JPH06288921A - 核酸の塩基配列決定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 塩基配列決定装置で、高速動作を可能にし、
操作も容易にする。 【構成】 レーザ３６からのレーザ光が集光レンズ３８
で集光され、反射鏡４２−１で反射されて泳動ゲル３０
へ入射し第１の泳動レーンの位置ＸＡを照射する。位置
ＸＡを透過してきたレーザ光３８は反射鏡４２−２で反
射されて再び泳動ゲル３０へ入射し、第２の泳動レーン
の位置ＸＧを照射する。このように、レーザ光３８は泳
動方向と直交する直線上の泳動レーン位置を順次照射し
ていく。各泳動レーンでレーザ光３８により照射された
点からのＤＮＡ断片試料の螢光ラベルが発する螢光を検
出するために、各泳動レーンごとに受光光学系が配置さ
れている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡの塩基配列を決定
する装置に関し、特に、予め螢光物質でラベルされたＤ
ＮＡ断片試料が末端塩基別に泳動ゲルの一端に投入さ
れ、泳動電圧の印加により泳動中に分離されたＤＮＡ断
片試料を、レーザ励起螢光検出法によって泳動中に検出
し、リアルタイムでＤＮＡの塩基配列を自動決定する装
置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】螢光ラベルしたＤＮＡ断片試料とは、プ
ライマー部又はダイデオキシ部に螢光ラベルし、サンガ
ーの方法で調整したＤＮＡ断片群試料であり、この螢光
ラベルしたＤＮＡ断片試料をゲル電気泳動して得られる
展開パターンはそのままＤＮＡの塩基配列を与える。

【０００３】ＤＮＡ塩基配列決定装置でレーザでＤＮＡ
断片試料を励起し、その螢光を検出する方式としては、
次の２種類が知られている。その第１は走査光学系方式
であり、図１に概略的に示されるものである（特開昭６
３−３１３０３５号公報参照）。図１では、ガラス板に
挾まれた泳動ゲル２の一端に螢光ラベルされたＤＮＡ断
片試料が末端塩基Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ
（シトシン）及びＴ（チミン）別に投入され、泳動電圧
が印加されることによって矢印で示される方向に電気泳
動する。２８はＤＮＡ泳動バンドである。泳動方向と直
交する走査方向に励起光学系と受光光学系とを走査する
ために、走査ステージ４が設けられ、この走査ステージ
４はガイドレール（図示略）によって泳動方向と直交す
る方向に案内され、モータ６で駆動される棒ネジ８の回
転によって走査方向に走査される。走査ステージ４上に
は励起光源のレーザ１０からのレーザ光（励起光）を集
光するレンズ１２及び偏向して泳動ゲル２へ入射させる
偏向ミラー１４が配置されており、また走査ステージ４
上には励起光で照射されたゲルからのＤＮＡ断片試料に
よる螢光を受光するために、対物レンズ１６、干渉フィ
ルタ１８、集光レンズ２０及び光電子増倍管２２が配置
されている。２４は光電子増倍管２２の検出信号をデジ
タル信号に変換するＡ／Ｄ変換器、２６は走査ステージ
４の走査を制御するとともに、Ａ／Ｄ変換器２４を介し
て取り込んだ検出信号から塩基配列を決定するコンピュ
ータである。図１ではステージ４を走査することによ
り、泳動してくるＤＮＡ泳動バンド２８を次々に検出し
ていく。

