
業者に公知の酵素が好適である。β−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼを使
用するのが有利である。特に抗−ハプテン−抗体又は結
合系の他のパートナーの標識として酵素標識を使用する
のが有利である。
ン−抗体又は結合系の標識付きパートナーの非放射性標
識付けのために、蛍光色素を使用するのが有利である。
好適な蛍光色素は当業者にとっては公知であり、本発明
によれば、特にレゾルフィン、ローダミン、クマリン、
又はフルオレッセインを使用するのが有利である。他の
有利な実施形では、ヌクレオチド、抗−ハプテン−抗体
又は結合系の他のパートナーの標識として、酵素標識を
用い、取り込み速度の測定を標識系の特異的な基質分解
を介して実施する。この際、酵素活性から、変性された
ヌクレオチドの取り込み速度及びこれに伴なう核酸−合
成速度を逆推論することができる。標識系としては、当
業者に公知の酵素が好適である。β−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼを使
用するのが有利である。特に抗−ハプテン−抗体又は結
合系の他のパートナーの標識として酵素標識を使用する
のが有利である。
リポソームとしては、本発明の範囲内では、例えば当業
者に公知であるような一般的な細胞膜に慣用の天然又は
合成のリポソームが好適である。特に、カチオン性リポ
ソーム例えば西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第０１７２００
７号明細書に記載のような一般式Ｉに挙げられているも
のが好適である。更に好適なリポイドは、文献ＪＡＣＳ
９９（１９７７）、３８６０頁及びBiophysical Chemis
try１０（１９７９）、２６１頁に記載されている。
者に公知であるような一般的な細胞膜に慣用の天然又は
合成のリポソームが好適である。特に、カチオン性リポ
ソーム例えば西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第０１７２００
７号明細書に記載のような一般式Ｉに挙げられているも
のが好適である。更に好適なリポイドは、文献ＪＡＣＳ
９９（１９７７）、３８６０頁及びBiophysical Chemis
try１０（１９７９）、２６１頁に記載されている。
西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第０１７２００７号明細書に
記載のリポソームをホスホリポイド例えばジオレイルホ
スファチジルエタノールアミン(PtdEth)又はジオレイル
ホスファチジルコリンと組み合せて使用するのが有利で
ある。リポイドにホスホリポイドを７５％まで特に最大
５０％の量で添加するのが有利である。しかしながら、
燐酸塩不含のリポイドを使用するのが特に有利である。
記載のリポソームをホスホリポイド例えばジオレイルホ
スファチジルエタノールアミン(PtdEth)又はジオレイル
ホスファチジルコリンと組み合せて使用するのが有利で
ある。リポイドにホスホリポイドを７５％まで特に最大
５０％の量で添加するのが有利である。しかしながら、
燐酸塩不含のリポイドを使用するのが特に有利である。
リポソームは、例えば、リポイドを水中に懸濁させ、澄
明溶液が得られるまで、例えば超音波又は細いノズルを
通す圧縮により処理することにより製造される。本発明
による好適なリポソームに関する詳細は例えばグレゴリ
イ・グレゴリアディス(Gregory Gyegoriadis)（１９８
４）のPreparation of Liposomes,Liposome Technolog
y.第１巻Ｇ．Ｒ．Ｃ．Press,Boca Raton,Floridaに記載
されている。
明溶液が得られるまで、例えば超音波又は細いノズルを
通す圧縮により処理することにより製造される。本発明
による好適なリポソームに関する詳細は例えばグレゴリ
イ・グレゴリアディス(Gregory Gyegoriadis)（１９８
４）のPreparation of Liposomes,Liposome Technolog
y.第１巻Ｇ．Ｒ．Ｃ．Press,Boca Raton,Floridaに記載
されている。
Ｎ−［１−（１，２−ジオレイルオキシ）プロピル］−
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドから形成
されたリポソームを使用するのが有利である。このDOTM
A−リポソームの使用は、Ｐ．Ｌ．Felgner等によるPro
c.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８４（１９８７）、７４１３〜
７４１７頁におけるTransfection von DNA in eukaryon
tischen Zellenに関して記載されている。
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドから形成
されたリポソームを使用するのが有利である。このDOTM
A−リポソームの使用は、Ｐ．Ｌ．Felgner等によるPro
c.Natl.Acad.Sci.ＵＳＡ８４（１９８７）、７４１３〜
７４１７頁におけるTransfection von DNA in eukaryon
tischen Zellenに関して記載されている。
細胞内へのリポソームの取り込みのために、有利に血清
含有生長培地を使用する。
含有生長培地を使用する。
ヌクレオチド、抗−ハプテン−抗体又は結合系の他のパ
ートナーの標識化を介しての合成速度の測定を、蛍光染
料の使用の際に、有利に、増殖細胞の免疫蛍光を介して
行なうか又は蛍光を直接測定する。
ートナーの標識化を介しての合成速度の測定を、蛍光染
料の使用の際に、有利に、増殖細胞の免疫蛍光を介して
行なうか又は蛍光を直接測定する。
本発明の他の有利なもう１つの実施形では、測定のため
に増殖細胞の免疫細胞化学的検査を使用するか又は細胞
−ELISA(enzyme Linked immunosorbent assay)を実施す
る。これにより、容易かつ迅速に実施可能な方法で、細
胞の核酸合成速度の非常に正確な測定を実施することが
でき、この際、細胞核酸の変性に基づく高いバックグラ
ウンドによる結果の誤まりは生じない。
に増殖細胞の免疫細胞化学的検査を使用するか又は細胞
−ELISA(enzyme Linked immunosorbent assay)を実施す
る。これにより、容易かつ迅速に実施可能な方法で、細
胞の核酸合成速度の非常に正確な測定を実施することが
でき、この際、細胞核酸の変性に基づく高いバックグラ
ウンドによる結果の誤まりは生じない。
真核細胞内に、リポソームを用いて、カチオン性界面活
性剤から非放射性標識ヌクレオチドと他の非標識物質例
えばイノシトール燐酸、ＤＮＡ及びＲＮＡ、治療剤、ホ
ルモン例えばエストロゲンとの組み合せも、取り込まれ
た非標識物質に対して特異的な核酸合成を測定する目的
で導入することができる。
性剤から非放射性標識ヌクレオチドと他の非標識物質例
えばイノシトール燐酸、ＤＮＡ及びＲＮＡ、治療剤、ホ
ルモン例えばエストロゲンとの組み合せも、取り込まれ
た非標識物質に対して特異的な核酸合成を測定する目的
で導入することができる。
標識されたヌクレオチドと例えば非標識イノシトール三
燐酸との組み合せにより、前記方法で、イノシトール三
燐酸により誘導される核酸合成を測定することができ
る。
燐酸との組み合せにより、前記方法で、イノシトール三
燐酸により誘導される核酸合成を測定することができ
る。
標識されたデソキシリボヌクレオチドと非標識ＤＮＡ例
えばプラスミドＤＮＡとの組み合せにより、このプラス
ミドの複製的核酸合成を検出することができ、この際、
例えば、サザンブロット(Southern blot)を用いて、非
標識プラスミドを膜上に移行させ、次いで、この標識さ
