JPH06279451A - ハリスタチン１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 新しい抗がん剤の原料としての海産生物を長
年にわたり鋭意探索したところ、西インド洋の海綿Ｐｈ
ｋｅｌｌｉａ ｃａｒｔｅｒｉからの新規なハリピラン
型のポリエーテルマクロライドであるハリスタチン１を
単離し、主としてハイフィールドＮＭＲと質量スペクト
ルによりその構造を決定した。 【作用】 ハリスタチン１は８．８×１０^−７％の収率
で得られ、このものは有糸分裂で阻止された細胞蓄積を
ひきおこし、チューブリンの重合を阻害し、そして放射
能ラベルしたビンブラスチンとＧＴＰのチューブリンへ
の結合を阻害した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトにがんを生起させ
るとして国立がん研究所（ＮＣＩ）で認定された種々の
細胞系の生長を阻害することが見出された新規化合物に
関するものであり、更に詳しくは、Ｐｈａｋｅｌｌｉａ
ｃａｒｔｅｒｉから始めて単離され「ハリスタチン
１」（Ｈａｌｉｓｔａｔｉｎ１）と命名された新規のポ
リエーテルマクロライド抗有糸分裂物質に関するもので
ある。ハリスタチン１は有糸分裂で阻止された細胞の蓄
積をひきおこし、チューブリンの重合を阻止し、放射能
ラベルしたビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）
とＧＴＰのチューブリンへの結合を阻止し、ＮＣＩプロ
トコールを用いてのＮＣＩのＰ３８８細胞系に対し４×
１０^−４μｇ／ｍｌのＥＤ_５０値を示し、そしてＮＣＩ
ヒトがん細胞系に対して有効であることが見出された。

【０００２】

【従来の技術；発明が解決しようとする課題】コケムシ
綱、軟体動物門及び海綿動物の門に属する昔の水産の無
脊椎動物の多くは何十億年もの昔から地球上の海中にい
た。それらは今日のレベルの細胞機能、組織及び防御に
達するまでには、その進化の化学のなかで莫な生合成反
応を行ってきたであろう。海産のスポンジ類は約５億年
のあいだその外観は殆ど変っていないが、これは少くと
もその間は外的条件の変化に応じての極めて有効な化学
的進化のあったことを示唆する。生物学的に活性な水産
動物成分の利用についての潜在力の認識は、紀元前、２
７００年にエジプトで記録されている。そして紀元年２
００年までに、ウミアラシの抽出物が医療用にギリシャ
で使用されていた。海産生物（とくに無脊椎動物やサ
メ）が殆どがんを発達させないという一般的観察と共
に、上記の考えは海産動物や植物の抗がん成分の最初の
系統的研究へと導くものであった。

【０００３】１９６８年までに、アメリカの国立がん研
究所（ＮＣＩ）の実験的がん系に基いて、ある種の水産
生物は新しくて構造的に新規の抗新生物及び／又は細胞
毒的物質をもつという十分な証明を得た。同様な検討
は、水産生物はまた、たとえばウイルス性疾患のような
重篤な医学的チャレンジのための効果的な新しい医薬を
も提供することを示唆した。さらに、水産生物は当時の
医化学技術の発見を逃れるような、前例のない構造タイ
プの有用な医薬の候補（及び生化学的プローブ）を含有
していると期待された。幸にもこれらの期待はそのうち
に現実のものとなった。その成功例はアリゾナ州のテン
プのがん研究所によるブリオスタチン、ドラスケン及び
セファロスタチンの発見であり、これらの系統の数種の
すぐれた抗がん剤の候補品が、今やヒトによる臨床試験
又は前臨床段階にある、アメリカ特許４８１６４４４，
４８３３２５７，４８７３２４５及び４８７９２７８参
照。

【０００４】医学の研究に現在従事している人に公知の
ように、新しい化合物の親からその市販までは最短で少
くとも数年を要し、幾つもの関門を必要とする。したが
って、政府と関連して、産業界は２つの目的のための多
くの試験を考案した。一つの目的は、化合物の特性が、
更なる投資として経済的に逆効果になるような化合物を
なくすることである。第２の、そしてもっと重要な目的
は、法規制をクリアし上市可能となるような化合物を見
出すことである。