【０００４】レーザ励起螢光検出法の第２の方式は、図
２に概略的に示されるゲル側面入射方式である（特開昭
６１−６２８４３号公報参照）。図２ではレーザ１０か
らのレーザ光を集光レンズ１２で集光して泳動ゲル２の
側面から入射させ、泳動ゲル２の方線方向には泳動レー
ンごとに受光光学系を配置している。各受光光学系には
対物レンズ１６−１，……、干渉フィルタ１８−１，…
…、集光レンズ２０−１，……、光電子増倍管２２−
１，……が一組ずつ配置されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】図１に示される走査光
学系方式は、機械的な走査を含むので、耐久性に問題が
あり、また、速く泳動させると信号の受信が不可能とな
る。図２のゲル側面入射方式は機械的な走査部を含まな
いので原理的には高速泳動にも対応が可能である。しか
し、泳動ゲル２へのレーザ光入射部（図２のＸ部分）に
ゲルの気泡が存在しないようにし、かつ液もれも発生し
ないようにするなどの対策に格段の注意が必要となる。
さらに、レーザ光を細く絞った状態で泳動ゲル２中を通
す必要があるため、薄い泳動ゲルには適用することがで
きない。これは、泳動ゲル２が薄くなるとレーザ光が拡
がり、ガラスの方がゲルより屈折率が高いため大部分の
光がガラス中に入ってしまうからである。また泳動ゲル
２が薄くなると泳動バンド２８の解像度が低下するため
でもある。そこで、本発明は図１のような走査光学系方
式の機械的走査による問題を解決し、図２のゲル側面入
射方式の欠点も除いて、高速動作が可能で操作も容易な
塩基配列決定装置を提供することを目的とするものであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明では励起光のレー
ザ光を泳動ゲルの面に対して斜め方向から入射させ、泳
動ゲルを透過した励起光を反射させて再び泳動ゲルに入
射させることを繰り返すことにより、１つのレーザ光で
複数の泳動レーンを順次照射していく。そのため、本発
明の塩基配列決定装置は、平板状泳動ゲルの一端に螢光
ラベルされたＤＮＡ断片試料が末端塩基別に投入され、
泳動ゲルの両端間に泳動電圧が印加されて前記ＤＮＡ断
片試料が泳動しながら分離されていくゲル電気泳動装置
と、泳動ゲルでの試料の泳動方向及び泳動ゲル面と直交
する平面内で、泳動ゲルの面に対して傾斜し、泳動ゲル
の一側部の第１の泳動レーン位置から泳動ゲルの内側方
向に励起光を入射させる励起光学系と、泳動ゲルの表面
側と裏面側とに反射鏡を有し、前記第１の泳動レーン位
置の泳動ゲルを透過した励起光を隣りの第２の泳動レー
ン位置の泳動ゲルへ入射させ、その第２の泳動レーン位
置の泳動ゲルを透過した励起光をさらにその隣りの第３
の泳動レーン位置の泳動ゲルへ入射させるというよう
に、隣りの泳動レーン位置の泳動ゲルへ順次励起光を入
射させるように前記表面側と裏面側の反射鏡で交互に励
起光を反射させる反射鏡群と、各泳動レーンの励起光入
射位置ごとに泳動ゲルに対向して配置され、ＤＮＡ断片
試料にラベルされた螢光物質からの螢光を受光する受光
光学系と、を備えている。

【０００７】

【実施例】一実施例を図３から図５により説明する。泳
動ゲル３０は例えば６％ポリアクリルアミドにてなり、
例えば、厚さが５ｍｍのパイレックスガラス板３２，３
４に挾まれて例えば０．３５ｍｍの厚さに形成され、垂
直方向に立てられている。泳動ゲル３０には螢光ラベル
されたＤＮＡ断片試料が泳動ゲル３０の上端に末端塩基
Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ別に投入され、泳動ゲル３０の上下両端
間に泳動電圧が印加されることによって泳動ゲル３０の
上から下方向に向かって電気泳動される。ＤＮＡ断片試
料は例えば螢光物質ＦＩＴＣでラベルされたものであ
り、その螢光物質は４８８ｎｍのアルゴンレーザ光で励
起されると５２０ｎｍの螢光を発する。

【０００８】励起光源としてアルゴンレーザ３６が設け
られ、レーザ３６からのレーザ光が集光レンズ３８で集
光され、泳動ゲル３０の表面側（レーザ３６のある側を
表面側とし、その反対側を裏面側とする）にある第１の
反射鏡４２−１で反射されて泳動ゲル３０へ入射する。
レーザ光３８の入射方向は、泳動方向及び泳動ゲル３０
の面と直交する平面内にあり、泳動ゲルの３０の表面に
対して傾斜している。レーザ光３８が反射鏡４２−１で
反射されて入射する位置は泳動ゲルの３０の一側部にあ
る第１の泳動レーンの位置（図４ではＸＡ）であり、そ
の位置から泳動ゲルの３０の内側方向に向くように入射
方向が傾斜している。泳動ゲル３０の裏面側には第２の
反射鏡４２−２が配置されており、この反射鏡４２−２
は泳動ゲルの３０の第１の泳動レーンの位置ＸＡを透過
してきたレーザ光３８を反射させて第２の泳動レーン位
置（図４ではＸＧ）の泳動ゲルへ入射させるようのに設
定されている。位置ＸＧの泳動ゲルを透過して泳動ゲル
の３０の表面側へ出てきたレーザ光３８を再び反射させ
て第３の泳動レーン（図４ではＸＣ）の位置の泳動ゲル
のへ入射させるために、泳動ゲルの３０の表面側には第
３の反射鏡４２−３が配置されている。このように、泳
動ゲルの３０を透過したレーザ光３８を多重反射させて
泳動方向と直交する直線上の泳動レーン位置を順次照射
するように、泳動ゲル３０の両側に反射鏡４２−１，４
２−２，４２−３，４２−４，……が配置されている。