れた新たに合成された（複製された）プラスミドＤＮＡ
に対してハイブリッド形成させる。標識されたリボヌク
レオチドと非標識mRNAとの組み合せにより、転写的核酸
合成が検出でき、この際、例えば、ノーザン、ブロット
(Northern blot)を用いて、非標識mRNAを膜上に転移さ
せ、次いでこの標識された新たに合成された（転写され
た）mRNAに対してハイブリッド形成させる。
えばプラスミドＤＮＡとの組み合せにより、このプラス
ミドの複製的核酸合成を検出することができ、この際、
例えば、サザンブロット(Southern blot)を用いて、非
標識プラスミドを膜上に移行させ、次いで、この標識さ
れた新たに合成された（複製された）プラスミドＤＮＡ
に対してハイブリッド形成させる。標識されたリボヌク
レオチドと非標識mRNAとの組み合せにより、転写的核酸
合成が検出でき、この際、例えば、ノーザン、ブロット
(Northern blot)を用いて、非標識mRNAを膜上に転移さ
せ、次いでこの標識された新たに合成された（転写され
た）mRNAに対してハイブリッド形成させる。
標識されたリボヌクレオチドと非標識ＤＮＡ例えばプラ
スミドＤＮＡとの組み合せにより、このプラスミドの転
写核酸合成を検出することができ、この際、例えばサザ
ンブロットを用いて、非標識プラスミドを膜上に転移さ
せ、次いで、標識された新たに合成された（転写され
た）mRNAに対してハイブリッド形成させる。
スミドＤＮＡとの組み合せにより、このプラスミドの転
写核酸合成を検出することができ、この際、例えばサザ
ンブロットを用いて、非標識プラスミドを膜上に転移さ
せ、次いで、標識された新たに合成された（転写され
た）mRNAに対してハイブリッド形成させる。
標識されたデソキシリボヌクレオチドと非標識ＲＮＡと
の組み合せにより、例えばＨＩＶ感染細胞中での逆転写
核酸合成を検出することができ、この際、例えば、ノー
ザンブロットを用いて、非標識ＲＮＡを膜上に転移さ
せ、次いで標識された新たに合成された（逆転写）ＤＮ
Ａに対してハイブリッド形成させる。同様な方法で、標
識されたデソキシリボヌクレオチドとジデソキシヌクレ
オチドとの組み合せを使用することができる。
の組み合せにより、例えばＨＩＶ感染細胞中での逆転写
核酸合成を検出することができ、この際、例えば、ノー
ザンブロットを用いて、非標識ＲＮＡを膜上に転移さ
せ、次いで標識された新たに合成された（逆転写）ＤＮ
Ａに対してハイブリッド形成させる。同様な方法で、標
識されたデソキシリボヌクレオチドとジデソキシヌクレ
オチドとの組み合せを使用することができる。
［実施例］ 次の例で本発明を詳述する。
例１ リポソームの製造 クロロホルム１ｍ中の［１−（２，３−ジオリルオキ
シ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム
クロリド（DOTMA）２０mgの溶液に窒素気下に乾燥する
まで蒸気導入し、真空下に１晩乾燥させる。残留分を再
蒸留水２ｍ中に再懸濁させ、４℃で溶液が澄明になる
まで超音波処理する。この溶液をヘペス緩衝食塩水（Ｈ
ＢＳ）を用いて、１mg／ｍの濃度まで希釈し、０．２
μｍのフィルターを通して滅菌濾過する。
シ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム
クロリド（DOTMA）２０mgの溶液に窒素気下に乾燥する
まで蒸気導入し、真空下に１晩乾燥させる。残留分を再
蒸留水２ｍ中に再懸濁させ、４℃で溶液が澄明になる
まで超音波処理する。この溶液をヘペス緩衝食塩水（Ｈ
ＢＳ）を用いて、１mg／ｍの濃度まで希釈し、０．２
μｍのフィルターを通して滅菌濾過する。
例２ 粘着性細胞中へのジゴキシゲニン−１１−dUTPの転移 (a)蛍光検査 例１で製造したリポソームの溶液２０μ（１mg／ｍ
）にジゴキシゲニン−１１−dUTP（西ドイツ特許第３
８１３２７８号により製造；１０mg／ｍＨＢＳ中）１
０μを加え、混合する。この混合物をインテグレーテ
ッド・チェンバー・スライド・（マイルス）(integrate
d chamber slides(Miles)）上で粘着性になるまで生長
する細胞（ＣＨＯ−細胞、ＡＴＣＣ、CCl６１）に添加
し（培地：細胞培養培地ＤＭＥＭ，Boehringer Mannhei
m GmbH５００μ＋１０％牛胎児血清）、恒温保持装置
（３７℃、５％CO2）中で２時間インキュベートする。
）にジゴキシゲニン−１１−dUTP（西ドイツ特許第３
８１３２７８号により製造；１０mg／ｍＨＢＳ中）１
０μを加え、混合する。この混合物をインテグレーテ
ッド・チェンバー・スライド・（マイルス）(integrate
d chamber slides(Miles)）上で粘着性になるまで生長
する細胞（ＣＨＯ−細胞、ＡＴＣＣ、CCl６１）に添加
し（培地：細胞培養培地ＤＭＥＭ，Boehringer Mannhei
m GmbH５００μ＋１０％牛胎児血清）、恒温保持装置
（３７℃、５％CO2）中で２時間インキュベートする。
上澄みを吸引し、細胞を燐酸塩緩衝食塩水（NaCl３７ｍ
モル／、KCl2.7mモル／、Na2HPO4８ｍモル／、KH
2PO41.5mモル／；pH7.5；（ＰＢＳ）、（３７℃））
で、室温で各々２分間、３回洗浄する。最後の吸引の後
に、細胞を、１００％メタノール（−２０℃）で、１０
分間−２０℃で固定させる。このメタノールを吸引除去
し、細胞を前記のようにＰＢＳで３回洗浄する。最後の
吸引の後に、純粋ＦＫＳと共に３７℃で３０分間インキ
ュベートする。引続き、ＦＫＳを吸引除去し、前記と同
様にＰＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、ジゴキ
シゲニンに対向しているポリクローナル抗体のFabフラ
グメント（これは５(6)−カルボキシ−Ｘ−ローダミン
(Boehringer Ma.)と接合している）を加え、３７℃で１
時間インキュベートする。次いで前記と同様にＰＢＳで
３回洗浄する。最後の吸引の後に、湿っている物体担体
をマウンティング培地例えばモビオール(Mowiol Fe.Ho
echst)中に埋め込み、暗所、室温で１時間乾燥させる。
蛍光−顕微鏡中で、緑色励起（５７２nm）の際に、細胞
核の赤色蛍光が認められる。
モル／、KCl2.7mモル／、Na2HPO4８ｍモル／、KH
2PO41.5mモル／；pH7.5；（ＰＢＳ）、（３７℃））
で、室温で各々２分間、３回洗浄する。最後の吸引の後
に、細胞を、１００％メタノール（−２０℃）で、１０
分間−２０℃で固定させる。このメタノールを吸引除去
し、細胞を前記のようにＰＢＳで３回洗浄する。最後の
吸引の後に、純粋ＦＫＳと共に３７℃で３０分間インキ
ュベートする。引続き、ＦＫＳを吸引除去し、前記と同
様にＰＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、ジゴキ
シゲニンに対向しているポリクローナル抗体のFabフラ
グメント（これは５(6)−カルボキシ−Ｘ−ローダミン
(Boehringer Ma.)と接合している）を加え、３７℃で１
時間インキュベートする。次いで前記と同様にＰＢＳで
３回洗浄する。最後の吸引の後に、湿っている物体担体
をマウンティング培地例えばモビオール(Mowiol Fe.Ho
echst)中に埋め込み、暗所、室温で１時間乾燥させる。
蛍光−顕微鏡中で、緑色励起（５７２nm）の際に、細胞
核の赤色蛍光が認められる。
(b)酵素検出 例１で製造したリポソームの溶液（１mg／ｍ）１０μ
に、ジゴキシゲニン−１１−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／
ｍ）５μを加え混合する。この混合物をマイクロ滴
定プレート（Fa.Nunc社）中で粘着性に生長する細胞
（ＣＨＯ−細胞ＡＴＣ：ＣＣＬ６１）に添加し（培地：
細胞培養培地：ＤＭＥＭ，Boehringer Mannheim GmbH.