【０００５】現在、そのデータを得るには一化合物につ
いて１千万ドルもの費用を必要とする。経済性の面から
は、それが回収可能である時にのみ投資すべきである。
このようなチャンスは特許の保護によって成さるべき
で、それがよい時は投資に行われず、生命保険の薬剤の
進歩は停止するであろう。

【０００６】僅か２００年以前に、多くの病気が人類を
破滅した。その病気の多くは制御され一掃された。その
開発過程では適切な実験動物が極めて重要であった。い
ろんなタイプのがんやＨＩＶウイルスでは現在そのよう
な研究が進行中である。いろんながんの治療研究に、政
府機関たるＮＣＩが主催し抗がん研究を助けている。あ
る化合物が抗がん活性をもつかどうかについて、ＮＣＩ
が開発した多くのプロトコールがある。そのひとつは６
０種のヒト腫瘍細胞系を含む細胞系パネルに対するテス
トから成る。このプロトコールは実証され学界で受け入
れられている。このプロトコールと、そこから得た統計
的評価法は文献に記載がある。すなわち、テストプロト
コールの詳細はＭｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｂｏｙｄ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃ
ｏｌｏｇｙ，（ＰＰＯ最新版），Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１
０（１９８９年１０月）を参照。また統計的分析は次の
文献に説明がある。“ヒト腫瘍細胞系に対する医薬の特
異活性のパターンの分析と展示：平均グラフとＣＯＭＰ
ＡＲＥアルゴリズムの光度”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆｔｈ
ｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ，Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．１４，
ｐ．１０８８（１９８９年７月１４日）（著者はＫ．
Ｄ．Ｐａｕｌｌほか）これら両文献はこの参照により本
明細書の一部を成すものである。

【０００７】過去２０年にわたる熱心な努力の大きな部
分は、海産海綿の抗新生物及び／又は細胞毒性の生合成
生産物に向けられてきた。以下の記載は新規で強力な細
胞毒性のマクロライドで、ハリスタチン１と称される物
質の単離と構造決定に関する報告である。

【０００８】

【課題を解決するための手段；作用】新規の抗がん剤の
原料としての海産生物の熱心な長期の研究は、西インド
洋の海綿であるＰｈａｋｅｌｌｉａ ｃａｒｔｅｒｉか
らの新規なハリピラン型のポリエーテルマクロライドで
あるハリスタチン１の単離と構造決定（主にハイフィー
ルドのＮＭＲと質量スペクトルによる）をもたらした。
その構造は後記する。ハリスタチン１（収量は８．８×
１０^−７％）は有糸分裂で阻止された細胞の蓄積をひき
おこし、チューブリンの重合を阻害し、放射能ラベルし
たビンブラスチンとＧＴＰのチューブリンへの結合を阻
害し、そしてＰ３８８細胞系に対し４×１０^−４μｇ／
ｍｌのＥＤ_５０値を示す。

【０００９】従って本発明の主目的に、抗有糸分裂作用
をもち、ハリスタチン１と命名される新規なポリエーテ
ルマクロライドの単離に関するものである。もうひとつ
の目的はハリスタチン１と称する物質の構造決定であ
る。

【００１０】ハリスタチン１の構造は下記のようであ
る。

【化１】

【００１１】

【実施例】オレンジ色の海綿Ｐ．ｃａｒｔｅｒｉの１９
８７年の採集物（湿量２５０ｋｇ）をメタノール中で保
存する。１９８９年に液相を除き、ジクロロメタン次い
で水で稀釈するジクロロメタン分画を、まずヘキサンと
メタノール−水（９：１）間で分配し、次いでジクロロ
メタンとメタノール−水（３：２）間で分配して分離す
る。細胞静止活性はジクロロメタン分画にある（ＥＤ
_５０ ０．２２μｇ／ｍｌ；チャート１）。次いでこの
ＰＳ細胞系に活性のジクロロメタン分画を、一連のゲル
透過（メタノール）及び分配カラムクロマトグラフィー
（セファデックスＬＨ−２０使用）で分離し、次の要領
でＲＰ−８逆相シリカゲル上でＨＰＬＣを行う。