【０００９】各泳動レーンでレーザ光３８により照射さ
れた点からのＤＮＡ断片試料の螢光ラベルが発する螢光
を検出するために、各泳動レーンごとに対物レンズ４４
−１，……、５２０ｎｍの光を透過させる干渉フィルタ
４６−１，……、集光レンズ４８−１，……及び光電子
増倍管５０−１，……の１つずつの組を含む受光光学系
が配置されている。各光電子増倍管５０−１，……の検
出出力はデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器５２を介
してコンピュータ５４へ取り込まれる。

【００１０】反射鏡４２−１，４２−２，……で多重反
射されたレーザ光３８が照射する泳動ゲル３０の位置が
受光光学系の光軸上にくるように光軸合わせを行なうた
めに、図５に示されるように、各反射鏡４２−１，４２
−２，……には反射鏡を泳動ゲルの３０の方向に平行移
動させる移動機構６０がそれぞれ設けられている。移動
機構６０はコンピュータ５４により制御されたモータに
より駆動されて反射鏡を泳動ゲル３０の方向に近づけた
り遠ざけたりする。

【００１１】図５の光軸合わせ機構の動作を説明する。
光軸合わせは試料の泳動前に泳動ゲル３０を設置した段
階で行なう。コンピュータ５４で光電子増倍管５０の出
力をモニタしながら、移動機構６０のモータを作動さ
せ、レーザ光３８がＡ→Ｂ→Ｃと移動するように反射鏡
４２を平行移動させる。

【００１２】ゲル３０を挾んでいるガラス板３２，３４
がパイレックスガラス（実施例）や石英ガラスのように
無螢光性ガラス板である場合には、反射鏡４２が平行移
動してレーザ光３８がＡ→Ｂ→Ｃと移動するにつれて、
光電子増倍管５０の出力は図６（Ａ）のように変化し、
そのピーク位置（Ｂ点）は受光光学系の光軸上の泳動ゲ
ル３０ルをレーザ光３８が透過した位置である。したが
って、このＢ点が検出されるように反射鏡４２を位置決
めすると光電子増倍管５０を含む受光光学系の光軸が調
整される。

【００１３】一方、ガラス板３２，３４がソーダーガラ
スのように螢光性ガラスである場合には、光電子増倍管
５０の入射側に螢光の入射を制限するマスク５６又はピ
ンホールが必要である。ガラス板が無蛍光性ガラス板の
場合にはこのマスク５６やピンポールは必ずしも必要で
はない。ガラス板が螢光性ガラスの場合、コンピュータ
５４によって移動機構６０を作動させレーザ光３８をＡ
→Ｂ→Ｃのように移動させると、光電子増倍管５０の視
野にはガラスからの螢光→ゲルからの蛍光→ガラスから
の螢光が入り、図６（Ｂ）の信号が得られて、ちょうど
泳動ゲルの３０に焦点が合ったときに信号が谷となる
る。この場合もＢ点の位置で反射鏡４２を固定する。こ
こでは、１つの反射鏡と１組の受光光学系を例として示
しているが、全ての反射鏡とその反射鏡により泳動ゲル
の３０に入射させられるレーザ光３８が照射する泳動レ
ーンに対応した各受光光学系についてこのように光学軸
が調整される。

【００１４】図７は泳動ゲル３０の両側に設けられた反
射鏡に集光手段を設けた例を表わしたものである。集光
手段は反射鏡４２の反射面に凸レンズ６０を設けたり、
反射鏡を凹面鏡４２ａに変えることによって実現するこ
とができる。集光手段を設けることによって、レーザ光
３８が拡がるのを防ぎ、レーザ光３８の反射を繰り返し
ても泳動バンドの解像度が落ちたり、また信号強度自体
が落ちたりしないように改良される。

【００１５】次に、図３から図５に示された実施例の動
作について説明する。図５の移動機構６０によって、泳
動前に受光光学系の光軸が調整されているものとする。
サンガー反応によって前処理されたＤＮＡ断片試料が図
３の上部から泳動してくる。この泳動してくる場所が、
例えば図４のＸＡ，ＸＧ，ＸＣ，ＸＴのところになるよ
うに予め泳動レーンが設定されている。

【００１６】アルゴンレーザ３６から発信された４８８
ｎｍのレーザ光は、集光レンズ４０でいったん集光され
た後、反射鏡４２−１によって反射され、泳動ゲル３０
のＸＡ部分を照射する。レーザ光３８はＸＡ点を照射
後、泳動ゲル３０の裏面側に透過して反射鏡４２−２で
反射され、再び泳動ゲル３０に入射してＸＧ位置を照射
する。このように、レーザ光３８はＸＡ，ＸＧ，……と
順次泳動ゲル３０上の多数の点を照射していく。レーザ
光３８で照射された点にはそれぞれ受光光学系が配置さ
れているので、レーザ光３８で照射された各点からの蛍
光信号出力がコンピュータ５４に取り込まれていく。