１０％牛胎児血清を含有する５００μ）、恒温保持器
中で２時間（３７℃。CO2５％）インキュベートする。
上澄みを吸引し、細胞をTris緩衝食塩水（Tris-HCl、５
０ｍモル／、NaCl１５０ｍモル／、pH7.5、（ＴＢ
Ｓ）、（３７℃））を用いて室温で各々２分間３回洗浄
する。最後の吸引の後に、１００％メタノール（−２０
℃）を用いて、細胞を−２０℃で１０分間固定させる。
メタノールを吸引除去し、細胞を前記のようにＴＢＳで
３回洗浄する。最後の吸引の後に、純粋なＦＫＳと共に
３７℃で３０分間インキュベートする。引続き、このＦ
ＫＳを吸引除去し、前記と同様にＴＢＳで３回洗浄す
る。最後の吸引の後に、アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）と接合されているジゴキシゲニンに対向しているポ
リクローナル抗体のFab−フラグメントを加え、３７℃
で１時間インキュベートする。その後、前記のように、
ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、この結合し
たＡＰを、基質Ｐ−ニトロフェニルホスフエートを用い
て、マイクロ滴定プレートリーダー（Fa.ＳＬＴ社）中
で、４０５nmで検出する。
に、ジゴキシゲニン−１１−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／
ｍ）５μを加え混合する。この混合物をマイクロ滴
定プレート（Fa.Nunc社）中で粘着性に生長する細胞
（ＣＨＯ−細胞ＡＴＣ：ＣＣＬ６１）に添加し（培地：
細胞培養培地：ＤＭＥＭ，Boehringer Mannheim GmbH.
１０％牛胎児血清を含有する５００μ）、恒温保持器
中で２時間（３７℃。CO2５％）インキュベートする。
上澄みを吸引し、細胞をTris緩衝食塩水（Tris-HCl、５
０ｍモル／、NaCl１５０ｍモル／、pH7.5、（ＴＢ
Ｓ）、（３７℃））を用いて室温で各々２分間３回洗浄
する。最後の吸引の後に、１００％メタノール（−２０
℃）を用いて、細胞を−２０℃で１０分間固定させる。
メタノールを吸引除去し、細胞を前記のようにＴＢＳで
３回洗浄する。最後の吸引の後に、純粋なＦＫＳと共に
３７℃で３０分間インキュベートする。引続き、このＦ
ＫＳを吸引除去し、前記と同様にＴＢＳで３回洗浄す
る。最後の吸引の後に、アルカリホスファターゼ（Ａ
Ｐ）と接合されているジゴキシゲニンに対向しているポ
リクローナル抗体のFab−フラグメントを加え、３７℃
で１時間インキュベートする。その後、前記のように、
ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、この結合し
たＡＰを、基質Ｐ−ニトロフェニルホスフエートを用い
て、マイクロ滴定プレートリーダー（Fa.ＳＬＴ社）中
で、４０５nmで検出する。
例３ 粘着性細胞内へのジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰの転移 a)例２a)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ
（西ドイツ特許第３８１３２７８号により製造）を使用
する。蛍光−顕微鏡中で緑色励起（５７２nm）の際に、
全細胞の赤色蛍光が認められる。
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ
（西ドイツ特許第３８１３２７８号により製造）を使用
する。蛍光−顕微鏡中で緑色励起（５７２nm）の際に、
全細胞の赤色蛍光が認められる。
b)例２b)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ
を使用する。
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ
を使用する。
例４ 粘着性細胞内へのジゴキシゲニン標識されたＤＮＡの転
移 a)例２a)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識されたＤＮ
Ａ（１００μｇ／ｍ、pBR３２８、製造は西ドイツ特
許第３８１３２７８号と同様）１０μを使用する。蛍
光顕微鏡中で、緑色励起（５７２nm）の際に全細胞の赤
色蛍光が認められる。
移 a)例２a)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識されたＤＮ
Ａ（１００μｇ／ｍ、pBR３２８、製造は西ドイツ特
許第３８１３２７８号と同様）１０μを使用する。蛍
光顕微鏡中で、緑色励起（５７２nm）の際に全細胞の赤
色蛍光が認められる。
b)例２b)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りに、ジゴキシゲニン標識されたＤ
ＮＡ（１００μｇ／ｍ、pBR３２８；西ドイツ特許第
３８１３２７８号と同様に製造）１０μを使用する。
ン−１１−dUTPの代りに、ジゴキシゲニン標識されたＤ
ＮＡ（１００μｇ／ｍ、pBR３２８；西ドイツ特許第
３８１３２７８号と同様に製造）１０μを使用する。
例５ 粘着性細胞内へのジゴキシゲニン標識されたＲＮＡの転
移 a)例２a)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りに、ジゴキシゲニン標識されたＲ
ＮＡ（１００μｇ／ｍ）１０μを、例えばネオマイ
シンGenのトランスクリプトと同様に使用する（製造は
西ドイツ特許第３８１３２７８号と同様）。蛍光顕微鏡
中で、緑色励起（５７２nm）の際に全細胞の赤色蛍光が
認められる。
移 a)例２a)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りに、ジゴキシゲニン標識されたＲ
ＮＡ（１００μｇ／ｍ）１０μを、例えばネオマイ
シンGenのトランスクリプトと同様に使用する（製造は
西ドイツ特許第３８１３２７８号と同様）。蛍光顕微鏡
中で、緑色励起（５７２nm）の際に全細胞の赤色蛍光が
認められる。
b)例２b)と同様に実施するが、ここでは、ジゴキシゲニ
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識されたＲＮ
Ａ（１００μｇ／ｍ）１０μを、例えばネオマイシ
ンGenのトランスクリプトを使用すると同様に使用する
（製造は西ドイツ特許第３８１３２７８号と同様）。
ン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識されたＲＮ
Ａ（１００μｇ／ｍ）１０μを、例えばネオマイシ
ンGenのトランスクリプトを使用すると同様に使用する
（製造は西ドイツ特許第３８１３２７８号と同様）。
例６ フルオレッセイン−dUTPの製造 a)５(6)−カルボキシフルオレッセイン−ε−アミドカ
プロイル−［５−（アミドアリル）−２′−デソキシ−
ウリジン−５′−トリホスフエート］−テトラリチウム
塩（フルオレッセイン−dUTP） ５(6)−カルボキシフルオレッセイン−ε−アミドカプ
ロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［５
(6)−カルボキシフルオレッセイン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（FLUOS、Boehringer Mannheim１
０５５０８９）と６−アミノカプロン酸との反応及び引
続くＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造によ
る２工程合成で製造］５８６１mg（１ｍモル）をジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍ中に溶かし、0.1モ
ル／ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）中の５−アミ
ノアリル−２′−デソキシ−ウリジン−５′−トリホス
フエート−４リチウム塩５４７１mg（１ｍモル）の溶液
に加える。混合物を室温で１晩（約１５時間）攪拌し、
その後濾紙電気泳動（クエン酸塩緩衝液（pH5.0）０．
０５モル／）で所望の生成物への殆んど定量的変換率
が認められる。