【００１２】バイオアッセイで導かれる（ＰＳ）セファ
デックスＬＨ−２０カラムクロマトによる生物活性のジ
クロロメタン分画の分離（チャート１−２）は、まずゲ
ル透過（メタノール）で始め、次いで分配（３：２のジ
クロロメタン−メタノール及び３：１：１のヘキサン−
トルエン−メタノール）で行う。あとのクロマトグラム
から３つのＰＳ活性分画（Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ）が得ら
れる（チャート１参照）。フラクションＩＩＩ（２．５
ｇ，ＥＤ_５０ ０．０３μｇ／ｍｌ）をセファデックス
ＬＨ−２０カラム上で、ヘキサン−２−プロパノール−
メタノール（８：１：１）、ヘキサン−酢酸エチル−メ
タノール（９：２：１）及びヘプタン−クロロホルム−
エタノール（７：４：１）を溶離液として用いて３度分
離し（チャート１参照）、ＰＳ ＥＤ_５０ ０．００２
９μｇ／ｍｌのフラクションＣ４（１０ｍｇ）を得る。
このフラクションＣ４を更に分離するために、メタノー
ル−アセトニトリル−水（５：５：６）での逆相シリカ
ゲルＨＰＬＣを行い屈折率で検出する。主成分はシャー
プなピークを示し、ハリスタチン１と称される（２ｍ
ｇ；収率８．８×１０^−７％）。

【００１３】ハリスタチン１の構造決定は、主として２
Ｄ ＮＭＲ（表１）と質量スペクトル分析で行なった。
分子式Ｃ_６０Ｈ_８６Ｏ_２０は、１１４９．５６２１〔Ｍ
＋Ｎａ〕で分子イオンピークの分子量として１１２６で
ある高解像質量分光分析で定められた、Ｃ_６０Ｈ_８６Ｏ
_２０Ｎａとしての理論値は１１４９．５６３２である。
ＩＲスペクトルは１７３６ｃｍ^−１にカルボニルの吸
収、１６５３ｃｍ^−１（シャープで弱い）に非共役二重
結合、そして１１８６，１０８０及び１０１８ｃｍ^−１
（強に）にエーテルの吸収を示す。^１Ｈ−ＮＭＲ，^１Ｈ
−^１Ｈ−ＣＯＳＹ，ＡＰＴ，ＨＭＱＣ及び^１３Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルによる広範囲の分析は、４コのメチル基
（δ０．９６／１８．１５；１．０１／１８．３５；
１．０５／１５．８４；１．０９／１８．４２）、１９
コのメチレン（ひとつはδ３．５２，３．４５／６７．
２０で酸素に直接ついている）、２８コのメチレン（２
４コは酸素に結合）、２コのビニリデン単位（δ５．０
７，５．０１／１０５．７０；４．８７，４．８１／１
０４．８０；１５３．３３；１５３．２２）、４コの４
級炭素及び１コのカルボニルの存在を示す。これらの解
決は、ハリコンドリン系を想起させるところのポリエー
テルマクロライド骨格集団を示唆する。ここにハリスタ
チン１と命名される化合物の構造は次のようである。