【００１７】いま、ＸＡ点にＡ末端のＤＮＡ断片が泳動
してくると、そのＤＮＡ断片にラベルされた螢光体が螢
光を発するので、光電子増倍管５０−１に信号を与え
る。同様にＸＧの位置ではＧ末端のＤＮＡ断片、ＸＣの
位置ではＣ末端のＤＮＡ断片、ＸＴの位置ではＴ末端の
ＤＮＡ断片がそれぞれの受光光学系で検出される。コン
ピュータ５４で各ＤＮＡ断片の出現パターンが解析され
ることによって、最終的にＤＮＡの塩基配列が決定され
る。

【００１８】

【発明の効果】本発明では泳動ゲルに斜め方向からレー
ザ光を励起光として入射させ、複数の泳動レーンを同時
に照射し、各泳動レーンの照射位置で受光光学系により
蛍光を受講するようにしたので、走査機構を備えた従来
の方式の装置に比べる機械的走査を必要としないので高
速泳動に対応できる。また、従来のゲル側面入射方式に
比べると、泳動ゲルによる励起光の散乱を防ぐことがで
き、泳動ゲルの状態（泡や濃度、実験ミス）によって励
起光が泳動ゲルの端まで到達できなくなるというような
問題もなくなる。また、本発明では励起光の光路の途中
に集光手段を配置することができるので、その場合には
励起光の強度が弱くなるのを抑えることができる。ま
た、本発明では泳動ゲルを必ずしもガラス板に挾み込ま
なくてもよく、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法と同様の
ゲル作成法で作成することもでき、ゲルの作成が容易に
なる。

【図面の簡単な説明】

【図１】機械的走査方式による従来の装置を示す概略斜
視図である。

【図２】ゲル側面入射方式による従来の装置を示す概略
斜視図である。

【図３】一実施例を示す概略斜視図である。

【図４】同実施例の上面図である。

【図５】同実施例における一組の受光光学系調整機構を
示す上面図である。

【図６】受光光学系光軸調整機構の動作を示す図であ
り、（Ａ）はガラス板が無螢光ガラス板の場合、（Ｂ）
はガラス板が螢光性ガラス板の場合である。

【図７】好ましい実施例における集光手段を備えた反射
鏡を示す上面図である。

【符号の説明】

３０ 泳動ゲル ３２，３４ ガラス板 ３６ アルゴンレーザ ３８ レーザ光 ４０ 集光レンズ ４２，４２−１，４２−２，…… 反射鏡 ４４，４４−１，４４−２，…… 対物レンズ ４６，４６−１，４６−２，…… 干渉フィルタ ４８，４８−１，４８−２，…… 集光レンズ ５０，５０−１，５０−２，…… 光電子増倍管 ５４ コンピュータ ６０ 反射鏡移動機構 ６２ 凸レンズ ４２ａ 凹面鏡

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 平板状泳動ゲルの一端に螢光ラベルされ
   たＤＮＡ断片試料が末端塩基別に投入され、泳動ゲルの
   両端間に泳動電圧が印加されて前記ＤＮＡ断片試料が泳
   動しながら分離されていくゲル電気泳動装置と、 泳動ゲルでの試料の泳動方向及び泳動ゲル面と直交する
   平面内で、泳動ゲルの面に対して傾斜し、泳動ゲルの一
   側部の第１の泳動レーン位置から泳動ゲルの内側方向に
   励起光を入射させる励起光学系と、 泳動ゲルの表面側と裏面側とに反射鏡を有し、前記第１
   の泳動レーン位置の泳動ゲルを透過した励起光を隣りの
   第２の泳動レーン位置の泳動ゲルへ入射させ、その第２
   の泳動レーン位置の泳動ゲルを透過した励起光をさらに
   その隣りの第３の泳動レーン位置の泳動ゲルへ入射させ
   るというように、隣りの泳動レーン位置の泳動ゲルへ順
   次励起光を入射させるように前記表面側と裏面側の反射
   鏡で交互に励起光を反射させる反射鏡群と、 各泳動レーンの励起光入射位置ごとに泳動ゲルに対向し
   て配置され、ＤＮＡ断片試料にラベルされた螢光物質か
   らの螢光を受光する受光光学系と、を備えたことを特徴
   とする核酸の塩基配列決定装置。