プロイル−［５−（アミドアリル）−２′−デソキシ−
ウリジン−５′−トリホスフエート］−テトラリチウム
塩（フルオレッセイン−dUTP） ５(6)−カルボキシフルオレッセイン−ε−アミドカプ
ロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［５
(6)−カルボキシフルオレッセイン−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（FLUOS、Boehringer Mannheim１
０５５０８９）と６−アミノカプロン酸との反応及び引
続くＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造によ
る２工程合成で製造］５８６１mg（１ｍモル）をジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｍ中に溶かし、0.1モ
ル／ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）中の５−アミ
ノアリル−２′−デソキシ−ウリジン−５′−トリホス
フエート−４リチウム塩５４７１mg（１ｍモル）の溶液
に加える。混合物を室温で１晩（約１５時間）攪拌し、
その後濾紙電気泳動（クエン酸塩緩衝液（pH5.0）０．
０５モル／）で所望の生成物への殆んど定量的変換率
が認められる。
反応混合物を真空中で蒸発濃縮し、残分を再蒸溜水２５
０ｍ中に入れ、イオン交換体−クロマトグラフィの目
的で、クロリド形のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５
カラム（２×４０cm）上に加える。水〜LiCl0.3モルの
直線勾配で溶離させ、生成物を含有するフラクションを
集め、これを真空中で全量約５０ｍまで濃縮する。こ
の濃縮物を激しい攪拌下に、アセトン／エタノール３：
１の混合物５８０ｍ中に滴加すると、ヌクレオチドが
沈殿する。この沈殿を遠心分離し、アセトン／エタノー
ル３：１でクロリド不含になるまで数回洗浄する。真空
中P2O5／KOH上で乾燥の後に、表題化合物４５３mg（理
論量の４５％）が黄色粉末の形で得られる。C39H37O24N
4P3Li4に関する元素分析： Ｃ（計算値）43.9％ Ｃ（実測値）43.5％ Ｈ（計算値） 3.5％ Ｈ（実測値）3.65％ Ｎ（計算値）5.25％ Ｎ（実測値） 5.0％ Ｐ（計算値） 8.7％ Ｐ（実測値） 8.9％31 P-NMR(D2O)：δ＝−5.2（ｄ、Ｐγ） −１０．３（ｄ、Ｐα）、−２１．３（ｔ，Ｐβ） b)５−(6)−カルボキシフルオレッセイン−ε−アミド
カプロイル−［５−（アミドアリル）−ウリジン−５′
−トリホスフェート］−４リチウム塩 例６a)と同様に、５(6)−カルボキシフルオレッセイン
−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル５８６mg（１ｍモル）と５−アミノアリル−
ウリジン−５′−トリホスフェート−４リチウム塩５３
６mg（１ｍモル）とをＤＭＦ／０．１モル／ホウ酸ナ
トリウム緩衝液（pH8.5）中で反応させる。
０ｍ中に入れ、イオン交換体−クロマトグラフィの目
的で、クロリド形のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５
カラム（２×４０cm）上に加える。水〜LiCl0.3モルの
直線勾配で溶離させ、生成物を含有するフラクションを
集め、これを真空中で全量約５０ｍまで濃縮する。こ
の濃縮物を激しい攪拌下に、アセトン／エタノール３：
１の混合物５８０ｍ中に滴加すると、ヌクレオチドが
沈殿する。この沈殿を遠心分離し、アセトン／エタノー
ル３：１でクロリド不含になるまで数回洗浄する。真空
中P2O5／KOH上で乾燥の後に、表題化合物４５３mg（理
論量の４５％）が黄色粉末の形で得られる。C39H37O24N
4P3Li4に関する元素分析： Ｃ（計算値）43.9％ Ｃ（実測値）43.5％ Ｈ（計算値） 3.5％ Ｈ（実測値）3.65％ Ｎ（計算値）5.25％ Ｎ（実測値） 5.0％ Ｐ（計算値） 8.7％ Ｐ（実測値） 8.9％31 P-NMR(D2O)：δ＝−5.2（ｄ、Ｐγ） −１０．３（ｄ、Ｐα）、−２１．３（ｔ，Ｐβ） b)５−(6)−カルボキシフルオレッセイン−ε−アミド
カプロイル−［５−（アミドアリル）−ウリジン−５′
−トリホスフェート］−４リチウム塩 例６a)と同様に、５(6)−カルボキシフルオレッセイン
−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル５８６mg（１ｍモル）と５−アミノアリル−
ウリジン−５′−トリホスフェート−４リチウム塩５３
６mg（１ｍモル）とをＤＭＦ／０．１モル／ホウ酸ナ
トリウム緩衝液（pH8.5）中で反応させる。
反応混合物の後処理は、同様に、例６a)に記載と同様な
方法で行ない、この際、所望の化合物５２０mg（理論量
の５０％）が黄橙色無定形粉末として得られる。
方法で行ない、この際、所望の化合物５２０mg（理論量
の５０％）が黄橙色無定形粉末として得られる。
C39H37O24N4P3Li4に関する元素分析： Ｃ（計算値）43.3％ Ｃ（実測値）42.9％ Ｈ（計算値） 3.4％ Ｈ（実測値） 3.5％ Ｎ（計算値） 5.2％ Ｎ（実測値） 5.1％ Ｐ（計算値） 8.6％ Ｐ（実測値）8.75％31 P-NMR−スペクトルは相応する２′−デソキシ−誘導
体のそれと一致する。
体のそれと一致する。
例７ 粘着性細胞内へのフルオレッセイン−dUTPの転移 a)例１で製造したリポソームの溶液（１mg／ｍ）２０
μにフルオレッセイン−dUTP（例６ａ）１０μを加
え、混合する。この混合物を粘着性のインテグレイテッ
ド・チエンバー・スライド（Miles）上で生長する細胞
（ＣＨＯ−細胞ＡＴＣＣ：ＣＣＬ６１）に加え（培地：
細胞培養培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH，１
０％牛胎児血清で５００μ）、恒温保持装置（３７
℃、CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄み
を吸引濾過し、細胞をＰＢＳ（３７℃）を用いて室温で
各々２分間３回洗浄する。最後の吸引濾過の後に、１０
０％メタノール（−２０℃）を用いて細胞を−２０℃で
１０分間固定させる。メタノールを吸引濾去し、細胞を
前記と同様に、ＰＢＳで３回洗浄する。最後の吸引濾過
の後に湿っている物体担体をマウンティング培地例えば
モビオール中に埋め込み、暗所、室温で１時間乾燥させ
る。蛍光−顕微鏡中で、青色励起（４９４nm）で、細胞
核の緑色蛍光が認められる。
μにフルオレッセイン−dUTP（例６ａ）１０μを加
え、混合する。この混合物を粘着性のインテグレイテッ
ド・チエンバー・スライド（Miles）上で生長する細胞
（ＣＨＯ−細胞ＡＴＣＣ：ＣＣＬ６１）に加え（培地：
細胞培養培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH，１
０％牛胎児血清で５００μ）、恒温保持装置（３７
℃、CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄み
を吸引濾過し、細胞をＰＢＳ（３７℃）を用いて室温で
各々２分間３回洗浄する。最後の吸引濾過の後に、１０
０％メタノール（−２０℃）を用いて細胞を−２０℃で
１０分間固定させる。メタノールを吸引濾去し、細胞を
前記と同様に、ＰＢＳで３回洗浄する。最後の吸引濾過
の後に湿っている物体担体をマウンティング培地例えば
モビオール中に埋め込み、暗所、室温で１時間乾燥させ
る。蛍光−顕微鏡中で、青色励起（４９４nm）で、細胞
核の緑色蛍光が認められる。
蛍光標識細胞はＦＡＣＡ（fluorescence Activated Cel
l Sorter）中で分析することもできる。
l Sorter）中で分析することもできる。
この使用のために、メタノール上での固定は省略でき
る。
る。
b)例１で製造されたリポソームの溶液（１mg／ｍ）２
０μをフルオレッセイン−dUTP１０μに加え、混合
する。この混合物を付着性のマイクロ滴定プレート（F
e.Nunc）上で生長する細胞（ＣＨＯ−細胞）（培地：細