【００１４】

【化１】

【００１５】ハリスタチン１の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
はハリコンドリンＢのそれと外面的に類似している。ハ
リスタチン１の^１Ｈ−^１Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルにおい
てδ４．７４（トリプレット，Ｊ＝４．６Ｈｚ）のシグ
ナルは、δ４．２５（広いダブレット，Ｊ＝４．４Ｈ
ｚ）でのシグナル及びδ１．９６（ダブレットのダブレ
ット，Ｊ＝１３．３，４．６Ｈｚ）のアップフィールド
シグナルとのカップリングを立証する（表１）。後者の
シグナルは、δ２．１２（広汎なダブレット，Ｊ＝１３
Ｈｚ）におけるもうひとつのアップフィールドシグナル
との強いカップリングを示す。化学シフト、カップリン
グの態様及びカップリング定数から、δ４．７４のシグ
ナルはＨ−１２そしてδ１．９６と２．１２のシグナル
はＨ−１３に帰せられる。ＣＯＳＹスペクトルにおいて
δ４．２５及びδ３．７５（ダブレットのダブレット，
Ｊ＝４．３，１．５Ｈｚ）のシグナルのカップリング態
様と化学シフトは、Ｃ−１０プロトンの欠除を示してい
る。そのような分析は、ヘミケタールに帰せられる新し
い４級炭素シグナルがδ１０３．７５に認められる^１３
Ｃ−ＮＭＲスペクトルによって支持される。Ｃ−１０に
おけるヘミケタール基と一致して、Ｃ−９とＣ−１１の
シグナルは下方フィールドにシフトされる（δ６．５ｐ
ｐｍ及び３．８ｐｐｍ）。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでＨ
−９とＨ−１１のシグナルはそれぞれ０．４ｐｐｍ及び
０．３５ｐｐｍの上方フィールドシフトを示す。他の原
子の^１Ｈ−及び^１３Ｃ−ＮＭＲシグナルは、ハリコンド
リンＢのそれと本質的に同じであるＨ−１１はＨ−９
（δ３．７５）及び２コのＨ−１３（δ２．１２）プロ
トンのひとつとの小さい結合を示す（Ｗ−カップリング
によって説明される）。実のところドライディング分子
モデルは、Ｈ−１１とＨ−１３プロトンのひとつとの間
と同じように、Ｗ−カップリングはＨ−１１とＨ−９の
間に存在することを示す。５００ＨＭｚに記録されるＨ
ＭＢＣスペクトルもまた、ハリスタチン１に与えた構造
を強く支持する。δ１０３．７５（Ｃ−１０）の^１３Ｃ
シグナルは、δ３．７５（Ｈ−９），４．２５（Ｈ−１
１），４．２３（Ｈ−８）及び４．７４（Ｈ−１２）の
^１Ｈシグナルとの相関を示す。δ８７．６４（Ｃ−１
１）の^１３Ｃシグナルは、δ３．７５（Ｈ−９），２．
１２（Ｈ−１３）及び４．７４（Ｈ−１２）のクロスピ
ークを示す。さらにδ１１０．８３（Ｃ−１４）の^１３
Ｃシグナルは、４．２５（Ｈ−１１），４．７４（Ｈ−
１２），１．９６及び２．１２（Ｈ−１３）及びδ４．
２３（Ｈ−８）でクロスピークを示す。他のクロスピー
クは提案の構造と一致する（詳細は表１参照）。^１Ｈシ
グナルの重大な重なりによる各々のメチレンシグナルを
与えるに、何の試みもされなかった。ただしδ５０〜２
８ｐｐｍ領域の１８コのメチレンの^１３Ｃシグナルが認
められた。ハリスタチン１の不●中心はハリコンドリン
Ｂのそれと同一と思われる。光学旋光は似ており〔α〕
_Ｄ＝−５８．１４°（ウエムラほかのＰｕｒｅ Ａｐｐ
ｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，５８巻，７０１−７１０によ
るハリコンドリンＢのそれは−５８．９°）である。ド
ライディング分子モデルによればそのような結合環系で
はβ−水酸基は立体的に不可能であることを示すので、
Ｃ−１０の水酸基にα−配位とアサインされ、ハリスタ
チン１の構造決定は完結する。逆にこれらすべてのアサ
インメントは、ノルハリコンドリン誘導体のＸ線結晶構
造決定に基いている。ハリコンドリンについての増大す
る重要性と多出現性の故に、非置換環系（Ａ）に対して
ハリピランという名称がアサインされた。