胞培養培地ＤＭＥＭ、Boehrihnger Mannheim GmbH.１０
％牛胎児血清で５００μ）に加え、恒温保持装置（３
７℃、CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄
みを吸引濾過し、細胞をＰＢＳ（３７℃）で室温で各々
２分間３回洗浄する。最後の吸引濾過の後に、１００％
メタノール（−２０℃）を用いて、この細胞を−２０℃
で１０分間固定させる。メタノールを吸引濾過し、細胞
を前記と同様に、ＰＢＳで３回洗浄する。検出は、蛍光
光度計（Fa.Flow社）で行なう。蛍光標識された細胞
は、公知方法で、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated G
ell Sorter）中で分析することもできる。この使用のた
めに、メタノール上での固定を省略することができる。
０μをフルオレッセイン−dUTP１０μに加え、混合
する。この混合物を付着性のマイクロ滴定プレート（F
e.Nunc）上で生長する細胞（ＣＨＯ−細胞）（培地：細
胞培養培地ＤＭＥＭ、Boehrihnger Mannheim GmbH.１０
％牛胎児血清で５００μ）に加え、恒温保持装置（３
７℃、CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄
みを吸引濾過し、細胞をＰＢＳ（３７℃）で室温で各々
２分間３回洗浄する。最後の吸引濾過の後に、１００％
メタノール（−２０℃）を用いて、この細胞を−２０℃
で１０分間固定させる。メタノールを吸引濾過し、細胞
を前記と同様に、ＰＢＳで３回洗浄する。検出は、蛍光
光度計（Fa.Flow社）で行なう。蛍光標識された細胞
は、公知方法で、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated G
ell Sorter）中で分析することもできる。この使用のた
めに、メタノール上での固定を省略することができる。
例８ 懸濁細胞中へのジゴキシゲニン−１１−dUTPの転移 a)蛍光検定 例１で製造したリポソームの溶液（１mg／ｍ）に、ジ
ゴキシゲニン−１１−dUTP（ＨＢＳ中の１０mg／ｍ）
１０μを加え、混合する。この混合物を組込まれたチ
エンバー・スライド（Miles）中、懸濁液中で生長する
細菌（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８）（培地：細胞
培養培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH.１０％
牛胎児血清で５００μ）を加え、恒温保持装置（３７
°CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの
吸引濾過の前に、細胞を物体担体の底部で遠心し（サイ
トスピン遠心機、Fa.Shandon、３９ｇ）、次いで、上澄
みを注意深く吸引濾過する。ＰＢＳ（３７℃）を用い室
温で各２分間３回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引除去の前
に、前記のようにそれぞれ物体担体の底部で遠心分離す
る。最後の吸引濾過の後に、細胞を物体担体上で３７℃
で１時間乾燥させ、次いで、１００％メタノール（−２
０℃）を用い−２０℃で１０分間固定させる。メタノー
ルを吸引除去し、細胞を前記のようにＰＢＳで３回洗浄
する。最後の吸引の後に、純粋ＦＫＳと共に３７℃で３
０分間インキュベートする。引続きこのＦＫＳを吸引
し、細胞を前記と同様にＰＢＳで３回洗浄する。最後の
吸引の後に、５(6)−カルボキシ−Ｘ−ローダミンと接
合されているジゴキシゲニンに対向しているポリクロー
ナル抗体のFab−フラグメントを加え、３７℃で１時間
インキュベートする。次いで、前記と同様にＰＢＳで３
回洗浄する。最後の吸引の後に、湿っている物体担体を
マウンティング培地例えばモビオール中に埋め込み、暗
所、室温で１時間乾燥させる。蛍光顕微鏡中で、緑色励
起（５７２nm）の際に細胞核の赤色蛍光が認められる。
ゴキシゲニン−１１−dUTP（ＨＢＳ中の１０mg／ｍ）
１０μを加え、混合する。この混合物を組込まれたチ
エンバー・スライド（Miles）中、懸濁液中で生長する
細菌（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８）（培地：細胞
培養培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH.１０％
牛胎児血清で５００μ）を加え、恒温保持装置（３７
°CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの
吸引濾過の前に、細胞を物体担体の底部で遠心し（サイ
トスピン遠心機、Fa.Shandon、３９ｇ）、次いで、上澄
みを注意深く吸引濾過する。ＰＢＳ（３７℃）を用い室
温で各２分間３回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引除去の前
に、前記のようにそれぞれ物体担体の底部で遠心分離す
る。最後の吸引濾過の後に、細胞を物体担体上で３７℃
で１時間乾燥させ、次いで、１００％メタノール（−２
０℃）を用い−２０℃で１０分間固定させる。メタノー
ルを吸引除去し、細胞を前記のようにＰＢＳで３回洗浄
する。最後の吸引の後に、純粋ＦＫＳと共に３７℃で３
０分間インキュベートする。引続きこのＦＫＳを吸引
し、細胞を前記と同様にＰＢＳで３回洗浄する。最後の
吸引の後に、５(6)−カルボキシ−Ｘ−ローダミンと接
合されているジゴキシゲニンに対向しているポリクロー
ナル抗体のFab−フラグメントを加え、３７℃で１時間
インキュベートする。次いで、前記と同様にＰＢＳで３
回洗浄する。最後の吸引の後に、湿っている物体担体を
マウンティング培地例えばモビオール中に埋め込み、暗
所、室温で１時間乾燥させる。蛍光顕微鏡中で、緑色励
起（５７２nm）の際に細胞核の赤色蛍光が認められる。
b)酵素反応 例１で製造されたリポソームの溶液（１mg／ｍ）１０
μにジゴキシゲニン−１１−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／
ｍ）５μを加え混合する。この混合物を、マイクロ
滴定プレート（Fa.Nunc）中の懸濁液中で生長する細胞
（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８）（培地：細胞培養
培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH.１０％牛胎
児血清で５００μ）に添加し、恒温保持装置（３７℃
CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの吸
引除去の前に細胞をマイクロ滴定プレートの底部上で遠
心し（マイクロ滴定プレート−挿入物を有する遠心機、
Fa.Hettich２００ｇ）、次いで上澄みを注意深く吸引除
去する。細胞をＴＢＳ（３７℃）を用い、室温で各２分
間３回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引除去の前に、細胞を
前記のように、各々、マイクロ滴定プレートの底部上で
遠心する。最後の吸引除去の前に細胞をマイクロ滴定プ
レートの底板上で３７℃で１時間乾燥させ、次いで１０
０％メタノール（−２０℃）を用いて−２０℃で１０分
間固定させる。メタノールを吸引除去し、細胞を前記と
同様に、ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、純
粋ＦＫＳと共に３７℃で３０分間インキュベートする。
引続きこのＦＫＳを吸引除去し、細胞を前記のように、
ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、アルカリホ
スファターゼ（ＡＰ）と接合しているジゴキシゲニンに
対向しているポリクローナル抗体のFab−フラグメント
を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次い
で、前記のように、ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引
除去の後に、結合したＡＰを基質ｐ−ニトロフェニルホ
スフェートを用い、マイクロ滴定プレートリーダー（F
a.ＳＬＴ）中で４０５nmで検出する。
μにジゴキシゲニン−１１−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／
ｍ）５μを加え混合する。この混合物を、マイクロ
滴定プレート（Fa.Nunc）中の懸濁液中で生長する細胞
（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８）（培地：細胞培養
培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH.１０％牛胎
児血清で５００μ）に添加し、恒温保持装置（３７℃
CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの吸
引除去の前に細胞をマイクロ滴定プレートの底部上で遠
心し（マイクロ滴定プレート−挿入物を有する遠心機、
Fa.Hettich２００ｇ）、次いで上澄みを注意深く吸引除
去する。細胞をＴＢＳ（３７℃）を用い、室温で各２分
間３回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引除去の前に、細胞を
前記のように、各々、マイクロ滴定プレートの底部上で
遠心する。最後の吸引除去の前に細胞をマイクロ滴定プ
レートの底板上で３７℃で１時間乾燥させ、次いで１０
０％メタノール（−２０℃）を用いて−２０℃で１０分
間固定させる。メタノールを吸引除去し、細胞を前記と
同様に、ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、純
粋ＦＫＳと共に３７℃で３０分間インキュベートする。
引続きこのＦＫＳを吸引除去し、細胞を前記のように、
ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、アルカリホ
スファターゼ（ＡＰ）と接合しているジゴキシゲニンに
対向しているポリクローナル抗体のFab−フラグメント
を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次い
で、前記のように、ＴＢＳで３回洗浄する。最後の吸引
除去の後に、結合したＡＰを基質ｐ−ニトロフェニルホ
スフェートを用い、マイクロ滴定プレートリーダー（F
a.ＳＬＴ）中で４０５nmで検出する。
例９ 懸濁細胞中へのジゴキシゲニン−１１−dUTPの転移 a)例７a)におけると同様に実施するが、この際、ジゴキ
シゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−
ＵＴＰを用いる。蛍光顕微鏡で、緑色励起（５７２nm）
の際に、全細胞の赤色蛍光が認められる。
シゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−
ＵＴＰを用いる。蛍光顕微鏡で、緑色励起（５７２nm）
の際に、全細胞の赤色蛍光が認められる。
b)例７b)におけると同様に実施するが、この際、ジゴキ
シゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−
ＵＴＰ使用する。
シゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン−１１−
ＵＴＰ使用する。
例１０ 懸濁細胞中へのジゴキシゲニン標識されたＤＮＡの転移 a)例７a)と同様に実施するが、この際、ジゴキシゲニン
−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識されたＤＮＡ
（１００μｇ／ｍpBR３２８）１０μを使用する。
−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識されたＤＮＡ
（１００μｇ／ｍpBR３２８）１０μを使用する。
蛍光顕微鏡で、緑色励起（５７２nm）の際に全細胞の赤
色蛍光が認められる。
色蛍光が認められる。
b)例７b)と同様に実施するが、この際、ジゴキシゲニン
−１１−dUTPの代りに、ジゴキシゲニン標識されたＤＮ
Ａ（１００μｇ／ｍ、pBR３２８）１０μを使用す
る。
−１１−dUTPの代りに、ジゴキシゲニン標識されたＤＮ
Ａ（１００μｇ／ｍ、pBR３２８）１０μを使用す
る。
例１１ 懸濁細胞中へのジゴキシゲニン標識されたＲＮＡの転移 a)例７a)におけると同様に実施するが、この際、ジゴキ
シゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識され
たＲＮＡ（１００μｇ／ｍ）例えばネオマイシンGen
のトランスクリプト１０μを使用する。蛍光顕微鏡
中、緑色励起（５２７nm）で全細胞の赤色蛍光が認めら
れる。b)例７b)と同様に実施するが、この際、ジゴキシ
ゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識された
ＲＮＡ（１００μｇ／ｍ）例えばネオマイシンGenの
トランスクリプト１０μを使用する。
シゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識され
たＲＮＡ（１００μｇ／ｍ）例えばネオマイシンGen
のトランスクリプト１０μを使用する。蛍光顕微鏡
中、緑色励起（５２７nm）で全細胞の赤色蛍光が認めら
れる。b)例７b)と同様に実施するが、この際、ジゴキシ
ゲニン−１１−dUTPの代りにジゴキシゲニン標識された
ＲＮＡ（１００μｇ／ｍ）例えばネオマイシンGenの
トランスクリプト１０μを使用する。
例１２ 懸濁細胞内へのフルオレッセイン−dUTPの転移 a)例１で製造したリポソームの溶液（１mg／ｍ）に、
フルオレッセイン−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／ｍ）１０
μを加え、混合する。この混合物を組込まれたチエン
バー・スライド（Ｍｉｌｅｓ）中の懸濁液中で生長する
細胞（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８、培地：細胞培
養培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH．１０％牛
胎児血清で５００μ）に添加し、恒温保持装置（３７
℃CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの
吸引除去の前に、細胞を物体担体の底部上で遠心し（サ
イトスピン遠心機、Fa.Shandon、３９ｇ）、次いで、上
澄みを注意深く吸引する。細胞をＰＢＳ（３７℃）を用
い室温で各々２分間３回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引の
前に、細胞を前記のように、それぞれ物体担体の底部上
で遠心すべきである。最後の吸引の後に、細胞を物体担
体上で３７℃で３０分間乾燥させ、次いで、１００％メ
タノール（−２０℃）を用い−２０℃で１０分間固定さ
せる。このメタノールを吸引除去し、細胞を前記のよう
にＰＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、湿った物
体担体をマウンティング媒体例えばモビオール（Fe.Hoe
chst）中に埋め込み、暗所、室温で１時間乾燥させる。
蛍光顕微鏡中で、青色励起（４９４nm）の際に、細胞核
の緑色蛍光が認められる。
フルオレッセイン−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／ｍ）１０
μを加え、混合する。この混合物を組込まれたチエン
バー・スライド（Ｍｉｌｅｓ）中の懸濁液中で生長する
細胞（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８、培地：細胞培
養培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH．１０％牛
胎児血清で５００μ）に添加し、恒温保持装置（３７
℃CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの
吸引除去の前に、細胞を物体担体の底部上で遠心し（サ
イトスピン遠心機、Fa.Shandon、３９ｇ）、次いで、上
澄みを注意深く吸引する。細胞をＰＢＳ（３７℃）を用
い室温で各々２分間３回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引の
前に、細胞を前記のように、それぞれ物体担体の底部上
で遠心すべきである。最後の吸引の後に、細胞を物体担
体上で３７℃で３０分間乾燥させ、次いで、１００％メ
タノール（−２０℃）を用い−２０℃で１０分間固定さ
せる。このメタノールを吸引除去し、細胞を前記のよう
にＰＢＳで３回洗浄する。最後の吸引の後に、湿った物
体担体をマウンティング媒体例えばモビオール（Fe.Hoe
chst）中に埋め込み、暗所、室温で１時間乾燥させる。
蛍光顕微鏡中で、青色励起（４９４nm）の際に、細胞核
の緑色蛍光が認められる。
この蛍光標識された細胞は、ＦＡＣＳ（Fluorescence A
ctivated Cell Sorter）中でも分析できる。この用途の
ために、メタノール固定は省略することができる。
ctivated Cell Sorter）中でも分析できる。この用途の
ために、メタノール固定は省略することができる。
b)例１で製造されたリポソームの溶液（１mg／ｍ）１
０μに、フルオレッセイン−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／
ｍ）５μを加え、混合する。この混合物をマイクロ
滴定プレート（Fa.Nunc）中の懸濁液中で生長する細胞
（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８）（培地：細胞培養
培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH.１０％牛胎
児血清で５００μ）に添加し、恒温保持装置（３７°
CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの吸
引の前にマイクロ滴定プレート上の細胞をで遠心し（マ
イクロ滴定プレート−挿入部を有する遠心機、Fa.Hetti
ch２００ｇ）、次いで、上澄みを注意深く吸引する。細
胞を、ＰＢＳ（３７℃）を用いて、室温で各々２分間３
回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引除去の前に、細胞を、そ
れぞれマイクロ滴定プレートの底部上で遠心すべきであ
る。最後の吸引の後にマイクロ滴定プレートの底板上の
細胞を３７℃で１時間乾燥させ、次いで、１００％メタ
ノール（−２０℃）を用いて、−２０℃で１０分間固定
させる。このメタノールを吸引除去し、細胞を前記のよ
うにＦＢＳで３回洗浄する。検出は蛍光光度計（Fe.Flo
w）を用いて行なう。
０μに、フルオレッセイン−dUTP（ＨＢＳ中１０mg／
ｍ）５μを加え、混合する。この混合物をマイクロ
滴定プレート（Fa.Nunc）中の懸濁液中で生長する細胞
（ＮＳ−１、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ１８）（培地：細胞培養
培地ＤＭＥＭ、Boehringer Mannheim GmbH.１０％牛胎
児血清で５００μ）に添加し、恒温保持装置（３７°
CO2５％）中で２時間インキュベートする。上澄みの吸
引の前にマイクロ滴定プレート上の細胞をで遠心し（マ
イクロ滴定プレート−挿入部を有する遠心機、Fa.Hetti
ch２００ｇ）、次いで、上澄みを注意深く吸引する。細
胞を、ＰＢＳ（３７℃）を用いて、室温で各々２分間３
回洗浄する。洗浄緩衝液の吸引除去の前に、細胞を、そ
れぞれマイクロ滴定プレートの底部上で遠心すべきであ
る。最後の吸引の後にマイクロ滴定プレートの底板上の
細胞を３７℃で１時間乾燥させ、次いで、１００％メタ
ノール（−２０℃）を用いて、−２０℃で１０分間固定
させる。このメタノールを吸引除去し、細胞を前記のよ
うにＦＢＳで３回洗浄する。検出は蛍光光度計（Fe.Flo
w）を用いて行なう。
蛍光標識された細胞は、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activ
ated Cell Sorter）中でも分析できる。この用途のため
に、メタノール固定は省略することができる。
ated Cell Sorter）中でも分析できる。この用途のため
に、メタノール固定は省略することができる。
例１３ ＰＮＡＳ８４（１９８７）７４１３〜７４１７に記載の
方法と同様にして、粘着性細胞内へのジゴキシゲニン−
１１−dUTPの移行 例１により製造したリポソームの溶液（１mg／ｍ）２
０μをＨＢＳで２５０μまで希釈する。ジゴキシゲ
ニン−１１−dUTP（１０mg／ｍ）１０μをＨＢＳで
２５０μまで希釈する。双方の溶液を混合し、血清残
分を除くためにＨＢＳで予め洗浄した細胞（ＣＯＨ）に
添加し、恒温保持装置（３７℃、CO2５％）中で２時間
インキュベートする。次いで、例２と同様に操作する。
方法と同様にして、粘着性細胞内へのジゴキシゲニン−
１１−dUTPの移行 例１により製造したリポソームの溶液（１mg／ｍ）２
０μをＨＢＳで２５０μまで希釈する。ジゴキシゲ
ニン−１１−dUTP（１０mg／ｍ）１０μをＨＢＳで
２５０μまで希釈する。双方の溶液を混合し、血清残
分を除くためにＨＢＳで予め洗浄した細胞（ＣＯＨ）に
添加し、恒温保持装置（３７℃、CO2５％）中で２時間
インキュベートする。次いで、例２と同様に操作する。
蛍光顕微鏡中で、緑色励起（５７２nm）で細胞核の非常
に弱い蛍光が認められる。
に弱い蛍光が認められる。
例１４ 標識されたヌクレオチドを含有するリポソームの製造 １，２−ジオレイル−sn−グリセロ−３−ホスホリルコ
リン５０mgクロロホルム５ｍ中に溶かし、溶剤を、３
０℃で、水浴温度３０℃で、回転蒸発器上で除去する。
引続き、ジゴキシゲニン標識細胞dUTP５mg（再蒸留水２
５ｍ中に溶解）を添加し、１０分間連続的に超音波処
理し、０．２μｍフィルターを通して滅菌する。
リン５０mgクロロホルム５ｍ中に溶かし、溶剤を、３
０℃で、水浴温度３０℃で、回転蒸発器上で除去する。
引続き、ジゴキシゲニン標識細胞dUTP５mg（再蒸留水２
５ｍ中に溶解）を添加し、１０分間連続的に超音波処
理し、０．２μｍフィルターを通して滅菌する。
例１５ 例１４で製造したリポソームを用いる細胞内へのジゴキ
シゲニン−１１−dUTPの転移 例１４で製造したリポソーム３３３μの血清を有する
培養培地（組成は例２と同じ）１６６μを加え、混合
する。この培養培地の吸引の後に、マイクロ滴定プレー
トの使用時には２５０μを、インテグレーテッド・チ
エンバー・スライドの使用時には全混合物を細胞に加え
る。２時間インキュベーション（３７℃、CO2５％）の
後に、他の例と同様に実施する。
シゲニン−１１−dUTPの転移 例１４で製造したリポソーム３３３μの血清を有する
培養培地（組成は例２と同じ）１６６μを加え、混合
する。この培養培地の吸引の後に、マイクロ滴定プレー
トの使用時には２５０μを、インテグレーテッド・チ
エンバー・スライドの使用時には全混合物を細胞に加え
る。２時間インキュベーション（３７℃、CO2５％）の
後に、他の例と同様に実施する。
Claims (1)
- 【請求項１】真核細胞の核酸合成速度を測定する方法に
おいて、リポソームの添加のもとに、ハプテンで誘導体
化されたか又は非放射性標識されたヌクレオチドを細胞
内に入れ、核酸合成速度を、このヌクレオチドの取り込
みに基づきその標識化又は誘導体化を介して測定するこ
とを特徴とする真核細胞の核酸合成速度を測定する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3916595.7 | 1989-05-22 | ||
| DE3916595A DE3916595A1 (de) | 1989-05-22 | 1989-05-22 | Verfahren zur nichtradioaktiven messung der nucleinsaeuresynthese in eukaryontischen zellen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0310699A JPH0310699A (ja) | 1991-01-18 |