【００１６】Ｌ１２１０ネズミ白血病細胞に対してハリ
スタチン１とハリコンドリンＢは類似の細胞毒性（ＩＣ
_５０はそれぞれ０．５及び２ｎＭ）を示し、両者は細胞
毒濃度において有糸分裂係数で著しい上昇を示し、ハリ
スタチン１の場合は２１％という高い値に達する。グル
タメートで誘発される純チューブリンの重合（Ｂａｉほ
か、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９９１年，２６６
巻、１５８８２−１５８８９参照）において、ハリスタ
チン１はハリコンドリンＢよりも更に少し活性である
（それぞれのＩＣ_５０は４．６^＋〜０．４及び４．９^＋
〜０．５μＭ）。ハリコンドリンＢはチューブリンに対
する、放射能ラベルしたビンブラスチンの結合の非競合
的阻害剤であって、チューブリンに対するヌクレオチド
交換を阻害することがわかった。ハリスタチン１とハリ
コンドリンＢを比べると、ビンブラスチン結合の阻害剤
としてハリスタチン１はハリコンドリンＢに比肩しうる
活性があり、またハリスタチン１はヌクレオチド交換の
阻害剤として優れていることがわかった。２つの薬物を
５及び１０μＭで比べると、ハリスタチン１は放射能ラ
ベルしたビンブラスチンの結合をそれぞれ５７％及び７
３％阻害し、一方それはハリコンドリンＢの場合は５１
％及び７３％である。チューブリンに対しての放射能ラ
ベルＧＴＰの結合について、薬物の同濃度のものはハリ
スタチン１の場合は１２％及び３７％、ハリコンドリン
Ｂの場合は１４％と１８％の阻害を示した。ハリコンド
リンＢについて以前に得られている比較値は、今回得ら
れたものと著しい差はない。合衆国のＮＣＩのインビト
ロの一次スクリーニング（次を参照せよ。Ｍ．Ｒ．Ｂｏ
ｙｄ，ＮＣＩ前臨床抗腫瘍薬発見スクリーニングの状
態：臨床試験用の新しい検体選択のためのヒント。ガン
の場合：「現在の腫瘍学の原理と実際」第３巻，第１０
号；Ｖ．Ｔ．ｄｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｓ．Ｈｅｌｌｍａ
ｎ；Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ編；Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ：フィラデルフィア，１９８９，ｐｐ１−
１２；Ａ．Ｍｏｎｋｓ；Ｄ．Ｓｃｕｄｉｅｒｏ；Ｐ．Ｓ
ｋｅｈａｎ；Ｒ．ｓｈｏｅｍａｋｅｒ；Ｋ．Ｐａｕｌ
ｌ；Ｄ．Ｖｉｓｔｉｃａ；Ｃ．Ｈｏｓｅ；Ｊ．Ｌａｎｇ
ｌｅｙ；Ｐ．Ｃｒｏｎｉｓｅ；Ａ．Ｖａｉｇｒｏ−Ｗｏ
ｌｆｆ；Ｍ．Ｇｒａｙ−Ｇｏｏｄｒｉｃｈ；Ｈ．Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌ；Ｍ．Ｂｏｙｄ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．１９９１年，８３巻，７５７−７６６；
Ｍ．Ｒ．Ｂｏｙｄ；Ｋ．Ｄ．；Ｌ．Ｒ．Ｒｕｂｉｎｓ
ｔｅｉｎ，ＮＣＩ疾患によるインビトロ抗腫瘍剤スクリ
ーニングのためのデータ提示と分析の戦略。抗腫瘍薬の
発見と開発については；Ｆ．Ａ．Ｖａｌｅｒｉｏｔｅ；
Ｔ．Ｃｏｒｂｅｔｔ；Ｌ．Ｂａｋｅｒ編；Ｋｌｕｗｅｒ
アカデミックパプリッシャーズ：アムステルダム，１９
９１年，１１−３４ページ）によれば、ハリスタチン１
は、強度に特徴的でありかつハリコンドリンに匹敵する
活性をもつところのすぐれた細胞生成阻害のパターンを
示す。電算機によるパターン認識分折は、ハリスタチン
１及びハリコンドリンＢとホモハリコンドリンＢの平均
グラフプロファイルは、すべて相互に大いに相関々係に
あり、また一般のチューブリン−相互作用的抗有糸分裂
剤のプロファイルとも相関性がある。

【００１７】

【チャート１】

【００１８】

【表１】

【００１９】

【チャート２】

【００２０】

【表２】

【００２１】ハリスタチン１のもう１つの原料は、その
後見出された。この第２の原料は西インド産の海綿のＡ
ｘｉｎｅｌｌａ ｃａｒｔｅｒｉである。これから次の
ようにしてハリスタチン１を抽出する。