| JPH0630624B2 true JPH0630624B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=6381133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2130444A Expired - Fee Related JPH0630624B2 (ja) | 1989-05-22 | 1990-05-22 | 真核細胞の核酸合成速度を測定する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5455157A (ja) |
| EP (1) | EP0399438B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0630624B2 (ja) |
| AT (1) | ATE134707T1 (ja) |
| DE (2) | DE3916595A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1087176C (zh) * | 1993-03-23 | 2002-07-10 | 史密斯克莱·比奇曼生物公司 | 含有3－o脱酰基单磷酰脂a的疫苗制剂 |
| DE4418691A1 (de) * | 1994-05-28 | 1996-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer |
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| WO1997028817A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | Cheng Pi Wan | Receptor ligand-facilitated delivery of biologically active molecules |
| IT1301735B1 (it) * | 1998-06-17 | 2000-07-07 | Armando Carioni | Apparecchiatura termografica. |
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| US6727356B1 (en) | 1999-12-08 | 2004-04-27 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
| DE10049732C2 (de) * | 2000-09-30 | 2003-06-26 | Stiftung A Wegener Inst Polar | Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, Anordnung zur Durchführung und Anwendung des Verfahrens |
| WO2003062462A2 (en) | 2002-01-16 | 2003-07-31 | Dynal Biotech Asa | Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample |
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| WO2005049849A2 (en) | 2003-11-14 | 2005-06-02 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use |
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| EP1816130A4 (en) * | 2004-11-08 | 2012-04-25 | Riken | NOVEL NUCLEOSIDE OR NUCLEOTIDE DERIVATIVE AND USE THEREOF |
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| US9854977B2 (en) | 2006-01-10 | 2018-01-02 | Accuvein, Inc. | Scanned laser vein contrast enhancer using a single laser, and modulation circuitry |
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| US9492117B2 (en) | 2006-01-10 | 2016-11-15 | Accuvein, Inc. | Practitioner-mounted micro vein enhancer |
| US10813588B2 (en) | 2006-01-10 | 2020-10-27 | Accuvein, Inc. | Micro vein enhancer |
| US11253198B2 (en) | 2006-01-10 | 2022-02-22 | Accuvein, Inc. | Stand-mounted scanned laser vein contrast enhancer |
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| US10238294B2 (en) | 2006-06-29 | 2019-03-26 | Accuvein, Inc. | Scanned laser vein contrast enhancer using one laser |
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| US20120108799A1 (en) | 2010-09-07 | 2012-05-03 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for Antisense Compounds |
| AU2011230496B2 (en) | 2010-03-26 | 2015-09-17 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for enhancing nucleic acid hybridization |
| US9506057B2 (en) | 2010-03-26 | 2016-11-29 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for antisense compounds |
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| US10376147B2 (en) | 2012-12-05 | 2019-08-13 | AccuVeiw, Inc. | System and method for multi-color laser imaging and ablation of cancer cells using fluorescence |
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| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
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1989
- 1989-05-22 DE DE3916595A patent/DE3916595A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-05-21 EP EP90109611A patent/EP0399438B1/de not_active Expired - Lifetime
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