【００２２】直立のオレンジ色の海綿Ａ．ｃａｒｔｅｒ
ｉ（メタノール中）の１９８９年の採集物（湿量６００
ｋｇ）をつくる。これをメタノール−ジクロロメタンで
抽出し、クロロカーボン分画をメタノール−水（９：１
→３：２）中で、ヘキサン→ジクロロメタン間で分配す
る。得られたＰＳ細胞系活性（ＥＤ_５０は０．３０μｇ
／ｍｌ）はジクロロメタン分画を、次いで一連のゲル透
過及び分配カラムクロマト工程により、上記のチャート
１に示すようにセファデックスＬＨ−２０上で、次いで
ＲＰ−８逆相シリカゲルでＨＰＬＣにより分離する。

【００２３】海綿の抽出と溶媒分配。Ａ．ｃａｒｔｅｒ
ｉの約６００ｋｇ（湿量）からのメタノール輸送溶液を
傾斜させ、次いで溶液に等量のジクロロメタン（６００
ｌ）及び充分な量（１０−２０容量％）の水を加え二相
とする。ジクロロメタン相を分離し溶媒を減圧下に蒸発
して最初の抽出物１．４３ｋｇをうる。海綿に対してジ
クロロメタン−メタノール（１：１）５５０ｌを加え
る。２８日後に、１５容量％の水を加えクロロカーボン
相を得、これを分離し減圧で濃縮して第２の抽出物１．
６６ｋｇをうる。回収したジクロロメタン上部の相（メ
タノール−水）と合併してジクロロメタン−メタノール
−水の溶媒混合物（概ね２：３．８：１．２）を形成さ
せ、それを海綿に戻して同様な方法（抽出期間は１８〜
３２日）で第３のジクロロメタン抽出分画６０７ｇをう
る。合併したジクロロメタン抽出物（３．７ｋｇ）を各
々２０ｌのヘキサンとメタノール−水（９：１）の混合
物にとかし、そして５５ｌの鋼製容器中でヘキサンで６
回抽出する。ヘキサン分画を３０℃で濃縮しついで温度
を５０℃に上昇させて水を除く。暗色の油状残渣は１．
６５ｋｇの重量である。９：１のメタノール−水の溶液
を濾過し（濾紙）そして黄褐色の沈でんを集める（ＥＤ
_５０＞１００μｇ／ｍｌ）。この溶液に水１２ｌを加え
て３：２に稀釈し、２０ｌのジクロロメタンで３回抽出
する。減圧濃縮してクロロカーボン抽出物から１８１ｇ
の分画、そしてメタノール−水からは４９３ｇの分画を
うる。バイオアッセイの結果（ＰＳ ＥＤ_５０ ０．３
０μｇ／ｍｌ）はジクロロメタン残渣は抗新生物成分の
貯蔵庫であることを示す。ＰＳ細胞系活性分画（１８１
ｇ）を、メタノールにパックされたセファデックスＬＨ
−２０カラム（１５×１２０ｃｍ）を通してのゲル濾過
により分離させる。カラムをメタノール２５ｌで溶離
し、分画をＰ３８８細胞系バイオアッセイでモニターす
る。活性分画（３）をジクロロメタン−メタノール
（３：２）中の他のセファデックスＬＨ−２０カラム
（９×９２ｃｍ）の頂部に加え、同じ溶媒で溶離する。
活性成分をさらに、ジクロロメタン−メタノール（９
５：５）を溶離液として用いるセファデックスＬＨ−２
０カラム（４．５×８０ｃｍ）分配しクロマトにより分
離する。得られた活性分画を、８：１：１のジクロヘキ
サン−イソプロパノール−メタノールの系を溶媒として
用い、セファデックスＬＨ−２０カラム（２．５×４０
ｃｍ）で分離する。

【００２４】カラムクロマトに用いる溶媒は再蒸留す
る。カラムクロマト分離に使うセファデックスＬＨ−２
０（粒子径：２５−１００μｍ）にスウェーデン，ウプ
サラのファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢから入
手できる。ＴＬＣプレートはアナルテック社（Ａｎａｌ
ｔｅｃｈ Ｉｎｃ）のものである。このＴＬＣプレート
は先ず短波長（２５０ｎｍ）の紫外線下でしらべ、次い
で３Ｎ硫酸中の硫酸セリウムをスプレーし約１５０℃で
熱する。ＨＰＬＣ分離のための条件は次のとおりであ
る。フェノメネックス・プレペックスＲＰ−８逆相セミ
分取カラム（１０．０×２５０ｍｍ，粒子サイズ５−２
０μｍ）；アセトニトリル−メタノール−水（５：５：
６）を溶離液として使用；アキシオム マイクロコンピ
ューターでコントロールされたＡｌｔｅｘ １１０Ａポ
ンプ；Ｒａｉｎｉｎ ＲＩ−１屈折率検出器、レンジ３
２、時間定数０．２５、流速（０．８又は１．０ｍｌ／
分）及び注入サンプル（１．０〜４．０ｍｇ）は変化さ
せる。^１Ｈ−ＮＭＲ，ＡＰＴ，^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ，
^１Ｈ−^１３Ｃ ＣＯＳＹ，ｎＯｅ及び^１３Ｃ−ＮＭＲ実
験は、クリオマグネット及びＡＳＰＥＣＴ−３００電算
機を具えたＢｒｕｃｋｅｒ ＡＭ−４００ ＮＭＲ分光
計を用いて行う。ＨＭＢＣスペクトルはＶＡＲＩＡＮ
５００ ＮＭＲ分光計で記録する。光学旋光はパーキン
−エルマー２４１旋光計で測定する。

【００２５】生物学的テスト：データ表示と分析；スク
リーンニングデータの概要 ハリスタチン１をＮＩＣのヒト腫瘍で、疾患配向性のイ
ンビトロ第一次スクリーニングテストを行いデータの計
算を行った。図１は、ハリスタチン１の四倍のスクリー
ニングの平均ＧＩ_５０値から構成した平均グラフから作
成したものである。

【００２６】この研究のハリスタチン１についての各々
の細胞系で得られた平均の負のｌｏｇ_１０ＧＩ_５０値
を、個々の細胞系同定体と共に以下に示す。ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ（９．４３），ＨＬ−６０ＴＢ（９．４８），Ｋ
−５６２（９．４４），ＭＯＬＴ−４（９．２１），Ｒ
ＰＭＩ−８２２６（９．３２），ＳＲ（９．７７），Ａ
５４９／ＡＴＣＣ（８．５４），ＥＫＶＸ（８．３
３），ＨＯＰ−１８（８．００），ＨＯＰ−６２（９．
０８），ＨＯＰ−９２（８．９６），ＮＣＩ−Ｈ２６
（９．０９），ＮＣＩ−Ｈ３２３（９．２４），ＮＣＩ
−Ｈ３２２Ｍ（８．４６），ＮＣＩ−Ｈ４６０（９．４
０），ＮＣＩ−Ｈ５２２（９．６８），ＬＸＦＬ５２９
（９．３２）；ＤＭＳ １１４（９．４８），ＤＭＳ
２７３（９．５４），ＣＯＬＯ ２０５（９．３７），
ＤＬＤ−１（８．９２），ＨＣＣ−２９９８（８．８
９），ＨＣＴ−１１６（９．３０），ＨＣＴ−１５
（８．３８），ＨＴ２９（９．３８），ＫＭ１２（９．
２４），ＫＭ２０Ｌ２（９．２８），ＳＷ−６２０
（９．４０）；ＳＦ−２６８（８．６６），ＳＦ−２９
５（９．９６），ＳＦ−５３９（９．４４）；ＳＮＢ−
１９（８．６４），ＳＮＢ−７５（９．５４），ＳＮＢ
−７８（９．３２），Ｕ２５１（９．２９），ＸＦ ４
９８（９．３２），ＬＯＸ ＩＭＶＩ（１０．０９），
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ（９．６８），Ｍ１４（９．２１），
Ｍ１９−ＭＥＬ（９．５４），ＳＫ−ＭＥＬ−２（９．
５４），ＳＫ−ＭＥＬ−２８（９．１１），ＳＫ−ＭＥ
Ｌ−５（９．８０），ＵＡＣＣ−２５７（９．０７），
ＵＡＣＣ−６２（９．５７）；ＩＧＲＯＶ１（９．０
８），ＯＶＣＡＲ−３（９．６０），ＯＶＣＡＲ−４
（８．１５），ＯＶＣＡＲ−５（９．３１），ＯＶＣＡ
Ｒ−８（８．７２），ＳＫ−ＯＶ−３（９．３３），７
８６−Ｏ（９．１６），Ａ４９８（８．８５），ＡＣＨ
Ｎ（８．４９），ＣＡＫＩ−１（８．８０），ＲＸＦ−
３９３（９．５２），ＳＮ１２Ｃ（８．６６），ＴＫ−
１０（８．２２），ＵＯ−３１（８．２１）．

【００２７】ハリスタチン１を、Ｐ３８８細胞白血病に
対してインビボでテストしたところ（但しＧｅｒａｎほ
か（１９７２年）のＣａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
ａｐｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ， Ｐａｒｔ３，３巻，１−１
０３ページに記載のＮＣＩプロトコール使用）ＢＤＦマ
ウスで４０μｇ／ｋｇ宿主体重で１００％の生存率を示
した。

【図面の簡単な説明】

【図１】ハリスタチン１の活性を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フェング ガオ アメリカ合衆国アリゾナ州85281 テンペ イース トレモン 1224番地

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の構造式で表わされる、ハリスタチン
   １と称する物質 【化１】
2. 【請求項２】 ハリスタチン１から成る医薬製剤
3. 【請求項３】 生長抑制量のハリスタチン１を用いて、
   白血病、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、大腸がん、Ｃ
   ＮＳがん、黒色腫、卵巣がん及び腎臓がんより成る群か
   ら選ばれたヒトの腫瘍細胞の生長を抑制する方法
4. 【請求項４】 腫瘍細胞がＮＣＩ命名による細胞系すな
   わちＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＨＬ−６０ＴＢ，Ｋ−５６２，
   ＭＯＬＴ−４，ＲＰＭＩ−８２２６，ＨＯ−６０ＴＢ，
   Ｋ−５６２，ＭＯＬＴ−４，ＲＰＭＩ−１２２６，Ｓ
   Ｒ，Ａ５４９／ＡＴＣＣ，ＥＫＶＳ，ＨＯＰ−１８，Ｈ
   ＯＰ−６２，ＨＯＰ−９２，ＮＣＩ−Ｈ２３，ＮＣＩ−
   Ｈ３２２Ｍ，ＮＣＩ−Ｈ４６０，ＮＣＩ−Ｈ５２２，Ｌ
   ＸＦＬ５２９，ＤＭＳ １１４，ＤＭＳ ２７３，ＣＯ
   ＬＯ ２０５，ＤＬＤ−１，ＨＣＣ−２９９８，ＨＣＴ
   −１１６，ＨＣＴ−１５，ＨＴ２９，ＫＭ１２，ＫＭ２
   ０Ｌ２，ＳＷ−６２０，ＳＦ−２６８，ＳＦ−２９５，
   ＳＦ−５３９，ＳＮＢ−１９，ＳＮＢ−７５，ＳＮＢ−
   ７８，Ｕ２５１，ＸＦ ４９８，ＬＯＸ ＩＭＶＩ，Ｍ
   ＡＬＭＥ−３Ｍ，Ｍ１４，Ｍ１９−ＭＥＬ，ＳＫ−ＭＥ
   Ｌ−２，ＳＫ−ＭＥＬ−２８，ＳＫ−ＭＥＬ−５，ＵＡ
   ＣＣ−２５７，ＵＡＣＣ−６２，ＩＧＲＯＶ１，ＯＶＣ
   ＡＲ−３，ＯＶＣＡＲ−４，ＯＶＣＡＲ−５，ＯＶＣＡ
   Ｒ−８，ＳＫ−ＯＶ−３，７８６−Ｏ，Ａ４９８，ＡＣ
   ＨＮ，ＣＡＫＩ−１，ＲＸＦ−３９３，ＳＮ１２Ｃ，Ｔ
   Ｋ−１０及びＵＯ−３１より成る群から選ばれたもので
   ある請求項３の方法
5. 【請求項５】 腫瘍細胞がリンパ性白血病より成る群か
   ら選ばれたものである請求項３の方法